Посещений:
Гликом Человека

Генетические Нарушения

Genetic defects in the human glycome
Hudson H. Freeze
NATURE REVIEWS | GENETICS Vol.7 No.7, P. 1-15 | doi:10.1038/nrg1894

The spectrum of all glycan structures — the glycome — is immense. In humans, its size is orders of magnitude greater than the number of proteins that are encoded by the genome, one percent of which encodes proteins that make, modify, localize or bind sugar chains, which are known as glycans. In the past decade, over 30 genetic diseases have been identified that alter glycan synthesis and structure, and ultimately the function of nearly all organ systems. Many of the causal mutations affect key biosynthetic enzymes, but more recent discoveries point to defects in chaperones and Golgi-trafficking complexes that impair several glycosylation pathways. As more glycosylation disorders and patients with these disorders are identified, the functions of the glycome are starting to be revealed.

Hypomorphic allele A mutation that causes a partial decrease in the activity of the gene product.

Heterosis Describes situations in which individuals who are heterozygous for a specific pair of alleles have a fitness advantage over those who carry either homozygous genotype.

Isoelectric focusing A method that is used to separate proteins within an electric field on the basis of their isoelectric points.

Electrospray ionization An ionization technique that is used in the mass-spectrometric analysis of large biomolecules. Charged droplets of analyte solution are used to produce gas-phase ions for analysis.

Thrombocytopaenia Decreased number of blood platelets.

Neutropaenia A type of leukopaenia that mainly affects neutrophils.

Complex-type glycans N-glycans that contain multiple GlcNAc-based branches, usually terminated with sialic acid or galactose.

Dysmorphology A morphological defect that results from an abnormal developmental process.

Interferon A pro-inflammatory cytokine that is produce by T cells in response to antigenic or mitogenic stimuli.

Reichert’s membrane The first basement membrane that is formed during mouse embryonic development; it is not present in humans.

Variable expressivity The variability in severity of a disease-causing genetic trait.

Haploinsufficiency The inability of the remaining wild-type allele to compensate for a heterozygous loss-offunction mutation.

Sialyl LewisX antigen A branched O-linked glycan, Sia-Gal-GlcNAc, in which fucose is bound to GlcNAc. It functions as a ligand for selectin, which is important for leukocyte trafficking.

Leukopaenia Reduction in the number of circulating leukocytes.

Protein-losing enteropathy Increased enteric loss of serum protein, especially albumin, that causes hypoproteinaemia.


Рис.1.  | Overview of glycan biosynthetic pathways.


Рис.2.  | | O-mannose and O-xylose biosynthetic pathways.


Рис.3.  | Sites of genetic defects in the N-linked glycan biosynthetic pathway.


Box 1  |  Identifying CDG and the underlying genetic defects


Box 2  |  Therapy for glycosylation disorders

Табл.1 Glycan classes: functions and biosynthesis

Табл.2 Human diseases caused by genetic defects in N-glycosylation pathways

Табл.3 Human diseases caused by genetic defects in O-glycosylation and glycolipid synthesis pathways

К геномам и протеомам добавляется их более молодой и юный собрат гликом (glycome)1. Определяется как все сахарные цепочки (glycans), которые производит организм, гликом, как подчитано, в 10-104 раз больше протеома в зависимости от вида. Гликозилирование - добавление гликанов к белкам и липидам - не является шаблоном, оно управляет так, что единый носитель может иметь удивительный массив гликоформ. Некоторые гликаны обладают известными, варьирующими или контекст-специфическими функциями, но функции многих др. далеки от понимания.
Несколько биохимических путей синтезируют гликаны, а генетические дефекты, которые затрагивают эти пути, вызывают ряд болезней. Почти 30 таких генетических нарушений идентифицировано за последнюю декаду, большинство затрагивает N-сцепленные и O-сцепленные пути2-4. Пациенты обнаруживают широкий спектр фенотипов, которые касаются многих медицинских специальностей. В последнее время увеличилось осознание важности гликозилирования при болезнях, что в комбинации с улучшением диагностических тестов, позволило выявить существование еще большего числа нарушений такого типа.

Biosynthetic pathways and glycan functions


У эукариот 11 биосинтетических путей связывают гликаны с белками и липидами5. Мною будут рассмотрены 6 путей для которых известны генетические нарушения (см. FIG. 1) будут рассмотрены основные функции гликанов, которые продуцируются (TABLE 1).
N-linked protein glycosylation. N-гликозилирование начинается с образования амидных связей между N-acetylglucosamine (GlcNAc) и asparagine на белке мишени. Сначала предшественник из 14 сахаров lipid-linked oligosaccharide (LLO), который содержит 2 GlcNAc, 9 mannose и 3 glucose единицы, конструируется на липидном носителе с помощью серии glycosyltransferases6. Гликан затем переносится на синтезируемые белки с доступным аспарагином в подходящем контексте7,8 (FIG. 1). Три единицы glucose units и до 6 единиц маннозы затем удаляются из большинства гликанов, а остатки GlcNAc, galactose, sialic acid и fucose могут быть добавлены, чтобы создать множественные веточки. Последовательность добавления и делеции сахаров предписана, но не подчинена шаблону и некоторые энзимы могут конкурировать за один и тот же субстрат, что может давать ряд N-glycan структур6. Специфические белки мишени и клеточно-специфическая экспрессия и организация этих биосинтетических факторий предопределяют структуру гликана.
Почти все белки, которые проходят через endoplasmic reticulum (ER)-Golgi ход (conduit) являются N-гликозилироваными и эта модификация может предопределить или повлиять на укладку, стабильность, трафик, локализацию и олигомеризацию белка, что имеет важные последствия для межклеточных взаимодействий и передачи внутриклеточных сигналов. Значение модификаций этого типа демонстрируется тем фактом, что отсутствие всех N-glycans является летальным у видов от дрожжей до млекопитающих.
O-linked protein glycosylation. O-сцепленное гликозилирование белка начинается с инициальных ступеней связывания между серином или треонином и маннозой, xylose или N-acetylgalactosamine (GalNAc) (FIGS 1,2). В случае O-mannose гликанов, GlcNAc, galactose и sialic acid добавляются последовательно9. Комплекс разветвленных гликанов этого типа может быть получен, это указывает на то, что биосинтетический путь также сложен10. Около трети из всех O-сцепленных цепочек в головном мозге строятся на O-mannose, хотя α-dystroglycan - который играет критическую роль в скелетномышечных клетках - является единственным идентифицированным носителем этого гликанах
После добавления O-αGalNAc к серину или треонину любые из 4-х сахаров могут быть добавлены для образования дисахаридов и многие могут быть увеличены за счет дальнейшего добавления galactose, GlcNAc, fucose и sialic acid, что создать линейные или с многими ответвлениями цепочки11. Такие гликаны в основном обнаруживаются в секретируемых или связанных с поверхностью муцинах эпителиальных клеток, где они служат в качестве смазки или барьеров против патогенов. Некоторые являются лигандами для selectins во время выхода из сосудов лейкоцитов и рециркуляции лимфоцитов.
Гликаны, которые являются O-сцеплеными посредством xylose с serine известны как glycosaminoglycans (GAGs), и включают heparan sulphate, heparin, chondroitin sulphate и dermatan sulphate12. После добавления первого сахара к серину, две молекулы галактозы и одна молекула glucuronic acid (GlcA) добавляются, это сопровождается увеличением этого стержня за счет повторяющихся дисахаридов GlcA-GalNAc (если первым сахаром является chondroitin sulphate или dermatan sulphate) или GlcA-GlcNAc (для heparin или heparan sulphate). Некоторые сахара затем модифицируются за счет epimerization и sulphation. Белки, которые несут chondroitin sulphate, появляются во внеклеточном матриксе (ECM), где они обеспечивают физическую интегральность и создают подушку, в то время как heparan sulphate цепочки, которые присутствуют в белках клеточных мембран, функционируют как ко-рецепторы для факторов роста, таких как семейство fibroblast growth factor (FGF). Heparan sulphate связывает также цитокины и морфогены во время развития для создания градиентов этих белков13.
Addition of glycans to lipids. Glycosphingolipids (GSLs) характеризуются O-сцеплением между glucose (иногда galactose) и ceramide, формирующим glucosyl ceramide, который увеличивается до lactosyl ceramide. Этот стержень затем может увеличиваться, чтобы сформировать боле сложные GSLs14. Sialylated версии называются gangliosides, и они особенно обильны в головном мозге и периферической нервной системе. GSLs появляются в липидных платформах, а их гликаны соединяются др. с др.15 или с белками, такими как интегрины, через которые они могут влиять на передачу сигналов.
Glycophospholipid (GPI) якорные гликаны содержат маннозу и glucosamine (не GlcNAc), которые собираются в ER на phosphatidylinositol осове. Гликолипид целиком переносится на C-терминальные области белков и закрепляют их в мембранах. GPI якоря играют также роли в диффузии мембран, внутриклеточном сортинге белков16 и передаче сигналов17.

Disorders of N-linked glycosylation - the CDGs


Огромное количество известных нарушений гликозилирования затрагивает N-гликозилирование, на сегодня идентифицировано около 600 пациентов3,18. Термин congenital disorders of glycosylation (CDGs) введен в 1999 для обозначения быстро растущей группы этих нарушений19, которые ранее назывались как carbohydrate deficient glycoprotein syndromes20. Идентификация пациентов с CDGs достигается с помощью диагностических тестов (BOX 1), из которых сегодня известны 19 типов. Смертность составляет около 20% в первые 5 лет жизни, но затем снижается. В результате многие взрослые с CDGs возможно остаются не диагностированы, т.к. родители этих пациентов и не помышляли о диагнозе. CDGs подразделяются на две группы, I и II, с малыми буквами, указывающими разные субтипы в хронологической последовательности идентификации дефектных генов (FIG. 3; TABLES 2,3). Все известные CDGs аутосомно рецессивные.
Type I CDGs. Гипогликозилированные белки появляются во всех 12 типа I CDGs из-за синтеза недостаточных и/или неполных предшественников LLO гликанов, которые неэффективно передаются белкам21-23. Все эти дефекты ведут к одному и тому же исходу: не занятие сайтов гликозилирования на множественных белках. Можно следовательно, предположить, что все CDG-I пациенты д. иметь сходные фенотипы, но это не так. Существует также существенная изменчивость среди этих нарушений, которая указывает на то, что генетические модификаторы являются важными в детерминации специфичных фенотипических исходов. Альтернативно, несоответствующим образом связанные с белком гликаны, накапливают метаболические промежуточные или укороченные LLOs, сами могут вызывать патологию.
При типа I CDGs, ранги замен, инсерций, микроделеций и иногда крупных делеций в кодирующих областях и сплайс-соединениях ведут к потере функции и гипоморфным аллелям скорее, чем к полному нокауту, который безусловно летален.
CDG-Ia является одним из превалирующих CDG, более чем с 500 пациентами по всему миру, что дает показатель 1/20,000 (REF. 22). Он вызывается мутациями в PMM2, одном из двух генов, который кодирует phosphomannomutases, которая превращает mannose-6-phosphate в mannose-1-phosphate. Эта молекула является непосредственным предшественником GDP-mannose, активированного донора для добавления маннозы. Мутации снижают уровни внетриклеточных GDP-mannose и LLO, оставляя незанятыми сайты гликозилирования на многих разнообразных белках. PMM2 высоко законсервирован (57% идентичности между человеком и дрожжами) и экспрессируется во всех тканях человека. Мыши, которые лишены Pmm2 погибают спутся 2-3 дня после оплодотворения (C. Kцrner, personal communication). Напротив, гомологичный ген PMM1 в основном экспрессируется в головном мозге, легких и неизвестны пациенты с CDG, имеющие мутации в этом гене. Белок PMM1 in vitro обладает ферментативной активностью, но он определенно не может заменить PMM2, поэтому его биосинтетическая роль неясна.
Имеется большое количество вариаций среди CDG-Ia пациентов в терминах ранга симптомов, которыми они обладают. Пациенты с 'classic' формой облаюают тяжелой психомоторной задержкой, судорогами, гипоплазией мозжечка и coagulopathy23, в то время как небольшое количество пациентов имеет значительно более слабую презентацию24-27. Общие генотип-фенотипические корреляции едва уловимы28. Почти 90 мутаций было открыто в PMM2, дающих в результате мутантные энзимы, обнаруживающие повышенную термолабильность29,30, плохое связывание субстрата или полную потерю активности. Некоторые пациенты с мягкими фенотипами имеют более высокую остаточную активность PMM2 (до 30%)24,31, указывая на корреляцию с слабо редуцированной ферментативной функцией, но такие взаимоотношения между ферментативной активностью и тяжестью фенотипа видны лишь в некоторых случаях. Строгая фенотип-генотипическая корреляция обнаруживается для большинства превалирующих мутаций в PMM2 у пациентов с Сев. Европы, которые вызывают Arg141His аминокислотные замены, которые почти полностью инактивируют энзим. Не выявлено гомозиготных пациентов, это, по-видимому, указывает на летальность, но частота носителей 1/80 iв сев. Европе указывает на позитивный гетерозис32.
Широкая фенотипическая изменчивость в CDG-Ia и отсутствие солидных генотип-фенотипических корреляций указывает на то, что генетический фон играет важную роль в экспрессивности болезни. Подтверждением этого служат частые не-патологические мутации в asparagine-linked glycosylation 6 (ALG6; которые являются причинными мутациями при CDG-Ic), появляющиеся вдвое чаще у тяжело затронутых CDG-Ia пациентов, как и у тех, что с легким или средним фенотипом33.
У немногих затронутых пациентов, менее известно о др. типа I CDGs, которые колеблются в отношении тяжести и фенотипа. Пациенты с CDG-Ib, которые обусловлены мутациями в phosphomannose isomerase (MPI), обладают менее выраженным фенотипом, чем с CDG-Ia, без задержки развития или психомоторной задержки и отвечают на терапию диетой34. Возможно, что материнская компенсация вносит вклад в этот облегченный фенотип и такая компенсация действительно продемонстрирована для др. типа I CDG: для CDG-Id, 19-недельный плод у незатронутой матери обнаруживал нормальное гликозилирование нескольких индикаторных плазменных гликопротеинов, но клетки хориона синтезировали укороченные виды LLO35. Это указывает на материнскую компенсацию, по крайней мере, для плодных производных печни плазменных гликопротеинов.
Причина генетических дефектов для большинства случаев CDG-I остается неизвестной. Такие 'CDG-Ix' пациенты могут turn out, чтобы нести мутации, которые ведут к дефектам активности oligosaccharyltransferase или биосинтеза и рециклинга dolichol, но это еще не подтверждено.
Type II CDGs. В то время как типа I CDGs вызывают дефекты в синтезе и переносе LLO, генетические дефекты, которые вызывают типа II CDGs меняют процессинг связанных с белком цепочек сахаров. Эти нарушения, по-видимому, менее часты, чем типа I нарушения, но это может отражать отсутствие осведомленности скорее, чем действительную распространенность. Различные генетические дефекты, которые лежат в основе типа II CDGs, нарушают специфические ступени пути гликозилирования.
Хотя этого можно было бы ожидать, что возникающие в результате фенотипических паттерны, которые могут помочь связать клинические признаки с причинными генетическими дефектами, но в общем то это совсем не так. Вместо этого структурный анализ сывороточных гликанов помог засечь цель генетических деяектов при CDG-IIa и CDG-IId (REFS 36-38) (BOX 1), в то время как для CDG-IIc и CDG-IIf комбинация анализа гликанов и знание специфических фенотипов возволило определить лежащие в основе дефекты39,40.
Мутации в Golgi-локализованных нуклеотидах транспортеров сахаров для GDP-fucose и CMP-sialic acid вызывают CDG-IIc и CDG-IIf, соотв., и в обоих случаях синтез O-сцепленного гликана sialyl LeX элиминирован40-42. При CDG-IIc это повышает циркулирующие лейкоциты даже в отсуствие инфекции43, в то время как при CDG-IIf он продуцирует гигантские тромбоциты с аномальными мембранами, thrombocytopaenia и умеренную neutropaenia44. Мутации сплайси-сайтов, которые лежат в основе CDG-IIf нарушают продукцию sialylated гликанов на поверхности гематопоэтических предшественников и зрелых клеток, но не изменяет sialylation сывороточных гликопротеинов, это возможно указывает на дифференциальную пенетрантность splice мутаций в разных тканях40.
CDG-IIe это первый пример из тех, что будут вероятно возникать, чтобы стать диапазоном новых CDG-II дефектов. Мутации сайтов сплайсинга в гене COG7 нарушают несколько путей гликозилирования путем затруднения нормального трафика множественных glycosyltransferases и nucleotide-sugar транспортеров45,46. COG7 является частью 8-субъединицы COG (conserved oligomeric Golgi) комплекса, который, как полагают, выполняет множественные роли по доставке внутри Golgi, и между ним и др. компартментами47,48. Клетки млекопитающих, которые дефицитны по COG1, COG2, COG3 или COG5также обнаруживают разной степени изменения гликозилирования49-51, указывая тем самым, что пациенты с дефектами в этих и др. субъединицах будут обнаруживаться среди всё увеличивающегося количества ещё не классифицированных CDG-II пациентов, которые обнаруживают дефекты во многих путях52-54. В самом деле, некоторые пациенты недавно были идентифицированы с дефектами в COG1 и COG8 (REFS 55,56). И также как затронутые N-сцепленные гликаны, эти COG мутации скорее всего затрагивают синтез GAG цепей и нормальную сборку ECM. Их открытие указывает, что мутации в др. связанных с trafficking белковых комплексах также могут затрагивать гликозилирование57.
Имеется несколько 'CDG-IIx' нарушений, для которых идентификация лежащих в основе генетических дефектов, ожидаема. Некоторые случаи избирательно затрагивают печень58, в то время как др. обнаруживают аномалии в ECM53. Как и с CDG-Ix нарушениями, лучшее понимание этих условий необходимо для более широкого и более углубленного анализа путей множественного гликозилирования, чтобы определить, какой2 из них нарушен.
Mouse models of CDGs. Большинство CDG случаев результат гипоморфных аллелей скорее, чем полной потери функции гена. В соответствии с этим имеется мало пригодных системных нокаутных мышиных моделей, т.к. мыши, которые являются нулевыми по генам, которые мутантны при CDGs, обычно погибают в раннем развитии. Создание моделей болезней для многих типов CDGs может быть достигнуто путем введения доказанных патологических точечных мутаций в мышиные ортологи дефектных генов людей. Др. подходом могло бы быть ткане-специфическое условное устранение, но это еще менее пригодно, т.к. немногие пациенты несут две нулевые мутации. Однако, имеется уже несколько пригодных CDG-подобных мышиных моделей. Мыши, которые являются нулевыми по Mgat2, который кодирует фермент GlcNAc-transferase II, необходимый для синтеза гликанов сложного типа, редко переживают период кормления (1%) и не выживают за пределами 4-х недель. Однако, немногие, которые переживают эту точку, напоминают пациентов с CDG-IIa - который обусловливается мутациями в человеческом ортологе этого гена - почти во всех отношениях, от их профиля гликанов до их дисморфологии и др. патологий59.
Мыши, которые являются нулевыми по Tsta3 (известен также как Fx), который кодирует энзим, который превращает GDP-mannose в GDP-fucose, обладают фенотипом, сходным с тем, что у пациентов с CDG-IIc. на некоторых генетических фонах, редкие Tsta3-null мыши, которые выживают (менее 1%) продуцируют потомков, чьё выживание и фенотип реагируют на fucose в питьевой воде60. Fucose превращается в GDP-fucose посредством fucose-1-phospate, обходя TSTA3 блок, а без fucose мыши погибают в течение немногих недель. Это сходно с фукозной терапией41, которая используется для пациентов с CDG-IIc, которые лишены GDP-fucose транспортера39,61. Специфические гены, которые могут компенсировать отсутствие функции TSTA3, не идентифицированы, но они возможно позволят более эффективно спасать fucose или повышать fucose-kinase активность для синтеза GDP-fucose. Возможность идентификации таких факторов демонстрирует потенциал мышиных моделей по предоставлению информации о фенотипическом разнообразии пациентов с этими нарушениями.
Emerging themes from the CDGs. Широкая клиническая изменчивость между CDGs и внутри каждого типа удивительна и возможно является результатом комбинации тяжести мутаций, генетических модификаторов и потери или замены специфических гликанов их нормальными аналогами. Тем не менее, выявляются некоторые фенотипические паттерны. Дефекты у N-сцепленных гликанов обнаруживают тенденцию затрагивать такие органы и клетки с высокими запросами на гликозилирование или быстрый оборот; напр., гепатоциты, энтероциты и лейкоциты62. Они также обнаруживают тенденцию затрагивать секретируемые белки (факторы каогуляции) и белки, которые вероятно играют роль в росте и межклеточных взаимодействиях. Онтогенетическая задержка, особенно такая, которая затрагивает развитие головного мозга, является наиболее важной находкой при CDG. Хотя специфические белки или процессы, которые ответственны ещё не идентифицированы, это согласуется с невозможностью соотв. межклеточных взаимодействий, которые необходимы для установления нормальной нервной системы во время развития. Далее мышиные модели, которые делают возможными такие онтогенетические фенотипы, д.б. изучены и стать пригодными для выявления специфических белков и путей, которые затрагиваются.
Other disorders that affect N-glycans Нарушения, иные, чем CDGs, также затрагивают синтез N-гликанов и их открытие действительно происходит в одно время с CDGs. В некоторых случаях затрагиваемые гены и/или белки не идентифицированы. Несмотря на это такие нарушения предоставляют информацию о том, как дефекты N-сцепленного гликозилирования могут затрагивать специфические пути или типы клеток. Напр., в противопложность глобальным нарушениям синтеза N-гликанов при CDGs, mucolipidosis II (ML-II или I-клеточная болезнь) и облегченная версия, ML-III (pseudo- Hurler polydystrophy), специфически затрагивают гликаны на лизосомных энзимах. Эти энзимы становятся неправильными мишенями (mistargeted), т.к. они лишены маркера для распознавания, mannose-6-phosphate, который необходимы для связывания с рецепторами в Golgi, которые обеспечивают доставку этих энзимов в лизосомы63. Пациенты с ML-II и ML-III несут мутации в transferase комплексе, который участвует в первых двух ступенях по добавлению mannose-6-phosphate64,65.
Др. заболевания могут также вызываться дефектами N-гликозилирования с фенотипами, которые затрагивают специфические типы клеток. Напр., аутосоно рецессивная type II congenital dyserythropoietic анемия нарушает эритропоэз. Дефект процессинга N-гликана может лежать в основе нарушения, но генетического подтверждени я этого ещё не получено66,67. Galactosaemia представляет собой пример, в котором генетический дефект, который не затрагивает непосредственно биосинтеза гликанов, может вызывать болезнь благодаря вторичным влияниям на N-гликозилирование. Это заболевание вызывается неспособностью метаболизировать galactose, которая приводит в результате к снижению уровней UDP-galactose или накоплению потенциально токсических метаболитов68. Большинство случаев обусловлено недостаточностью galactose-1-phosphate uridyltransferase (GALT), с мутациями в UDP-galactose-4 epimerase (GALE) и galactokinase 1 (GALK1), лежащими в основе др. случаев. Однако, некоторые из патологий, которые наблюдаются при galactosaemia, могут быть вызваны дефектным гликозилированием белков. Фибробласты от пациентов с GALT, которые оказываются подвержены действию galactose, накапливают существенные количества внутриклеточного galactose-1-phosphate69, которые могут менять концентрацию nucleotide sugars. Недавние исследования идентифицировали некоторых пациентов с GALT, которые не контролировались с помощью приема galactose с пищей и имели незанятые сайты гликозилирования на сывороточном transferrin и измененные структуры N-гликанов в выборках общих сывороточных гликопротеинов70. Эти признаки устраняются, когда galactose удаляется из диеты. Несмотря на это даже пациенты с GALT, которые бережно контролируются галактозой в пище, все-таки обнаруживают умственную отсталость, apraxic речь и неспособность яичников у женщин. Неполное sialylation фолликул-стимулирующего гормона указывает на то, что гликопротеины могут быть задействованы71, но пока неясно, могут ли др. эффекты вызываться накоплением токсических метаболитов, таких как galactitol или за счет несоответствующего гликозилирования72. Мыши с недостаточностью GALT не воспроизводят человеческий фенотип, когда получают массивные количества галактозы, указывая тем самым, что последующий метаболизм galactose-1-phosphate может быть ограничен у людей, но не у мышей68.

Too much N-glycosylation?


Не все доступные сайты N-гликозилирования на белках, которые проходят через ER и Golgi, оккупируются73,74 , а некоторые оккупируются по-разному в разных тканях75. Несмотря на это локализация N-glycan сайтов законсервирована в большинстве белков. Точковые мутации, которые создают новые сайты гликозилирования могут вызывать неправильную укладку белков и быструю деградацию76. Альтернативно, выживаемость таких белков может оказывать даже более тяжелые эффекты, если присутствие гликана нарушает образование сигнального комплекса или мультимерных белков. Напр., одна мутация, которая может вызывать синдром Marfan, создает N-сцепленный сайт в fibrillin 1 (FBN1), это меняет процессинг и собственно сборку из мономеров этого белка77,78. Недавно некоторые пациенты, с повышенной чувствительностью к mycobacterial инфекциям, как оказалось несут патологические точковые мутации, которые создают новый сайт гликозилирования в рецепторе interferon receptor IFNгR2 (REF. 79). Эта мутация не нарушает укладку белка или его локализацию на поверхности, но его функция драматически снижается. Ингибиторы N-гликозилирования или ферментативное удаление дополнительного гликана восстанавливает активность IFN.R2, показывая тем самым, что добавление N-гликана к этому сайту нарушает функцию рецептора. В том же исследовании идентифицированы function-compromising мутации, которые генерируют новые сайты гликозилирования в др. связанных с иммунитетом белках79. Более того, авт. рассмотрели 577 missense мутаций, которые затрагивают белки, которые следуют по пути ER-Golgi, и показали, что 13% из них создают несоответствующие места гликозилирования. Такое неожиданно высокое число может указывать на то, что избыточное гликозилирование белка действительно оказывает значительный эффект на функцию, чем потеря гликозилирования. Не удивительно, что случайная вставка радя гликанов в белки, такие как IFN.R2, оказывают негативные эффекты; даже правильно помещенные гликаны с неправильной структурой могут влиять на способность формирования сигнальных комплексов80. Изменчивость в занятии сайтов гликозилирования может быть физиологическим способом контроля формирования таких комплексов.

Disorders of O-linked glycosylation


Вызывающие болезни дефекты биосинтеза O-гликанов возникают преимущественно в O-mannose и O-xylose путях и большинство пациентов затрагиваются этими нарушениями скорее, чем дефектами N-гликанов. Их клинические проявления такж обычно отличны от тех, что обнаруживаются при нарушениях N-гликозилирования: на O-mannose-базирующиеся нарушения все вызывают мышечную дистрофию, редки находки дефектов N-гликанов, в то время как базирующиеся на O-xylose дефекты обычно вызывают аномалии костей, хрящей и др. ECM производных.
Defects in O-mannose glycans: congenital muscular dystrophies. Нарушения, которые возникают в результате дефектов в базирующихся на O-mannose гликанах, первоначально были известны под др. именем, а их связь с гликозилированием выявлена недавно. Мутации в кухне (machinery) гликозилирования, которые добавляют базирующиеся на O-mannose гликаны к α-dystroglycan, как недавно было показано, вызывает, по крайней мере, 5 типов congenital muscular dystrophy (CMD) (TABLES 2,3) и др. связанные с гликозилированием дефекты скорее всего будут идентифицированы для CMDs с ещё неизвестной этиологией4,81-84. Клинически исследованные категории этих нарушений теперь пересмотрены на базе знаний об дефектных генах, которые ранее рассматривались как характерные для др. нарушений83. Идентификация генов, вызывающих болезни, также ставит новые вопросы о том. как их белковые продукты влияют на гликозилирование, т.к. некоторые не обладают доказанной каталитической активностью, но способны корректировать множественные дефекты гликозилирования в клетках и мышиных моделях CMD.
α-Dystroglycan является одной из двух субъединиц dystrophin glycoprotein complex (DGC), который соединяет ECM с цитоскелетом во многих тканях. Обе субъединицы - α-dystroglycan и β-dystroglycan - являются производными одного гена, DAG1. В мышцах цитоскелетный актин связан с β-dystroglycan, который пронизывает клеточную мембрану. Внеклеточный домен β-dystroglycan соединяется с α-dystroglycan, который в свою очередь связывает laminin 2 в ECM посредством своего glycan-содержащего внеклеточного домена81. Степень и типы гликозилирования α-dystroglycan варьируют между разными тканями, но присутствие sialic acid чаще всего приводит к добавлению гликана, необходимого для связывания laminin-2. Используя моноклональные антитела против гликанов можно было бы идентифицировать связанные с гликозилированием дефекты, которые затрагивают α-dystroglycan, также как использование transferrin для выявления дефектов N-гликозилирования (BOX 1). Хотя не было найдено патологических мутаций в самом α-dystroglycan, название α-dystroglycanopathy было предложено для описания этих нарушений гликозилирования, т.к. это единственный белок, который безусловно несет гликаны, которые затрагиваются при CMDs82.
Walker-Warburg syndrome (WWS) является наиболее тяжелым из CMDs, который вызывается дефектным гликозилированием α-dystroglycan, с коротким периодом жизни (в среднем менее 1 года), множественными аномалиями головного мозга и тяжелой мышечной дистрофией. Примерно в 20% случаев имеются мутации в POMT1, который кодирует glycosyltransferase, необходимую для добавления O-mannose к α-dystroglycan. Как и в случае DAG1-нулевых мышей, POMT-нулевые животные погибают на ст. E7.5-9.5 и обе модели неспособны синтезировать Reichert's мембрану, что подтверждает функциональную связь между двумя генами85. Комплекс POMT1-POMT2 в ER необходим для активности transferase86, a мутации в POMT2 также обнаруживаются у WWS пациентов87. Немногие клинически диагностированные пациенты с WWS имеют дефекты в генах, которые кодируют Fukutin and Fukutin-related protein (FKRP)83,84, который также, как полагают, функционирует на пути гликозилирования. Мутации в fukutin и FKRP вызывают также др. более легкие формы CMD (see below), это подчеркивает фенотипическую зависимость как от специфических генов, так и от мутации. Исследования базирующегося на сцеплении картирования WWS в родственных семьях показало, что, по крайней мере, два др. гена также несут вызывающие WWS мутации83.
Ген POMGNT1 кодирует transferase, которая катализирует ступень на пути после инициального добавления O-mannose88, a мутации этого гена вызывают muscle-eye-brain болезнь (MEB), которая характеризуется симптомами, которые сходны с теми, что при WWS. Это заболевание обнаруживает варьирующую экспрессивность: наиболее тяжело затронутые пациенты погибают в течение первых лет жизни, но в направлении спектра умеренного проявления возможно доживание до взрослого периода. Наиболее тяжело затронутые WWS-подобные пациенты имеют мутации в 5' конце гена, но ни один из мутантных белков не обладает ферментативной активностью, указывая тем самым, что др. факторы предопределяют тяжесть заболевания89. Это может быть очень высокая экспрессия like-glycosyltransferase (LARGE), которая может подавлять некоторые DGC мутации. POMGnT1-нулевые мыши жизнеспособны, но имеют множественные дефекты в мышцах, глазах и гловном мозге90.
Для некоторых CMDs, был идентифицирован мутантный ген, но функция белка, который им кодируется неизвестна. Напр., Fukuyama muscular dystrophy (FCMD) вызывается 3-kb 3' инсерцией ретротранспозона в fukutin, которая частично редуцирует стабильность мРНК, что делает её относительно слабой мутацией. Продукты fukutin экспрессируются в мышцах и др. тканях и ко-локализуются с α-dystroglycan в разных регионах взрослого головного мозга мышей. Белок обладает предполагаемой glycosyltransferase signature (Asp-X-Asp, где X любая аминокислота) и локализуется в cis-Golgi, но не выявлено transferase активности. Сходным образом врожденная muscular dystrophy type Ic (MDCIC) является довольно легким нарушением и вызывается мутациями в FKRP91. Again, белок, в основном локализующийся в Golgi и обладающий Asp-X-Asp glycosyltransferase signature, не обладает доказанной transferase активностью.
Исследования одного из типов CMD, MDCID, предоставили информацию о потенциально важных признаках путей гликозилирования84. Пациенты с этим нарушением несут мутацию в LARGE, которая первоначально была описана у myodystrophic мышей (myd, теперь Largemyd). Белок содержит две glycosytransferase signatures в разных доменах, это указывает на возможность бифункциональности энзима. Не было продемонстрировано ферментативной активности, но мутации этих доменов супрессировали способность эктопической экспрессия LARGE, чтобы восстановить дефекты гликозилирования92. LARGE располагается в Golgi и, по-видимому, распознает N-терминальную область α-dystroglycan, который затем протеолизуется, высвобождая гликозилированный домен mucin. Избыточная экспрессия LARGE приводи к гипергликозилированию α-dystroglycan, это указывает на то, что это является скорость ограничивающей ступенью92.
Избыточная экспрессия LARGE фенотипически восстанавливает Largemyd мышей и предупреждает развитие мышечной дистрофии без увеличения экспрессии др. белков dystroglycan-комплекса93. Наиболее удивительно то, что LARGE может также восстанавливать дефектное гликозилирование миобластов от пациентов с FCMD и WWS и фибробластов от пациентов с MEB. Это не связано с увеличением активности энзимов, которые дефектны при этих нарушениях; гликозилирование восстанавливается за счет неизвестного компенсаторного механизма. Эти результаты важны, т.к.они указывают на то, что эктопическая экспрессия LARGE может служить потенциальной терапией для CMD.
LARGE является не единственным способом действия. Избыточная экспрессия специфической цитоксической Т-клеточной βGalNAc transferase94 также может создавать новый гликан на α-dystroglycan и предупреждать начало патологии у mdx мышей, которые дефицитны по dystrophin, белку, который дефектен при мышечной дистрофии Дюшена. Итак, образование эффективного внеклеточного комплекса может преодолевать и замещать потерю внутриклеточных связей с актином. Механизм, по-видимому, участвует в повышении связывания с utrophin, гомологом dystrophin, который обычно не присутствует на мышечных мембранах в достаточных количествах без 'booster' гена, который создает 'artificial sweetener' которое и преодолевает эту недостаточность95,96.
Defects in O-xylose glycosaminoglycans. Мутации, которые затрагивают различные стадии синтеза GAG, вызывают несколько болезненных фенотипов у людей (TABLES 2,3). Напр., дефекты ECM, которые вызывают аномалии костей и хрящей в progeriod варианте синдрома Ehlers-Danlos, являются результатом мутаций в B4GALT7, который кодирует энзим, ответственный за добавление первого остатка galactose к xylose97. Хорошо изученные генетические дефекты этого типа затрагивают образование heparan sulphate и вызывают hereditary multiple exostosis (HME), что является аутосомно доминантным заболеванием с показателем около 1:50,000 (REF. 98). HME характеризуется костными выростами (экзостозами), обычно в ростовых пластинках длинных костей, и у 1-2% пациентов развивается остеосаркома99. Изучение этого заболевания предоставило информацию о роли GAGs на передачу сигналов и развитие.
HME вызывается missense или frameshift мутациями в 3-х генах, exostoses 1 (EXT1), EXT2 и EXT3, каждый из которых вовлечен в синтез heparan sulphate98. Большинство HME мутаций возникает в EXT1 (60-70%) и EXT2 (30-40%). Эти белки, как полагают, существуют в виде комплекса в Golgi и оба необходимы для полимеризации alternating остатков GlcNAc.1,4 and GlcA.1,3, которые определяют heparan sulphate98. Частичная потеря одного из аллелей любого из генов, по-видимому, достаточна для возникновения MHE, это указывает на то, что гаплонедостаточность снижает количество heparan sulphate и что активность Ext является скорость лимитирующей для биосинтеза heparan sulphate.
Механизм патологии HME может заключаться в нарушении нормального распределения heparan-sulphate-связывающих ростовых факторов, которые включают FGF и морфогены, такие как Hedgehog, Wingless и Decapentaplegic13. В согласии с этой теорией и то, что отсутствие heparan sulphate нарушает пути hedgehog, wingless и decapentaplegic у Drosophila. Мыши, которые являются нулевыми или по Ext1 или Ext2 эмбрионально летальны и неспособны к гаструляции100; однако, Ext2-гетерозиготные животные жизнеспособны и около трети имеют одиночные видимые экзостозы на ребрах101. Экзостозы не возникают на длинных костях этих животных в противоположность HME, но едва различимые аномалии роста хондроцитов обнаруживаются в ростовых пластинках этих костей. Эти дефекты не обусловлены неправильной передачей сигналов Hedgehog, т.к. распределение этого белка не затрагивается. Ext1 гетерозиготы также имеют экзостозы, хотя пенетрантность зависит от линии мышей. Кроме того, они обнаруживают пониженную передачу сигналов FGF18 через FGF receptor 3 (FGFR3), a комбинация мутации Ext1 с Fgfr3+/- фоном увеличивает пенетрантность и тяжесть (J. Esko, personal communication), это указывает на то, что этот путь затрагивается нарушениями синтеза heparan sulphate.
Др. CDGs ещё неизвестного генетического происхождения, которые затрагивают трафик кухни гликозилирования, также могут влиять на синтез GAG-цепей и менять развитие скелета, нарушая передачу сигналов FGF. Многие свойства GAGs зависят от sulphation и некоторые аутосомно рецессивные chondrodysplasias вызывают аномальное развитие скелета (TABLES 2,3), благодаря дефектам транспорта sulphate-anion в клетки102 или его активации в 3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulphate, универсальный донор sulphate103.
Defects in O-GalNAc glycans. Семейный tumoral calcinosis является тяжелым аутосомно рецессивным метаболическим нарушением, которое связано с phosphataemia и массивными отложениями кальция в коже и подкожных тканях. Анализ сцепления, идентифицированный с помощью биаллельных мутаций в GALNT3, в одном из более 20 известных гомологов, которые кодируют GalNAc transferases, инициирующие O-гликозилирование104. Мутации в O-гликозилированном FGF23 также вызывают phosphataemia105, это указывает на связь между функциями GALNT3 и FGF23106, хотя это ещё предстоит подтвердить.
Редкое аутоиммунное заболевание, Tn syndrome, вызывается соматическими мутациями в X-сцепленном гене COSMC106. Этот ген кодирует высоко специфичный хаперон, который необходим для собственно упаковки и нормальной активности T-synthase, galactosyltransferase, которая превращает GalNAcα-Ser/Thr, известный как Tn антиген в Galβ1,3GalNAcα-Ser/Thr, известный как T антиген. При Tn синдроме субпопуляции всех типов кровяных клеток несут Tn антиген благодаря соматической мутации в стволовой клетке. Анти-Tn антитела присутствуют у большинства людей, a при Tn синдроме распознавание Tn антигена приводит к аутоиммунной реакции, которая ведет к анемии, лейкопении и тромбоцитопении. Мутации в COSMC являются прекрасными кандидатами на роль дефектов, лежащих в основе др. сходных с Tn нарушений, таких как IgA nephropathy и почечная недостаточность106.

Defects in glycolipid synthesis


Лишь немногие нарушения специфически затрагивают синтез GSLs и GPI якорей, но те, что были идентифицированы предоставляют информацию о том. как дефекты этого типа приводят к болезням. Мутации, которые лежат в основе CDG-Ie и CDG-If, также могут нарушать и синтез GPI-якоря в дополнение к своим эффектам на синитез N-гликанов.
Defects in GSL synthesis. Мутации в ST3GAL5 (известном также как SIAT9) были идентифицированы в случае аутосомно рецессивного Amish infantile epilepsy синдрома107. Этот ген кодирует sialyltransferase, которая необходима для синтеза ganglioside GM3 (sialic acid-2,3-galactose-в1,4-glucose-ceramide, который является также предшественником для некоторых более сложных gangliosides) из lactosyl ceramide (galactose-β1,4-glucose-ceramide). Причинная SIAT9 nonsense мутация укорачивает энзим и устраняет его активность, приводя к накоплению множественных non-sialylated гликолипидов. В противоположность человеческим формам болезни, мыши, лишенные GM3 не обладают судорогами или укороченным периодом жизни108. Однако, линии, которые являются нулевыми по Siat9 и гену, который кодирует αGalNAc transferase, необходимую для создания др. сложных gangliosides, имеют судороги108,109, это указывает на то, что отсутствие этих более сложных ганглиозидов может лежать в основе проблемы.
Defects in GPI-anchor biosynthesis. Не было идентифицировано наследственных дефектов биосинтеза GPI-якоря. Однако, известно более 100 оцененных соматических мутаций, появившихся в Х-сцепленном гене PIGA, который кодирует GlcNAc transferase, инициирующую этот путь. Нарушение синтеза GPI-якоря вызывает paroxysmal nocturnal haemoglobinuria (PNH)110. При этом заболевании потомство аномальных мультипотентных гематопоэтических стволовых клеток, которые лишены GPI-закрепляющих белков, становится резистентным к апоптозу и становится доминирующей популяцией111. Такая аномальная выживаемость, по-видимому, связана с потерей индуцируемых стрессами UL16-связывающих белков (ULBP1 и ULBP2), которые активируют NK и T клетки. PNH, вместе с нарушениями, которые вызываются дефектами COSMC, обнаруживают потенциальные последствия Х-сцепленных соматических мутаций на путях гликозилирования. Хотя такие нарушения еще не идентифицированы, но вполне могут существовать те, что обусловлены мутациями в др. Х-сцепленных генах, связанных с гликозилированием, куда входят ген UDP-galactose transporter (SLC35A2), ALG13 (который кодирует субъединицу, необходимую для добавления второго GlcNAc к LLO предшественнику) и OGT (который кодирует O-GlcNAc transferase).

Conclusions and future perspectives


Many patients with multi-systemic disorders, especially those with developmental delays, often do not receive a definitive diagnosis. Insights into glycosylation disorders have offered a new and mostly unexplored possibility in this respect. In the past 10 years, progress in this area has been referred to as ‘booming’99 with the identification of 32 diseases that are caused by defective glycosylationrelated genes. Many predictable glycosylation defects have been found in N-glycosylation, and neighbouring steps within this pathways are likely to be catalogued; so far we know of diseases in only 19 of the more than 60 genes that are involved in the N-glycan pathway. On the basis of the types of known genetic defect, other COG and trafficking-related disorders are likely to be found, as are defects in many of the GAG and O-GalNAc pathway biosynthetic steps. For all of these, the phenotypes will probably be extremely diverse. Inherited defects in more genes, the products of which are involved in GPI-anchor biosynthesis, are also likely to be identified. In these cases, more specific phenotypes are likely to be seen: effects on blood homeostasis are a probable outcome. These phenotypes might also overlap with those that are seen in patients with CDG-Ie, in whom the underlying genetic defects lead to impairment of the dolichol-Pmannose synthesis that is needed for the biosynthesis of both GPI anchors and N-glycans, which sometimes occur on the same protein.
Clinical awareness of and testing for glycosylation disorders must continue to increase. For the CDGs, identifying the defective gene in each patient is a slow process using current methods. Tailored gene chips that represent all known and potential defects are possible, but the cost of this approach might be too high. Alternatively, a cDNA-complementation approach might be effective. Lectin-binding differences between normal and CDG cells are not dramatic in most cases (with the exception of CDG-IIc39), which makes it impractical to exploit such binding to recognize cDNA-complemented cells. Furthermore, defects in COG-like Golgi trafficking proteins and COSMClike chaperones are likely to cause multi-systemic disorders, so simply finding an altered glycan structure will not indicate the defect62. However, coupling complementation to a highly glycosylation-dependent readout, such as viral gene expression, could be used to identify probable defects.
Another challenge is identifying the specific misglycosylated proteins that are responsible for various pathologies, and which could lead to new insights for therapy. The discovery of new markers, including those for complex O-linked glycans, might provide new possibilities. The Human Disease Glycomics/ Proteome Initiative112 and the Consortium for Functional Glycomics1,113 will probably lead the way in marker identification.
Novel perspectives on glycosylation itself are likely to emerge in the near future, and will add to our understanding of the genetic pathways that are affected in glycosylation disorders. For example, explaining how LARGE expression over-rides multiple defects in the dystrophin complex will require extending traditional perspectives of glycosyltransferase organization and interactions with specific glycoprotein substrates114,115. Linkage analysis and positional cloning will continue to identify glycosylation-related genes and the biochemical analysis of glycosylation will provide mechanistic explanations. Importantly, glycosylation will probably be shown to be a crucial feature in complex diseases, as it is likely to promote the assembly of various signalling complexes and regulate the turnover of receptors, as has already been suggested for autoimmunity and type II diabetes80,116,117. Furthermore, glycosylation efficiency could be affected by SNPs118. For instance, one known SNP that occurs in an N-glycan biosynthetic enzyme might alter its subcellular localization (ID 4292135 in the SNPeffect database). Over 150 other non-synonymous SNPs are known to occur in genes that are involved in multiple glycan biosynthetic pathways, but their effect is unknown. Glycosylation is also likely to be featured at the gene–environment interface in the development of complex diseases. For example, in the case of protein-losing enteropathy, which occurs during viral or bacterial infections, a propensity to lower levels of the heparan sulphate proteoglycans, such as syndecan 1, has a contributing role119–121. Finally, what is the prospect for therapy for glycosylation disorders? Most are not currently treatable122, but there are simple and effective therapies for a few patients (BOX 2). In these cases, identifying the underlying genetic defects has been crucial in determining who would benefit from them. Understanding the biology of glycosylation disorders will hopefully provide a foundation for future therapies.
Сайт создан в системе uCoz