Чтобы функционально связать гены с CAD с помощью genome wide association studies (GWAS) и исследовать клеточные и молекулярные механизмы атеросклероза, использовали chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-Seq) с CAD ассоциированным транскрипционным фактором TCF21 в human coronary artery smooth muscle cells (HCASMC). Анализ идентифицированных генов мишеней для TCF21, связанных с CAD патофизиологией, включая "growth factor binding," "matrix interaction" и "smooth muscle contraction." Мы охарактеризовали каноническую последовательность связывания TCF21 как CAGCTG, идентифицировав AP-1 сайты связывания в виде TCF21 пиков и путем проведения ChIP-Seq для JUN и JUND в HCASMC, подтвердив, что имеется существенное перекрывание между TCF21 и AP-1 локусами связывания в этом типе клеток. Выраженность вариаций количественного признака, картируемого для TCF21 генов мишеней, была существенно увеличена среди вариантов с низкими P-занчениями при GWAS анализе, подтвердив возможное функциональное взаимодействие между связыванием TCF21 и причинными вариантами в др. болезненных локусах для CAD. Выявлена избыточная репрезентация генов мишеней для TCF21 среди генов, ассоциированных с CAD, и неравновесное сцепление между пиком TCF21 вариаций и пиками, обнаруженными в GWAS локусах, это согласуется с гипотезой, что TCF21 может влиять на риск болезни посредством взаимодействия с др. локусами, ассоциированными с болезнью. Интересно, что обогащение генов мишеней для TCF21 было также обнаружено в др. геномных ассационных фенотипах, включая inflammatory bowel disease. Полученные данные подтверждают, что GWAS транскрипционные факторы могут быть высоко пригодным подходом для идентификации взаимодействий генов беолезни и mtv самым путей, которые могут иметь отношение к этиологии сложных болезней.
Coronary artery disease (CAD) наиболее частая причина гибели в индустриализованных странах и быстро увеличивается в развивающихся странах. С 1990 больше всего людей во всем мире погибает от CAD, чем от др. болезней1. Связанная с возрастом смертность, обусловленная CAD в Сев. Америке и Зап. Европе, падает ежегодно, т.к. в этих популяциях возраст предпочтения CAD действительно возрастает и эта тенденция, как ожидается, ускорится в будущем благодаря растущей эпидемической тучности. В развивающихся странах снижение детской смертности, как ожидается, изменит демографическую структуру, в результате чего больше взрослых подвергнутся риску CAD.
CAD давно была известна как внутрисемейная ('run in families'). Небольшая пропорция случаев может быть отнесена к редким, с высокой пенетрантностью, моногенным эффектам, но большинство из них мультфакториально по своей этиологии с вовлечением многочисленных средовых и наследственных факторов риска. Идентификация специфических генов чувствительности расширяет наши знания о молекулярной патофизиологии CAD, улучшает идентификацию индивидов с высоким риском и делает возможным поиск лекарств.
Т.к. модифицируемые факторы риска, связанные со стилем жизни, такие как курение, вносят важный вклад в CAD, то фармакологические вмешательства составляют лишь часть любой профилактической стратегии. Тем не менее, потребность в эффективных лекарствах существенна и некоторые важные преимущества превентивной терапии уже получены. Наиболее заметным явилось использование statins - лекарств, которые понижают уровни low density lipoprotein (LDL) cholesterol. Важно знать вклад человеческой генетики в это открытие: изучение Менделирующей болезни, семейной hypercholesterolaemia, выявило участие LDL receptor (LDLR) в CAD, это продвинуло наше понимание путей метаболизма холестерола, которые играют ключевую роль в патогенезе CAD.
Несмотря на этот успех, новые лекарства - следовательно, новые лекарственные мишени - необходимы. В дополнение к имеющимся маркерам, нет адекватных для предсказания индивидуального риска возникновения CAD, что придает даже еще большее значение усилению наших знаний о патофизиологии CAD. Сегодня нет полностью удовлетворяющих животных моделей CAD. Позволяющие генетические манипуляции мышиные модели и инбредные линии информативны в отношении некоторых аспектов атеросклероза (ключевого компонента в развитии CAD) и липидных промежуточных фенотипов, но не в отношении важных аспектов инфаркта миокарда у людей, главного клинического исхода CAD. Следовательно, новая патофизиологическая информация об этой ключевой области в основном зависит в значительной степени от генетики человека.
Молекулярно-генетические исследования редких Менделирующих заболеваний идентифицировали немногие мутации, которые вызывают преждевременную CAD. Генетические исследования промежуточных фенотипов, которые базируются на этих находках, раскрывают наследственную основу некоторых факторов риска атеросклероза, которые позволяют объяснить часть индивидуального наследуемого риска для общераспространенных, мультифакториальных CAD (rev. 2). Однако, всё ещё имеется огромный пробел в нашем знании о генах, которые участвуют в предрасположенности у большинства пациентов с мультифакториальными CAD.
The pathobiology of CAD - an overview
Клинические проявления CAD являются главными осложнениями атеросклероза - лежащего в основе процесса, который также ответственен за ишемические инсульты и болезни периферических сосудов. Атеросклероз является дегенеративным заболеванием, характеризующимся прогрессивным отложением липидов и фиброзного матрикса в стенке артерий (FIG. 1). Лежащая в основе патология отражает сложные серии событий и по большей части отражает затрагиваемые молекулярные и клеточные процессы. Ключевыми ступенями являются потеря нормальной барьерной функции эндотелия, аномалии липопротеинов, которые способствуют поступлению липидов (включая высокие уровни LDL и/или низкие уровни high density lipoprotein (HDL) cholesterol), рекрутированию моноцитов и лимфоцитов в стенку артерий и пролиферации гладкомышечных клеток (rev. 3).
Хотя этот процесс отражает глобальные изменения в функции эндотелия, клинически важными повреждениями являются фокальные, стремящиеся появиться в специфических местах (FIG. 2). Ранние повреждения появляются в виде прожилок жира (fatty streaks), которые характеризуются липид-содержащими пенистыми (foam) клетками. Эти последние превращаются в атеросклеротические бляшки, которые состоят из липидной сердцевины и покрывающей фиброзной шапочки. Некоторые переменные управляют процессами, которые ускоряют клинические события и в конечном итоге влияют на исход болезни: бляшки могут оставаться молчащими, могут прогрессивно сужать просвет сосуда, что ограничивает кровоток (вызывая angina) или могут ускоренно закупоривать сосуд благодаря острому тромбозу, который ведет к инфаркту миокарда. Клинические признаки CAD, следовательно, практически результат сложного болезненного процесса со значительной степенью гетерогенности среди пациентов, которые, как кажется, имеют сходные клинические проявления и, как результат, значительную генетическую гетерогенность. genetic heterogeneity.
Genetic basis of CAD as a complex trait
Молекулярно-генетические исследования редких, Менделирующих форм болезней идентифицировали некоторые мутации, которые вызывают преждевременную CAD (TABLE 1), многие из которых затрагивают уровни LDL и HDL cholesterol. Однако, широко распространенные мультифакториальные CAD, как было установлено, также имеют наследственную основу. Данные собранные в течение 36 лет в когорте из 20,966 шведских близнецов показали, что наследование фатальных CAD событий составляет 57% и 38% для мужчин и женщин, соотв.4. Влияние генов становится очевидным в возрастной группе в 36-86 лет, слегка снижаясь у более старых мужчин (но не у женщин), возможно благодаря увеличению варианс средовых факторов с возрастом5. Это имеет значение для отбора затронутых индивидов для генетических исследований (BOX 1).
Степень, с которой образование семейных кластеров CAD может быть объяснено с помощью наследственных количественных вариаций классических факторов риска - таких как LDL и HDL cholesterol и кровяное давление (BOX 2) - спорна6,7. В Framingham Heart Study, в большом, базирующемся на сообществах, проспективном исследовании наличие в анамнезе родительской преждевременной коронарной, cerebrovascular болезни или болезни периферических сосудов (после согласования по возрасту и курению) явилось строгим фактором риска для CAD (с коэффициентом отклонения (odds ratios (OR)) в 2.4 для мужчин и 2.2 для женщин). После корректировки по некоторым классическим факторам риска семейный анамнез продолжал предсказывать избыточный риск (OR = 2.0 для мужчин и 1.7 для женщин)8. Сходные заключения были сделаны и в PROCAM исследовании, при котором инфаркт миокарда в семейном анамнезе, как было установлено, является независимым предсказателем риска CAD9. Исследование INTERHEART10 подтвердило, что CAD в семейном анамнезе (после корректировки на возраст, пол, курение и геограйический регион) является фактором рстка (OR = 1.55); после корректировки по 9 классическим факторам риска, риск снижался незанычительно (OR = 1.45). Это указывает, что др. генетические факторы также играют роль наравне с влиянием известных факторов риска, таких как уровни cholesterol и давление крови.
Эти находки подтвердили аргументы в пользу изучения по всему геному сцепления и ассоциированных с генами исследований для идентификации генов CAD-чувствительности. Эти подходы не зависят от предыдущей информации о биохимических путях или патофизиологии. Они, следовательно, служат дополнением к исследованиям генов-кандидатов, которые концентрируются на хорошо известных факторах риска и биологических путях, таких как уровни, метаболизм и транспорт холестерола.
Genetic architecture of CAD susceptibility
Хотя общий генетический вклад в риск возникновения CAD может быть определен количественно, определение размера и количества вносимых эффектов невозможно без идентификации всех генов CAD-предрасположенности. Тем не менее, генетическая сложность предрасположенности к CAD, как подсчитано, существенна. Во-первых, список известных факторов риска длинный и многие из этих признаков обладают своей собственной сложной генетической основой. Во-вторых, CAD довольно редка до 50 летнего возраста и, следовательно, ограничена популяцией пожилых. Следовательно, она может рассматриваться как полностью современная болезнь, которая не являлась предметом прямого селективного давления, т.к. мало вероятно, что она оказывала эффект на успешность воспроизведения. Варианты, которые ограничивают предрасположенность или защищают от CAD, могут, следовательно, быть нейтральными в последнее время и д.б. представлены широким кругом частот11. Только если эти варианты обладают плейотропными эффектами, которые затрагивают предрасположенность к более 'ancient' болезням (напр., к инфекционным болезням), м. оказаться аллелями со значительными эффектами на предрасположенность к CAD сегодня с обнаружимыми частотами.
Внутри этой ожидаемой сложности как общераспространенные, так и редкие варианты скорее всего участвуют в предрасположенности к CAD. Однако, как в случае любого сложного признака имеется некоторая неопределенность, которая может оказаться более важной. Недавнее исследование генов-кандидатов для идентификации вариантов, которые ассоциируют с низкими уровнями в плазме HDL cholesterol, показали, что множественные редкие аллели, каждый из которых ассоциирован с крупных фенотипическим эффектом, совместно вносят существенный вклад в популяционное распределение этого количественного признака12. Это находится в конфликте с моделью common disease/common variant (CDCV) генетической архитектуры общераспространенных болезней. Кроме того, популяционные исследования кровного родства и превалирования сложных заболеваний привели к заключению о важной роли вредных рецессивных аллелей при CAD, заключение, которое также вступает в конфликт с моделью CDCV13. Эти находки открывают потенциал, касающийся способности ассоциационных исследований (которые обладают малой мощностью детекции редких вариантов), чтобы быть эффективным для CAD. Однако, в противоположность этому, обзор 25 описанных ассоциаций подтверждает важность общераспространенных аллелей при общераспространенных заболеваниях, включая и CAD14. Более того, некоторые CAD гены были открыты при обследовании всего генома, что согласуется с CDCV моделью.
Positional cloning: linkage-based family studies
A role for MEF2A? Семьи с Менделирующими CAD без ассоциированного синдрома описываются не часто. Несмотря на это, Wang и др.15 сообщили о позиционном клонировании аутосомно доминантной мутации с ролью в CAD на базе скрининга геномного сцепления в одиночной multiplex семье. тонкое картирование локуса оказалось затруднено, т.к. только 14 информативных мейозов (предполагающих полную пенетрантность) было доступно для изучения и сцепленная область содержала, по крайней мере, 93 идентифицированных генов. Авт. сконцентрировали свое внимание на гене myocyte enhancer factor 2A (MEF2A), который кодирует транскрипционный фактор, а паттерн его эмбриональной экспрессии указывает на его роль в васкулогенезе. В 21-п.н. in-frame делеция ко-сегрегировала с болезнью в этой семье и отсутствовала у 119 индивидов с нормальной ангиограммой. In vitro исследования показали, что делеция затрагивает функцию гена. В последующем мутационном обследовании не родственных случаев и нормального контроля выявлены три редких варианта, которые кодируют non-synonymous мутации в MEF2A, ассоциирующие с CAD16. Один из этих вариантов, Pro279Leu, был ассоциирован с риском CAD в Испанской когорте17.
Однако, сцепление между MEF2A и CAD остается дискуссионным. Weng и др.18 использовали resequencing подход, сконцентрировавшись на изменчивости экзонов в этом гене в случаях преждевременных CAD. Идентифицировано 5 non-synonymous вариантов, из которых только один, Ser360Leu, не был обнаружен в бессимптомных контрольных выборках. Боле того, делеция в 21 п.н., идентифицированная Wang и др.15 была идентифицирована в контрольной популяции и не обнаруживала ко-сегрегации в семьях с CAD с ограниченным числом информативных мейозов18. Эти данные не подтверждают, что делеция MEF2A является высоко пенетрантным аллелем CAD, но всё ещё может быть совместима с ролью вариантов MEF2A в предрасположенности к CAD. Альтернативно, т.к. др. полностью сцепленные варианты последовательностей д. существовать в оригинальном описанном интервале, пока ещё не идентифицированный ген д. объяснять оригинальную находку по сцеплению.
A success for linkage: evidence for the role of leukotrienes.
Изучение генетического сцепления было подвергнуто критике в качестве первой ступени позиционного клонирования генов предрасположенности для общераспространенных болезней, т.к. его результаты заведомо трудно воспроизвести для мутаций с низкой пенетрантностью с малыми эффектами. Прогресс от 'linkage-to-locus' также остается трудной технической задачей, несмотря на доступность геномных ресурсов имеется относительно мало примеров локусов сложных заболеваний, которые были бы клонированы подобным образом. Однако, один пример успешного использования такой стратегии связан с идентификацией ALOX5AP (который кодирует 5-lipoxygenase activation protein (FLAP)) в качестве гена предрасположенности к инфаркту миокарда и инсульам19.
При изучении сцепления в Исландских семьях, были получены невысокие
LOD scores (1.5-2.9) для локуса, который был идентифицирован для инфаркта миокарда и инсультов, когда данные были подразделены по полу и возрасту начала. Однако, ни один из этих статистических критериев не удовлетворял строгим критериям достоверности для всего генома (что не было неожиданным для исследований сцепления сложных болезней). Идя в разрез с современной модой использования SNPs, 120 микросателлитных маркеров было затем использовано для сканирования в 8-Mb сцепленной области для доказательства генетической ассоциации с инфарктом миокарда, что привело к идентификации ALOX5AP.
FLAP белок активирует arachidonate 5-lipoxygenase (ALOX5), которая катализирует биосинтез leukotriene LTA4 - путь, который был независимо установлен в патогенезе атеросклероза у людей20 (FIG. 3).Более того, мышиный аллель Alox5, который произошел от определенных инбредных линий, обеспечивает высокую защиты от атеросклероза на на высоком генетическом фоне cholesterol (Ldlr-/- нокаут); сходные находки были сделаны, когда гетерозиготные Alox5 нокаутные мыши были скрещены с Ldlr-/- животными21.
Идентификация причинного варианта в ALOX5AP оказалась более трудной. В Исландском исследовании19, подход с SNPs в затронутых семьях выявил множество вариантов ALOX5AP, которые были в строгом неравновесном сцеплении с фенотипом болезни, но ни один из них не имел очевидного эффекта на функцию (напр., ни один не вызывал non-synonymous замен). В Исландских выборках, 4-SNP haplotype (HapA) обнаруживал строгую ассоциацию с инфарктом миокарда, но это не было подтверждено в выборке Британских пациентов с инфарктом миокарда; однако, дальнейший анализ выявил разные 4-SNP risk haplotype (HapB) в Британской выборке. Эти разные риск-гаплотипы в популяциях с разными генеалогиями могут указывать на аллельную гетерогенность предрасположенности к CAD.
Исландский HapA risk haplotype ассоциирован с повышенным высвобождением нейтрофилами leukotriene B4 (LTB4), который синтезируется с LTA4, указывая тем самым, что ALOX5AP варианты могут быть про-воспалительными. LTB4 активирует моноциты, которые мигрируют через артериальный эндотелий и дифференцируются в макрофаги, которые продуцируют липиды, чтобы стать foam клетками, ключевое раннее событие в развитии атером (FIG. 1). Блокада LTB4 рецепторов, как было показано, редуцирует количество накапливаемых липидов, инфильтрацию моноцитов и размеры повреждений у Ldlr-/- или ApoE-/- (apolipoprotein E) нокаутных мышей, моделирующих атеросклероз (которые чувствительны к атеросклерозу благодаря dyslipidaemia)22. Следовательно, первоначальные исследования сцепления, которые указывали на роль ALOX5AP
в предрасположенности к CAD предоставили первые генетические доказательства вовлечения leukotriene пути в эту болезнь, находка, которая недавно была подтверждена с помощью изучения ассоциаций генов-кандидатов23.
The outlook for further linkage studies. Некоторые скрининги сцепления по свему геному варьирующих размеров были опубликованы для CAD, в основном используя семьи, которые были выбраны на базе, что они включают выживших после раннего инфаркта миокарда (чтобы выявить генетическую компоненту). Помимо исследования, которое привело к идентификации ALOX5AP,
эти скрининги - включая очень крупные - продуцировали локусы, но еще не идентифицировали гены27-30. Предполагаемые локусы не были реплицированы, но это не должно выглядеть неожиданным (или на самом деле волнующее) т.к. ни одно из этих исследований не обладает статистической силой, чтобы реплицировать специфические локусы. Скорее соотношение сигнал-шум таково, что эти исследования будут иметь низкую силу выявлять индивидуальные гены предрасположенности и так что каждое будет стремиться с помощью шанса идентифицировать разные выборы. По той же причине мало вероятно извлечь выгоду с помощью объединения или мета-анализа31 доступных исследований пока не будут исследованы более крупные выборки по сравнению с теми, которые первоначально идентифицировали специфические локусы. В будущем предполагаемые локусы, которые выявлены в результате сканирования сцеплений по всему геному, будут скорее информировать о выборе областей для систематических крупно масштабным ген-ассоциированных исследований.
Candidate-gene association studies
Исследования генов-кандидатов строятся на существующих знаниях путем исследования вариацией в генах, которые уже участвуют в патофизиологии болезни. Исследования мотивируются с помощью разного типа доказательств (которые могут быть также разного качества). Напр., исследования apolipoproteins, которые имеют хорошо изученную роль в атеросклерозе, позволили идентифицировать QTLs, которые ассоциируют с CAD (напр., lipoprotein A (REF. 2)). Однако генетика человека часто интригует менее очевидными связями, может надеяться, что это позволит открыть новые возможности для терапии - на полпути к дому между классическим исследованием генов-кандидатов уже известных биологических путей и проектами геномного позиционного клонировании, которые обладают потенциалом идентифицировать новые гены и пути.
Частичное перекрывание в воспалительных реакциях, которые наблюдаются при хронических инфекциях и атеросклерозе способствовало исследованию возможной роли инфекционных агентов , которые могут запускать процесс образования бляшек32. Это привело к открытию интересных генов кандидатов для CAD, которые участвуют во врожденном иммунитете. Среди них, CD14, связанный с мембраной гликопротеиновый рецептор для бактериальных lipopolysaccharide (LPS), оказался первым геном, участвующим в предрасположенности к CAD. Полиморфизм промотора (Cys260Thr), который как было предположено является транскрипционно активным33 многократно исследовался34, хотя и не было выявлено достоверных ассоциаций.
Др. компонент передачи сигналов врожденного иммунитета,
toll-like receptor 4 (TLR4) - который является важным ко-рецептором для CD14 - также участвует в предрасположенности к CAD34,35. TLR4 распознает экзогенные pathogen-associated molecular patterns (PAMPS) (напр., LPS), а также эндогенные лиганды и активирует воспалительные клетки посредством NF-кB пути. Широко распространенный non-synonymous полиморфизм (Asp299Gly) в TLR4 ассоциирован с низкими уровнями некоторых биомаркеров воспаления и и снижения в каротидной артерии intima-media thickness (IMT)36. Снижение риска CAD, которое ассоциирует с этим полиморфизмом37 выявлено также в исследованиях острого коронарного синдрома и в подгруппе людей, которые лечились statins38. Гипотеза, что TLR4 обеспечивает связь между врожденным иммунитетом, воспалением и атеросклерозом далее было подтверждено в исследованиях Tlr4/ApoE двойных нокаутных мышей39. Эти мыши обнаруживают скромное снижение размеров атеросклеротических бляшек по сравнению с одиночными нокаутными по ApoE мышами, которые чувствительны к атеросклерозу благодаря dyslipidaemia. Однако, крупные исследования ассоциаций этого полиморфизма не выявили различий в воспалительных маркерах у носителей TLR4 299Gly варианта и даже выявили некоторое увеличение риска инфаркта миокарда40. Кроме того. исследования стеноза коронарных артерий показали отсутствие ассоциации с этим вариантом41. Это несоответствие результатов может быть объяснено дифференциальными патогенными механизмами инфаркта миокарда (где разрушение бляшек ведет к закупорке коронарных сосудов) и др. CAD фенотипами, при которых бляшки могут быть крупными, но относительно стабильными40. Альтернативно, это может просто отражать привычный жизненный цикл ген-ассоциированных исследований для сложных болезней, при которых небольшие генетические эффекты на границах обнаружения трудно воспроизводятся14,42.
Два успешных исследования candidate-gene ассоциаций по идентификации предрасположенности к CAD представили дальнейшие доказательства роли компонентов leukotriene пути, вытекающие из исследований сцеплений, описанных выше, которые выявили роль ALOX5AP. Для первого из этих промоторных вариантов в гене ALOX5 выявлена ассоциация в повышенным IMT коронарных артерий, преклиническим маркером атеросклероза23. В этом исследовании высокие диетические уровни arachidonic acid (an omega-6 polyunsaturated fatty acid) повышали каротидное IMT, тогда как полученная из рыб omega-3 fatty acids оказывала противоположный эффект, указывая тем самым на взаимодействие ген-среда. Интересно, что уровни C-reactive protein (CRP) также были ассоциированы с вариациями ALOX5 в этом исследовании23. CRP является не специфическим биомаркером воспаления и выше среднего предсказателем риска CAD24 (BOX 2), и как полагают, оказывает непосредственное влияние на формирование бляшек25. Фаза II клинических испытаний соединения, которое ингибирует FLAP, сейчас проводится, чтобы оценить эффекты на биомаркеры воспаления при сердечно-сосудистых заболеваниях26.
Др. компоненты leukotriene пути могут рассматриваться как возможные гены кандидаты для CAD. Ген LTA4H, кодирует leukotriene A4 hydrolase, metallopeptidase которой катализирует ограничивающую скорость ступень биосинтеза LTB4. Генетическая изменчивость LTA4H, как было установлено, ассоциирует с CAD (REF. 83). Сила ассоциации была слабой у пациентов Европейского происхождения, но значительно более сильной у Афро-Американских пациентов, это указывает на то, что имеется специфическое для родоначальных групп взаимодействие, вызывающее чувствительность к LTA4H. Эти результаты подтверждают важность генетической изменчивости в генах воспалительного пути для патогенеза CAD.
Однако, несмотря на некоторый успех с подтвержденными находками14, исследования ассоциаций одиночных генов остаются проблематичными, с плохо воспроизводимым большинством. Т.к. только небольшая пропорция вариантов обнаруживает достоверный эффект, эти исследования имеют a priori низкие шансы идентификации важных вариантов. Однако, мало масштабные исследования легче проводить и они становятся более многочисленными; некоторые дают ложно-позитивные ассоциации и их количество может расти43.
По этим причинам отмечается тенденция к систематическому тестированию больших количеств генов кандидатов или анонимных вариантов.
Large-scale, systematic, gene-association studies
Хотя небольшое количество проектов по позиционному клонированию успешно использовало сцепление first-pass mapping подходов сложных заболеваний людей (напр., исследовании по идентификации ALOX5AP (REF. 19)), 'smart money' сегодня инвестируются в крупно масштабные исследования по генным ассоциациям44-45. В отличие от исследований по генам кандидатам, при которых небольшие количества вариантов, которые участвуют в болезни были тестированы на ассоциации, эти исследования предназначены для ассоциаций с непредвзятым отбором вариантов, которые располагаются по всему геному. Этот сдвиг подтверждений ограничений генетического сцепления по отношению к надежно картированным генам, которые оказывают лишь довольно слабые эффекты на предрасположенность46. Крупно масштабные исследования по генным ассоциациям предоставляют значительно большую силу для идентификации этих вариантов и если достаточно маркеров, то могут быть типированы с достаточной плотностью, эта сила может теоретически быть использована для систематического поиска генов предрасположенности. Эти исследования кроме того свободны от биологических предположений, которые ограничивают исследования ассоциаций генов кандидатов. Внушительные практические проблемы предпринимаемых исследований по геномным ассоциациям могут быть облегчены с помощью The SNP Consortium and The International HapMap
Project, который имеет целью уменьшить количество вариантов, которые необходимо генотипировать, чтобы покрыть весь геном и благодаря успехам технологий генотипирования. Как case-control, так и family-based исследования могут быть использованы для поиска ассоциаций; case-control серия более легка для сборки, но имеются вопросы - как к общим комплексным признакам, так и к специфическим для CAD - что дает некоторые преимущества для family-based исследований (BOX 1).
В пионерском исследовании почти 93,000 преимущественно gene-based SNPs в Японской case-control выборке, были найдены полимофризмы по lymphotoxin-α (LTA) гену, который кодирует член семейства TNF лигандов, в ассоциации с предрасположенностью к инфаркту миокарда47. Эта ассоциация была подтверждена в одной из двух Японских выборок48,49, а также при исследовании выживших после инфаркта миокарда, среди белых Европейцев50. Non-synonymous SNP (Thr26Asn) в LTA гаплотипном блоке, который ассоциирует с риском CAD, в этом исследовании повышал транскрипционную индукцию адгезивных молекул VCAM1 (vascular-cell adhesion molecule 1) и SELE (soluble selectin E), оба участвуют в атеросклерозе и, как полагают, облегчают рекрутирование нейтрофилов (FIG. 1). Во-вторых, anonymous SNP в интроне 1 (252A>G) ассоциировал с повышенной in vitro транскрипционной активацией
LTA47, что согласуется с др. исследованиями экспрессии51,52. Оба аллеля присутствуют в гаплотипе, который ассоциирует с предрасположенностью к инфаркту миокарда, которая может быть опосредована с помощью про-воспалительного механизма, который ведет к разрушению бляшек. LTA, как было показано, экспрессируется в повреждениях в виде жировых прожилок (fatty streak) в аортальном синусе у мышей, которых кормили атерогенной диетой (модель ранних атероматозных бляшек), а LTA-/- нокаутные животные обнаруживали менее значительные повреждения53.
Базируясь на этом Ozaki и др.54 использовали Escherichia coli двугибридную систему и фагов для идентификации белков, которые взаимодействуют с LTA. Был идентифицирован galectin 2 (LGALS2), a β-galactosidase-binding lectin? физиологическая функция которого неизвестна. LGALS2 SNPs, которые были идентифицированы путем ре-секвенирования, были тестированы на ассоциацию с болезнью в case-control исследовании инфарктов миокарда, и интронный SNP (3279C) показал убедительную ассоциацию с инфарктом миокарда. In vitro транскрипционный подход показал, что этот аллель примерно вдове активнее аллеля 3279T. LGALS2 ко-экспрессируется с LTA в гладкомышечных клетках и макрофагах в атеросклеротических бляшках и также ко-локализуется с α- и β-tubulin в виде паттерна, который согласуется с ролью во внутриклеточной поставке белков и тем самым в принципе связывает этот аллель с измененной секрецией LTA. Эти указания на возможную роль LGALS2 в предрасположенности CAD показывают, как крупно-масштабные исследования ассоциаций и подходы функциональной геномики могут быть использованы совместно, чтобы показать целиком непредвиденные молекулярные механизмы сложного заболевания.
Mouse genetic studies
Как обсуждалось выше, хотя пищевые и трансгенные манипуляции и могут давать мышиные модели ускоренного атеросклероза, но еще нет удовлетворительных моделей бурно текущих событий разрушения бляшек с закупоривающим тромбозом55. Однако, информация получена при изучении моделей предрасположенности к атеросклерозу или с помощью сравнительных геномных стратегий, которые зависят от консервации физиологических и биохимических путей у видов млекопитающих.
A further link to immunological pathways. Atherosclerosis
1 (Ath1) является QTL на мышиной хромосоме 1, который делает C57BL/6 мышей, чувствительными к диете, индуцирующей атеросклероз, тогда как противоположный эффект наблюдается у мушей C3H/He56. Один из 11 известных генов, сцепленных с этой областью - Tnfsf4 (tumour necrosis factor (ligand) superfamily, member 4), который кодирует лиганд для OX40 рецептора - был далее выявлен с помощью нокаута по этому гену как причина мелких атеросклеротических повреждений, обнаруживаемых у контрольных мышей. OX40 лиганд экспрессируется в активированных В клетках, эндотелиальных клетках и макрофагах. Он создает ко-стимулирующие сигналы в этих клетках путем взаимодействия с OX40 рецепторами на Т лимфоцитах, чтобы усилить их пролиферацию и дифференцировку и возможно тем самым внести вклад в накопление этих клеток в атеросклеротических повреждениях. В двух независимых, небольшого размера популяциях пациентов менее распространенный аллель из одного TNFSF4 SNP оказался ассоциированным с повышенным риском инфаркта миокарда у женщин, но не у мужчин, что указывает на пол-специфический эффект56. Хотя данные на людях всё ещё предварительные, эти находки интересны, т.к. они указывают на ген кандидат болезни у людей, который может оказаться особенно поддатливым для лекарственный терапии посредством блокады рецепторов.
New insights into dyslipidaemia. Высокий уровень циркулирующих триглицеридов распознается как легкий фактор риска для CAD57 и давно ассоциирует с генетической изменчивостью кластера генов APOA1-APOC3-APOA458. APOC3 как известно, подавляет гидролиз триглицеридов, но не наблюдалось генетической изменчивости по APOC3, которая бы объясняла наблюдаемую изменчивость59. Исследования в этой области были поддержаны с помощью сравнительного анализа последовательностей геномов мышей и людей, которые выявили неизвестный слен этого кластера APOA5 (REF. 60). Нокаутные и трансгенные эксперименты показали, что экспрессия APOA5 и уровни триглицеридов обнаруживают обратную корреляцию у мышей60. Эти находки индуцировали серию исследований на людях, которые проверяли, как генетическая изменчивость по APOA5 - возможно в комбинации с APOC3 - влияет на уровни триглицеридов61. Данные, которые непосредственно картировали предрасположенность к CAD с этим кластером получены и в исследованиях familial combined hyperlipidaemia (FCHL), наследственной dyslipidaemia, которая обнаруживает сложный паттерн hypercholesterolaemia и hypertriglyceridaemia62. Проспективное исследование показало, что сердечно-сосудистая смертность двадцатилетних почти удваивается в семьях, которые обнаруживают FCHL63. Первый намек на связь с кластером генов APOA1-APOC3-APOA4 получен при анализе комбинированного сцепления и ассоциаций для FCHL, который выявил участие APOC3 вариантов в предрасположенности64, хотя эти находки не удалось повторить. однако, некоторые недавние исследования ассоциации подтвердили связь между кластером APOA1-APOC3-APOA4-APOA5
и FCHL, возможно посредством механизма, который использует аллели локусов APOA5 и APOC361.
Информация, которая получена из сравнительной геномики не является, однако, безошибочной. Спонтанные мутанты мышей Hyplip1 обнаруживают некоторые метаболические атрибуты FCHL, включая повышенные уровни триглицеридов, холестерола и APOB. Картирование мутации на мышиной хромосоме 3 (REF. 65) и нонсенс мутация в гене, который кодирует thioredoxin interacting protein (Txnip), были идентифицированы с помощью позиционного клонирования66. Хотя некоторые клеточные функции были описаны для этого гена, но предполагаемая роль в регуляции липидного метаболизма не просматривается. Человеческий ортолог, TXNIP, картируется на хромосоме 1q21.2 внутри сцепленной области, найденной в Финских семьях с FCHL67. Однако, не выявлено ассоциации TXNIP с FCHL или уровнями триглицеридов67,68.
Вместо этого др. позиционный ген кандидат USF1 (upstream transcription factor 1), который лежит внутри 15 Mb из TXNIP, обнаруживает доказательства ассоциации с некоторыми FCHL фенотипами67. Этот ген кодирует транскрипционный фактор, который участвует в регуляции некоторых apolipoproteins и др. белков в ролью в липидном и глюкозном метаболизме. Трудно интерпретируемые мутации (fнапр., non-synonymous SNP) были найдены в USF1, a последующий скрининг среди Британских пациентов с FCHL оказался не в состоянии выявить какой-лобо кодирующий вариант69. Однако, 60-bp высоко законсервированный элемент в интроне 7 был идентифицирован, который, как полагают, влияет на транскрипцию гена in vitro67; эта регуляторная функция затем была экспериментально приписана элементу в 20-bp70. Важность количественной изменчивости в сайтах, которые участвуют в регуляции транскрипции генов, выявляется всё чаще71 и затрагивает как цис, так и транс изменчивость72, так что любые варианты в этой регуляторной области являются строгими кандидатами на дальнейший анализ. Наконец, вполне вероятно эволюционное соответствие, что USF1 и TXNIP являются синтеничными (они оба на хромосоме 1 человека), что Usf1 и Txnip не синтеничны (т.к. располагаются на мышиных хромосомах 3 и 1, соотв.), и что мутации в Txnip и USF1 могут приводить к FCHL фенотипам.
Эти исследования показали, что имеется существенный прогресс в изучении генов, которые лежат в основе мышиных моделей атеросклероза. Иногда генетическая изменчивость в генах ортологах вызывает сходные патологии и родственные фенотипы у людей. Даже если человеческий ген обнаруживает незначительную или не обнаруживает роль в предрасположенности, информация из мышиной генетики всё ещё может использоваться для программ разработки лекарств путем идентификации новых биологических путей
.
Conclusions
CAD genetics is a field that is gathering momentum.
Although complex trait analyses for other diseases
have longer histories, the public-health importance of
CAD has ensured that it is now the focus of some
of the largest human genetics programmes (for example,
see REF. 47). Genome-wide linkage analyses indicate
that although there are no loci for CAD risk that
have very large effects, there are mappable loci with
effects that are comparable to those in other diseases
for which gene identification has been successful.
Indeed, the first positionally cloned CAD genes are now
emerging19,47,67. Progress will accelerate now that genomewide
association studies, using hundreds of thousands
of SNPs, are feasible. Similarly, combined genetic and
genomic approaches have the potential to reveal new
realms of quantitative heritable variation that influence
the biological processes underlying CAD (BOX 3). Large
studies, involving thousands of cases and controls, will
be needed to provide robust evidence of novel susceptibility
genes in CAD because effect sizes will be modest
and gene–environment interactions will undoubtedly
be important. However, even a gene of modest effect
can be of enormous significance if it identifies a new
therapeutic target or biological pathway.
At this stage, one can only speculate on the probable
biological roles of the susceptibility genes that will
emerge. Many of the genes that have been implicated
until now in CAD are involved in innate and adaptive
immunity. Inflammation is increasingly recognized as a
crucial component in the development of atheromatous
plaques and thrombosis3, so these results are not unexpected.
However, the predominance of inflammatory
response genes among those that have been identified
might also indicate that it will only be in the context of
previous selection pressure that CAD variants will be
easily discernable in genome-wide studies. If so, this
could constrain the types of genetic influence that will be
identified; however, it could also yield unexpected synergies
across fields. If selection pressures predict an overlap
between genes that affect the risk of CAD and the risk
of ‘ancient’ infectious diseases, one would also expect an
overlap with susceptibility for other modern diseases that
are governed by innate and adaptive immune responses.
Of note, a polymorphism in the type III promoter of the
MHC class II transactivator (MHC2TA; also known
as CIITA) has recently been associated with increased
susceptibility to rheumatoid arthritis, multiple sclerosis
and myocardial infarction73. As genetic data accumulate
across a range of diseases that involve inflammation, we
should expect to see more connections of this type being
identified and ‘added value’ being gained from disparate
mapping studies. This is another reason to be optimistic
that the substantial investment in complex trait analysis
in human disease will produce the desired returns.
and Martin Farrall
