В нормальных хондроцитах взрослых, как и во всех соматических клетках, эпигенетические механизмы с использованием метилирования ДНК в CpG мотивах, модификаций гистоновых хвостов и изменений в структуре хроматина, обусловленных ферментативными активностями и некодирующими РНК, все вместе генерируют стабильные, наследуемые фенотипы. Растут доказательства, подчеркивающие взаимодействия со средой, вызывающими эпигенетические альтерации в экспрессии генов, которые ведут к фенотипам, передающимися генарациям клеток, и к этиологиям болезней, передающихся дочерним клеткам посредством множественных удвоений [9]. Особый интерес в этом отношении представляют, подобные парамутационным, эффекты, описанные у мышей, при этом специфические miRNAs контролируют экспрессию генов посредством передающего через зародышевую линию эпигенетического механизма [10], который может приводить к патофизиологическим состояниям, таким как наследственная кардиальная гипертрофия [11]. OA заболевание развивается в контексте хондроцитов, чувствительных к ассоциированным со стрессами провоспалительными условиями. Т.о., очень важно исследовать, как альтерации в регуляции miRNAs, которые поддерживают длительное время нормальный фенотип хондроцитов или контролируют медиаторы воспалительной реакции и ассоциированные с ними сигнальные пути (rev. [12,13]) прямо или косвенно влияют на прогрессирование болезни OA. Др. недавнее доказательство также подчеркивает важное значение miRNA-обеспечиваемой регуляции circuitry генного контроля, который воздействует на epigenetic-like, наследсвенное превращение нормальных клеток в раковые [14].
Влияние ацетилирования гистонов на фенотип хондроцитов исследовалось на уровне специфических гистоновых деацетилаз (HDACs). HDACs состоят из двух семейств: классического семейства HDAC NAD+-зависимого SIR2 семейства (также известного как Class III HDACs). Исходя из филогении классические HDACs могут быть сгруппированы в три класса: Class I (HDAC1, 2, 3 и 8), родственный дрожжевому RPD3; Class II (HDAC4, 5, 6, 7, 9 и 10), очень близко родственен дрожжевому HDA1; и Class IV (HDAC11). HDACs, как было установлено, не только ингибируют экспрессию MMPs, индуцированную воспалительными цитокинами и др. медиаторами [18-21], но также супрессируют экспрессию специфичных для хряща генов, включая COL2A1 и aggrecan (ACAN) [22].
Из SIR2 семейства, SIRT1, лизиновая деацетилаза, которая играет важную роль в связанных с возрастом болезнях, представляет интерес, поскольку она способствует экспрессии специфичных для хряща ECM генов, включая COL2A1, путем усиления Sox9-обеспечиваемой транскрипции посредством рекрутирования гистоновых ацетилтрансфераз (HATs) на промоторные и энхансерные сайты [27]. SIRT1 также блокирует апоптоз в хондроцитах посредством множественных механизмов [28,29], а находки в OA хрящах в сравнении с нормальным хрящом указывают, что пониженная экспрессия и активность SIRT1 в хондроцитах может коррелировать с повышенным апоптозом и нарушенным паттерном экспрессии генов (снижение COL2A1 и ACAN и усиление COL10A1 и ADAMTS5) , обнаруживаемым на определенных стадиях OA [27,28,30]. Хотя это пока не показано при OA болезни, но SIRT1 также выполняет существенную противовоспалительную функцию в разнообразных тканях [31], в которых он инициирует программу репрессии ген-специфической транскрипции, частично, путем деацетилирования p65 субъединицы ядерного фактора κB (NF-κB), который блокирует связывание NF-κB ДНК [32] и может приводить к рекрутированию RelB-зависимых репрессирующих транскрипцию комплексов, чтобы завершить острую воспалительную реакцию [33]. Интересно, что недавнее исследование показало, что воздействие на хондроциты tumor necrosis factor (TNF)-α вызывает cathepsin B-обеспечиваемое расщепление SIRT1, и тем самым редуцирует его ферментативную активность в ассоциации со снижением соединения Sox9 с энхансером COL2A1 [34].
OA является воспалительным заболеванием и поэтому важно отметить, что при определенных условиях деметилирование гистонов может индуцировать программу экспрессии провоспалительных генов внутри клеток. Напр., в активированных иммунных эффекторных клетках каноническая передача сигналов NF-κB, как было установлено, ингибирует образование polycomb репрессорных комплексов, которые зависят от трижды метилированного по лизину 27 гистона 3 (H3K27me3) путем индукции экспрессии
Jmjd3, a Jumonji C (JmjC) каталитический домен-содержащего белка, который действует как H3K27me3 деметилаза [35]. Канонический путь передачи сигналов NF-κB управляется с помощью Iκ kinaseβ (IKKβ), как полагают, управляет MMP-13-зависимым ремоделированием ECM в культурах дифференцировки первичных OA суставных хондроцитов человека [36]; поэтому было бы интересно узнать, участвует ли IKKβ-обеспечиваемая передача сигналов NF-κB в альтерациях структуры хроматина в развитии болезни OA
in vivo. Недавние доказательства показывают, что повышенная экспрессия NFAT1 (NFATc2/NFATp; ядерный фактор активированных T клеток 1), важного транскрипционного регулятора гомеостаза суставного хряща, связана с увеличением H3K4me2 (гистоновой модификацией, связанной с активацией транскрипции), тогда как снижение экспрессии NFAT1, что вызывает OA-подобные изменения у взрослых мышей, коррелирует с повышением уровня H3K9me2 (гистоновой модификации, связанной с транскрипционной репрессией) [37].
Epigenetic mechanisms involving DNA methylation
Метилирование геномной ДНК представляет собой важный механизм для регуляции экспрессии тканеспецифических генов. Патологическая потеря метилирования ДНК может приводить к аберрантной индукции генов, тогда как усиление метилирования может заставить замолчать обычно экспрессирующиеся гены. На метилирование могут влиять пищевые и др. средовые факторы, а паттерн метилирования ДНК специфических генов варьирует в разных типах клеток. В целом активные промоторы, которые управляют транскрипцией генов гипометилированы в клетках, тогда как гиперметилирование способствует молчанию генов. Статус метилирования ДНК наследуется так, что репертуар клеточно-специфической экспрессии стабильно передается дочерним клеткам. Т.о., паттерн аберрантного метилирования также может передаваться дочерним клеткам, это может приводить или к продолжающейся аномальной экспрессии замалчиваемых генов или супрессии обычно экспрессирующихся генов.
Предыдущие исследования продемонстрировали, что эпигенетическая дерепрессия, ассоциированная с потерей метилирования ДНК, на гены хондроцитов, включая MMP3, MMP9, MMP13, ADAMTS4, IL1β и LEP, которые кодируют энзимы, вносящие вклад в дегенеративный фенотип хряща OA [38-43]. Ингибитор для NF-κB, частично путем модуляции экспрессии DNA methyltransferase-1, может предупреждать вызываемое цитокинами деметилирование специфического сайта в промоторе IL1β, которое ассоциирует с понижением экспрессии IL-1? [44]. Недавнее исследование продемонстрировало, что в то время, когда два гена, кодирующих супрессоры suppressors of cytokine signaling (SOCS), SOCS2 и CIS-1, но не SOCS1 и SOCS3, супрессируются в OA хондроцитах, статус метилирования CpG промотора SOCS2 остается неизменным [45]. Интересно, что потеря экспрессии osteogenic protein-1 (OP-1 или bone morphogenetic protein-7) в старых хондроцитах ассоциирована с гиперметилированием промотора OP-1. Воздействие на хондроциты OP-1 может подавить стрессовую и воспалительную реакцию генов [46].
Остается неясным гипометилирование или гиперметилирование ДНК изменяет регуляцию генов хрящевого матрикса при OA. Как наблюдали Poschl и др. [47], метилирование ДНК не является ключевым компонентом в подавлении активности ACAN, чей промотор имеет 33 CpG сайта внутри 340 п.н., островки CpG остаются неметилированными в выборках нормального и OA хряща. Хотя p21WAF1/CIP1, ингибитор пролиферации клеток, регулируется с помощью эпигенетической модуляции в др. контекстах и экспрессируется также в нормальных хондроцитах, метилирование ДНК его промотора, по-видимому, ответственно за его подавление в OA хондроцитах [48]. Др. исследования продемонстрировали, что статус метилирования CpG островков вблизи точки старта транскрипции промотора COL2A1, деметилирование в суставных хондроцитах, мезенхимных стволовых клетках (MSCs) и в производных MSC хондроцитах человека не зависит от экспрессии COL2A1 [49]. Однако статус метилирования сайтов CpG в энхансерном регионе в 309 п.н. гена COL2A1, который необходим для его Sox9-зависимой транскрипции, ещё предстоит изучить. Напротив, индукция гена коллагена типа X (COL2A1) во время MSC хондрогенеза коррелирует с деметилированием двух сайтов CpG в промоторном регионе гена COL10A1. Очевидно, что повышенная экспрессия COL2A1 в OA выборках в отсутствие дифференциального метилирования, может быть объяснено усилиями OA хондроцитов регенерировать ECM, поскольку похожая на анаболическую реакция в условиях, способствующих деградации, согласуется с находками при анализе микромассивов хряща человека [50,51]. The Human Epigenome Project показал, что гены, такие как COL2A1, с большим количеством CpG островков, обычно не метилированы в нормальных клетках, независимо от экспрессии, за исключением супрессирующих опухоли генов при раке [52,53]. Напр., несмотря на пониженную экспрессию в OA хондроцитах, как упоминалось выше, статус в промоторе SOCS2 сайтов CpG остается неизменным [45], тогда как в опухолевых клетках сайты CpG в промоторных регионах SOCS генов гиперметилированы, что сопровождается снижением экспрессии [54,55].
Итак, эпигенетические изменения при OA, касающиеся гипометилирования и соответствующей активации аберрантных генов, являются преобладающими по сравнению с изменениями, связанными с гиперметилированием и замалчиванием анаболических генов. Нет сомнения в том, что др. такие гены будут идентифицированы позднее. Хотя метилирование ДНК не всегда объясняет постоянно измененную экспрессию генов при OA, повышение нашего понимания паттернов метилирования в OA тканях откроют важный терапевтический потенциал для новых подходов для предупреждения и купирования эпигенетических изменений.
Impact of miRNAs on chondrocyte physiology and OA disease
В последние годы влияние специфических miRNAs на гомеостаз хряща и OA привлекло значительное внимание [56-65]. Dicer, энзим, необходимый для биогенеза miRNA, важен для развития скелета мышей, у Dicer-нулевых мышей ростовые пластинки обнаруживают выраженное отсутствие пролиферации хондроцитов в сочетании с усиленной дифференцировкой постмитотических гипертрофических хондроцитов [57]. Последние результаты могут быть объяснены тем, что потеря Dicer оказывает различные функциональные эффекты на разных стадиях развития хондроцитов [57]. Профиль экспрессии miRNA в MSCs сильно изменяется, как только они дифференцируются в хондроциты [66,67]. miR-1 репрессирует экспрессию гена ACAN в клеточной линии хондросаркомы человека, HCS-2/8; а уровни miR-1 снижаются на поздней гипертрофической стадии дифференцировки хондроцитов [68]. Экспрессия miR-199a снижается во время индуцированного с помощью BMP-2 хондрогенеза, указывая, что она может функционировать как супрессор на ранних ступенях хондрогенной программы [69]. В самом деле, усиление экспрессии miR-199a в мышиных C3H10T1/2 стволовых клетках или в линии прехондрогенных клеток ATDC5 супрессирует множественные маркеры раннего хондрогенеза, включая type II коллаген и COMP, тогда как анти-miR-199a оказывает противоположный, стимулирующий эффект [69]. В согласии с этими наблюдениями, Smad1, позитивный нижестоящий медиатор передачи сигналов BMP-2 и регулятор развития кости и хряща, как было установлено, управляет miR-199a мишенью [69]. Т.о., BMP-2-обеспечиваемая репрессия miR-199a должна предупреждать посттрансляционную репрессию ею Smad1. Кроме того, некоторые miRNAs были также идентифицированы как регуляторы остеобластогенеза, включая miR-29, miR-141, miR-200a, miR-206, miR-210 и miR-2861 [70]. Дифференцировка остеобластов из остеохондральных предшественников также использует активности новых транскрипционных факторов, включая Osterix (Osx) [71]. В эпигенетической перспективе гены мишени для Osx репрессируются в остеохондральных предшественниках благодаря активности NO66, JmjC-домен содержащей гистоновой деметилазе, которая удаляет активирующие хроматин метки H3K4me и H3K36me из промоторов специфичных для остеобластов генов [71]. Итак, эти данные подтверждают, что подходы по преобразованию в хрящевую ткань могут быть усилены за счет манипуляций с программированием остеохондральных предшественников c помощью разных комбинаций miRNAs и/или активностей хроматин модифицирующих факторов, таких как NO66 (см Figure 2 о специфических miRs и модификациях хроматина, ассоциированных с гомеостазом хондрогенеза и хряща).
Беспристрастные подходы по профилированию геномной экспрессии выявили несколько miRNAs, чья экспрессия или существенно усиливается или супрессируется в OA хондроцитах человека, по сравнению с их нормальным суставными аналогами. В одном скрининге идентифицировано 17 miRNAs, чья экспрессия варьирует четырехкратно или более [58] в нормальных в противоположность хрящу на поздней стадии OA. В независимом исследовании выявлена сигнатура из 16 miRNAs, которые позволяют отличить нормальную от OA хрящевой ткани, при этом 9 miRNAs достоверно повышали свою активность, а 7 miRNAs снижали в OA ткани по сравнению с нормальными контролями [56] (Figure 3). Кроме того, эксперименты с избыточной экспрессией специфических miRNAs или их целенаправленными LNA (locked nucleic acid) ингибиторами выявили участие miR-9 в регуляции MMP13, также как и miR-9, miR-98 и miR-146 в контроле TNF? [58]. Хотя удовлетворительный непосредственный целенаправленный функциональный анализ отсутствует для большинства из этих дифференциально экспрессируемых miRNAs, интеграция некоторых из этих результатов с протеомным анализом нормального в противовес OA хрящу выявила несколько пар miRNA-ген мишень, участвующих в гомеостазе и структуре хряща (miR-140-ADAMTS5, miR-483-ACAN, miR-509-Sox9, miR-223-GDF5), в биомеханике (miR-25-ITGA5), в апоптозе (miR-373-CASP6, miR-210-CASP10), а также в липидном метаболизме (miR-22-PPAR, miR-22-BMP-7, miR-29a-LEP) [56]. Функциональные эксперименты с отобранными парами miR-ген показали, что miR-22 регулирует BMP-7 и PPARA на уровне РНК и белка, соотв. [56]. Более того, усиление экспрессии miR-22 или siRNA-обусловленная супрессия или PPARA или BMP-7 ведет к увеличению уровней белка IL-1? и MMP-13, тогда как ингибирование эндогенной miR-22 в OA хондроцитах повышает уровни PPARA и BMP-7, в то же время одновременно ингибирует IL-1? и MMP-13, что сопровождается защищающим хрящ увеличением белка aggrecan [56]. Альтерации в сигнатурах miRNA ассоциированные с развитием и прогрессированием болезни OA представлены на Рис. 3.
Специфические сигнатуры miRNA в синовиальной жидкости могут служить новыми биомаркерами болезни хряща. Концентрации miR-16, miR-132, miR-146a и miR-223 снижены в синовиальной жидкости индивидов, страдающих от OA, по сравнению со здоровым контролем [60], тогда как miR-16, miR-132, miR-223, miR-146a и miR-155 [72] экспрессируются на более высоких уровнях в синовиальной жидкости у пациентов с ревматоидным артритом (RA). Однако различия в сигнатурах в OA хряще в сравнении с синовиальной жидкостью включают miR-16 и miR-223, которые усиливают свою активность в OA хряще [56], это может быть связано с тканеспецифическими различиями активностей при болезни. Доказательство,что специфические miRNAs могут воздействовать на связанную со стрессами механотрансдукцию в суставном хряще также были представлены [59]. miRNA-34a , как было установлено, модулирует апоптоз хондроцитов [73]. miR-222, которая нацелена на p27Kip1 cyclin-зависимый киназный ингибитор [74], как было установлено, активируется в передней части хряща с нагрузкой на ногу в коленном суставе в противоположность его заднему аналогу, не испытывающему нагрузки на ногу, подтверждая тем самым, что miR-222 может вносить вклад в усиление пролиферации хондроцитов в поверхностной зоне хряща суставов, испытывающих механические воздействия [59].
miRNA-140, кодируемая геном miR-140, располагается в интроне Е3 ubiquitin протеин лигазного гена Wwp2, она эволюционно законсервирована у позвоночных и обильно и специфически экспрессируется в хондроцитах эмбрионов мышей во время развития кости [61,75-77]. Важно, что экспрессия miR-140 в значительной степени редуцирована в OA хряща [63] и супрессируется c помощью передачи сигналов IL1β [63]. Впервые было показано, что miR-140 воздействует на HDAC4 [76], известный корепрессор факторов транскрипции Runx2 и MEF2C, существенных для гипертрофии хондроцитов и развития кости. miR-140 также воздействует на CXCL12 (stromal cell-derived factor 1) [78] и SMAD3 [79], оба сопричастны к дифференцировке хондроцитов. Недавно было установлено, что miR-140 влияет на ADAMTS5 [64]. Наконец, miR-140 также супрессирует Dnpep, aspartyl aminopeptidase, которая, как полагают, противодействует передаче сигналов BMP, стоящей ниже активации Smad [80]. Важно, что нокаутные по miR-140 мыши предрасположены к связанным с возрастом OA-подобными изменениями, а избыточная экспрессия miR-140 в хондроцитах защищает против хирургически индуцируемого OA [61,64].
Др.недавние находки показывают, что miR-27b, miR-27a и miR-146a супрессируют экспрессию ADAMTS и/или MMP в хондроцитах [65,81,82]. miR-27b воздействует на мРНК MMP-13, а экспрессия miR-27b супрессируется c помощью mitogen-activated protein kinase (MAPK) и передачи сигналов NF-κB [81]. Др. сообщение предоставило доказательств, что miR-27a может непосредственно регулировать уровни MMP-13 и про-анаболического insulin-like growth factor binding protein (IGFBP)-5 путем воздействия на вышестоящий позитивный эффектор или эффекторы обоих генов [82]. Хотя miR-146a экспрессируется на высоком уровне в OA хряще низкого ранга, уровни miR-146a стремительно падают на поздней стадии OA [62]. Более того, miR-146a строго усиливает свою активность c помощью передачи сигналов IL1β [62] при этом её индуцированная транскрипция зависит от канонической активации NF-κB [83]. miR-146a , как было установлено, непосредственно воздействует на мРНК, кодирующие TRAF6 и IRAK, тем самым ослабляют способствующие воспалению сигнальные пути [83]. miR-146a, как полагают, также действует как негативный регулятор обратной связи для MMP-13 [62] и как супрессор аутоиммунитета и миэлопролиферации [84]. Более того, miR-146a оказался вовлеченным в контроль гомеостаза коленных суставов и OA-ассоциированной алгезии за счет балансировки воспалительной реакции в хряще и синовиальной оболочке с боль вызывающими факторами в глиальных клетках. Как таковая она может быть использована для воздействия как на регенерацию хряща, так и на болевые симптомы, вызываемые OA [65].
Потенциальная важность miRNAs в поддержании целостности и гомеостаза хряща подтверждена недавним исследованием, продемонстрировавшим, что главный хондрогенный транскрипционный фактор Sox9 позитивно регулирует ген
COL2A1 в хондроцитах человека посредством miR-675-зависимого механизма [85]. miRNA-675 , происходит из первичного транскрипта, кодируемого геном H19, а
экспрессия H19 и miR-675 РНК зависит от Sox9. Важно, что усиление экспрессии
miR-675 восстанавливает уровни мРНК COL2A1 у истощенных по Sox9 или H19 первичных суставных хондроцитов человека. Хотя статус экспрессии
miR-675 при АО и её мишени остаются неизвестны, эти данные указывают, что miR-675 может модулировать гомеостаз хряща, супрессируя транскрипционный репрессор COL2A1 [85]. Исследования по выявлению профилей в первичных суставных хондроцитах взрослых показали, что miRNAs дифференциально экспрессируются в клетках отличаясь рангами в дифференцированных, хондробласт-подобных и дедифференцированных фенотипах, подтверждая, что манипуляции с профилями miRNA могут предоставить новые стратегии для улучшения преобразования хрящевой ткани
[86,87]
Future perspectives
OA in humans develops slowly with time and may not be symptomatic until significant joint damage occurs. Thus, it has been extremely difficult to develop disease-modifying drugs and prove their effectiveness in clinical trials owing to the lack of biomarkers and sensitive techniques for identifying and assessing patients with early changes. Because the cytotoxicity and off-target effects of HDAC inhibitors may preclude their use for treatment of a relatively benign disease, compared with cancer, more specific inhibitors that target OA disease-specific processes, such as inflammation and mechanotransduction, or targeting the inhibitors to the joint tissues themselves must be considered. Inhibitors of signaling pathways that regulate DNA methylation might be another approach. Profiling unique patterns of epigenetic changes to distinguish diverse chondrocyte phenotypes, including those involving chondrogenic programming, articular cartilage homeostasis, and OA disease progression, represents a novel strategy to identify novel biomarkers of early OA. Correlating DNA methylation, chromatin marks, and miRNA signatures in human OA disease with those found in well-defined OA animal models should allow us to define the regulatory requirements for stress-related proinflammatory signaling and the acquired hypertrophic-like phenotypes of OA chondrocytes. To design effective miRNA-based treatment modalities without potentially deleterious off-target effects, future work must be directed towards identifying key miRNA targets that functionally impact on early OA onset and disease progression. Overall, we are increasingly hopeful that rational molecular therapies may be on the horizon to combat the proinflammatory tissue destructive phases of OA disease and to simultaneously enhance cartilage integrity and maintain joint flexibility with progressing age.
Сайт создан в системе
uCoz
Figure 1. Major phenotypic changes by which normal cartilage tissue becomes compromised in osteoarthritis (OA). Normal articular cartilage subjected to stresses such as inflammation, mechanical stress, genetic aberrations, and age-related degeneration can slowly develop phenotypic characteristics of OA tissue. These include increased stress and inflammatory signaling, proliferation of chondrocytes resulting in chondrocyte clusters, and degradation of the extracellular matrix (ECM). The role of the subchondral bone in OA and its interactions with cartilage have been reviewed by Goldring and Goldring [88].
Figure 2. Major epigenetic players and miRNAs that help to drive the genesis of articular chondrocytes from osteochondral progenitors. The ECM and physiological status of chondrocytes before and after progression to OA are shown. Note that a pericellular matrix surrounds chondrocytes is present in normal articular cartilage. Statements with question marks indicate regulatory mechanisms based on in vitro evidence that require further validation in vivo. 
Figure 3. The path towards osteoarthritis (OA). Summary of the epigenetic markers and associated regulatory alterations impacting on the physiology of growth- and differentiation-arrested normal articular chondrocytes leading them down a path towards OA disease. Note that the pericellular matrix surrounding normal chondrocytes becomes disrupted in OA cartilage. *, miR-25 was found to be upmodulated by Jones et al.[58] and suppressed by Iliopoulos et al.[56] in OA cartilage.