Аденокарцинома простаты наиболее часто диагностируемый злокачественный рак, ведущая причина гибели мужчин в США [Jemal et al., 2005]. Локальный рак простаты может быть удален хирургически или с помощью радиационной терапии [Catalona et al., 1999; Denmeade and Isaacs, 2002; Dorff et al., 2006; Swanson, 2006]. Однако инвазивная или даже микрометастатическая болезнь представляет клиническую проблему, т.к. опухоль плохо реагирует на стандартные цитотоксические режимы, которые действуют посредством геномного инсульта. Поэтому раки простаты лечатся, исходя из уникальных характеристик, из того, что они сильно зависят от андрогенов для своего развития, роста и выживания [Balk, 2002; Culig and Bartsch, 2006; Jenster, 1999; Klotz, 2000]. Устранение андрогенов запускает клеточную гибель или останову клеточного цикла клеток рака простаты [Agus et al., 1999; Denmeade et al., 1996; Huggins and Hodges, 1972; Isaacs, 1984; Knudsen et al., 1998; Kyprianou and Isaacs, 1988]. Т.о., устранение андрогенов остается первичным способом лечения для всех пациентов с метастатическим заболеванием [Jenster, 1999; Klotz, 2000; Loblaw et al., 2004; Sowery et al., 2007]. Такая терапия первоначально эффективна и приводит к ремиссии болезни. Однако возобновление опухолей происходит в среднем в 2-3 года, причем передача сигналов восстанавливается некстати [Feldman and Feldman, 2001]. В настоящее время описано мало терапевтических режимов для эффективного лечения ремиссии раков простаты и это считается некурабельной стадией болезни. Учитывая зависимость клеток рака простаты от оси передачи андрогенов, предприняты массивные усилия для выявления механизма(ов), с помощью которого андрогены индуцируют пролиферацию и жизнеспособность клеток рака простаты.
Androgen receptor regulation in prostate cancer
Андрогены осуществляют свои эффекты посредством androgen receptor (AR), члена сверхсемейства ядерных рецепторов, который действуют как лиганд зависимый транскрипционный фактор [Evans, 1988; Mangelsdorf et al., 1995; Shand and Gelmann, 2006; Trapman and Brinkmann, 1996]. Testosterone является наиболее обильным андрогеном в сыворотке, но в эпителии простаты он превращается в более мощный андроген, dihydrotestosterone (DHT) благодаря действию резидентного энзима, 5?-reductase [Russell and Wilson, 1994; Wilson, 1996]. До связывания с лигандом AR остается неактивным благодаря ассоциации с хитшоковыми белками и это предохраняет его от связывания с ДНК. Связывание лиганда высвобождает ингибирующие хитшоковые белки и рецепторы быстро транслоцируются в ядро, где они соединяются с ДНК в качестве гомодимеров на androgen responsive elements (AREs) внутри регуляторных областей генов мишеней [Gelmann, 2002; Marivoet et al., 1992; Trapman and Brinkmann, 1996]. Более того, рекрутирование коактиваторов (которые содержат или рекрутируют histone acetylases) и хроматин ремоделирующих комплексов облегчает инициацию транскрипции и гарантирует AR-зависимую экспрессию генов [Gnanapragasam et al., 2000; Heinlein and Chang, 2002; Heinlein and Chang, 2004]. Способность AR в дальнейшем индуцировать программу генной экспрессии, которая способствует ходу клеточного цикла, четко зависит от клеточного контекста. Напр., во время развития и гомеостаза становится ясно, что стромальные AR играют главную роль в стимулировании пролиферации эпителиальных клеток; напротив, предполагается, что механизм переключения возникает во время туморогенеза, чтобы наделить пролиферативную функцию AR клеточной автономностью клеток рака простаты. Специфические комбинации кофакторов, рекрутируемых на AREs, скорее всего и обеспечивают механизм ткане-специфической и лиганд-специфической экспрессии генов. Благодаря этим действиям, по-видимому, AR способствуют выживанию рака простаты и пролиферации клеток рака простаты [Balk, 2002; Feldman and Feldman, 2001].
В то время как субнаборы генов мишеней для AR, которые лежат в основе каждого клеточного исхода, теперь четко определены, то открытие, по крайней мере, одного основного AR-зависимого гена мишени, prostate specific antigen (PSA) [Riegman et al., 1991], оказало большое влияние на ведение болезни. В частности, сывороточный PSA отслеживается клинически, чтобы выявить ранние стадии болезни, отслеживать тяжесть болезни, отслеживать эффективность терапевтического вмешательства и определять появление повторной опухоли после лечения [Nash and Melezinek, 2000; Ryan et al., 2006]. Поэтому индикаторы AR активности являются критическими для оценки течения болезни и эффективности терапии. Кроме того, недавно было установлено, что хромосомные транслокации происходят с достоверной частотой при раке простаты, это запускает потенциально про-пролиферативные ETS гены (ERG, ETV1 или ETV4) под контролем AR-индуцированного TMPRSS2 promoter/enhancer [Demichelis et al., 2007; Tomlins et al., 2005; Wang et al., 2007]. Однако последующие функциональные исследования показали, что TMPRSS2-ETS слияния могут принципиально осуществлять свои эффекты путем альтераций фенотипов опухолей, иных чем клеточная пролиферация. Напр., избыточная экспрессия ETV1 в нормальном или трансформированном эпителии простаты не влияет на скорость клеточной пролиферации или ход клеточного цикла, а облегчает инвазию этих моделей [Tomlins et al., 2007]. Т.о., вклад этих слияний в альтерации контроля клеточного цикла д. быть решен. Наконец, возможно, что не геномная передача сигналов AR может влиять на пролиферативную программу. Известно, что стимуляция андрогеном в AR-позитивных клетках может запускать быструю активацию MAPK пути и тем самым потенциально индуцировать митогенную реакцию. В согласии с этой идеей то, что быстрая передача сигналов androgen недавно была идентифицирована как главный стимул для мейотической прогрессии в ооцитах Xenopusи это было также увязано с пролиферацией мышечных клеток [White et al., 2005; Yoshioka et al., 2006]. Т.о., т.к. механизмы, подкрепляющие способность AR индуцировать митогенную программу, могут быть разнообразны и зависеть от клеточного контекста, то становится ясным, что лиганд-зависимая активация AR является ограничивающим фактором вовлечения аппарата клеточного цикла в клетках рака простаты.
Учитывая эти функции, ингибирование активности AR является основной терапевтической целью для ведения метастатической болезни, что достигается множественными механизмами [Balk, 2002; Feldman and Feldman, 2001; Leewansangtong and Soontrapa, 1999; Taplin and Balk, 2004]. Лечение первой линии - устранение функции AR посредством деплеции лиганда, что достигается за счет или двухсторонней орхидэктомии или использования GnRH агонистов. Вспомогательная или вторая линия терапии связана с использованием прямых AR антагонистов (напр., bicalutamide) который использует, по крайней мере, два механизма действия [Chodak, 2005; Klotz, 2006] . Во-первых, эти агенты конкурируют за связывание DHT. Во-вторых, отобранные AR антагонисты запускают рекрутирование транскрипционных корепрессоров (напр., NCoR) на AREs, тем самым способствуют активной репрессии экспрессии генов мишеней для AR [Shang et al., 2002]. На клеточном уровне устранение андрогена индуцирует клеточную гибель или остановку клеточного цикла, это поддерживает регрессию опухоли [Agus et al., 1999; Denmeade et al., 1996; Huggins and Hodges, 1972; Isaacs, 1984; Knudsen et al., 1998; Kyprianou and Isaacs, 1988]. Эффективное ингибирование AR также обнаруживается при потере обнаружимых PSA в сыворотке. Однако эта ремиссия временная и опухоль почти всегда возобновляется [Balk, 2002; Feldman and Feldman, 2001; Leewansangtong and Soontrapa, 1999]. Повторному появлению обычно предшествует увеличение PSA (также наз. "biochemical recurrence") [Feldman and Feldman, 2001; Klotz, 2000; Trapman and Brinkmann, 1996], и это наблюдение предоставляет некоторые из первых доказательств того, что прогрессия опухоли ассоциирует с нецелесообразным восстановлением функции AR, несмотря на существенное устранение и/или использование AR антагонистов. Реактивация AR в рецидивирующих опухолях происходит благодаря множественным механизмам, включая амплификацию AR, мутации AR, лиганд-независимую активацию AR, гиперчувствительность к низким уровням внешнесредовых лигандов, усилению локальной продукции андрогенов, избыточной продукции AR коактиваторов и/или как результат передачи сигналов. которые разрушают функцию AR корепрессора [Chmelar et al., 2007; Feldman and Feldman, 2001; Stanbrough et al., 2006]. В самом деле, сегодня хорошо известно, что такой "androgen independent" рак простаты остается зависимым исключительно от функции AR [Chen et al., 2004; Cheng et al., 2006; Yuan et al., 2006]. Т.к. AR, по-видимому, является ключевым детерминантом роста и прогрессирования рака простаты, то важно выяснить механизмы, с помощью которых AR управляет клеточной пролиферацией клеток рака простаты.
Mitogenic signaling and the cell cycle machinery: an overview
Переходы в и внутри митотического клеточного цикла диктуются с помощью скоординированной активации комплексов cyclin-dependent kinase (CDK)/cyclin, причем связывание cyclin индуцирует каталитическую активность киназы [Lee and Sicinski, 2006; Malumbres and Barbacid, 2007; Sherr, 1996; Sherr and Roberts, 2004]. пути митогенной передачи сигналов в целом индуцируют ход клеточного цикла с помощью упорядоченной активации CDK-cyclin комплексов, тогда как анти-митогенные сигналы, которые обусловливаются внеклеточными событиями (напр., истощением питательных веществ) или внутриклеточными инсультами (напр., повреждениями ДНК) обычно служат для ослабления функции CDK. Хотя сигналы, которые диктуют детерминацию клеточного цикла часто специфичны для типа клеток, основной аппарат, который управляет двигателем клеточного цикла, также законсервирован. До митогенной стимуляции клетки могут выходить из клеточного цикла и вступать в стадию покоя "G0". На этой стадии вызываются несколько ключевых стражников (gatekeepers) переходов клеточного цикла, чтобы предупредить нежелательный ход клеточного цикла. Важнейшим среди них является активация retinoblastoma tumor suppressor protein (RB), который собирает транскрипционные репрессорные комплексы на промоторах генов мишеней, которые необходимы для инициации репликации ДНК (напр., cyclin A, PCNA) [Knudsen and Knudsen, 2006]. Многие из таких критических генов мишеней для RB выбираются первыми для активации с помощью расположения активаторных E2F/DP1 комплексов на промоторных регионах, но транскрипционные репрессорные комплексы, рекрутируемые с помощью RB (которые включают histone deacetylases, SWI/SNF комплексы ремоделирующие хроматин и/или белки группы Polycomb), действуют как мощные ингибиторы активации транскрипции [Johnson and Degregori, 2006]. Т.о., митогенные стимулы могут действовать, чтобы сбалансировать функцию RB и делают это посредством активации CDK-cyclin комплексов.
Митогенные стимулы обычно запускают накопление D-type cyclins (cyclins D1, D2 и/или D3), которые могут соединяться и активировать ранние G1 киназы CDK4 или CDK6 [Lee and Sicinski, 2006; Sherr and Roberts, 2004]. Продукция D-cyclin является тонко регулируемым процессом, который наиболее активно исследовался для cyclin D1 [Alao, 2007; Gladden and Diehl, 2005; Knudsen, 2006]. Транскрипция cyclin D1 контролируется на уровне продукции, стабильности, сплайсинга и трансляции мРНК. После продукции действие cyclin D1 находится под дальнейшей регуляцией на уровне субклеточной локализации, целенаправленной деградации и связывания CDK4/6 [Alt et al., 2000; Gladden et al., 2006]. Этот последний процесс, по-видимому, использует p21Cip1, который первоначально был классифицирован как ингибитор CDK. Эта классификация может быть через чур упрощенной, поскольку p21Cip1 может ингибировать CDK2 комплексы, p21Cip1 напротив важен для обеспечения образования, активации и обогащения ядер CDK4/6-cyclin D комплексами [Alt et al., 2002; Cheng et al., 1999; LaBaer et al., 1997; Sherr and Roberts, 1999]. Став активными, CDK4/6-cyclin D комплексы инициируют фосфорилирование RB. Концепция, что это является главной функцией в клеточном цикле для CDK4/6, подтверждается наблюдением, что RB-дефицитные опухолевые клетки устойчивы к аресту клеточного цикла, индуцируемого с помощью ингибирования киназ [Lukas et al., 1995]. Потеря RB при раке предполагается, чтобы обходить потребность в этом раннем событии в ходе клеточного цикла.
Хотя RB фосфорилирование/активирование инициируется с помощью CDK4/6, это лишь частично компроментирует транскрипционную репрессорную функцию RB [Knudsen and Knudsen, 2006]. Вслед за этим событием нижестоящая киназа, (CDK2) становится ответственной за завершение фосфорилирования RB и тем самым за погашение его репрессорной функции. Важным реквизитом циклинов, ассоциированных с CDK2, cyclins E and A, то, что они сами себя регулируют посредством RB-обеспечиваемой репрессии транскрипции. Т.о., CDK2-cyclin комплексы представляют собой механизм упреждающего сигнала (feed-forward mechanism), чтобы стимулировать ход клеточного цикла посредством модуляции RB. Кроме того, cyclin E- и cyclin A-собранные комплексы сталкиваются с дополнительными субстратами, которые способствуют активации аппарата репликации ДНК, удвоению центросом и экспрессии гистоновых генов. Недавние находки продемонстрировали, что эти активности ассоциированы как с каталитической (CDK2 kinase dependent), так и не каталитическими функциями [Geng et al., 2007; Lee and Sicinski, 2006]. Далее прохождение через оставшуюся часть клеточного цикла (G2 и M фазу) управляется с помощью упорядоченной активации CDK1-cyclin A и CDK1-cyclin B комплексов [Shapiro, 2006]. Продукция cyclin B постоянно увеличивается в G2; до тех пор, пока не достигнет порогового уровня, вступление с митоз наступает в зависимости от этой киназы. Активность CDK1-cyclin B продолжает увеличиваться в ходе всего раннего митоза вплоть до анафазы, затем быстрая деградация cyclin B (и следовательно, потеря активности CDK1) запускает выход из митоза и завершение клеточного цикла [Pines, 2006; Shapiro, 2006].
Чтобы уравновесить эту сложную скоординированную активацию CDK-cyclin, существуют механизмы удерживающие клеточный цикл в присутствии клеточного инсульта. RB обычно остается гиперфосфорилированным/инактивированным вплоть до выхода из митоза, когда "тормозящее" действие опухолевого супрессора RB восстанавливается с помощью активности phosphatase. Однако множественные анти-пролиферативные сигналы приводят к дефосфорилированию/активированию RB, индуцируя тем самым RB-зависимое прекращение хода клеточного цикла. Напр., сигналы от поврежденных ДНК, которые индуцируют p53-обусловленную индукцию p21Cip1 до высоких уровней, могут вызывать подавление активности CDK2 и тем самым предупреждать фосфорилирование RB [Sherr and Roberts, 2004]. Альтернативно, родственный CDK2 ингибитор p27Kip1 часто индуцируется сигналами, такими как депривация сыворотки, т.о., действует посредством сходных путей, чтобы остановить ход клеточного цикла [Nickeleit et al., 2007]. Из этих наблюдений с очевидностью вытекает, что аппарат G1-S клеточного цикла играет критическую роль в реакции на внутри - и внеклеточные условия. Т.к. эти генеральные принципы консервативны в большинстве типов клеток, то становится очевидным, что разные митогенные сигналы используют несопоставимые механизмы, чтобы запустить аппарат клеточного цикла.
AR governs the cyclin D-RB axis in prostate cancer cells
Анализ AR-зависимого хода клеточного цикла в раковых клетках простаты показал, что androgen является критическим регулятором перехода G1-S (Figure 1). Простатические раковые клетки, лишенные androgen, останавливаются в ранней G1 фазе, одновременно с потерей экспрессии cyclin D1 и cyclin D3 expression, ослаблением активности CDK4 (экспрессия не изменена), и гипофосфорилированием/активированием retinoblastoma tumor suppressor [Knudsen et al., 1998; Xu et al., 2006]. Недавние исследования показали, что androgen индуцирует экспрессию D-type cyclin посредством mTOR-зависимого усиления трансляции [Xu et al., 2006]. Способность андрогена модулировать трансляцию cyclin D отличается от механизмов, используемых др. гормонами. Напр., эстрогеном индуцированная транскрипция cyclin D1 в клетках рака груди благодаря способности соотв. его рецептора (estrogen receptor, ER), чтобы непосредственно модулировать регуляторные области cyclin D1 [Eeckhoute et al., 2006; Sabbah et al., 1999]. Т.о., регуляция андрогеном ранних G1 событий является специфической для гормонов этого класса.
В противовес D-type cyclins, уровни cyclin E levels остаются относительно неизменными при удалении андрогена, указывая тем самым, что альтерации экспрессии cyclin E не являются основным механизмом действия андрогена [Knudsen et al., 1998; Xu et al., 2006]. Однако уровни cyclin A и общей активности CDK2 уменьшаются после устранения androgen. Эти данные согласуются с наблюдением, что деплеция андрогена вызывает активность RB, т.к. cyclin A является хорошо известной моделью RB-обусловленной репрессии транскрипции. Более того, деплеция андрогена индуцирует p27Kip1, который скорее всего вносит вклад в наблюдаемое снижение активности CDK2 [Knudsen et al., 1998]. Это предположение согласуется с сравнительно недавними находками, которые продемонстрировали, что низкая экспрессия p27Kip1 предсказуема для более короткого периода времени возобновления болезни рака простаты [Halvorsen et al., 2003]. Сходным образом, потеря p27Kip1 в контексте PTEN мутации способствует туморогенному фенотипу в простате [Gao et al., 2004]. Интересно, что после ре-стимулирования андрогеном, p27Kip1 деградирует [Ye et al., 1999]. Напротив, экспрессия p21Cip1 теряется после устранения андрогена мз клеток рака простаты in vitro, это коррелирует с более высоким пролиферативным индексом в экземплярах опухолей человека [Knudsen et al., 1998; Kolar et al., 2000]. Т. о., p21Cip1 коррелирует со стимуляцией андрогеном и митогенной пролиферацией в раке простаты. Удивительно, что p21Cip1 рассматривался как прямой ген мишень для AR [Lu et al., 1999], а его индукция после стимуляции андрогеном может ассистировать сборке активных CDK4/cyclin D1 комплексов. В согласии с этим проверка p21Cip1 в раке простаты выявила, что экспрессия усиливается в опухолях и коррелирует с высоким пролиферативным индексом и Gleason grade [Aaltomaa et al., 1999; Baretton et al., 1999].
Кстати, эти наблюдения достигают кульминации в модели, где андроген индуцирует накопление cyclin D1 посредством mTOR, способствует сборке активного CDK4/cyclin D1 (потенциально посредством индукции p21Cip1), и облегчает активацию CDK2 посредством деградации p27Kip1. Эти коллективные события приводят к фосфорилированию RB, дерепрессии экспрессии cyclin A и прогрессии S-фазы. Базируясь на этом знании функции AR, можно предположить, что аберрации в оси cyclin D-RB при раке могут устранять потребность в андрогене и вносить вклад в прогрессирование болезни. исследования, оспаривающие эту гипотезу, выявили важную функцию для RB в контроле реакции на терапию устранением андрогена и уникальные перекрывающиеся механизмы между AR и путями клеточного цикла, которые ассистируют в координации и/или поддержании андроген-зависимой клеточной пролиферации.
RB function in prostate cancer and the response to AR-directed therapeutics
Как обсуждалось выше, CDK-обусловленное фосфорилирование/инактивирование RB является ключевым компонентом реакции на AR. Эти находки указывают на то, что потеря RB может играть важную роль в развитии рака простаты и/или реакции на AR-направленную терапию. В согласии с этой концепцией, RB теряется или инактивируется приблизительно в 30-60% adenocarcinomas простаты за счет несопоставимых механизмов [Brooks et al., 1995; Ittmann and Wieczorek, 1996; Jarrard et al., 2002; Tricoli et al., 1996]. Соотв. были разработаны некоторые модельные системы для более прямой проверки важности функции RB в этой ткани. Трансгенные мышиные модели, где RB и p53 инактивированы с помощью избыточной экспрессии SV40 крупного T- и малого T-антигена в эпителии просвета, обнаруживали высокую степень PIN и/или рака простаты (часто с нейроэндокринным фенотипом) и могут достигать независимости от андрогена после кастрации [Gingrich et al., 1997; Greenberg et al., 1995]. Исследования тканевых рекомбинаций показали, что RB-дефицитный эпителий простаты вызывает гиперпластическую болезнь в 40% трансплантированных примеров, если рекомбинировался с дикого типа урогенитальной мезенхимой крыс [Wang et al., 2000]. Сходным образом условные делеции RB в простате приводили к фокальной гиперплазии, которая в принципе напоминала раннюю стадию болезни [Maddison et al., 2004b]. Эти эффекты усиливались с помощью комбинаторной делеции p53, которая приводила к быстро прогрессирующим метастатическим карциномам простаты [Zhou et al., 2006]. Итак, эти данные показывают, что инактивация RB может инициировать клетки простаты становиться канцерогенными, если они становятся предметом для др. вредных воздействий.
В дополнение к этим наблюдениям появились доказательства, подтверждающие, что инактивация RB может также ниспровергать или ослаблять потребность в AR-обусловленной прогрессии клеточного цикла. Одно исследование показало, что экспрессия мРНК RB низкая у 36% пациентов, у которых не удалась комбинированная блокада андрогена [Mack et al., 1998]. Более того, с помощью FISH анализа было установлено, что потеря RB почти в 4 раза более часта после гормональной терапии [Kaltz-Wittmer et al., 2000]. Т.к. эти данные показывают , что инактивация RB и/или делеция могут облегчать переход к независимости от андрогена, недавнее исследование оспаривает эту гипотезу
in vitro, посредством shRNA-обусловленной деплеции RB в AR-зависимых клетках рака простаты [Sharma et al., 2007]. В этих моделях деплеция RB не обеспечивает пролиферативных преимуществ в присутствии андрогена; скорее RB-дефицитные клетки неспособны вызывать цитостатическую реакцию (в сравнении с RB-позитивным изогенным контролем), когда сталкиваются с устранением андрогена, AR антагонистами или комбинированной блокадой андрогена. Однако пока не рассматривалось, может ли потеря RB или дерегуляция G1-S смягчать потребность в не связанных с лигандом AR. Однако исследования, проверяющие влияние потери RB будут расширены, чтобы определить влияние потери RB на реакцию на химотерапевтические вмешательства второй линии, как это описывалось для др. клеточных систем, показавших, что потеря RB-зависимых checkpoints повреждений ДНК может сенсибилизировать клетки к цитотоксическим агентам [Harrington et al., 1998; Knudsen et al., 1998]. В самом деле, RB-итощенные клетки рака простаты демонстрируют повышенную чувствительность к клеточной гибели, индуцированной с помощью отобранного субнабора химотерапевтических агентов. В целом эти данные показывают, что статус RB может быть важным детерминантом реакции AR-направленных терапевтических стратегий против рака простаты и что способность AR контролировать переход G1-S является. скорее всего, критическим компонентом для поддержания зависимости от андрогенов. Т.к. эти исследования подчеркивают важность AR в управлении аппаратом клеточного цикла, то становится очевидным, что существенная взаимосвязь между AR и путями клеточного цикла может вносить вклад в этот процесс.
Cell cycle regulation of AR
Лишь небольшое количество исследований изучало непосредственно влияние клеточного цикла на активность AR. Несмотря на это найдены многие белки, которые взаимодействуют или модулируют AR и также регулируются во время клеточного цикла. Сюда входят белки, чья экспрессия или активность повышены в G0 (RB), G1 - S фазе (cyclin D1, cyclin E, Cdk6), или G2 (Cdk1). Следовательно, вполне возможно, что активность AR модулируется во время клеточного цикла посредством взаимодействий с одним или более из этих белков. Более того, AR может быть далее модулирован непосредственно во время клеточного цикла с помощью транскрипционных и посттранскрипционных механизмов, последние включают альтерации в фосфорилировании, ацетилировании и убиквитилировании, которые затрагивают активность или стабильность транскрипции.
Retinoblastoma protein (RB)
непосредственные взаимодействия между AR и RB описаны двумя группами, базируясь на GST-RB и двугибридных белковых взаимодействиях у млекопитающих [Lu and Danielsen, 1998; Yeh et al., 1998]. Место взаимодействия на AR было картировано в AR в N-терминальном домене. Избыточная экспрессия RB усиливает транскрипционную активность AR, тогда как транскрипционная активность AR терялась в клетках, которые были RB-негативными, и снижалась в клетках, которые экспрессировали RB-связывающие онкогены. Интересно, что RB был также описан, как взаимодействующий с GR, а избыточная экспрессия RB могла одновременно усиливать транскрипционную активность GR [Singh et al., 1995]. Однако в противоположность AR, GR оставался транскрипционно активным в RB дефицитных клетках [Lu and Danielsen, 1998]. Знаменательно, что коактивация GR с помощью RB зависит от Brm, с RB и Brm, формирующими комплекс и оба они необходимы для коактивации GR [Singh et al., 1995]. Неясно, может ли сходный механизм обеспечивать RB коактивацию AR.
Как было установлено, AR также непосредственно взаимодействует с RB-ассоциированным белком, retinoblastoma-associated Kruppel protein (RbaK) [Hofman et al., 2003]. RbaK содержит Kruppel-associated box (KRAB) репрессорный мотив на своем N-конце, в сочетании с множественными Kruppel типа доменами zinc finger, и вносит вклад в RB-зависимую регуляцию E2F транскрипционных факторов. RbaK взаимодействует непосредственно с RB и, по-видимому, взаимодействует независимо с AR LBD, базируясь на экспериментах mammalian-two hybrid и по коиммунопреципитации, при этом взаимодействие андроген-независимо. Хотя RbaK содержит KRAB репрессорный мотив избыточная экспрессия усиливает транскрипционную активность AR за счет неизвестных механизмов. Необходимы дальнейшие исследования для установления в точности, как RB и RbaK модулируют активность AR и для установления биологического значения этих взаимодействий для активности AR , особенно для RB негативного PCa [Sharma et al., 2007].
D-cyclins
Хотя андроген стимулирует накопление cyclin D1 и одновременно активацию CDK4 [Knudsen et al., 1998; Xu et al., 2006], восстановление экспрессии cyclin D1 в условиях устранения андрогена недостаточно, чтобы управлять андроген-независимой пролиферацией [Fribourg et al., 2000]. Более того, наблюдалось, что скромные подъемы cyclin D1 в присутствии androgen ингибируют (скорее, чем усиливают) клеточную пролиферацию [Burd et al., 2005; Petre-Draviam et al., 2003]. Эта неожиданная способность cyclin D1 ослаблять прогрессию клеточного цикла является специфической для AR-позитивных клеток рака простаты, указывая тем самым на предполагаемые взаимоотношения между функцией cyclin D1 и AR. Детальная проверка этого взаимодействия выявила неожиданную и уникальную роль cyclin D1 в контроле активности AR.
Помимо его способности модулировать активность CDK4 киназы растут доказательства, демонстрирующие, что cyclin D1 обладает CDK-независимыми функциями в контроле действия транскрипционных факторов [Coqueret, 2002]. Cyclin D1 может непосредственно взаимодействовать с и модулировать большое количество транскрипционных факторов, включая v-Myb, DMP1, Sp-1 и MyoD. Была продемонстрирована уместность cyclin D1-обеспечиваемой регуляции транскрипции, при этом было показано, что способность cyclin D1 взаимодействовать с и модулировать CCAAT/enhancer связывающий белок (и репрессировать большой субнабор генов) имеет важные последствия в опухолях человека [Lamb et al., 2003]. Кроме того, недавно было показано, что "kinase independent" функции cyclin D1 лежат в основе развития молочных желез, при котором in vivo knock-in мутанты cyclin D1, которые неспособны активировать CDK4, ммогут эффективно обращать фенотип молочных желез, наблюдаемый у cyclin D1-/- мышей [Landis et al., 2006]. Т.о., CDK4-независимые функции cyclin D1, по-видимому, служат критическим клеточным функциям.
Самый крупный класс транскрипционных факторов, модулируемых с помощью cyclin D, принадлежит сверхсемейству ядерных рецепторов, включая ER (estrogen receptor ?), TR (thyroid hormone receptor), PPAR? and AR [Coqueret, 2002; Ewen and Lamb, 2004]. В случае AR, cyclin D1 соединяется непосредственно с N-концом рецептора и блокирует конформационные изменения, которые необходимы для максимальной активности AR после активации лигандом (N-C взаимодействие) [Burd et al., 2005; Petre-Draviam et al., 2005]. Более того, cyclin D1 ассоциирует с histone deacetylase 3 (HDAC3) и с рекрутированием HDAC активности, важных для функции этого корепрессора [Lin et al., 2002; Petre-Draviam et al., 2005]. Эти действия cyclin D1 не зависят от CDK активности, а репрессорный домен в белке (кодируемый аминокислотами 142-253), как было установлено, способен поддерживать cyclin D1 корепрессорную функцию [Petre-Draviam et al., 2005]. Биологические следствия обнаруживались даже при скромной индукции уровней cyclin D1 (при стоихометрических уровнях с рецептором) и оказывались достаточными, чтобы супрессировать как активность AR так и androgen-зависимую пролиферацию в клетках AR-позитивного рака простаты [Petre-Draviam et al., 2003]. Как и ожидалось, AR-негативные клетки рака простаты противостоят репрессороной функции cyclin D1 [Burd et al., 2006]. эти данные согласуются с наблюдениями, что AR активность высоко регулируется в зависимости от клеточного цикла, при этом уровни cyclin D1 обратным образом коррелируют с AR активностью [Martinez and Danielsen, 2002]. Более того, в мышиной модели рака простаты уровни cyclin D1 снижаются как функция от прогрессирования, тогда как уровни cyclin E повышаются; эти наблюдения ведут к гипотезе предполагаемого "cyclin switch", который может происходить при прогрессировании рака простаты [Maddison et al., 2004a] , хотя эта концепция не была оценена в отношении человека. Предполагается, что cyclin D1 служит в качестве "negative feedback switch", чтобы модулировать зависимую от андрогена генную экспрессию и одновременно клеточную пролиферацию. управляя тем самым силой и продолжительностью реакции на андроген. Недавний анализ показал, эти "balancing" функции cyclin D1 нарушены при раке простаты [Burd et al., 2006; Comstock et al., 2007; Knudsen, 2006]. В контексте нормального простатического эпителия роль AR заключается в супрессии клеточной пролиферации и управлении дифференцировкой. Возможно, что cyclin D1 может быть важным для супрессии этих функций, чтобы сделать возможным вступление в клеточный цикл.
Cdk6
В одном исследовании было найдено, что AR может коактивироваться с помощью трансфекции Cdk6 [Lim et al., 2005]. Важно, что эта коактивация не была обусловлена секвестрированием cyclin D1, как это наблюдалось в cyclin D1-дефицитных NIH3T3 клетках. Более того, коактивация не предупреждалась мутациями в Cdk6, которые предупреждали связывание cyclin D1, или точковыми мутациями, которые предупреждали связывание p16INK4a или ингибировали каталитическую активность. Cdk6 связывает AR, исходя из коиммунопреципитации трансфицированных AR и Cdk6, и это взаимодействие сходным образом не блокируется упомянутыми выше мутациями, которые предупреждают связывание cyclin D1 и p16INK4a, или каталитическую активность. Стабильная трансфекция Cdk6 в LNCaP клетки может усиливать андрогеном стимулируемый рост и экспрессию регулируемого гена
PSA. Наконец, ChIP эксперименты показали, что Cdk6 является частью AR транскрипционного комплекса. который собирается на гене
PSA. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить молекулярные основы для этой независимой от киназы коактивации AR с помощью Cdk6. Интересно, что экспрессия
Cdk6 в клетках чувствительного к андрогену рака простаты возрастает в ответ на андроген, как только клетка переходит от G1 к S фазе, это может предоставлять позитивную петлю обратной связи для дальнейшего усиления активности AR [Bai et al., 2005].
Cyclin E
Исследования по котрансфекции, проведенные с AR, ARE-CAT репортером и cyclin D1, E, и A, показали, что cyclin E может специфически усиливать стимулируемую андрогеном транскрипционную активность [Yamamoto et al., 2000]. Эта коактивация не зависит от связывания cyclin E с Cdk2, не зависит от хода клеточного цикла и не наблюдается для GR или PR. Трансфекция Cyclin E в клетки LNCaP сходным образом усиливает экспрессию эндогенного гена
PSA. Взаимодействие между AR и cyclin E было продемонстрировано с помощью метода двугибридного взаимодействия белков у млекопитающих и с помощью коиммунопреципитации трансфицируемых белков. Взаимодействие было картировано в N-терминальном домене AR, а GST pulldowns показало, что cyclin E взаимодействует с доменом на C-терминальном конце AR N-терминального домена (аминокислоты 419-556). необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, как cyclin E обеспечивает коактивацию AR и может ли это взаимодействие вносить вклад в развитие или прогрессирование PCa.
CDK-activating kinase (CAK)/Cdk7
CDK-activating kinase (CAK), состоит из Cdk7, cyclin H и MAT1, обеспечивает фосфорилирование Cdk2 и Cdk1, которое необходимо для полной активации и прогрессии клеточного цикла. CAK является также компонентом аппарата транскрипции и может обеспечивать фосфорилирование ER и RAR [Rochette-Egly et al., 1997; Trowbridge et al., 1997]. Immunoblotting анти-AR иммунопреципитатов идентифицировал комплекс TFIIH транскрипционного фактора, который содержит CAK, а дальнейшие эксперименты показали взаимодействие между AR и CAK [Lee et al., 2000]. Трансфекция индивидуальных CAK белков может в слабой степени усиливать транскрипционную активность AR , но наблюдается значительная коактивация, если трансфицированы все три компонента. Эксперименты по копреципитации
in vitro с
35S-меченными CAK белками показали. что Cdk7 и cyclin H могут взаимодействовать с AR N-терминальным доменом. Эти исследования подтвердили заключение, что TFIIH, как генеральный транскрипционный фактор, взаимодействует с AR. Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, может ли CAK фосфорилировать AR или избирательно усиливать его активность и может ли это непосредственно модулировать AR во время клеточного цикла.
Cdc25B
Cdc25 фосфатазы с двойной функцией (Cdc25A, B и C) обеспечивают активацию Cdk1 за счет удаления ингибирующих фосфатаз с Thr-14 и Tyr-15. Точная функция каждой из изоформ Cdc25 пока неясна, но недавние данные показали, что Cdc25B специфически дефосфорилирует и активирует комплексы cyclin B-Cdk1 на центросомах [Lindqvist et al., 2005]. Важно, что Cdc25B была также идентифицирована как коактиватор стероидных рецепторов, который может усиливать активность ER, PR, GR и AR [Ma et al., 2001; Ngan et al., 2003]. Cdc25B может взаимодействовать непосредственно с этими стероидными рецепторами и стимулировать их активность в бесклеточной транскрипционной системе. Неожиданно эта стимуляция не зависела от фосфатазной активности Cdc25B и её молекулярная основа остаётся неясной. Интересно, что как Cdc25B, так и Cdc25C увеличиваются в очень высокой степени в раке простаты, при этом Cdc25C и новый активированный сплайс-вариант ещё больше возрастали при PCa, который давал рецидив после терапии за счет удаления андрогена [Ngan et al., 2003; Ozen and Ittmann, 2005]. Взаимодействие с AR указывает на то, что Cdc25B может вносить вклад в прогрессирование PCa как благодаря эффектам на активацию AR, так и на клеточный цикл.
Cdk1
Cdk1 активируется в G2 фазе клеточного цикла и является критической Cdk, необходимой для митозов. Cdk1 ассоциирует с cyclin B и затем активируется за счет удаления ингибирующих phosphates (посредством Cdc25 изоформ) и за счет активации фосфорилирования T петли посредством Cdk7. Несвязанный с лигандом AR фосфорилируется в первую очередь по одному serine-proline сайту в N-терминальном домене (Ser-94), и фосфорилируется по множественным дополнительным сайтам Ser-Pro в ответ на андроген [Gioeli et al., 2002; Kuiper and Brinkmann, 1995; Zhou et al., 1995]. Существуют сайты кандидаты для Cdk1 и др. нацеленных на proline киназ, и исследования с использованием трансфекции Cdk1 и ингибиторов Cdk, показали, что Cdk1 фосфорилирует, по крайней мере, сайт на AR N-конце (Ser-81) [Chen et al., 2006]. Важно. что трансфекция клеток активированной Cdk1 усиливает стабильность и транскрипционную активность AR. Напротив, ингибиторы Cdk1 снижают экспрессию AR и транскрипционную активность, хотя эти соединения не являются высоко специфичными для Cdk1 и могут также влиять на AR путем поставки др. Cdks, таких как Cdk7 [Chen et al., 2006]. Хотя Cdk1 фосфорилирует AR, сайт-направленный мутагенез по Ser-81 и дополнительным Ser-Pro не блокировал способность Cdk1 стабилизировать AR, указывая тем самым, что множественные сайты могут обеспечивать этот эффект или что Cdk1 стабилизирует AR за счет косвенного механизма.
Интересно, что анализ клинических примеров PCa от пациентов, у которых вновь возобновлялся рост после терапии устранением андрогенов, показал, что cyclin B1, cyclin B2 и Cdk1 были наиболее высоко избыточно экспрессируемыми регуляторными генами клеточного цикла по сравнению с первичными не леченными опухолями [Stanbrough et al., 2006]. Как отмечалось выше и Cdc25B и Cdc25C также увеличивались в значительной степени в раке простаты и в рецидивах опухолей после терапии удалением андрогена [Ngan et al., 2003; Ozen and Ittmann, 2005]. Экспрессия cyclin B также увеличивалась с прогрессированием болезни в мышиной TRAMP модели рака простаты [Maddison et al., 2004a]. Всё это указывает на то, что Cdk1 может вносить вклад в активацию AR в прогрессирующих раках. В подтверждение этой гипотезы активация AR, обусловленная низкими уровнями DHT в C4-2 клетках (сублиния клеток LNCaP , которые гиперчувствительны к низким уровням андрогена), может быть блокирована обработкой ингибитора Cdk [Chen et al., 2006].
Direct assessment of transcriptional AR activity during the cell cycle
В одном исследовании была изучена модуляция транскрипционной активности AR во время клеточного цикла [Martinez and Danielsen, 2002]. В этом исследовании изучалась AR транскрипционная активность в L929 клетках (которые экспрессируют эндогенные AR), используя ARE регулируемые репортерные гены (MMTV-CAT и probasin-CAT). Было установлено, что транскрипционная активность AR (но не активность GR) была заметно снижена при переходе G1/S и снова восстанавливалась во время S-фазы. Уровень AR белка также снижался при переходе G1/S, но это снижение было не столь заметным как потеря транскрипционной активности. Возможным механизмом снижения экспрессии AR во время G1/S является увеличение E2F1, который, как было установлено, супрессирует экспрессию гена AR посредством связывания промотора AR [Davis et al., 2006].
Важно, что HDAC ингибитор (TSA) может частично восстанавливать транскрипционную активность AR при переходе G1/S без увеличения уровней белка AR. Одной из интерпретаций является то, что рекрутирование с помощью AR коактиваторного белка с HAT активностью становится ограничивающим при переходе G1/S , приводя в результате к снижению ацетилирования гистона или AR acetylation. Однако, поскольку ацетилирование гистонов может усиливать транскрипцию, то роль ацетилирования AR в регуляции активности AR неясна [Popov et al., 2007]. Более того, недавно было показано, что HDAC ингибиторы снижают экспрессию AR путем ингибирования Hsp90, который д. деацетилироваться с помощью HDAC6 для своей активности [Kovacs et al., 2005]. В любом случае множественные функции HDACs затрудняют выяснение их ролей в регуляции активности AR во время клеточного цикла.
Одним из возможных медиаторов этой потери транскрипционной активности AR при переходе G1/S является безусловно cyclin D1, уровень которого увеличивается во время перехода от G1 к S и который может действовать как мощный AR корепрессор (see above). Вторым возможным медиатором является RB, который может функционировать как AR коактиватор, так что гиперфосфорилирование RB при G1/S может снижать активность AR. Cyclin E также может действовать как коактиватор AR а его увеличение экспрессии при вступлении клеток в S-фазу может вносить вклад в реактивацию AR.
Cell cycle regulation of AR protein expression
Экспрессия AR белка во время клеточного цикла была исследована в одой работе, где была использована двухцветная жидкостная цитометрия, чтобы оценить экспрессию AR в противовес связыванию краски Hoechst [Litvinov et al., 2006]. Важно, что связывание краски Hoechst является наинизшим в клетках, которые только что вышли из митоза, клетки рака простаты (LNCaP, CWR22Rv1 и LAPC-4) с наинизшим окрашиванием краской Hoechst не обнаруживали AR с помощью жидкостной цитометрии. Сортировка этой популяции с помощью наинизшего связывания Hoechst краски, сопровождалась AR иммуноблотингом, и подтвердила чрезвычайно низкий уровень AR белка. Иммуногистохимия клеточных линий in vitro, в раках простаты in vivo также показала потерю экспрессии AR белка в митотических клетках. Авт. полагают, что AR в этих клетках является лицензионным фактором для репликации ДНК и что это снижение AR белка необходимо, чтобы лицензировать новый раунд репликации ДНК. Такое снижение не обнаруживается в стромальных клетках, которые не являются чувствительными к андрогену и экспрессируют заметно более низкие уровни AR, но необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить связь между деградацией AR и синтезом ДНК.
Эта потеря AR белка может быть блокирована протеосомным ингибитором (MG132), указывая тем самым, что задействована протеосомная деградация. Эти наблюдения указывают на то, что AR может подвергаться посттрансляционным модификациям, в частности ubiquitination, которое увеличивает шансы его деградации во время митоза. Ubiquitin ligases для AR были идентифицированы и включают E6-AP, CHIP и MDM2, но их активности в отношении AR неизвестны, регулируются ли они клеточным циклом. Интересно, что Cdk1 стабилизирует AR белок, хотя неясно, обусловлено ли это прямым фосфорилированием AR или другими косвенными механизмами [Chen et al., 2006]. Следовательно, снижение активности Cdk1, которое происходит в конце митоза может вносить вклад в заметное увеличение деградации AR, которое наблюдается в ранней G1.
Conclusions
The clinical challenges in prostate cancer center on controlling the action of the AR, which is required for both tumor development and disease progression. Selective pressure brought on by androgen ablation typically results in a bypass mechanism to activate the receptor in the absence of ligand, and thereby restore AR-dependent cellular proliferation. Thus, dissecting the mechanisms by which AR governs cell cycle progression is instrumental for the design of new strategies to treat recurrent disease. It is apparent that activated AR governs the G1-S progression, and emerging evidence indicates that cross talk between AR and the downstream cell cycle machinery serves a critical role in modulating the androgen response. Aberrations in these processes can facilitate androgen-independent cellular proliferation, and may contribute to the development of recurrent tumors. Future investigations into the consequence of AR-cell cycle crosstalk in prostate cancer are likely to lead to new avenues of therapeutic intervention.
Сайт создан в системе
uCoz
