Abnormal Vertebral Segmentation and the Notch Signaling Pathway in Man
Peter D. Turnpenny, Ben Alman, Alberto S. Cornier, Philip F. Giampietro, Amaka Offiah, Olivier Tassy, Olivier Pourquie, Kenro Kusumi, Hid Sally Dunwoodie DEVELOPMENTAL DYNAMICS 236 1456-1474, 2007 (www.interscience.wiley.com)
Abnormal vertebral segmentation (AVS) in man is a relatively common congenital malformation but cannot be subjected to the scientific analysis that is applied in animal models. Nevertheless, some spectacular advances in the cell biology and molecular genetics of somitogenesis in animal models have proved to be directly relevant to human disease. Some advances in our understanding have come through DNA linkage analysis in families demonstrating a clustering of AVS cases, as well as adopting a candidate gene approach. Only rarely do AVS phenotypes follow clear Mendelian inheritance, but three genes—DLL3, MESP2, and LNFG—have now been identified for spondylocostal dysostosis (SCD). SCD is characterized by extensive hemivertebrae, trunkal shortening, and abnormally aligned ribs with points of fusion. In familial cases clearly following a Mendelian pattern, autosomal recessive inheritance is more common than autosomal dominant and the genes identified are functional within the Notch signaling pathway. Other genes within the pathway cause diverse phenotypes such as Alagille syndrome (AGS) and CADASIL, conditions that may have their origin in defective vasculogenesis. Here, we deal mainly with SCD and AGS, and present a new classification system for AVS phenotypes, for which, hitherto, the terminology has been inconsistent and confusing.
Рис.1. | X-ray of a child with spondylothoracic dysostosis. Severe shortening of the spine occurs with poorly formed vertebrae. The ribs have very crowded origins but do not show points of fusion along their length. The prominence of the vertebral pedicles has led to the suggestion of the tramline sign. (Courtesy of Alberto Cornier.)
Рис.2 | A reversed radiograph from Jarcho and Levin's original paper in 1938. Abnormal segmentation affects all vertebrae, and the ribs are fused at their origins. Today, this finding fits best into the diagnosis of spondylocostal dysostosis, type 2.
Рис.3 | A typical case of spondylocostal dysostosis showing major abnormality of all vertebrae. There is no tramline effect of the vertebral pedicles (see Fig. 1), and the ribs are irregularly aligned with variable points of fusion along their length.
Рис.4 | A typical case of spondylocostal dysostosis showing major abnormality of all vertebrae. There is no tramline effect of the vertebral pedicles (see Fig. 1), and the ribs are irregularly aligned with variable points of fusion along their length.
Рис.5 | The X-ray of a child with multiple congenital abnormalities that best fits a form of the VACTERL association. She had abnormal vertebral segmentation affecting mainly the thoracic region, progressive scoliosis, anal stenosis, unilateral renal agenesis, and tricuspid regurgitation.
Рис.6 | The X-ray of a child with hemivertebrae, axial skeletal defects, and left renal agenesis. The mother was a poorly controlled insulin-dependent diabetic, and it is likely that this is causally related to the pattern of malformations.
Рис.7 | The cellular relationships of Notch signaling pathway genes discussed in this review.
Рис.8 | Schematic of the DLL3 gene in man, showing the mutations identified to date. DSL, delta-serrate-lag; EGF, epidermal growth factor; TM, transmembrane.
Рис.9 | a: Spondylocostal dysostosis (SCD) due to homozygous mutations in DLL3. All vertebrae show abnormal segmentation, and the ribs show irregular points of fusion along their length. However, there is an overall symmetry to the thoracic cage. We designate this SCD type 1. (Courtesy of Yanick Crow.) b: Because of the similarity to smooth, eroded pebbles on a beach, we have suggested calling the radiological appearance the pebble beach sign.
Рис.10 | Magnetic resonance image of the spine in an affected individual homozygous for a mutation in MESP2. The most striking segmentation abnormality is seen in the thoracic spine with relative sparing of the lumber vertebrae. We designate this as spondylocostal dysostosis type 2.
Рис.11 | Schematic showing the MesP2 and MesP1 homologues from human, mouse, and chick. The carboxy-terminus is highly divergent between species.
Рис.12 | Magnetic resonance image of the spine in the affected individuals homozygous for a mutation in LNFG. Severe segmentation abnormalities throughout the spine has given rise to marked shortening of the trunk. We designate this spondylocostal dysostosis type 3.
Рис.13 | Butterfly vertebrae in the thoracic spine of a 5-year-old patient with Alagille syndrome. (Note the radiopaque wires overlying the vertebrae are situated in the sternum bone, and this patient had surgery for congenital heart disease.)
Рис.14 | The face in Alagille syndrome. The mother and her child both have a mutation in JAGGED1. The forehead is broad and the palpebral fissures narrow and upslanting. The mandible is slightly prominent.
Рис.15 | Schematic of the JAG1 gene in man. SP, signal peptide; DSL, delta-serrate-lag; EGF, epidermal growth factor; TM, transmembrane.
Сегментация позвоночных отражает процесс эмбрионального развития, который приводит к образованию позвоночника с серией раздельных, сходных анатомически единиц, позвонков. Ключевой частью этого процесса является сомитогенез. У видов позвоночных сомиты симметрично располагаются, парными блоками мезодермы, формируемыми в результате сегментации параксиальной пресомитной мезодермы. Этот процесс начинается вскоре после гаструляции и продолжается вплоть до тех пор, пока не сформируется предопределенное количество сомитов. У человека образуется 31 парных блоков ткани, но их количество специфично для каждого вида. У модельных животных образование сомитных границ происходит точно по времени в ростро-каудальном направлении, сначала формируются наиболее ростральные сомиты и прогрессивно закладываются более каудальные сомиты. В эмбриональном развитии человека этот процесс происходит между 20 и 35 днями после зачатия, а образование границ каждого сомита занимает 4-6 ч. Сомиты в конечном счете дают три структуры, склеротом, который формирует осевой скелет и ребра; дермотом, который формирует дерму; и миотом, который формирует осевую мускулатуру. Потенциальное количество и разнообразие заболеваний у людей, обусловленных дефектным сомитогенезом, огромно, но здесь мы сконцентрировались на хорошо известных заболеваниях осевого скелета - собственно позвоночнике - и на их генетических основах. Abnormal vertebral segmentation (AVS), во всех эти различных и разнообразных проявлениях, является общей врожденной аномалией, хотя действительная сфера действия и распространенность трудны для определения. Пропорция случаев, для который причина может быть указана с определенностью, невелика и прогресс в понимании этиологии медленный. Поэтому в клинике трудно точно оценить генетический риск, когда в семье появляется единичный случай.
У человека проблемы, связанные с аномальной сегментацией позвоночника, интересны разным дисциплинам. Радиологи пытаются описать аномальные паттерны на рентгенограммах, хирурги спинного мозга затрудняются в выборе решения относительно хирургического вмешательства у затронутых детей и взрослых, педиатры озабочены многочисленными последствиями, такими как дыхательная недостаточность, а генетики стремятся поставить специфический диагноз и разработать генетическую диагностику и пытаются оценить риск повторного появления. Сегодня существует значительный беспорядок в отношении номенклатуры для различных радиологических фенотипов, при этом клиницистами используемая терминология несостоятельна. В будущем мы надеемся мультидисциплинарные подходы с участием биологов развития и различных клинических дисциплин, с использованием коллекций огромных баз данных и подходов по генам кандидатам, позволят достигнуть прогресса в этой сложной области.
CLINICAL HETEROGENEITY IN AVS PHENOTYPES
Развитие осевого скелета очень чувствительно к генетическим и разрушительным пертурбациям нормального сомитогенеза, а широкий круг дисморфных синдромов, большинство из которых редки, обнаруживают AVS в разных формах. Table 1 предоставляет заболевания, которые включают multiple vertebral segmentation defects (MVSD), для лишь незначительной части, патофизиология которых известна. Обзор будет иметь в основном дело с несиндромальными формами AVS, т.е. с такими заболеваниями, в которых аномальное образование позвоночника (и обычно ребер) является изолированной анатомической аномалией, не затрагивающей др. системы тела. Эти состояния часто обозначаются как разные типы, но мы обсудим терминологию и номенклатуру позднее.
AVS Phenotypes Following Mendelian Inheritance
Эта группа включает самостоятельные заболевания, известные как spondylothoracic dysostosis (STD) и SCD типы 1-3, каждое из которых, по-видимому, характеризуется autosomal recessive (AR) наследованием. STD является термином, зарезервированным для самостоятельных заболеваний, наиболее часто описываемых у пуэрториканцев, которые характеризуются сильным укорочением туловища и радиологической картиной ребер, расходящихся из их позвонково-реберных источников в "crab-like" виде (Fig. 1). Слияние ребер происходит кзади от их вертебрального происхождения, но во всем остальном они обычно в точности расположены и упакованы тесно др. с др. Такое состояние хорошо охарактеризовано в недавнем исследовании (Cornier et al., 2004). Смертность детей составляет ~ 50% из-за ограничивающей респираторной недостаточности, хотя доступность интенсивного педиатрического ухаживания существенно улучшает приогноз. В ранний период жизни, выступы pedicles позвонков радиологически заставляют нас предполагать, что термин "tramline" признак (Fig. 1) аккуратно описывает проявление. Кроме того, в горизонтальных срезах при CT сканировании, тела позвонков соответствуют "sickle cell" (сеповидноклеточной) форме (Cornier et al., 2004). Исследования ультраструктуры при аутопсии скудны. Однако в одном сообщении (Solomon et al., 1978) описывается увеличение соотношения между хрящом и костью на парасагитальных срезах тел позвонков, с персистенцией хряща приблизительно по срединной линии. Центры оссификации были дезорганизованы и варьировали в размерах и распределении, а в латеральных частях некоторых тел позвонков продольные расщепления из хряща разделяли передний и задний центры оссификации. Хотя моделирование тел позвонков было сильно дезорганизованным, микроскопически формирование и структура кости не были нарушенными. в
STD фенотип безусловно наиболее част у пуэрториканцев иногда он описывается как Jarcho-Levin syndrome (JLS) (Lavy et al., 1966; Moseley and Bonforte, 1969; Pochaczevsky et al., 1971; Perez-Comas and Garcia-Castro, 1974; Gellis and Feingold, 1976; Trindade and de Ndbrega, 1977; Solomon et al., 1978; Tolmie et al., 1987; Schulman et al, 1993; McCall et al., 1994; Mortier et al., 1996). Jarcho and Levin (1938) описали Puerto Rican семью с двумя затронутыми сиблингами, но радиологический фенотип (Fig. 2) слегка отличался от такового STD , проиллюстрированного на Figure 1 и нет уверенности, что они имели то же самое заболевание. Использование eponymous термина JLS имеет тенденцию не выявлять различий и по этой причине мы полагаем. что он д. быть устранен. Напр., существуют и др. описания, обозначаемые как JLS, которые не очнень сходны с тем, что описано Jarcho and Levin, и не согласуются с STD (Poor et al., 1983; Karnes et al, 1991; Simpson et al., 1995; Aurora et al., 1996; Eliyahu et al., 1997; Rastogi et al., 2002). Т.к. ген для STD в семьях пуэрториканцев был идентифицирован, то возможно производить генотип-фенотипические исследования, которые смогут в дальнейшем облегчить классификацию. Фенотип, для которого мы предпочитаем ограничить использование термина spondylocostal dysostosis (SCD), отличается от STD в силу того, что ребра оказываются нерегулярно расположены и обнаруживают разные точки слияния по всей длине (Fig. 3). Позвоночник обычно не столь сильно укорочен по сравнению с STD , но как и в случае STD, наблюдается существенное вовлечение тел позвонков, обычно смежных и часто затрагиваются все спинальные области. Несмотря на это торакальная область позвоночника часто затрагивается более тяжело, чем др. области. AR наследование регулярно описывается для этого фенотипа (Norum and McKusick, 1969; Cantu et al., 1971; Castroveijo et al, 1973; France-schini et al., 1974; Silengo et al., 1978; Beighton and Horan, 1981; Turnpenny et al., 1991; Satar et al., 1992), и сегодня известно, что SCD может быть обусловлена мутациями генов пути Notch, DLL3 (SCD1), MESP2 (SCD2) или LNFG (SCD3), хотя безусловно, что и др. ген(ы) смогут быть идентифицированы в надлежащее время. Фенотипические признаки SCD типов 1-3 описываются ниже при обсуждении молекулярных аспектов соотв. им генов. Вовлечение обширных и смежных спинальных регионов, является признаком, который наводит на размышление о менделирующей форме SCD и скорее всего объясняет некоторые изолированные случаи, описанные в литературе, напр., случай Young and Moore (1984). Однако затрагиваемые близнецы в случае монозиготных двоен, дискордантных по SCD, обнаруживают сходный фенотип (Van Thienen and Van der Auwera, 1994) и эту находку трудно объяснить на этой основе.
Дополнительные аномалии были описаны в некоторых семьях с SCD, по-видимому, демонстрируют AR наследование. Напр., урогенитальные аномалии (Casamassima et al., 1981), врожденные болезни сердца (Delgoffe et al., 1982; Simpson et al., 1995; Aurora et al., 1996), и паховые грыжи у мужчин (Bonaime, 1978). Аномалии конечностей были описаны при синдроме COVESDEM (Wadia et al., 1978), но это, как полагается, является случаем Robinow синдрома.
Семьи с SCD, по-видимому, следующие autosomal dominant (AD) наследованию, также были описаны (Van der Sar, 1952; Rutt and Degen-hardt, 1959; Peralta et al., 1967; Rimoin et al., 1968; Kubryk and Borde, 1981; Temple et al., 1988; Lorenz and Rupprecht, 1990), но причинные гены в этих случаях неизвестны. в
Роль пути передачи сигналов Notch в вызывании SCD (types 1-3) , по крайней мере, частично понятна (see below). Однако существуют синдромы, следующие Менделевскому наследованию, которые включают варьирующие степени AVS, но функции этих генов относительно спинального развития изучены плохо. В эту группу входят, напр., ROR2 в синдроме Robinow и CHD7 в синдроме CHARGE. Неясно, какова роль этих генов в сомитогенезе.
NON-MENDELIAN FORMS OF AVS
В клинической практике спорадически появляющиеся случаи AVS довольно более распространены, чем семейные случаи и чаще всего ассоциированы с дополнительными аномалиями (Martinez-Frias et al., 1994; Mortier et al., 1996). Анальные и урогенеитальные аномалии появляются наиболее часто (Pochaczevsky et al., 1971; Eller and Morton, 1976; Bonaime et al., 1978; Devos et al., 1978; Solomon et al., 1978; Poor et al., 1983; Kozlow-ski, 1984; Roberts et al., 1988; Giacoia and Say, 1991; Karnes et al, 1991; Murr et al., 1992; Lin and Harster, 1993; Mortier et al., 1996) , сопровождаемые разнообразными врожденными пороками сердаца (Delgoffe et al., 1982; Kozlowski, 1984; Ohzeki et al., 1990; Aurora et al., 1996; Mortier et al., 1996). Аномалии конечностей появляются, но обычно относительно минорной природы, напр., косолапость и полидактилия или полидактилия (Karnes et al., 1991; Mortier et al., 1996). Нечасто появляется диафрагмальная грыжа (Martinez-Frias et al., 1994). В качестве минорной аномалии, паховая или абдоминальная грыжа, часто описываются при MVSD. Как правило, эти спорадически возникающие случаи скорее всего обнаруживают заметную асимметрию в форме грудной клетки и количестве ребер (Fig. 4) по сравнению с семейными фенотипами, безусловно следующими Менделевскому наследованию.
Большинство случаев неточно относят к ассоциациям VATER (Vertebral defects, Anal atresia, Tracheo-Esophageal fistula, Radial defects, and Renal anomalies) или VACTERL (Vertebral defects. Anal atresia, Cardiac defects, Tracheo-Esophageal fistula, Radial defects and Renal anomalies, and nonradial Limb defects) (Kozlowski, 1984.) , гетерогенной группе с неясной причиной (Fig. 5).
Частой ассоциацией, которая может быть причинно связана, является neural tube defect (NTD; Wynne-Davies, 1975; Eller and Morton, 1976; McLennan, 1976; Naik et al., 1978; Lendon et al., 1981; Kozlowski, 1984; Giacoia and Say, 1991; Martinez-Frias et al., 1994; . Sharma and Phadke, 1994). Однако мы полагаем. что NTD-ассоциированная группа д. быть классифицироваться отдельно от SCD группы, т.к. первичная патология развития безусловно лежит в процессе детерминации закрытия нервной трубки, отличном от сомитогенеза (Martinez-Frias, 1996). Сходным образом, ассоциация между spina bifida occulta и/или diastematomyelia и AVS была описана (Poor et al., 1983; Ayme and Preus, 1986; Herold et al., 1988; Reyes et al., 1989), это строго указывает на причинную связь или следствие, хотя механизм остается не выясненным.
AVS описан при синдроме материнского диабета, который может давать множественные врожденные аномалии. Классическим аксиальным скелетным уродством при синдроме материнского диабета является каудальная регрессия в различной степени, т.е. отсутствие кресцовой кости или агенез нижней части позвоночного столба (Bohring et al., 1999), но встречаются и пациенты с полу-позвонками (Novak and Robinson, 1994) и различными дефектов осевого скелета (Fig. 6), сопровождающих плохо контролируемый дибет при беременности.
AVS Associated With Chromosomal Aberrations
Некоторые четкие указания на генетическую природу AVS могут быть получены у пациентов с осевыми скелетными аномалиями и хромосомными аномалиями. Эти случаи относительно редки, не говоря уже о мозаицизме с трисомией 8 (Riccardi, 1977), отсутствует ясная логика в этой группе. были описаны делеции, затрагивающие 18q (Dowton et al., 1997) и 18p (Nakano et al., 1977), сверхчисленный дицентрический 15q маркер (Crow et al., 1997) и, по-видимому, сбалансированная транслокация между хромосомами 14 и 15 (De Grouchy et al., 1963). Геномная гаплонедостаточность может демаскировать Менделирующий локус для SCD , так что механизм является аутосомно рецессивным на молекулярном уровне, но малое количество и несогласованность этих случаев может указывать на то, что MVSD в ассоциации с MCA представляют общий путь сложных плейотропных онтогенетических механизмов, которые чувствительны к ряду несбалансированных кариотипов. Возможно также, что хромосомный мозаицизм объясняет некоторые случаи, при который обнаруживается заметная асимметрия радиологических фенотипов, это может также объяснить кажущееся спорадическое появление, но сегодня нет доказательной основы для этого, т.к. биопсия кожи и ткани применялась редко.
NOTCH SIGNALING PATHWAY GENES AND SCD
передача сигналов Notch является ключевым каскадом в сомитогенезе, а действие многих генов и их продуктов, вместе с х сложными взаимодействиями, были частично выявлены путем изучения животных моделей. У человека действие генов ортологов и их белков безусловно не может исследоваться тем же способом. Тем не менее исследования ДНК сцеплений и секвенирование генов кандидатов привело к идентификации некоторых генов, которые клинически важны. Болезни, которые возникают в результате мутаций Notch сигнальных генов, неожиданно разнообразны, затрагивают системы органов, включая сосудистую и центральную нервную систему; скелет, лицо и конечности; гематопоэз; детерминацию латеральности; печень, сердце, почки и глаза. Гены пути Notch и ассоциированные с ними болезни представлены в Table 2 и нескольких обзорах (Joutel and Tournier-Lasserve, 1998; Gridley, 1997, 2003, 2006; Pourquie and Kusumi, 2001; Harper et al., 2003). Т.к. данный обзор имеет дело прежде всего с аномалиями сомитогенеза, затрагивающими осевой скелет, то рассуждения будут касаться DLL3, MESP2, LNFG, JAGGED1 и NOTCH2 генов. Клеточные взаимоотношения этих генов проиллюстрированы на Figure 7.
Delta-like 3 (DLL3)
Исследования по картированию аутозиготности ДНК в крупной инбредной арабской родословной с 7 затронутыми индивидами, стали ключевыми в прорыве по идентификации генетической основы SCD (Turnpenny et al., 1991, 1999). Идентифицированный локус, 19q13.1, является синтеничным таковому на хромосоме 7 мыши (Giampietro et al., 1999), который принадлежит Dll3 гену. Др. существенным прорывом стала идентификация мутации в Dll3 как причины MVSD у радиацией поврежденных мышей, известных как Pudgy (Gruneberg, 1961; Dunwoodie et al., 1997; Kusumi et al., 1998). DLL3 поэтому стал очевидным кандидатом гена SCD в большой инбредной арабской родословной и др. семьи продемонстрировали сцепление с 19q13.1. Секвенированы инициально идентифицированные мутации в трех единокровных семьях (Bulman et al., 2000). в
DLL3 кодирует лиганд для передачи сигналов Notch, а ген представлен 8 экзонами и занимает приблизительно 9.2 kb на хромосоме 19. Транскрипт в 1.9-kb кодирует белок в 618 аминокислот. Белок состоит из сигнальной последовательности, Delta-Serrate-Lag2 (взаимодействующего с рецептором) домена, 6 epidermal growth factor (EGF)-подобных доменов и трансмембранного домена (Fig. 8). В животных моделях Dll3 обнаруживает пространственно ограниченные паттерны экспрессии во время формирования сомитов и как полагают играет ключевую роль в процессах передачи клеточных сигналов, участвующих в формировании границ сомитов, которые возникают в ростро-каудальном направлении с точной временной периодичностью, управляемой внутренним осциллятором или молекулярными "segmentation clock" (McGrew and Pourquie, 1998; Pourquie, 1999).
Мутантный DLL3 у людей вызывает аномальную вертебральную сегментацию всего позвоночника, при этом все позвонки теряют свою нормальную форму и регулярные трехмерные очертания. Наиболее драматические изменения, радиологически, затрагивают торакальные позвонки и ребра, они уродливы с варьирующим числом точек слияний вдоль всей длины (Fig. 9a). В целом сохраняется симметрия грудной клетки и минимальное, не прогрессирующее scoliotic искривление, которое не нуждается в корректирующей хирургии. Эти признаки определяют SCD. В раннем детстве до завершения оссификации, позвонки сглажены, с округлыми контурами-особенно в торакальной области-вид для которого мы предлагаем термин "pebble beach" признак (Fig. 9b). Мы обозначаем это как SCD type 1 (SCD1), хотя DLL3-ассоциированная SCD является альтернативным названием (Martinez-Frias, 2004). Дополнительные аномалии, по-видимому, редки, в одном случае присутствовал абдоминальный situs inversus, хотя его связь с мутантным DLL3 неопределенна. В одной семье, затронутые сибсы, гомозиготные по мутации exon 8 1369delCGCTCCCGGCTACATGG (C655M660dell7) обнаруживали форму дистального arthrogryposis в сочетании с fetal akinesia sequence, и оба погибли в раннем детстве (C. McKeown, personal communication). Этот дополнительный фенотип мог быть самостоятельным AR заболеванием, сегрегирующим совместно с SCD, т.к. в этой семье отмечен частый имбридинг. Сдавление спинного мозга и ассоциирующие с этим признаки не наблюдались при SCD1, а интеллигентность и познавательная способность были нормальными. Эта находка указывает на то, что DLL3 не экспрессируется в головном мозге человека в противоположность находкам у мышей, где обнаруживались дефекты ЦНС (Kusumi et al., 2001), включая дефекты в neuroventricles мышей Pudgy (Kusumi et al., 1998; Dunwoodie et al., 2002).
Кстати, 24 мутации (Table 3) были идентифицированы у SCD пациентов из 26 семей (Табл.4)
Только 5 из этих семей определенно были не единокровные, а мутации идентифицировались в широком круге этнических групп. 18 мутаций укорачивают белок, а 6 являются missense. Некоторые из missense мутаций могут давать более легкий фенотип, а исследования по моделированию белка могут помочь объяснить эти легкие фенотипические отличия должным образом. За одним исключением мутации в трансмембранном домене, все мутации затрагивают внеклеточный домен гена и сконцентрированы в экзонах 4-8. Три мутации были идентифицированы более чем в одной семье. Мутация 945de-1AT (T315C316del2) была обнаружена в двух этнических Пакистанских родословных, происходящих из Kashmir, а анализ ДНК маркеров, фланкирующих локус DLL3 идентифицировал общий гаплотип, указывающий на общее происхождение. Сходным образом мутация 614insGTC-CGGGACTGCG (R205insl3) была обнаружена в двух кровнородственных семьях, одна у этнических ливанских арабов, а др. у этнических турков. Анализ гаплотипов снова подтвердил общее происхождение для двух этих Levant родословных. Мутация 599-603dup присутствует в оригинальной арабской родословной, гомозиготная у затронутых особей, но в Испанской семье затронутые дети были гетерозиготными по той же самой мутации. Анализ гаплотипов двух этих родословных не подтвердил общего происхождения, следовательно, мутация 599-603dup возникла повторно, т.к. она находится в облсти гена с множественными повторами GCGGT. Slipped mispairing во время репликации ДНК является наиболее вероятным объяснением этой инсерционной мутации.
Мутация missense G504D была обнаружена в Сев. Европейской семье с аутосомно доминантной SCD (Floor et al., 1989), но недавно было установлено, что имеет место псевдодоминантное наследование (Whittock et al., 2004a). В настоящее время не описаны случаи AD SCD, связанные с мутациями в DLL3. Однако в крупной арабской семье, описанной Turnpenny et al. (1991), одна женщина была гетерозиготной по мутации 599-603dup и имела умеренный торакальный сколиоз, но не было ассоциированных аномалий сегментации в торакальной области, а большинство локальных аномалий сегментации было в нижних поясничных позвонках. Возможно, что её сколиоз и аномалии поясничной сегментации были случайными по отношению к её статусу носительницы DLL3 , т.к. др. облигатные носители в этой семье не обнаруживали подобных проявлений. Возможно она несет мутацию в отдельном гене сомитогенеза и поэтому была описана как "double heterozygote," пример известный для модельных животных (Kusumi et al., 2003).
В целом мы наблюдали удивительное совпадение радиологических фенотипов в случаях мутаций (Turnpenny et al., 2003), при навыке и тщательном исследовании рентгенограмм обычно возможно идентифицировать таких пациентов, у которых будутт доказаны DLL3 мутации. Важно, что DLL3 мутации не были найдены среди широкого разнообразия более распространенных, хотя и отличных фенотипов, которые включали MVSD и аномальные ребра (Maisenbacher et al., 2005; Giampietro et al., 2006). Следовательно, обнаруживается удивительно мало клинической гетерогенности для пороков осевого скелета, обусловленных мутантным DLL3, это имеет важное значение для применения генетического тестирования в клинических условиях.
В связи с дефектами осевого скелета у людей, идентификация гена DLL3 при SCD представила прорыв в понимании причин этой группы уродств, а также явилась др. примером биологической гомологии между видами. Это стало примером поиска генетических основ для др. SCD фенотипов, которые привели прямо к идентификации MESP2 и позднее LNFG, в случаях SCD.
Mesoderm Posterior 2 (MESP2)
Идентификация мутантного MESP2 в ассоциации с SCD произошла при исследовании двух небольших семей с SCD , в которых не было обнаружено DLL3 мутаций и сцепление с 19ql3.1 было исключено. В этих семьях радиологический фенотип был сходен, но слегка отличен от SCD type 1. Торакальные позвонки были сильно изменены, но поясничные позвонки лишь умеренно, как показало magnetic resonance imaging (MRI; Fig. 10).
Картирование гомозиготности по всему геному в одной семье ливанских арабов выявило 84 гомозиготных маркеров, разбросанных по всему геному, из которых 6 были сконцентрированы в блоке 15q (D15S153 to D15S120) и 5 были сконцентрированы в блоке 20q (D20S117 to D20S186). Последующее картирование исключило область 20q, но продемонстрировало сцепление с 15q маркерами D15S153, D15S131, D15S205 и D15S127. Тонкое картирование с использованием дополнительных маркеров продемонстрировало область в 36.6 Mb на 15q21.3-15q26.1, между маркерами D15S117 и D15S1004, с максимумом two-point lod score в 1.588, при 9 = 0 для маркеров D15S131, D15S205, D15S1046 и D15S127. Область между маркерами D15S117 и D15S1004 содержит избыток из 50 генов и синтенична мышиной хромосоме 7, которая содержит ген Mesp2. Нокаут Mesp2 у мышей проявляется в виде измененной ростро-каудальной полярности, приводящей к дефектам осевого скелета (Saga et al., 1997). Предполагаемый человеческий ген, MESP2, представлен двумя экзонами, занимающими приблизительно 2 kb геномной ДНК на 15q26.1. Непосредственное секвенирование гена MESP2 у двух затронутых сибсов продемонстрировало гомозиготную в 4-bp (ACCG) дупликационную мутацию в экзоне 1, названную 500-503dup (Whittock et al., 2004b). Родители оказались гетерозиготными, а незатронутые сибсы гомозиготными по нормальному аллелю, что согласуется с сегрегацией дупликации с SCD в семье. Флюоресцентная полимеразная цепная реакция исключила эту мутацию в 68 этнически соотв. контрольных хромосомах. Анализ геномной структуры гена MESP2 подчеркнул расхождение между Sanger Centre и NCBI human genomic assembly базами данных. В последней имеется дополнительный интрон, расположенный после основания 502 в MESP2 кодирующей области. Эта находка не появилась в Ensembl gene prediction и обусловлена отсутствием консенсусного сплайс-сайта внутри этой предполагаемой интронной последовательности, группа Exeter пришла к заключению, что интрон не существует. Однако присутствие или отсутствие такого интрона не повлияет на заключение, связанное с инсерцией 4-bp в продукцию белка MESP2, который как предполагается прерывает сплайсинг и ведет к сдвигу рамки считывания в некоторой точке белка MESP2. Имеется подтвержденный мутантный MESP2 в качестве причины AR SCD, мы обозначили его как SCD type 2, или MESP2-ассоциированный SCD.
Во второй семье без кровосмешения при анализе гаплотипов были получены данные, согласующиеся со сцеплением с локусом MESP2, но секвенирование гена не выявило мутации. Ген MESP1, который локализован выше MESP2 на 15q, также был секвенирован и в нем не было идентифицировано отклонений. Осталось посмотреть, не находится ли мутация в одной из промоторных областей, или ответственен некий иной позиционный эффект. Ген MESP2 , как известно, продуцирует транскрипт в 1,191 bp, кодирующий белок в 397 аминокислот. Белок MESP2 человека на 58.1% идентичен мышиному MesP2 и на 47.4% идентичен MESP1 человека. Человеческий MESP2 N-конец содержит basic helix-loop-helix (bHLH) область, соответствующую 51 аминокислоте, подразделенную на базовый домен в 11 остатков, в 13 остатков helix I домен и в 11 остатков loop домен и в 16 остатков helix II домен. Область петли слегка длиннее, чем та что найдена у гомолога, такого как paraxis. Длина области петли законсервирована для мышиных и человеческих MESP1, MESP2, Thylacine 1 и 2, для куриного mesogenin. Кроме того, и MESP1 и MESP2 содержат уникальный CPXCP мотив непосредственно С-терминальнее bHLH домена (Fig. 11). N- и С-терминальный домены разделены в человеческом MESP2 с помощью области GQ повторов, также найденного в человеческом MESP1 (2 повтора), но увеличен в MESP2 (13 повторов). Мышиный MesP1 и MesP2 не содержат GQ повторов, но они содержат два QX повтора в той же самой области: мышиный MesP1 QSQS, мышиный MesP2 QAQM. Кривые гидрофобности показывают, что MesP1 и MesP2 обладают общей С-терминальной областью, которая обеспечивает образование сходной складки, хотя MesP2 последовательность содержит уникальную область на С-конце.
Анализ последовательностей 20 этнически сопоставимых и 10 отличающихся индивидов выявил присутствие варьирующей длины полиморфизм в GQ области человеческого MESP2, начиная с нуклеотида 535. Эта область содержит серию из 12-bp повторяющихся единиц. Наименьшая из выявленных GQ областей содержит две типа А единицы (GGG CAG GGG CAA, кодирующие аминокислоты GQGQ), сопровождаемые двумя типа В единицами (GGA CAG GGG CAA, кодирующими GQGQ) и одним типом С единицы (GGG CAG GGG CGC, кодирующим GQGR). Анализ этого полиморфизма в равноценном и не равноценном контроле выявил аллельные частоты, которые достоверно не отличались статистически в двух этих группах.
MESP2 является членом bHLH семейства транскрипционных регуляторных белков, существенных для большого числа процессов (Massari and Murre, 2000). Мышиный Mesp1 и Mesp2, локализуются на хромосоме 7, они разделены приблизительно 23 kb. Они расположены голова к голове и транскрибируются с межлокусного региона (Saga et al., 1996). По крайней мере, два энхансера участвуют в экспрессии этих генов у мышей (Haraguchi et al., 2001): один экспрессируется в ранней мезодерме, а др. в пресомитной мезодерме (PSM) . Кроме того, идентифицирован супрессор, ответственный за рострально ограниченную экспрессию в PSM (Haraguchi et al., 2001). Эти энхансеры существенны для специфической и скоординированной экспрессии MesP белков. Экспрессия MesP1 и Mesp2 впервые обнаруживается у эмбрионов мышей в начале гаструляции (~6.5 days post coitum [dpc]) и ограничивается рано появляющейся мезодермой (Saga et al., 1996; Kitajima et al., 2000). На этой стадии домен экспрессии Mesp1 шире, чем Mesp2, а клональный анализ Mesp2-экспрессирующих клеток показал, что они вносят вклад в краниальную, кардиальную и внеэмбриональную мезодерму (Saga et al., 1999). Экспрессия затем подавляется, т.к. Mesp транскрипты не обнаруживаются в более позднем развитии. Второе место экспрессии Mesp выявляется на ст. 8.0 dpc непосредственно перед сомитогенезом. Пара MesP-экспрессирующих полос появляется на каждой из сторон эмбриональной срединной линии, в передней части PSM, где начинают формироваться сомиты (Saga et al., 1997, 1999). Во время сомитогенеза MesP1 и MesP2 продолжают экспрессироваться в одиночных билатеральных полосках передней PSM. MesP2 экспрессия внутри PSM продолжается вплоть до приблизительно времени, когда затухает образование сомитов (~13.5 dpc; Saga et al., 1999), после чего экспрессия Mesp быстро подавляется, т.к. транскрипты больше не обнаруживаются во вновь формируемых сомитах.
Сравнение MesP2 гомологов человека, мыши, Xenopus и кур демонстрирует сильную дивергенцию по С-концу между видами (Fig. 11), и неизвестно, расположены ли функциональные домены одинаково во всех Mesp2 ортологах, в сравнении с таковым для хорошо охарактеризованного Xenopus Mesp2 ортолога, Thylacine (Sparrow et al., 1998). Если С-конец в человеческом MesP2 необходим для активации транскрипции, тогда мутантная форма белка, описанная здесь, лишенная С-конца, должна терять эту функцию. Новорожденные мышата. лишенные MesP2 погибают в течение 20 мин. после рождения, характеризуются коротким. суживающимся к концу туловищем и аномальной сегментацией, затрагивающей все кроме нескольких каудальных (хвостовых) позвонков (Saga et al., 1997). Эта находка напоминает Dll3-нулевых мышей, где архитектура ребер и позвонков нарушена вдоль всей оси.
В отличие от мышиного нулевого MesP2 аллеля, человеческий мутантный белок сохраняет свою bHLH область и хотя и укорочен, всё ещё может димеризоваться, соединяться с ДНК и действовать доминантно-негативным образом. Однако в затронутой семье гетерозиготные родители не обнаруживают дефектов осевого скелета, из этого выходит, что эта мутация MESP2 рецессивная. Сходным образом гетерозиготные мыши являются нормальными и плодовитыми (Saga et al., 1997). Возможно, что одиночный функциональные С-конец достаточен для активации транскрипции, но в свою очередь MESP1 белок может компенсировать отсутствие функции MESP2, т.к. MesP1 может восстанавливать дефекты осевого скелета у MesP2-дефицитных мышей зависимым от дозы способом (Saga, 1998). Др. возможность заключается в том, что мутантный MESP2 транскрипт содержит преждевременный стоп кодон в 1099-1101 bp и деградирует с помощью nonsense-опосредованного распада РНК, не давая укороченного белка (Culbertson, 1999).
В сомитогенезе мышей, MesP2 играет ключевую роль в установлении ростро-каудальой полярности за счет участия в разных Notch-сигнальных путях (Takahashi et al., 2000, 2003). Экспрессия Mesp2, индуцированная с помощью Dll1-обеспечиваемой передачи сигналов Notch (presenilin1-независимой) и Dll3-обеспечиваемой передачи сигналов Notch (presenilin 1-зависимой), тогда как ингибирование экспрессии Mesp2 достигается посредством presenilinl-независимой передачи сигналов Dll3-Notch. Поскольку Mesp2 может ингибировать экспрессию Dll1, то эта сложная сигнальная сеть обусловливает полоски экспрессии Dll1, Dll3 и Mesp2 в передней PSM.
Степень, с которой этот процесс непосредственно коррелирует с сомитогенезом у человека, неизвестна за исключением того, что фенотипы Mesp2 и Dll3 мутантных мышей похожи на токовые при SCD людей (Saga et al., 1997; Kusumi et al., 1998; Dunwoodie et al., 2002). Находки в одной из таких семей предоставили первые доказательства того, что MESP2 является критическим для нормального сомитогенеза у людей. Вторая затронутая семья с идентичной мутацией была представлена в 2005 на встрече International Skeletal Dysplasia Society (L. Bonafe, personal communication), Martigny, Switzerland, и характеризовалась сходным фенотипом. Существует ли общий предшественник у этих двух семей, неизвестно.
Lunatic Fringe
Идентификация генов пути Notch как причины SCD человека неизбежно подтверждает гипотезу, что др. гены пути могут участвовать в др. формах AVS/MVSD. Среди них, ген Lunatic Fringe (LNFG) рассматривается как надежный кандидат, т.к. Lnfg-нулевые мыши имеют нелетальный фенотип, который включает аномалии ребер и позвонков. Первоначально, , однако, скрининг мутаций в серии затронутых субъектов с разнообразными радиологическими фенотипами не выявил каких-либо позитивных генов. LFNG кодирует glycosyltransferase, которая пост-трансляционно модифицирует Notch семейство рецепторов клеточной поверхности, ключевая ступень регуляции этого сигнального пути (Haines and Irvine, 2003). Белок LFNG является fucose-specific β-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase (Bruckner et al., 2000; Moloney et al., 2000)? которая функционирует в Гольджи, чтобы пост-трансляционно модифицировать Notch рецепторы, изменяя их сигнальные свойства (Haines and Irvine, 2003). Более ранние исследования показали, что экспрессия гена Lfng сильно дерегулировна у Dll3-нулевых мышей, указывая тем самым, что экспрессия Lfng зависит от функции D113 (Dunwoodie et al., 2002; Kusumi et al., 2004).
Изучаемый пробанд мальчик подросток, происходящий из сев. Ливана, второй из 5-ти детей, рожденный от близкородственного брака. Он имел короткую шею и короткое туловище при рождении, а к 15 годам имел заметное укорочение грудной клетки с pectus carinatum deformity и kyphoscoliosis. Спинальное MRI подтвердило MVSD в шейном и торакальном отделах позвоночника с змееевидной кривой шейной части позвоночника и вогнутостью вправо верхних позвонков и вогнутостью влево нижних. Тороколюмбарная часть позвонков обнаруживала множественные полу-позвонки (Fig. 12), и имелись многочисленные аномалии ребер. Спинной мозг был нормален без признаков патологических областей. В 15, он имел заметно укороченное туловище и имел рост в 155 cm (5th percentile), нижний сегмент 92.5 cm и размах рук (span) в 186.5 cm. Соотношение span:height близко к единице у индивидов с нормальными пропорциями, но измерения показывают, что его foreshortened туловище уменьшает его высоту приблизительно на 30 см. При рождении, как было отмечено, он имел контрактуру левого указательного пальца, а в возрасте 15 лет он имел гипоплазию всех дистальных суставов между фалангами пальцев, которые стали длинными и тонкими. На рентгеновских снимках запястья и лодыжи были нормальными, связь между уродствами позвоночника и средей выраженности контрактурами пальцев остается спорной.
При секвенировании всей кодирующей области и сплайс-сайтов LFNG выявлена гомозиготная missense мутация (c.564C>A) в экзоне 3 (Sparrow et al., 2006), приводящая к замене лейцином фенилаланина (F188L). Родители пробанда имели нормальную анатомию позвоночника и оба были гетерозиготны по мутантному аллелю. Замещаемый остаток фенилаланина высоко консервативен (Correia et al., 2003) и близок к активному сайту энзима. Мутация создает новый Mse рестрикционный сайт энзима, который был использован для подтверждения результатов секвенирования в родословной. Этот вариант не был обнаружен у 34 этнически сопоставимых контрольных субъектов (68 хромосом), и лежащая в основе замена не была представлена в NCBI SNP базе данных (www.ncbi.nlm.nih. gov). Проверка мутации в дополнительной модели, базирующаяся на известной структуре glycosyltransferase, показала, что консервативный остаток фенилаланина (F188) располагается в спирали, которая packs напротив нити, содержащей Mn2+-ligating остаток скорее, чем непосредственно участвует в связывании UDP-N-acetylglucosamine или белка. Дальнейшие указания причинности были получены в функциональном исследовании мутантов LFNG. Две мутации F187L получены
в Lfng мышей, которые соответствовали F188L LFNG человека: c.564C>A мутация, которая кодировала редкий кодон лейцина (TTA), наблюдаемый у пробанда, и [c.562T>C + c.567C>GJ мутация, кодирующая наиболее распространенный лейциновый кодон (CTG) человека. В дополнение к ранее охарактеризованной энзиматически неактивной форме Lfng (D202A) была получена др., которая нарушает консервативный DDD Mn2+-связывающий активный сайт (Chen et al., 2001). Изучение экспрессии белка показало, что оба F187L мутантных Lfng белка экспрессировались на более высоких уровнях, чем дикого типа или D202A Lfng формы, указывая тем самым, что эффективность трансляции и стабильность белка не были негативно изменены при F187L замене аминокислот. Т.к. белок Lfng обычно присутствует в аппарате Гольджи (Fig. 7), поэтому изучали внутриклеточную локализацию белка, используя иммунофлюоресценцию. Дикого типа и D202A мутантный Lfng локализовались преимущественно в Гольджи, тогда как F187L мутантный Lfng не ко-локализовался с маркером. Был сделан вывод, что F187L мутантная форма Lfng экспрессируется, но неправильно располагается в клетке. Это единственный случай SCD, обусловленный мутантным LNFG предоставил дальнейшие доказательства, что собственно регуляция пути передачи сигналов Notch является абсолютной потребностью для правильного формирования паттерна осевого скелета, в то же самое время определил SCD type 3, или LNFG-associated SCD.
ALAGILLE SYNDROME (ARTERIOHEPATIC DYSPLASIA), JAGGED1 AND NOTCH2
Коротко рассмотрим JAGGED1 и NOTCH2 гены из-за их роли в передаче сигналов Notch и из-за того, что их мутации вызывают Alagille syndrome (AGS), который хорошо известен педиатрам и клиническим генетикам. Однако сведения об участии осевого скелета в AGS ограничены. AGS это мультисистемное нарушение, характеризующееся недостаточностью желчных протоков, приводящей к прогрессивной холестатической болезни печени (иногда проявляется как длительная желтуха новорожденных), и врожденным порокам сердца. Она характеризуется аутосомно доминантным наследованием в противоположность рецессивно наследуемому SCD из-за мутантных DLL3, MESP2 и LNFG, и соответствует большинству доминантно наследуемых заболеваний, она демонстрирует заметную изменчивость. Впервые описанная в 1969 (Alagille et al., 1969), она была очерчена в 1975 (Alagille et al., 1975) и были установлены диагностические критерии (Alagille et al., 1987). Table 5 дает список признаков AGS.
Очевидно, что широко распространенные признаки этого заболевания отличаются от чистых нарушений осевого скелета, наблюдаемых при SCD, описанных выше. Однако осевой скелет часть затрагивается при AGS, хотя и в меньшей степени, чем при SCD. Основной характеристикой является варьирующее присутствие расщепленных позвонков в форме бабочки (Fig. 13), иногда полу-позвонков и случайное отсутствие крестца. Эти скелетные аномалии редки среди др. проявлений у AGS пациентов. в
В классических случаях опытный клиницист может диагностировать AGS по незначительной дисморфии лица (Fig. 14). Лоб часто высокий и выступает вперед, глаза могут быть глубоко посажены и/или глазная щель узкая и наклонена вверх (up-slanting). Являются ли лицевые изменения вторичными по отношении к др. признакам AGS, таким как долговременные последствия cholestasis, предмет догадок (Kamath et al., 2002). Kamath et al. (2003) показали, что необычные лица наиболее пенетрантны из всех варьирующих клинических симптомов.
На крайнем конце болезненного спектра, тяжело страдающие субъекты имеют угрожающие жизни осложнения болезни печени и/или врожденного порока сердца. Болезнь печени обычно характеризуется бедностью внутрипеченочных желчных протоков при биопсии, но может происходить прогрессирование, приводящее в конечном итоге к циррозу и печеночной недостаточности, и вообще у четверти пациентов в раннем детстве прибегают к трансплантации органов. Врожденный порок сердца присутствует у большой части пациентов, и легочная сосудистая сеть вовлекается довольно часто. Т.о., pulmonary клапаны или стеноз легочной артерии и стеноз периферических легочных артерий являются наиболее частыми нарушениями, появляющимися у двух третей AGS пациентов (Emerick et al., 1999). Однако тетрада Фалло сложный порог возникает у свыше 10% пациентов, встречаются и дефекты вентрикулярной и атриальной перегородки (Alagille et al., 1975; Kamath et al., 2003). Интересно, что одна семья была описана с врожденной болезнью сердца, сегрегирующей с мутацией JAGGED1, в отсутствие печеночных или др. признаков AGS (Eldadah et al., 2001). AGS пациенты со сложным пороком сердца имеют плохой прогноз по сравнению с пациентами со сходными пороками сердаец , но без AGS (Emerick et al., 1999), причина этого не вполне понятна.
Ген JAGGED 1 локализован на хромосоме 20p12, представлен 26 экзонами и подобно DLL3, является лигандом для Notch рецепторов (Fig. 7) со сходной доменовой структурой (Fig. 15). Клонирован в 1997 (Li et al., 1997; Oda et al., 1997), обнаружены многочисленные мутации у затронутых пациентов. Описаны все типы мутаций-nonsense, missense, splice site, frame-shift, и делеции. Ранее сообщалось, что мутации идентифицированы у 70% пациентов (Krantz et al., 1998; Crosnier et al., 1999), сегодня их величина более 90% , когда используются строгие клинические критерии (B. Kamath, personal communication). До 5% пациентов AGS могут иметь микроделеции, затрагивающие хромосому 20p12 (Krantz et al., 1997), и таких пациентов нелегко отличить от пациентов с мутациями JAGGED1. Для тех гетерозигот по мутациям, которые картируются во внеклеточном и трансмембранном домене JAGGED1, отсутствуют четкие генотип-фенотипические корреляции (Kamath et al., 2003), а мутации в 70% случаев дают кодон преждевременного окончания. Как было предположено, гаплонедостаточность, следовательно, является основным механизмом AGS. Однако имеется интересная возможность доминантно-негативного эффекта укороченных форм Serrate/Jagged, хотя было осуществлено немного исследований мутантных мРНК и белков от пациентов AGS для выяснения молекулярных механизмов. Недавно в работе (Boyer et al., 2005) по стабильности мутантной мРНК была открыта возможность, что доминантно-негативный эффект может быть молекулярным механизмом у некоторых пациентов. Изучены транскрипты из печени от 5 пациентов и из 24 lymphoblastoid клеточных линий от AGS пациентов. Мутантные JAGGED1 транскрипты были извлечены из РНК с 5 missense мутациями, 2 in-frame делециями и в 19 из 21 с кодонами преждевременного окончания. Мутантные транскрипты были также извлечены из тканей 23-недельного AGS плода с мутацией, дающей кодон преждевременного окончания. Результаты указывают на то, что мутантные транскрипты с кодонами преждевременного окончания обычно избегают nonsense-обусловленного распада мРНК, это может затем приводить к синтезу растворимых форм JAG1. Сходные укороченные белковые транскрипты были идентифицированы в др. клеточных линиях, трансфицированных мутантной JAGGED1 кДНК, и присутствие мутантных белков, независимо от типа мутаций, подтвердило возможность доминантно-негативного эффекта. Точный механизм вызывания мутантным JAGGED1 AGS, следовательно, еще предстоит выяснить.
Вклад пути передачи сигналов Notch и JAGGED1 в intrahepatic bile duct formation (IHBD) остается неизвестным. Изучение паттернов экспрессии Jagged1, Notch2 и Hes1 2 у Hes1-нулевых мышей по сравнению с мышами дикого типа, указывает на то, что передача сигналов Notch очень важна для дифференцировки желчных эпителиальных клеток и существенна для образования ими трубочек во время IHBD. Jagged1 экспрессируется в портальной мезенхиме во время неонатального периода и в то же самый период наблюдается экспрессия Notch2 и Hes1 в желчных эпителиальных клетках рядом с Jagged1-позитивными клетками. Во время ремоделирования пластинки для протоков Notch2 и Hes1 активируются исключительно в желчных эпителиальных клетках, которые формируют трубчатые структуры, но образование трубочек при IHBD отсутствует у Hes1 нулевых мышей (Kodama et al., 2004). в
Наблюдение, что небольшое количество AGS пациентов негативно в отношении скрининга JAGGED 1 мутаций, несмотря на четкие диагностические критерии, ведет к заключению, что может вовлекаться вторичный локус в AGS. Двойные гетерозиготы Jaggedl/Notch2 мышей обладают печеночными, сердечными, глазными и почечными аномалиями, сходными с таковыми у AGS пациентов (McCright et al., 2002). Более того, паттерн экспрессии Noteh2 подтверждает. что может существовать тесная взаимосвязь его онтогенетического пути с Jagged1 (Loomes et al., 2002). Секвенирование NOTCH2 у 11 пробандов выявило мутации в двух случаях, чьи семьи вместе содержали 5 затронутых индивидов (Mc-Daniell et al., 2006). У обоих пробандов было тяжелое почечное заболевание, которое также присутствовало у всех слабо затронутых родственников, это открывает возможность слегка отличного спектра клинической тяжести по сравнению с JAGGEDl-позитивными случаями AGS.
Одна из мутаций, c.59301G→A (exon 33), предсказывает кодон преждевременного окончания экзона 34, так что три из 7 ankyrin повторов и последующая последовательность теряются. Ankyrin повторы располагаются внутриклеточно и взаимодействуют с с ядерными кофакторами, которые модулируют передачу сигналов Notch. Вторая мутация, C.1331G→A (экзон 8), приводит к замене остатка тирозина на цистеин в 11th EGF-подобном повторе (C444Y). Как и при missense мутациях, затрагивающих консервативный цистеиновый остаток в EGF повторах DLL3 и др. генов, это может быть патогенетическим и в самом деле такой замены не обнаружено в 220 контрольных хромосомах. Мутантный Notch2 рецептор, следовательно, подтвержден как редкая причина AGS. Ген NOTCH2 является крупным, состоящим из кодирующей области из 34 экзонов и вставленных 36 EGF-подобных повторов в дополнение к внутриклеточному домену ankyrin повторов. в
В терминах патофизиологии, внимание было уделено возможности того, что AGS является важным дефектом васкулогенеза (Kamath et al., 2004). Касательно, частоты врожденного порока сердца, становится ясно, что др. формы сосудистых аномалий происходят часто, до 9% пациентов AGS. В обзоре Kamath et al. (2004), были пациенты с аневризмами basilar артерий, средней церебральной артерии и аорты, а некоторые имели структурные аномалии внутренних сонных артерий. Из 268 рассмотренных пациентов, 25 (9%) имели достоверные некардиальные сосудистые аномалии и ещё 9 субъектов имели внутричерепные эпизоды в отсутствие задокументированных внутричерепных сосудистых аномалий. Из 29 пациентов этой группы, которые погибли, 10 (34%) стали жертвами некардиальных сосудистых осложнений. Отсутствуют генотип-фенотипические корреляции у них с не кардиальной сосудистой патологией. В самом деле, большинство типов мутаций, возникших в JAGGED1- nonsense, missense, splice site и frameshift. в
Дефектный васкулогенез у AGS согласуется с паттерном, наблюдаемым при дефектах пути передачи сигналов Notch. Большинство семейных с клиническим проявлением аутосомно доминантных заболеваний CADASIL (Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy) обусловлено гетерозиготной мутацией Notch 3 рецептора. Цереброваскулярные несчастные случаи и деменция обычно появляются начиная с позднего среднего возраста при данном заболевании, им часто предшествует в анамнезе атаки мигреней в более юном возрасте. Мутации в Notch 3 рецепторе, по-видимому, вызывают альтерации гладкомышечных клеток кровеносных сосудов (Joutel et al., 1996). У Notch1 нокаутных мышей и Notch1/Notch4 , а также у мышей, гомозиготных по мутациям Jagged1, нежизнеспособность обусловлена неспособностью к нормальному васкулогенезу (Xue et al., 1999; Krebs et al., 2000). В развивающейся печени образованию зрелых трубчатых желчных протоков предшествует формирование внутрипеченочных артериальных ветвей (Libbrecht et al., 2002). Дефектная передача сигналов Notch у AGS, следовательно, может быть механизмом, который ведет к бедности желчными протоками, за счет плохого развития сосудов. Однако специфичность аномальной сегментации позвоночника у AGS, в виде позвонков формы бабочек, делает дефектный васкулогенез маловероятным механизмом, вызывающим этот признак. Наиболее вероятно то, что гаплонедостаточность по JAG1 ведет к специфическим дефектам образования границ при сомитогенезе.
NOMENCLATURE AND TERMINOLOGY
При нарушениях сегментации осевого скелета радиологические признаки является критическими для диагностики синдрома, которая в свою очередь существенна для осуществления аккуратного генетического консультирования. Однако, в медицинской литературе и клинической практике номенклатура очень запутана, так что термины используются взаимно заменяя др. др. при описании фенотипов. При описании аномалий сегментации позвонков и ребер в терминах синдрома Jarcho-Levin, все признаки используются и при costovertebral (Norum and McKusick, 1969; Cantu et al., 1971; Bartsocas et al., 1981; David and Glass, 1983) / spondylocostal I spondylothoracic dysostosis I dysplasia. Строго говоря, эти нарушения являются скорее дизостозами, чем дисплазиями. Дисплазия означает онтогенетическую и постоянно текущую аномалию костно-хрящевых тканей во время (пре- и) постнатальной жизни, в то время как дизостозы являются стабильными состояниями, возникшими в результате возникновения аномалии в раннем морфогенезе.
Дающий свое название Jarcho-Levin syndrome (JLS) часто используется для всего спектра радиологических фенотипов, который включает abnormal vertebral segmentation (AVS) и расположения ребер. В 1938 Jarcho and Levin описали двух сибсов Puerto Rican происхождения с AVS всего позвоночного столба, хотя и более тяжелые в торакальной области (Jarcho and Levin, 1938). Присутствовало слияние некоторых ребер (Fig. 2) и оба субъекта погибли в детстве от легочной недостаточности. Тщательное исследование картин указывает на то, что фенотип очень близок к SCD type 2, обусловливаемого мутациями в MESP2. Чтобы предупредить беспорядок, мы полагаем, что необходимо отказаться от использования описательных (eponymous) обозначений в этой области в пользу более строгой описательной системы радиологических аномалий. Такая система была предложена International Consortium for Vertebral Anomalies and Scoliosis (ICVAS) и опубликована в деталях. Здесь мы предоставляем контур схемы (см. Appendix), которая является достаточно описательной, базируясь на радиологии позвоночного столба и на соотв. сегодняшнем знании Менделевских форм SCD.
Кроме того, чтобы внести логичность и уменьшить беспорядочность, необходимо, чтобы новая система классификации д. доказать (1) клиническую пригодность для рентгенологов, спинальных хирургов и клинических генетиков; и (2) готовность к переносу на биоинформационные подходы, разработанные биологами, специалистами по сегментации, так чтобы аномальные фенотипы осевого скелета у модельных животных могли быть описаны в той же самой системе. в
Во-первых, vertebral segmentation defects (VSD) д. быть идентифицированы по количеству затронутых, включая непрерывность, вовлеченных спинальных регионов. Они, следовательно, д. быть одиночными (SVSD), множественными (MVSD), или генерализованными (GVSD) и описываться внутри затронутй области, т.e., шейной, торакальной, поясничной и/или кресцово-копчиковой. Спинальные изгибы (напр., scoliosis) и морфология позвонков, напр., д. быть описаны полу-позвонки-complete, incarcerated или wedge, fusion, cleft, block, bar. Система позволяет использовать специфические радиологические признаки, напр., "pebble beach," "tramlines," и "sickle-shaped," которые связаны со специфическими фенотипами. Размер, форма и симметрия грудной клетки д. быть описаны и сходным образом количество ребер, симметрия и тип слияний ребер. Специфические термины. такие как spondylocostal dysostosis (SCD), д. быть зарезервированы за специфическими фенотипами, которые мы определяем как вовлечение смежных 10 или более сегментов, без присутствия несегментированного куска, обычными симметричной торакальной клеткой и количествами ребер, плюс присутствие межреберных слияний. Эти фенотипы коррелируют с генотипом, т.е. с участием генов DLL3, MESP2 и LNFG , которые предопределяют SCD1, SCD2 и SCD3, соотв. Сходным образом термин spondylothoracic dysostosis д. быть ограничен специфической комбинацией фенотипических признаков, как было описано выше. Термины Jarcho-Levin и Klippel-Feil д. быть устранены из-за их неразборчивого использования. Классификация, однако позволяет сохранить хорошо установленные и eponymous синдромные ассоциации, напр., Alagille и Robinow. в
Система д. стать предметом проверочных упражнений, состоящих из 10 разных рентгенологических AVS фенотипов, ранее невиданных, которые были независимо оценены членами ICVAS Classification Group. Вариабельность результатов исследований д.оцениваться статистически и д. достигаться kappa значение равным 0.77, указывающим на высокий уровень корреляции. Мы верим, что система станет неукоснительной для использования. Т.к. биологи специалисты по сегментации, работающие с животными моделями, идентифицируют гены кандидаты, то использование системы переносимой классификации д. базироваться на аккуратном фенотипическом описании , это облегчит стратификацию и тестирование кагорты пациентов для выявления дальнейших факторов, вызывающих аномальную сегментацию позвоночника у людей..
PERSPECTIVES
Abnormal segmentation of the spine is a relatively common birth defect but very diverse in nature and extent. Sometimes the simplest defect in segmentation can lead to devastating clinical consequences, for example severe progressive scoliosis secondary to a single congenital hemivertebra. There are no reliable data on the true frequency of these defects in man, and there is a need to study the epidemiology in greater depth and on a larger scale. Although much exciting developmental biological science in animal models is beginning to elucidate the mechanisms and signaling pathways in somitogenesis, studies of the mechanisms of abnormal segmentation in man pose enormous challenges. For the foreseeable future, there needs to be a strong alliance between developmental biologists and human geneticists and clinicians, such that the relevance of breakthroughs in the understanding of somitogenesis can be applied in a clinical setting. It is to this end that collaborative efforts are under way through the establishment of the multidisciplinary ICVAS. в
It will certainly prove to be the case that multiple different mechanisms account for abnormal segmentation. Not all will prove to be genetic, either in whole or in part. Small but significant progress has taken place with a group of rare disorders, the spondylocostal dysostoses, mostly inherited as autosomal recessive traits. There are undoubtedly more genes to be identified in elucidating the cause(s) of cases and families that bear all the hallmarks of Mende-lian traits. As yet, there are few clues to understanding the majority of abnormal phenotypes, characterized by limited, regional involvement of the spine and often manifesting marked asymmetry, sometimes with other organ systems involved. What are the genetic and disruptive factors giving rise to these phenotypes? Only when inroads are made in this group will it begin to be possible to offer reliable and accurate genetic counseling to affected families.
APPENDIX
ICVAS CLASSIFICATION OF CONGENITAL SPINAL MALFORMATIONS (ICVAS - International Consortium for Vertebral Anomalies and Scoliosis)
Ben Alman, Alberto S. Cornier, Philip F. Giampietro, Amaka Offiah, Olivier Tassy, Olivier Pourquie, Kenro Kusumi, Hid Sally Dunwoodie 
