Рецепторы Tgfbr1 и Tgfbr2 являются важными белками для эмбриогенеза, а разрушение любого из генов у мвшей ведет к эмбриональной летальности приблизительно на ст. ED 10.5, когда сердце находится на ранней стадии развития (Oshima et al., 1996; Larsson et al., 2001). Однако современные генетические подходы способны обойти эту эмбриональную летальность и были использованы для выявления роли этих рецепторов в развитии сердца (Table 1). Этот подход нуждается в инзерции рекомбиногенных сайтов (обычно LoxP последовательности) в интроны, которые заключают в скобки существенные части гена мишени, чтобы генерировать floxed аллель. Затем в присутствии энзима recombinase (напр., Cre) он преобразуется, чтобы экспрессироваться специфическим типом клеток (напр., кардиомиоцитами), LoxP сайты д. рекомбинировать, чтобы внести тканеспецифическую мутацию гена мишени. Если необходимо, то измененные версии Cre также доступны, которые могут быть регулируемы во времени. В случае когда Cre синтезируется в неактивной форме (напр., путем слияния определенных форм белка эстрогенового рецептора) то способом, который позволяет активацию является воздействие tamoxifen на любой стадии развития сердца. Эти сложные генетические инструменты позволяют контролировать как время, так и место инактивации гена, что позволяет выявлять функцию гена во время развития и даже во взрослой жизни. Такие подходы "conditional knockout" были успешно использованы для выяснения роли генов Tgfbr1 и Tgfbr2 в кардиогенезе мыши.

Используя Tgfbr1 floxed мышей (Larsson et al., 2001), бвл исследован эффект потери Tgfbr1 в клетках нервного гребня, используя Wnt1-Cre (Wang et al., 2006). Возникающая в результате в нервном гребне специфическая потеря Tgfbr1 ведет к 100% пенетрантности фенотипа persistent truncus arteriosus (PTA), который был правосторонним в 40% случаев. Поскольку не присутствовал легочный ствол, этот фенотиа PTA был типа A2 (Fig. 3). Анализ инъецированных меткой артерий фарингеальных дуг подтвердил, что четвертая PAA регрессирована; , следовательно, возможно, что дуга аорты может формироваться шестой PAA артерией. Очевидно, что миграция клеток cardiac neural crest (CNC) в OFT не затрагивается при истощении Tgfbr1, но обнаруживается повышенный апоптоз этих клеток после миграции в OFT подушки, приводя к уменьшению вклада клеток в ремоделируемом OFT и как следствие неспособность к образованию перегородки между аортой и легочным стволом. Эта находка указывает на то, что передача сигналов TGF-β необходима для поддержания клеток CNC во время ремоделирования OFT подушек, чтобы сформировать аорто-пульмональную перегородку.

Поскольку необходимы Tgfbr1 и Tgfbr2 для передачи сигналов TGF-β, то потеря любого из рецепторов в нервном гребне может предсказуемо вести к сходному фенотипу. Tgfbr2 floxed мыши были получены независимо в трех лаб. (Cazac и Roes, 2000; Chytil et al., 2002; Leveen et al., 2002), и роль Tgfbr2 в клетках нервного гребня были исследована с использованием Wnt1-Cre в двух независимых исследованиях (Wurdak et al., 2005; Choudhary et al., 2006). В обоих случаях специфичная для нервного гребня потеря Tgfbr2 приводила к кардиальным дефектам и перинатальной летальности. Не выявлено обнаружимых дефектов на миграцию клеток кардиального нервного гребня в подушки OFT, но подобно нокаутным мышам по Tgfbr1, специфичному для нервного гребня, обнаружены дефекты с ремоделировании и созревании подушек OFT. Как следствие обнаруживается 100% пенетрантность PTA фенотипа, указывающая, что передача сигналов TGF-β необходима клеткам нервного гребня для обеспечения образования перегородки между аортой и легочным стволом. Обнаруживаются также интригующие различия между мышиными фенотипами после потери Tgfbr2 клетками нервного гребня в двух исследованиях. В одном случае PTA фенотип присутствовал в комбинации с VSD и аномальным паттерном аортальноай дуги, что может быть интерпретировано как IAA, возможно PTA типа A4 (Fig. 3; Wurdak et al., 2005). В этом исследовании обнаружены также дефекты тканей, происходящих из фарингеальных дуг (паращитовидной железы и тимуса) у мутантов Tgfbr2, специфичных для нервного гребня, и авт. связывают общий фенотип с синдромом DiGeorge, вызываемым делецией небольшого региона хромосомы 22 (del22q11) человека, и затрагивающим миграцию клеток нервного гребня (Wurdak et al., 2005). Нпротив, Choudhary et al. ( 2006) не сообщают о дефектах в паратироидных железах и о высоко пенетрантном interrupted aortic arch фенотипе, между левой каротидной артерией и левой подключичной артерией (an IAA type B). Хотя эти два исследования использовали разные Tgfbr2 floxed аллели, в обоих случаях ожидалось возникновение Tgfbr2 нулевых мутаций в клетках CNC. Фенотипические различия, напр., в паратироидном развитии могут быть обусловлены различиями в генетическом фоне и эффектами модификаторов; однако согласующиеся находки PTA в обоих исследованиях и в исследованиях специфичного для нервного гребня Tgfbr1, рассмотренного выше, подтверждает важность передачи сигналов TGF-β в клетках CNC для образования аорто-пульмональной перегородки.

Чтобы определить роль TGF-β type I рецептора в кардиомиоцитах, рецептор истощался в этого типа клетка с использованием Nkx2.5-Cre (Sridurongrit et al., 2008). Неожиданно, подавляющее большинство эмбрионов развивалось нормально, указывая тем самым, что передача сигналов TGF-β оказывает незначительное или не играет клеточно автономной роли в клетках кардиальных мышц во время кардиогенеза. Сходным образом, большинство мышей, которые имели специфичную для миокарда деплецию Tgfbr2, также давали нормальные сердца. Эта находка отмечена в двух независимых исследованиях с использованием двух разных Cre линий, Mlc2v-Cre и cTnT-Cre, (Jiao et al., 2006; Robson et al., 2010), это подтверждает, что передача сигналов TGF-β играет незначительную роль в клетках кардиомиоцитов во время развития сердца.

В противоположность отсутствия их функциональной роли в кардиомиоцитах, Tgfbr1 и Tgfbr2 важны в эндотелиальных клетках для сердечно-сосудистого развития и для выживания эмбрионов. Специфичная для эндотелия потеря Tgfbr1 с использованием Tie2-Cre, ведет к сильному снижению клеток в AV кардиальных подушках на ст. ED 10 - 11 (Sridurongrit et al., 2008). Сердца у этих мутантных мышей имеют тонкий и плохо трабекулированный миокард и эмбрионы погибают на ED 13. Сходное исследование с использованием Tie1-Cre приводило к ранней смертности на ED 10.5, это подтверждает важность передачи сигналов TGF-β в эндотелиальных клетках, но способ вклада Tgfbr1 в ремоделирование подушек и образование клапанов и перегородок в сердце официально не подтвержден (Carvalho et al., 2007). Наиболее тяжелые фенотипы могут быть обусловлены повышенной эффективностью Tie1-Cre по сравнению с Tie2-Cre линии.

Специфичная для эндотелия делеция Tgfbr2 с использованием Tie2-Cre ведет к эмбриональной летальности на ст. ED 11.5, на два дня раньше, чем у нокаутных по специфичному для эндотелия Tgfbr1 мышей с использованием той же самой Tie2-Cre линии (Jiao et al., 2006). EMT, по-видимому, осуществляется нормально в AV подушках сердец, нулевых по специфичному для эндотелия Tgfbr2 на ED 9.5 и 10.5. Однако на ст. ED 11.5 отмечается снижение количества клеток нижних подушек, это согласуется с дефектом в пролиферации мезенхимных клеток подушек. Неясно, почему затронуты клетки нижних, а не верхних AV подушек у этих эмбрионов. Авт. полагают, что здесь происходит спасение верхних AV подушек из-за диффузии сигнальных молекул, секретируемых соседней тканью OFT. Небольшая пропорция этих мутантных эмбрионов доживает до ED 12.5 и обнаруживает задержку образования перегородки желудочков, это указывает на дефект AV подушек. Потеря Tgfbr2 с использованием Tie1-Cre трансгена приводит к ещё более ранней эмбриональной летальности на ED 10, что препятствует дальнейшему анализу (Carvalho et al., 2007). Однако важность Tgfbr2 в ремоделировании мезенхимы AV подушек подтвержена с использованием tamoxifen-индуцибельным специфичным для эндотелия Cre (Cdh5-CreERT2) для инактивации Tgfbr2 рецептора на ED 11.5, когда EMT почти закончен. Эти эмбрионы доживают до ED 15.5, но у них возникают VSDs из-за дефекта слияния подушек. Эмбрионы также обнаруживают фенотип внутримозговых кровоизлияний, сходный с таковым у Tgfb1(RGE/RGE)Tgfb3^-/- двойных мутантов, рассмотренных ранее (Robson et al., 2010).

Интересно обсудить, почему специфичная для эндотелия потеря Tgfbr2 вызывает иной фенотип, чем потеря Tgfbr1 в этих клетках в свете того факта, что оба рецептора действуют вместе с гетеромерном сигнальном комплексе (Fig. 1). Одно из возможных объяснений, что Tgfbr1 может также взаимодействовать с др. рецепторами и лигандами сверхсемейства TGF-β ; поэтому потеря Tgfbr1 может в принципе нарушаться или компенсироваться с помощью др. рецепторов сверхсемейства TGF-β сигнальной сети (Dudas et al., 2006; Carvalho et al., 2007; Zhao et al., 2008). Такого типа пластичность рецепторов не ограничивается Tgfbr1; напр., Acvrl1 может взаимодействовать с Tgfbr2, Bmpr2 и ActRII (Goumans et al., 2003; Upton et al., 2009). Однако, труднее объяснить противоречивые данные исследований in vitro и in vivo в случаях, в которых используются одни и те же мышиные модели . Напр., как обсуждалось ранее Tgfbr2 необходим для EMT эндокардиальных клеток in vitro, но не in vivo (Jiao et al., 2006). Авт. этого исследования предположили, существуют компенсаторные механизмы в живых эмбрионах для поддержания EMT, которые не доступны ex vivo, но пока неясно, что это может быть.

Недавно мутации в TGFBR1 и TGFBR2 генах были найдены у пациентов с синдромом Loeys-Dietz (LDS), аутосомно доминантном нарушении, характеризующимся увеличенным корнем аорты на уровне синуса Valsalva, и ассоциирующегося с диффузной медиальной дегенерацией аневриз аортальной стенки восходящей или нисходящей аорты или обеих и с высоким риском потенциально фатальных разрывов аорты (Loeys et al., 2006; Van Hemelrijk et al., 2010). Хотя тяжесть LDS увеличивается с возрастом, расширение корня аорты может присутствовать при рождении и дополнительными клиническими признаками являются hypertelorism (широко расставленные глаза) и расщепление нёбы или удвоение нёбного язычка. Эти признаки перекрываются с теми, что при синдроме Marfan's (MFS), который характеризуется мутациями в fibrillin-1 и кистозной медиальной дегенерацией стенки аорты. Важно отметить, что гистопатология аорты отличается у этих двух групп пациентов и что пациенты с LDS обнаруживают более высокий риск разрыва аорты с более агрессивным и широко распространяющейся болезнь артерий, чем у пациентов с MFS (Jain et al., 2009). Тем не менее существует сходство между фенотипами расширения аорты у двух групп пациентов, что первоначально привело к предположению о важности fibrillin-1 для секвестрации TGF-β во внеклеточном матриксе и вытекающей регуляции передачи сигналов TGF-β для поддержания целостности аорты (Neptune et al., 2003; ten Dijke и Arthur, 2007). Пациенты с синдромом Марфана и с LDS имеют нарушенными волокна эластина в стенке аорты, критический дефект благодаря важнолсти эластина в поддержании гибкости и целостности аорты. Эластин секретируется как tropoelastin сосудистыми гладкомышечными клетками (VSMC) в ответ на стимуляцию TGF-β. Более того, эластин может быть деградирован с помощью metalloproteinases (MMPs), которая также может регулироваться с помощью передачи сигналов TGF-β. Следовательно, нарушение экспрессии или tropoelastin или MMPs может быть объяснено в принципе наблюдаемой потерей целостности эластина в стенке аорты. С этой точки зрения неясно, какая из этих потенциальных причин вызывается нарушением передачи сигналов TGF-β при аортальном фенотипе LDS, а мышиные модели предоставляют важный инструмент для исследования патогенеза болезни. Однако, не обнаруживается дефектов аорты у мышей, которые гетерозиготны по нулевым мутациям или Tgfbr2 илиTgfbr1 генов, которые предоставляют на первый взгляд наиболее очевидную модель LDS. Сегодня известно, что большинство причинных мутаций при LDS являются миссенс мутациями TGFBR2 или TGFBR1 генов, которые локализуются вблизи области. кодирующей киназный домен и в отличие от мышиных Tgfbr2 и Tgfbr1 нулевых мутаций, они могут не быть нулевыми аллелями и могут обладать доминантно-негативными эффектами. Напр., исследование ассоциированных с раком missense мутаций в c-терминальном регионе киназного домена TGFBR2 (R537P) показало, что имеется потеря активации SMAD2/3 и конституитивная активация SMAD1/5 (Bharathy et al., 2008). Следовательно, генерация мышей со специфическими для LDS пациентов мутациями в TGF-β рецепторах скорее всего будет информативной. Однако, недавние генетические исследования на мышах использовали подход нокаута тканеспецифического рецептора. Поскольку гладкомышечные клетки аорты являются центральными в отношении как секреции эластина, так и мышечных сокращений, то были получены модели для изучения, могут ли дефекты клеточно автономной передачи сигналов TGF-β в гладкомышечных клетках аорты отвечать за фенотип разрушения эластина при LDS. Мыши с VSMC-специфической делецией Tgfbr2 получали, используя SM22-Cre в трех независимых лаб. В двух случаях возникающие в результате фенотипы являлись эмбриональными леталями на ED 12.5 из-за дефектов ангиогенеза недоразвитого сердца, что препятствует анализу роли Tgfbr2 в VSMCs аорты (Frutkin et al., 2006; Carvalho et al., 2007). Однако, в третьем исследовании, Langlois et al ( 2010) установили, что эмбрионы выживают дольше (т.e., вплоть до позднего периода беременности) и описали дефекты перегородки желудочков у половины мутантных эмбрионов. Эти мутанты также обнаруживали беспорядок эластичных волокон в стенке аорты и расширение нисходящей части торакальной аорты. Это не сопровождаелось увеличением экспрессии Mmp2 и очевидно, что фенотип нарушенного elastin обусловлен нарушением синтеза и отложения elastin скорее, чем усилением его деградации (Langlois et al., 2010). Фенотипические различия в этих трех исследованиях могут быть обусловлены различиями в линиях SM22-Cre, используемых в экспериментах (Moessler et al., 1996; Holtwick et al., 2002). Напр., более тяжелые фенотипы, как и ожидалось, результат наиболее эффективного или более раннего действия линии SM22-Cre. Недавний анализ гладкомышечных клеток аорты, проведенный на пациентах с мутациями TGFBR2 показал, что патология болезни может быть также обусловлена неспособностью передачи сигналов TGF-β1 , чтобы поддерживать полностью сократительную функцию аортальных VSMCs (Inamoto et al., 2010). Однако, эти клетки были взатя после оперативного вмешательства у пациентов на поздних стадиях патологического развития. Было бы интересно отследить прогресс патологии аорты, тем более, что пригодная модель LDS становится доступной. Одной из потенциально пригодных моделей могут быть мыши со специфической для нервного гребня потерей типа II рецептора (Wnt1-Cre; Tgfbrfl/fl), рассмотрены выше. Недавний анаиз этих мутантов показал, что экспрессия транскриптов elastin происходит на нормальных уровнях в производных нервного гребня VSMCs в аорте, но что организация и стабилизация elastin за счет поперечных связываний была дефектной. Эта находка означает, что эластиновые волокна плохо формируются и недостаточны, чтобы выдерживать нагрузки во время пульсаций аорты (Choudhary et al., 2009). Фенотипические отклонения обнаружены в стенке аорты с компонентом нервного гребня (т.e., дефицитом по Tgfbr2), но не в VSMCs мезодермального происхождения, где экспрессия Tgfbr2 была нормальной. Эта находка иллюстрирует совпадение elastin фенотипа с сосудистыми гладкомышечными клетками аорты, затронутыми мутациями TGF-β рецептора. Более пригодная модель поможет понять прогрессию этих артериальных патологий и открое один из крупнейших парадоксов патологии LDS: сильно повышенные уровни активированного SMAD2 в аортальной media пациентов с LDS в присутствии мутаций, которые нарушают функцию TGF-β рецептора (Jones et al., 2009; Lin и Yang, 2010). Одним из возможных объяснений является то. что ткань пациента становится доступной для иммуногистохимического анализа только на поздних стадиях патологии, когда др. дегенеративные события могут вносит вклад в избыток активности SMAD2. Поскольку мышиные модели могут быть исследованы в ходе всей болезни, то пригодная модль LDS сможет существенно увеличить наше понимание роли передачи сигналов TGF-β в VSMCs для поддержания целостности стенки аорты.

Передача сигналов TGF-β, как было установлено, также важна в клетках эпикарда во время развития сердца. Эти клетки подвергаются EMT и и вносят вклад в фибробласты и коронарные сосуды сердца (Fig. 2). Когда была использована Gata5-Cre линия для истощения Tgfbr1 в эпикарде, то это привело к снижению мышечных клеток в развивающихся коронарных артериях, что согласуется с ролью передачи сигналов TGF-β в обеспечении дифференцировки VSMC . происходящих из мезенхимных клеток эпикарда (Sridurongrit et al., 2008). Однако, также обнаруживается повышенное количество коронарных капилляров у мутантов по сравнению с контролем. К сожалению не возможно отслеживание клонов, чтобы определить источник эндотелиальных клеток этих сосудов, которые в свете последних находок, могут не происходить из эпикарда (Red-Horse et al., 2010). Следовательно, роль Tgfbr1 в EMT в эпикарде in vivo ещё предстоит установить.

SM22-Cre также экспрессируется в эпикарде и миокарде помимо VSMCs, рассмотренных выше. Поэтому, гипоплазия миокарда желудочков, дефекты перегородок и дефекты мускулияризации коронарных артерий, обнаруженные у мышей, у которых истощен Tgfbr2 в эпикардиальном клоне (SM22-Cre; Tgfbr2fl/fl) были приписаны дефектам в эпикардиальных клетках (Langlois et al., 2010), в частности, так как эффект деплеции Tgfbr2 в кардиомиоцитах, по-видимому, был минимален appear (Jiao et al., 2006; Robson et al., 2010). Имеется неполная пенетрантность дефектов маскуляризации коронарных артерий. которые наблюдаются в 25% из всей группы исследованных мутантных эмбрионов (n = 8). Несмотря на это такие дефекты согласуются с потребностью в передаче сигналов TGF-β для превращения происходящих из мезенхимных клеток эпикарда а гладкомышечные сосудистые клетки коронарных сосудов, и они сходны по фенотипу с фенотипом после потери специфичного для эпикарда Tgfbr1, как описано выше.