Регуляция экспрессии генов у эукариот является сложным процессом, в основе которого лежат множество разнообразных аспектов клеточной биологии (1). Скорость транскрипции и пространственно-временная экспрессия любого данного гена является результатом сложной сети ДНК-белок и межбелковых взаимодействий, происходящих на промоторе гена. Первоначально этот феномен рассматривался как результат баланса между активаторами и репрессорами транскрипции (2-4). Однако, недавние исследования показали, что собственно экспрессия гена зависит также от доступности таких регуляторных факторов к промоторам генов. Доступ этих факторов управляется организацией хроматина и сказывается на генной экспрессии, в частности в виде репрессии транскрипции и молчании гена (5, 6). Как специфический статус хроматина м. влиять на молчание генов хорошо видно на примере геномного импринтинга и инактивации Х хромосомы (7-10).

По крайней мере, два основных механизма вносят вклад в контроль за организацией хроматина: метилирование ДНК и ковалентные модификации гистонов. Хотя эти механизмы различны, они взаимосвязаны. Оба вносят вклад в степень компактности хроматина (6). Более того, оба типа модификаций рассматриваются как 'epigenetic', подразумевая, что они может наследоваться во время мейоза или митозов без изменения последовательностей ДНК.

Метилирование ДНК происходит по 5'-углероду цитозинового остатка только в контексте CpG динуклеотида, Геномная ДНК у позвоночных глобально метилирована по CpG сайтам за исключением специфических регионов, называемых CpG островками, в которых плотность CpG динуклеотидов. по-видимому, существенно возрастает по сравнению с остальной частью генома (11). CpG островки обычно локализованы вблизи или внутри промоторов генов (11). Не метилированные CpG островки ассоциированы с транскрипционно активными генами. CpG островки могут быть также метилированы; это ассоциирует с репрессией транскрипции. Профили метилирования наследуются - неизменными - в ходе клеточных делений. Это свойство гарантируется несколькими клеточными DNA methyl transferases, обеспечивающие разные функциональные роли (12). DNA methyl transferase 1 (DNMT1) в основном посвящена поддержанию уже установленного паттерна метилирования, тогда как DNA methyl transferases 3A и 3B, по-видимому, необходимы для метилирования de novo (13-16). Недавно было показано, что DNA methyl transferase 3L играет критическую роль в мейозе путем супрессии реактивации ретротранспозона в зародышевых клетках самцов (17).

Ковалентная модификация гистонов происходит по специфическим аминокислотным остаткам в N-треминальном хвосте. Многие из энзимов, участвующие в модификациях гистонов прежде всего действуют на гистоны H3 и H4. Эти модификации создают изменения в сродства гистонов к ДНК и др. ассоциирующим не-гистоновым белкам (18, 19). Как результат эти модификации вносят вклад в конденсацию или реляксацию хроматиновых структур и те, в свою очередь предопределяют уровень экспрессии мРНК. Гистоновые модификации включают ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, poly ADP ribosylation, sumoylation и ubiquitination (20-25). Помимо энзимов, которые вносят специфические модификации, имеются также энзимы, такие как фосфатазы и гистоновые деацетилазы, которые их ревертируют (26, 27).

Ацетилирование гистонов коррелирует с транскрипционной активностью, тогда как деацетилирование гистонов ассоциирует с молчанием генов. Интересно, что специфические сайты из аминокислотных остатков N-терминальных хвостах гистонов могут быть модифицированы по разному, создавая таким образом разнообразные комбинации, которые могут иметь разный эффект на конденсацию хроматина. Эти находки привели к гипотезе существования точного 'histone code', который вместе с метилированием ДНК управляет рекрутированием и сборкой транскрипционного преиниационного комплекса (1-4, 28) и контролирует транскрипционную элонгацию (29) и возможно купированный с транскрипцией процессинг мРНК (30).

Помимо гистонов недавние исследования идентифицировали и др. белковые комплексы, которые являются критическими для регуляции молчания генов. Напр., белки Polycomb и Trithorax групп у Drosophila, по-видимому, устанавливают молчащее или открытое состояние хроматина, которое может наследоваться в ходе множественных клеточных циклов делений от первичного понуждающего к молчанию или активирующего сигнала (31, 32).

Молчание генов оказалось важным эпигенетическим механизмом для гомеостаза у многоклеточных организмов. Альтерации этого механизма, по-видимому, связаны с началом нескольких генетических нарушений у людей, включая immunodeficiency-centromeric instability-facial anomalies (ICF) syndrome, Rett syndrome (RTT) и facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD).

ICF синдром (OMIM 242860) это аутосомно рецессивное заболевание. характеризующееся нестабильностью перицентромерных регионов хромосом 1, 9 и 16; заметным иммунодефицитом, часто проявляющимся клинически в виде хронических респираторных и желудочно-кишечных инфекций; и характерным лицом с гипертелоризмом, epicanthal складками и аномальными низко-сидящими ушами (33, 34). Для большинства пациентов продолжительность жизни коротка из-за бронхиальных инфекций или хронической пневмонии (35). Большинство случаев ICF синдромов характеризуется мутациями в каталитическом домене гена DNA methyltransferase 3B (DNTM3B) (36, 37).

DNTM3B является de novo DNA methylase, которая метилирует цитозины в CpG парах, которые затем могут быть связаны репрессорами, такими как methyl CpG-binding protein 2 (MeCP2) (38). На мышиных моделях инактивация гена Dnmt3b дает нежизнеспособное потомство благодаря многочисленным онтогенетическим дефектам во время эмбриогенеза (14). Тяжесть фенотипа у мышей подтверждает, что пациенты с ICF синдромом д. сохранять некоторую остаточную метилазную активность; в самом деле, не выявлено ICF пациентов, гомозиготных по нулевому аллелю DNMT3B.

Одним из следствий наличия мутантного DNMT3b белка является специфическое и явное гиперметилирование перицентромерных областей хромосом 1, 9, и 16, которые характеризуются высоким количеством тандемных повторов последовательностей satellite II и III ДНК (39, 40). Гипометилирование этих областей, по-видимому, индуцирует деконденсацию хромосом, сопровождаемую увеличением хромосомных разрывов и воссоединений. На цитогенетическом уровне гипометилирование приводит к хромосомным аномалиям, включая хромосомные перестройки и удлиненные центромеры хромосом 1, 9 и 16. Интересно, что эти аномалии наблюдаются в лимфоцитах, но не в кожных фибробластах, указывая тем самым, что затрагивается ткане-специфический механизм мутациями DNMT3b (41).

Дефекты метилирования, наблюдаемые при ICF синдроме, вызывают и др. геномные последствия (42, 43). В частности inactive X (Xi) хромосома, состоящая из факультативного гетерохроматина, является глобально недометилированной у женщин с синдромом ICF (42, 44). Этот сценарий приводит к ещё большим осложнениям, однако, он позволил открыть вторую группу ICF пациентов, у которых имеются измененные профили метилирования всех последовательностей alpha сателлитной ДНК и нормальное метилирование Xi-CpG островков, но которые несут нормальный DNMT3b ген (45). эта находка подчеркнула возможность того, что новый, еще не идентифицированный, ген ICF может участвовать в эпигенетической модификации специфического набора гетерохроматиновых регионов. Необходимо упомянуть, что DNMT3b взаимодействует в несколькими ядерными факторами, включая histone deacetylase HDAC1 и её ко-репрессор Sin3a, который участвует в генном молчании (46), а также hSNF2H, KIF4A, и hCAPC/G, которые являются компонентами кухни конденсации митотических хромосом (47).

Чтобы исследовать, как мутации DNMT3b могут приводить к синдрому ICF, изучали профили экспрессии по всему геному в лимфоцитах от ICF пациентов и сравнивали с таковыми от нормальных индивидов. Эти исследования выявили дерегуляцию нескольких генов, большинство из которых кодирует специфические маркеры B-lymphocytes, тем самым становится возможным объяснение фенотипа иммунодефицита при этой болезни. Неожиданно профиль метилирования этих генов оказался нормальным, это исключает возможность того, что их дерегуляция является прямым следствием дефектной активности гена DNMT3b (36).

Что же вызывает ICF? Сформулировано несколько гипотез. Во-первых, несмотря на тот факт, что при генеральном анализе всех уровней 5-methyl-цитозин редуцирован лишь слегка и что статус метилирования генома кажется нормальным (43), нельзя исключить, что обычные подходы неспособны выявить гены, имеющие слегка измененные профили метилирования. Во-вторых, может предположить, что гипометилирование специфических повторяющихся элементов ДНК sможет играть роль в патогенезе синдрома ICF посредством транс-действующих эффектов гетерохроматина. Напр., показано, что центромерный гетерохроматин формирует кластеры в ядрах активированных B-lymphocytes млекопитающих, где молчащие гены рекрутируются и включаются (48, 49). Сходным образом, деконденсация перицентромерного гетерохроматина хромосом 1, 9 и 16 может действовать на удаленные области хромосом путем их ре-позиционирования в клеточном ядре. Эта модификация может индуцировать аберрантную транскрипцию генов, участвующих черепно-лицевом развитии и дифференцировке иммунной системы.

RTT (OMIM 312750) тяжелым нарушением нейрального развития и является второй ведущей причиной умственной отсталости у женщин с показателем 1 на 10,000 (50). Начинается болезнь в раннем детстве между 6 и 18 мес. RTT характеризуется прогрессивной потерей интеллектуальной функции, тонких и больших моторных навыков и способности общения, с появлением стереотипических движений руками, все это происходит после периода нормального развития (50).

Мутации в гене methyl-CpG binding protein 2 (MECP2), локализуются в Xq28, что характерно для 75% пациентов с RTT (51). Белок MeCP2 является повсеместно экспрессируемым репрессором транскрипции, который соединяется с метилированными CpG последовательностями посредством methyl-CpG-binding domain (MBD) (38). MeCP2 содержит также transcriptional repression domain (TRD) (52). Благодаря этому домену, MeCP2 взаимодействует с репрессорными комплексами, такими как Sin3A/HDAC1 (53, 54) или Ski/NcoR/HDAC2 (55), которые обеспечивают репрессию путем деацетилирования стержневых гистонов, участвуя тем самым в формировании гетерохроматина и молчания генов.

MECP2 мутации, ассоциированные с RTT, были картирована и в MBD и в TRD. Было предположено, что глобальное изменение репрессии транскрипции является основой этой болезни. Однако, все транскрипционные исследования, проведенные или на нокаутных мышах или MECP2-дефицитном головном мозге оказались неспособными выявить унифицированную молекулярную картину brains failed to produce a unified molecular picture (56-59). В частности, было показано, что MECP2-дефицитные мыши не обнаруживают драматических изменений профилей транскрипции даже у мышей с явной болезнью (59). Растут доказательства, показывающие, что первичным местом действия MeCP2 являются нейроны головного мозга (60-63).

Поиск биологических MeCP2 мишеней затруднен и выделено очень мало генов кандидатов. Эта проблема может объясняться тем фактом, что MeCP2 может или действовать локально на один специфический промотор или оказывать дально-действующие эффекты на структуру хроматина высшего порядка. Кстати, единственный ген у млекопитающих, который был доказан как прямая мишень для MeCP2 является brain-derived neurotrophic factor (BDNF). BDNF кодирует neurotrophin, который существенен для пластичности взрослых нейронов, обучения и памяти (64-66). Как и ожидалось, MeCP2 был обнаружен в ассоциации с метилированными CpG последовательностями, стоящими выше промотора BDNF. Интересно, что поведение MeCP2 на промоторе BDNF очень динамично, его ассоциация модулируется в ответ на внеклеточные сигналы (64, 65). Отделение MeCP2 от промотора приводит к переключению на транскрипционно пермиссивное состояние хроматина.

В согласии с дально-действующим эффектом MeCP2 на структуру хроматина высшего порядка, было показано, что MeCP2 существенен для формирования структуры молчащего хроматина нового импринтируемого локуса мышиного генома, названного Dlx5-Dlx6 (67). Ген Dlx5 кодирует гомеобоксный белок, участвующий в формировании паттерна головного мозга. У MECP2-дефицитных животных, relaxed imprinting Dlx5 теряется в результате происходит двухкратное увеличение уровня транскрипции гена Dlx5. Ген DLX5 человека также импринтируется. Интересно, что матерински импринтируемый статус локуса DLX5 человека теряется в линии lymphoblastoid клеток, полученных от RTT пациентов, болезни, которая напоминает ту, что наблюдается у MECP2-дефицитных мышей (68). Итак, эти исследования подчеркивают функциональную пластичность MeCP2 и подтверждают, что RTT фенотип может быть результатом нескольких отличающихся аберрантных механизмов транскрипции генов.

FSHD (OMIM 158900) является с ранним началом аутосомно доминантной миопатией, главным образом характеризующейся прогрессивной и варьирующей атрофией и слабостью лицевых, плечевых и верхнего пояса мышц (69). Прогрессирование болезни непредсказуемо и обычно наблюдается широко варьирующий клинический спектр среди пациентов.

FSHD является интересным Mendelian нарушением. которое не является результатом классической мутации внутри белок-кодирующего гена. Почти все FSHD пациенты несут делецию интегрального количества тандемных 3.3 kb гетерохроматических повторов, названной D4Z4, расположенной на хромосоме 4q35 (70). Делеция D4Z4 затрагивает организацию хроматина 4q35 субтеломерной области, а значит и экспрессию соседних генов. Как результат 4q35 гены, расположенные выше D4Z4, обнаруживают не соответствующую избыточную экспрессию особенно в мышцах FSHD (71). Элемент внутри D4Z4 (D4Z4 Binding Element) , как было установлено, ведет себя как silencer, который предоставляет места связывания для репрессирующего транскрипцию комплекса, формируемого с помощью YY1, HMGB2 и nucleolin. Эти результаты подтверждают модель, согласно которой делеция D4Z4 ведет к не соответствующей дерепрессии транскрипции 4q35 генов, что приводит к болезни (71, 72).

Недавние эксперименты показали, что YY1 рекрутирует HDAC1 и белок Ezh2, histone lysine methyltransferase, родственную с Polycomb group protein enhancer of zeste, на геномную область молчащих мышце-специфических генов (73). Эти результаты указывают на то, что этот комплекс может быть вовлечён в репрессию транскрипции специфического набора скелетно-мышечных генов. Эти данные подкрепляют гипотезу, что делеция D4Z4 может влиять на экспрессию 4q35 генов путем модификации структуры хроматина высшего порядка.

Делеция D4Z4, как было показано, ассоциирует с заметными гипометилированием делетированного D4Z4 аллеля у индивидов с FSHD. Кстати, FSHD фенокопии (индивиды с симптомами клинически идентичными с FSHD, но не несущие делеций D4Z4) также обнаруживают гипометилирование D4Z4 (74).

FSHD может рассматриваться как интересная модель для изучения позиционного эффекта у людей. В самом деле, делеция D4Z4 может вызывать стохастическую изменчивость в экспрессии генов в мышечных клетках и объясняет асимметричное вовлечение мышц, значительную вариабельность клинического проявления между и внутри семей и очевидный пороговый эффект, причем имеется потребность в делеции определенного количества копий D4Z4 для возникновения FSHD.

Although studies focusing on the relationship between chromatin and cancer have become quite popular (75, 76), only recently investigations have focused on how altered regulation of chromatin architecture may contribute to certain inherited diseases. In this review, we have focused on three such diseases. RTT, ICF syndrome and FSHD follow a typical Mendelian inheritance in that they are caused by mutations in either specific genes or genomic regions. However, these mutations affect genes or regions involved in controlling or maintaining specific chromatin architecture, thus altering gene transcription and, in particular, gene silencing. Contrary to many other Mendelian disorders, RTT and ICF syndromes show complex and variable phenotypes that can be explained by the fact that the protein factors involved might act on several genes. Alternatively, like in the case of FSHD, tandem repeats of the D4Z4 sequence, depending on their number, may generate different transcription conditions ranging from complete silencing to overt transcription of flanking genes.

RTT and ICF syndromes are caused by defects in either generating or recognizing the correct DNA methylation pattern of genomic DNA. It would be plausible to think that mutations in either DNMT3b or MeCP2 might therefore generate similar and/or overlapping phenotypes. Instead, the two diseases are phenotypically distinct with great heterogeneity among patients. This inconsistency suggests that the involved genes are not sufficient per se to explain the complexity of phenotypic diversity.

Many factors may contribute to the formation of heterochromatin complexes responsible for tissue-specific gene silencing; identifying these factors will be key areas for further investigation. First, it will be important to identify the components of the silencing complexes that interact with MeCP2, DNMT3b, and the D4Z4 repeats, and to define their allelic variability and the higher-order chromatin structures that they may form. Second, additional non-protein elements, such as microRNAs, should be considered. MicroRNAs are small non-coding RNAs that regulate gene silencing by post-transcriptional mechanisms. Although they have been described in the context of physiological conditions such as the assembly of centromere heterochromatin and, more recently, transcriptional silencing of the a-globin gene (77–80), recent studies have revealed their importance in the genesis and progression of cancer (81, 82). Thus, it is likely that such elements may also play a role in other human disorders.

A third set of factors to consider are repetitive DNA sequences, which can also be critical for heterochromatin formation and silencing of proximal genes. These sequences may have different functions. For instance, the number of repeats in a specific region may determine how many repressing complexes will be assembled and, thus, how efficient transcriptional silencing of flanking genes will be. Under particular conditions, repetitive sequences can also be transcribed, and their transcripts may function to modify chromatin assembly. This phenomenon has been illustrated in the case of the satellite III repeats within the pericentromeric DNA of human chromosome 9 (83). Moreover, certain combinations of repetitive elements may have been selected during evolution to establish precise gene silencing patterns. X chromosome inactivation is an interesting example in which a specific set of LINE-1 sequences is distinctive of this chromosome and undergoes hypermethylation only on the Xi chromosome (84, 85).

Altered gene silencing explains many aspects of the pathogenesis of ICF syndrome, RTT and FSHD. These disorders represent a paradigm for other inherited diseases with complex phenotypes that have been difficult to classify or study. Defining the molecular mechanisms responsible for higher order chromatin organization, imprinting and coordinated gene regulation will not only help understand how their alterations generate human disorders but also provide the basis for the identification and development of novel compounds to target transcriptional repression and silencing.