Хроническая обструктивная болезнь лёгких (COPD) эт болезненное состояние, ассоциированное с закупоркой воздушных путей, которая не является полностью обратимой (http://www.goldcopd.org/). COPD на сегодня четвертая среди ведущих причин вызывающих гибель согласно World Health Organization и, скорее всего, она может выйти на 3-е место к 2030. Согласно World Health Organization, COPD является наиболее распространенной серьёзной хронической болезнью во всем мире и затрагивает примерно 64 миллионов людей (The global burden of disease: 2004 update, published in 2008). Следовательно, COPD представляет собой крупную и всё увеличивающуюся ношу для системы здравоохранения. К сожалению, мы обладаем ограниченной терапией, модифицирующей болезнь COPD, и поэтому увеличение нашего понимания патогенетических механизмов может привести к новым терапевтическим вмешательствам и превентивным стратегиям. Понимание генетической предрасположенности к COPD важно для разработки персонализованных режимов лечения (Shapiro, 2011).

Хроническая обструктивная легочная болезнь является многофакторным заболеванием, вызываемым внешнесредовыми детерминантами - чаще всего это курение сигарет - и генетическими факторами риска (Decramer et al, 2012). Помимо курения сигарет, COPD может также вызываться др. средовыми факторами, в частности задымлённость помещений в развивающихся странах (Kennedy & Chambers, 2007). COPD диагностируется с помощью спирометрии, обнаруживающей необратимое снижение forced expiratory volume in 1?s (FEV₁) и отношение FEV₁ к forced vital capacity (FEV₁/FVC). Хотя существует взаимоотношение доза-эффект между FEV₁и количеством вдыхаемого дыма, снижение FEV₁ у курильщиков с одинаковой экспозицией существенно варьирует (Burrows et al, 1977; Fletcher, 1976). Это указывает на то, что помимо курения сигарет (и потенциально др. внешнесредовых факторов), COPD обнаруживает также зависимость от генетических факторов риска (Fig 1). Более 45 лет известно, что генетические варианты гена alpha-1 antitrypsin (AAT) serpin peptidase inhibitor, clade A, member 1 (SERPINA1) ведет к COPD. Однако, недостаточность AAT объясняет лишь 1-2% от всех случаев болезни COPD. Следовательно, др. варианты в геноме, скорее всего, ассоциированы в признаками COPD. Как и в случае др. хронических воспалительных болезней, было показано, что эпигенетические изменения (Yao & Rahman, 2012) и соматические мутации (Tzortzaki et al, 2012) участвуют в патогенезе COPD. Figure 1. COPD is caused by chronic environmental insults (in particular cigarette smoking) in individuals with predispositions due to variations in one or multiple genes. The combination of environment and genes lead to distinct aberrant pathophysiological processes/pathways, the combination of which causes COPD.

Подобно многим хроническим сложным болезням трудно установить генетическую предрасположенность и патологические механизмы COPD. Это частично обусловлено гетерогенной природой болезни. Напр., обструкция воздушных путей, которая определяет COPD может быть результатом деструкции и увеличения альвеол (т.e. эмфиземы) с потерей упругой отдачи или результатом обструкции мелких воздушных путей или обоих (Hogg et al, 2004). Оба эти процесса появляются при курении, но не связаны с механически. Следовательно, идентификация генетических основ каждого из признаков не позволяет экстраполяции генетических детерминант для др. фенотипических отклонений. Скорее всего, фенотипические признаки могут быть детерминированы сложной генетической сетью, которые могут перекрываться или нет. Улучшение измерений фенотипических отклонений разных свойств болезни, таких как computerized tomography (CT) для эмфиземы или спирометрия прежде всего для болезни мелких воздушных путей, позволит исследователям более точно идентифицировать корреляции генотип-фенотип (Kim et al, 2009).

Genetic approaches

Family, twin and segregation studies

Основные генетические подходы включают исследования семей, близнецов и сегрегации. Ранние эпидемиологические исследования установили, что COPD агрегирует в семьях (Larson et al, 1970; Higgins et al, 1984; Tager and Speizer, 1976), показав наличие строгих корреляций между родителями и детьми или между сиблингами или супругами. Близнецовые (Redline et al, 1987; Redline, 1990) и сегрегационные исследования (Givelber et al, 1998) подтвердили, что генетическая чувствительность к COPD обусловлена многими генами с малыми эффектами (Chen et al, 1996; Givelber et al, 1998). Эти ранние открытия инициировали поиск новых вариантов генов с помощью генных ассоциаций и сцеплений.

Candidate gene-association studies

Исследования ассоциаций с генами кандидатами проверяли гены, которые, как полагали, играют центральную роль в патогенезе COPD и исследовали силу ассоциаций между признаками болезни и вариантами генов кандидатов. Генетические исследования по COPD были предприняты в отношении генных ассоциаций, сфокусировавшись в первую очередь на генах protease-antiprotease и oxidant-antioxidant путей. Однако, учитывая разнообразие путей (таких как воспаление, врожденный иммунитет, клеточная гибель, механизмы репарации матрикса и развитие легких ), вовлеченных в патогенез COPD, становится ясно, что, скорее всего, и др. гены вносят вклад также. Несогласованность между этими исследованиями ограничивает наши успехи в отношении выяснения генетических основ COPD. Противоречивые находки связаны в основном с ограниченными когортами популяций, не стандартизованными определениями болезни и различиями в статистических методах (включая расовые, этнические, половые, средовые и генетического фона различия). Недавний мета-анализ предполагаемых генов показал, что многие варианты генов, протестированные в исследованиях по генным ассоциациям на самом деле оказались безуспешными в отношении ассоциации с COPD (Smolonska et al, 2009). Несмотря на в целом неутешительные результаты, немногие исследования оказались многообещающими - а именно для MMP12 - и будут обсуждены ниже (Hersh et al, 2011; Hunninghake et al, 2009).

Linkage studies

В противоположность исследованиям ассоциаций с генами кандидатами, где гены выбирались, исследования сцепления представляют собой беспристрастный подход и не ограничены неполным пониманием патогенеза болезни. Полиморфные маркеры, которые распространены по всему геному, исследуются в их ассоциации с интересующим фенотипом. Однако из-за низкой плотности маркеров идентифицированные локусы часто велики по размеру и могут содержать несколько сотен генов, которые необходимо отсортировать, чтобы найти те, которые ассоциируют с болезнью. Процедуры тонкого картирования могут в конечном итоге сузить регионы до более определенных мест и потенциально идентифицировать новые гены (DeMeo et al, 2006; Wilk et al, 2003). Однако исследования сцепления лишены статистической силы, необходимой для идентификации генетических локусов с небольшими генетическими эффектами, которые обычно ассоциируют со сложным заболеванием, таким как COPD (Risch & Merikangas, 1996). С тех пор как недавно стала доступна панель высокой плотности single nucleotide polymorphism (SNP) для изучения ассоциаций по всему геному, исследования сцепления оказались в основном заброшены.

Genome-wide association studies

Исследования genome-wide association (GWA) предоставляют беспристрастный и свободный от предположений подход к идентификации геномных вариаций, ассоциированных с болезненным фенотипом (Soler Artigas, 2012). Мы прошли длинный путь, поскольку первые COPD GWA исследования не только не идентифицировали новых генов кандидатов, но и также улучшали методы на всём пути, чтобы гарантировать наиболее аккуратные результаты. Благодаря использованию плотных карт SNP (обычно сотен тысяч SNPs), поиск новых генов может засекать точечную цель более аккуратно, чем анализ сцепления. Однако исследования GWAS также имеют ограничения, обусловленные небольшими размерами выборки (геномная изменчивость, лежащая в основе легочной функции, как полагают, оказывает скромные эффекты; поэтому необходимы очень большие популяции, чтобы их идентифицировать) и отсутствием крупномасштабных исследований, это увеличивает риск идентификации ложно-позитивных ассоциаций. Также, SNP панели часто не содержат ассоциированные с болезнью генетические варианты per se, но могут , скорее всего, быть ассоциированными с ними linkage disequilibrium (LD). Потенциальная стратегия для разрешения этого вопроса предложена недавно на международной конференции по генетике COPD, где было предложено сформировать COPD Genetics Consortium, для осуществления сотрудничества между исследователями по изучению COPD популяций (Silverman et al, 2011). Сходный подход был инициирован SpiraMeta Consortium , объединившего множественные GWA исследования на субъектах с Европейскими корнями для крупномасштабного мета-анализа (Obeidat et al, 2011). Эти Консорциумы предоставляют подходы усиливающие GWA исследования и ускоряющие идентификацию широко распространенных геномных вариантов, ассоциированных с COPD.

В ближайшем будущем мы окажемся способными использовать информацию по всему геному, полученную с помощью секвенирования следующего поколения, которая не только улучшит нашу способность идентифицировать общераспространенные варианты, но и также помочь выяснить роль редких и структурных геномных вариаций. Однако существует множество препятствий, которые необходимо преодолеть, прежде чем секвенирование генома станет рутинным. Для Freeman-Sheldon syndrome 2 и Miller синдрома уже было успешно продемонстрировано, что секвенирование всего экзома может идентифицировать ген, лежащий в основе болезни (Biesecker, 2010; Ng et al, 2010). Секвенирование всего экзом успешно было применено для идентификации мутаций DNMT3A при острой миелоидной лейкемии (Ley et al, 2010). Поскольку секвенирование всего экзома имеет преимущества в цене и охвате, быстрое снижение затрат на секвенирование всего генома, скорее всего, сделает секвенирование всего экзома менее пригодным, поскольку оно охватывает только 1-2% генома - хотя важные 1-2%.

Итак, новейшие технологии существенно улучшают и облегчают выявление COPD генов. Кстати, существуют на сегодня принимаемые и недавно предположенные гены COPD, которые будут рассмотрены ниже (Table 1 and Fig 1).

Table 1. Overview of COPD genes and details of their study of origin Nicotine dependence

Accepted COPD genes

Alpha-1 antitrypsin, кодируемый геном SERPINA1, является членом сверхсемейства serpine protease inhibitor (SERPIN). AAT в основном продуцируется печенью и является главным физиологическим ингибитором сериновой протеазы neutrophil elastase (NE; Stoller & Aboussouan, 2011). Помимо NE, AAT ингибирует и др. сериновые протеиназы, включая proteinase 3 (PR3) (Esnault et al, 1993) и cathepsin G (Topic et al, 2009). AAT ингибирует также kallikreins (Felber et al, 2006), matriptase (Janciauskiene et al, 2008), caspase-3 (Miller et al, 2007) и ADAM-17 (Bergin et al, 2010).

Дефицит alpha-1 antitrypsin впервые был описан в 1964 у двух пациентов с тяжелой респираторной недостаточностью, обусловленной эмфиземой (Eriksson, 1964). Идентификация варианта AAT стало возможным благодаря разработке Pi системы, в которой мутантные AAT мигрируют по-другому в электрическом поле по сравнению с нормальной M формой. Наиболее распространенный вариант, изоформа Z, обусловлена одиночной аминокислотной заменой глютаминовой кислоты на лизин (т.e. Glu342Lys), которая вызывает пертурбации в структуре белка, приводя к его дефектной секреции гепатоцитами (Kass et al, 2012). Эта удивительная история не только показала, как клинически может быть установлен диагноз, но и успешно связала с генетической основой фенотипа COPD, она также подчеркнула продолжительный период времени, необходимый для перехода от клинических наблюдений (1963) до идентификации аминокислотных замен (1978) с помощью ограниченных инструментов. К счастью, технические успехи в раскрытии патогенетической основы болезни существенно ускорили процесс обнаружения генов. Однако сегодня Z вариант AAT остается единственным действительно принятым геномным вариантом, ассоциированным с COPD.

Suggested COPD genes

Early COPD GWA studies: interleukin 6 receptor (IL6R) and glutathione S-transferase (GSTO2)

Wilk и коллеги сообщили о GWA исследовании функции легких (Wilk et al, 2007). Авт. собрали несколько спирометрических параметров от 1220 родственных индивидов, которые участвовали в Framingham Heart Study (FHS) и предприняли изучение ассоциации, используя 70987 SNPs с Affymetrix 100K SNP GeneChip. Расположение самых сильных ассоциаций отличалось в зависимости от физиологического фенотипа. Процент предсказанного форсированного потока выдоха от 25th до 75th percentile (FEF25-75) обнаруживал легкую ассоциацию с SNP в IL6R регионе 1q21 (rs4129267; p-value = 0.07), тогда как FEV₁ и FVC оказались достоверно ассоциированными с регионом GSTO2 на 10q25.1 (rs156697; p-value = 9.42 х 10^-5). Хотя находки этого исследования казались прорывными в то время, они оказались недостаточными. В частности, важно отметить, что обе ассоциации не достигли достоверности для генома. Если не-синонимные SNP в GSTO2 достигали p-значения 10^-5, то SNP в локусе IL6R достигали только значений p в 0.07. Наиболее вероятно, что эти недостатки были , по крайней мере, частично обусловлены низкой плотностью геномного охвата с <100,000 SNPs, что могло дать потенциально ложно-положительные ассоциации.

IL6R, the receptor of interleukin 6 (IL6), участвует как в pro- , так и anti-воспалительных процессах. IL6R существует как в растворимой форме, так и образует комплексы с IL6. Комплекс IL6/IL6R, по-видимому, играет роль в вызванном курением воспалении, привлекая воспалительные клетки в легкие, чтобы устранить чужеродные частицы, такие как компоненты сигаретного дыма, оказывая бесчисленное количество др. эффектов на лёгочную ткань. Наконец, IL6 (лиганд для IL6R), как было установлено, ассоциирует с функцией легких в популяции отпрысков Framingham (Walter et al, 2008).

GSTO2, член семейства glutathione S-transferases, который в качестве белка участвует в метаболизации ксенобиотиков и канцерогенов, и, как полагают, играет роль в COPD, связанную с его участием в биотрансформации мышьяка, т.к.мышьяк является химическим элементом дыма сигарет (Mukherjee et al, 2006).

Hedgehog-interacting protein (HHIP)

Спустя два года после COPD GWA публикации, исследователи снова опубликовали находки по FHS популяции, обратившись к некоторым вопросам, рассмотренным в их первом исследовании (Wilk et al, 2009). Прежде всего, панель SNP стала в 5 раз больше, 550,000 SNPs. Также увеличилось количество субъектов с 1220 до 7691. Др. преимуществом этого исследования стало то, что существенная часть SNPs была также протестирована на второй не родственной популяции - Family Heart Study когорте. На этот раз исследователи изучали FEV₁/FVC, чтобы охарактеризовать пациентов. 4 сцепления SNPs на (Chr) 4 на приблизительно 145 Mb (т.e. в 4q31) было идентифицировано достоверным на геномном уровне. Один из этих 4-х SNPs (rs13147758) был генотипирован в Family Heart Study, но в том репликационном исследовании он не достиг геномной достоверности. Однако др. исследования выявили SNP ассоциации в 4q31 (Hancock et al, 2010; Repapi et al, 2010; Zhou et al, 2012), тем самым подкрепив доказательства, что локус содержит новый COPD ген. SNPs на Chr 4 были найдены локализованными в межгенном регионе непосредственно ниже 5' точки старта HHIP, указывая тем самым на потенциальную роль в регуляции экспрессии HHIP. Альтернативно, эти SNPs могут быть также связаны с вариантом, вызывающим болезнь. Итак, эти находки представили неотразимые доказательства, что этот локус кандидат может действительно влиять на обструкцию воздушных путей у COPD пациентов. HHIP, a hedgehog-interacting protein, участвует в передаче сигналов hedgehog и, как было установлено, участвует в развитии легких (Shi et al, 2009). Процесс развития легких имеет отношение к COPD, поскольку аномальное развитие лёгких д. приводить к нарушениям резервов, обусловливающим предрасположенность курильщиков к COPD. Также было установлено, что др. гены роста и ремоделирования легких, такие как WNT, активируются повторно (Tzortzaki et al, 2012), это указывает на то, что механизмы аномального ремоделирования и репарации легких являются важными молекулярными процессами, вовлеченными в COPD.

α-Nicotinic acetylcholine receptor (CHRNA 3/5) locus and iron-responsive element binding protein (IREB2)

В то же самое время, когда был опубликован HHIP в качестве локуса кандидата, Pillai et al опубликовали GWA исследование по идентификации CHRNA 3/5 локуса в 15q25.1 (Pillai et al, 2009). Здесь проведено первичное исследование популяции из, Bergen, Norway, с 823 COPD пациентами и 810 контрольными субъектами. Верхушка из 100 ассоциаций была исследована далее в трех др. кагортах: International COPD Genetics Network (ICGN; cases and controls), US National Emphysema Treatment Trail (NETT; COPD cases) и Normative Aging Study (NAS; controls), а также в Boston Early-Onset COPD (BEOCOPD) когорте. Подобно публикации по HHIP, исследованными фенотипами были FEV₁/FVC и post-bronchodilator FEV₁ (только в BEOCOPD). Два SNPs на Chr 15 в CHRNA 3/5 локусе (rs8034191 и rs1051730) достигли геномной достоверности и были успешно воспроизведены в исследованиях независимых когорт. Этот Chr 15 локус ранее изучался в связи с никотиновой зависимостью и поэтому представлял собой многообещающий регион кандидат (Berrettini, 2008; Saccone et al, 2007; Siedlinski et al, 2011). Интересно, что SNP ассоциации были достоверными с и без использования поправки продолжительность курения в исходной когорте из Норвегии и было выявлено достоверное SNP с помощью pack-years взаимодействия в ICGN популяции реплике. Эти наблюдения показывали, что различия между COPD пациентами и контролем были, скорее всего, обусловлены генетическими детерминантами поведения курения (т.e. пристрастием к никотину) скорее, чем генетическими детерминантами самого COPD. Последнее подтверждается в свет наблюдений достоверных ассоциаций между CHRNA 3/5 локусом и поведением курения при раке легких (Spitz et al, 2008; Thorgeirsson et al, 2008). Однако др. исследование рака лёгких не обнаружило, что этот локус ассоциирован с поведением курения (Cantrell et al, 2008). Поэтому необходимы дальнейшие исследования, чтобы охарактеризовать эффекты локуса Chr 15 в отношении поведения курения, рака лёгки х или обоих. Подход интегративной геномики (т.e. комбинированная экспрессия генов и исследования генетических ассоциаций) независимо идентифицировал варианты в IREB2, которые крепко связывают LD с CHRNA 3/5 вариантами, указывая тем самым, что IREB2, скорее всего, является COPD геном кандидатом в локусе CHRNA 3/5 (DeMeo et al, 2009). IREB2 принадлежит к семейству iron regulatory protein (IRPs), которые поддерживают гомеостаз железа, регулируя потребление и распределение железа. IREB1 и IREB2 поддерживают клеточный метаболизм железа (Rouault, 2006). Существуют региональные отличия по железу и IRPs у курильщиков (Nelson et al, 1996), которые потенциально могут приводить к изменчивости в оксидативных стрессах в лёгких - механизм, важный для возникновнеия эмфиземы и рака лёгких.

Family with sequence similarity 13, member A1 (FAM13A)

Независимые популяции, в которых были идентифицированы CHRNA3-CHRNA5-IREB2 и HHIP локусы, были скомбинированы и привели к идентификации локуса FAM13A (Cho et al, 2010). Итак, исследователи, используя 2940 случаев COPD и 1380 контрольных индивидов (т.e. активных и бывших курильщиков) из трех популяций: (i) популяции случай-контроль из Норвегии; (ii) когорту, состоящую из NETT случаев и NAS контроля; и (iii) популяцию случай-контроль от Evaluation of COPD Longitudinally to Identify Predicted Surrogate Endpoints (ECLIPSE). Две наиболее достоверные ассоциации SNPs (rs7671167 и rs1903003; r² = 0.85) были выявлены в 4q22.1 внутри интрона FAM13A, которые расположены непосредственно ниже домена Rho-GTPase-activating protein (Rho-GAP). Чтобы оценить свои находки, исследователи генотипировали наиболее достоверные SNPs, используя COPDGene Study популяцию. SNP ассоциации для для двух верхних SNPs были также тестированы в ICGN и BEOCOPD популяциях. Ассоциация SNP rs7671167 была достоверной в COPDGene и ICGN и обнаруживала тенденцию в направлении к достоверности в BEOCOPD. Более того, независимое GWA исследование функции легких с использованием популяций из Cohorts for Heart and Aging Research in Genomic Epidemiology (CHARGE) консорциума описало ассоциацию FAM13A с FEV₁/FVC (Hancock et al, 2010). Доказательством возможной роли FAM13A в COPD является его дифференциальная экспрессия во время гипоксии в культурах клеток эпителия и эндотелия (Chi et al, 2006) во время дифференцировки эпителиальных клеток в альвеолярного типа II клетки (Wade et al, 2006). Различия в экспрессии FAM13A также наблюдались у пациентов с легким и тяжелым кистозным фиброзом (Wright et al, 2006). Достоверные SNP ассоциации не удалось связать с pack-years курением сигарет и поэтому FAM13A, скорее всего, опосредует генетику легочной функции или потенциально COPD в противоположность поведению курения. Недавнее сообщение также показало независимую ассоциацию локуса FAM13A с раком лёгких (Young & Hopkins, 2011).

FAM13A - Rho-GAP домен содержащий ген (Cohen et al, 2004) - обладает активностью опухолевого супрессора, ингибирующего сигнальную трансдукцию молекулы Rho A (Ridley, 2001). При COPD активность Rho A, как было установлено, участвует в оксидативных стрессах и нарушает избавление от апоптозных клеток (Richens et al, 2009). Подобно HMGCoA ингибиторам редуктазы (statins), Rho-GAP, по-видимому, модулирует энзим HMGCoA reductase, и тем самым объясняет, почему статины могут обладать защитным потенциалом от COPD и рака лёгких (Young et al, 2009).

Five additional loci associated with FEV₁ and FEV₁/FVC

Мета-анализ некоторых GWA исследований SpiraMeta Consortium идентифицировал 5 дополнительных локусов, ассоциированных с FEV₁ и FEV₁/FVC (Repapi et al, 2010): Tensin 1 (TNS1); glutathione S-transferase, C-terminal domain containing (GSTCD); advanced glycosylation end product-specific receptor (AGER); 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 4 (HTR4); и thrombospondin, type I, domain containing 4 (THSD4).

Как результат исследователи комбинированных множественных GWA исследований оказались способны включить 20288 с Европейскими корнями и 54276 индивидов в завершающих исследованиях. Сила анализа существенно повышалась благодаря повышению величины генотипических и фенотипических данных, которые в конечном итоге привели к идентификации высоко достоверных ассоциаций SNP (p-значения в пределах от 10^-9 до 10^-23). Достоверные локусы были выявлены для FEV₁ в 4q24 (GSTCD), 2q35 (TNS1) и 5q33 (HTR4) и для FEV₁/FVC в 6p21 (AGER) и 15q23 (THSD4). Др. локус в 6p21 на границе dishevelled associated activator of morphogenesis 2 (DAAM2) содержал соблазнительную ассоциацию с FEV₁/FVC. GSTCD, HTR4 и AGER были идентифицированы независимо в GWA исследовании с помощью CHARGE Consortium (Hancock et al, 2010). Как SpiroMeta, так и CHARGE Consortia, также выявили ассоциации по HHIP локусу (see above). Ассоциации, идентифицированные в этом исследовании, не менялись, когда приводились в соответствие с качествами или количествами воздействия курения, так что лежащие в основе гены, скорее всего, не участвовали в привыкании к курению. Тем не менее, предыдущее сообщение выявило роль TSHD4 в прекращении курения (Uhl et al, 2008). Предложены механизмы, которые могут лежать в основе этих вновь идентифицированных генов, как связанные или с путями развития или путями тканевого ремоделирования, которые важны для архитектуры воздушных путей и репарации легких.

SRY (sex determining region Y)-box 5 (SOX5)

Исследования сцеплений в базирующейся на семьях BEOCOPD когорте идентифицировали локус на Chr 12, но интересующий ген не был выделен (Silverman et al, 2002a, b). Т.о., систематический подход по тонкому картированию региона Chr 12 был использован для генотипирования 1387 SNPs в 386 случаях COPD из когорты NETT и 424 здоровых курильщиков из когорты NAS cohort (Hersh et al, 2011). Достоверные ассоциации были локализованы в межгенном регионе и регионе с плотным расположением генов, что затрудняет идентификацию настоящего гена кандидата. Достоверные SNPs попытались реплицировать в BEOCOPD и ICGN когортах. Наиболее достоверным SNP в BEOCOPD популяции (rs11046966) оказался расположенный в тесно близи (7?kb downstream) к 3' концу SOX5. Дальнейшие доказательства, что SOX5 является COPD геном кандидатом, стали следующие. COPD субъекты обнаруживали пониженную экспрессию гена SOX5 и аномальное развитие эмбриональных легких, а также пониженную экспрессию молекулы внеклеточного матрикса fibronectin у Sox5^-/- мышей. Даже воспроизведение SNP не было убедительным в одной из популяций реплик (ICGN), анализ мышиных моделей подтвердил роль SOX5 в морфогенезе развивающихся легких, что должно снижать легочный функциональный резерв у взрослых.

Bicaudal D homolog 1 (BICD1)

Исследования, которые привели к идентификации BICD1, впервые использовали chest CT сканы, которые позволили специфически охарактеризовать эмфизему (Kong et al, 2011). Вплоть до этого момента пациенты с COPD характеризовались с использованием спирометрии, которая измеряла воздушный поток, косвенно связанный с одиночным фенотипическим отклонением COPD . Грудной клетки CT сканы оценивали плотность легких, которая была пропорциональна увеличению воздушного пространства легких, определяющего эмфизему. Количественный анализ и базирующиеся на радиологии качественные особенностей CT изображений были изучены при этом GWA исследовании, используя три разные когорты COPD (т.e. ECLIPSE, NETT/NAS, Bergen cohort from Norway). Интересно, что было обнаружено лишь легкое перекрывание между количественными и качественными фенотипирующими методами. Наиболее достоверная интронная вариация в 12p11.21 (rs10844154) была ассоциирована с качественной оценкой радиологов, но не с количественным методом. Эта изменчивость была локализована вблизи экзона 2 BICD1. BICD1, это гомолог гена Drosophila bicaudal-D (BicD), участвует в регуляции функции dynein. Экзон 2 обладает связывающим регионом для dynein, молекулы, участвующей с митозах, транспорте мРНК и в везикулярном транспорте в дендритах и аксонах (Baens & Marynen, 1997). Ранее BICD1 был также связан с укорочением длины теломер (Mangino et al, 2008), подтверждая недавнюю теорию связи COPD со старением (Shapiro, 2011). Укорочение теломер запускает клеточное старение, особенно в эпителиальных стволовых клетках. Следовательно, короткие теломеры могут приводить к неспособности поддержания эпителиальной целостности, ведущей к эмфиземе (Alder et al, 2011).

Sixteen novel genome loci for lung functions

Крупномасштабный мета-анализ в комбинации с последующими исследованиями идентифицировал 16 новых геномных локусов для функции легких (Soler Artigas et al, 2011): Microfibrillar-associated protein 2 (MFAP2), Transforming growth factor, beta 2 (TGFB2-LYPLAL1), Histone deacatylase 4 (HDAC4FLJ43879), Retinoic acid receptor (RARB), Ecotropic virus integration site 1 [MECOM (EVI1)], Spermatogenesis associated 9 (SPATA9-RHOBTB3), Armadillo repeat containing 2 (ARMC2), Natureal cytotoxicity triggering receptor 3 (NCR3-AIF1), Zinc finger with KRAB and SCAN domains 3 (ZKSCAN3), Cell division cycle 123 homolog (CDC123), Chromosome 100 open reading frame 11 (C10orf11), Low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1), Coiled-coil domain containing 38 (CCDC38), Matrix metallopeptidase 15 (MMP15), Craniofacial development protein 1 (CFDP1) and Potassium voltage-gated channel subfamily E member 2 [KCNE2-LINC00310 (C21orf82)].

Авторы оценили 2.5 миллионов SNPs из 23 индивидуальных исследований (17 от SpiroMeta consortium и 6 от CHARGE consortium) для FEV₁ и FEV₁/FVC у 48201 индивидов Европейского происхождения. Тестируемые ассоциации были стратифицированы в отношении статуса курения (всегда в противовес некурящим вообще), выявили 29 новых локусов, которые были ассоциированы с легочной функцией при p-значении меньше чем 3 х 10^-6. Эти локусы были также исследованы в др. 17 работах с использованием in silico и новых генотипированных данных. Второй мета-анализ оригинальных и последующих работ идентифицировал SNP ассоциации с p-значениями менее 5 х 10^-8 в 16 из 29 новых локусов. Эти 16 SNPs расположены внутри или в тесной близи к MFAP2 и TGFB2-LYPLAL1 на Chr1; HDAC4FLJ43879 на Chr2; RARB и MECOM (EVI1) на Chr3; SPATA9-RHOBTB3 на Chr5; ARMC2, NCR3-AIF1 и ZKSCAN3 на Chr6; CDC123 и C10orf11 на Chr10; LRP1 и CCDC38 на Chr12; MMP15 и CFDP1 на Chr16; и KCNE2-LINC00310 (C21orf82) на Chr21. Некоторые из этих новых локусов, как известно, участвуют в молекулярных механизмах, которые регулируют функции легких. Напр., MFAP2 является антигеном микрофибрилл, ассоциированных с elastin (Gibson et al, 1986), а RARB ранее был сцеплен с преждевременным образованием альвеолярных перегородок (Massaro et al, 2000). CDC123 играет важную роль в ответ на клеточные стрессы путем регуляции эукариотического инициирующего фактора 2 (Bieganowski et al, 2004). HDAC уже был известен своим участием в COPD благодаря своей регуляторной функции экспрессии генов (Ito et al, 2005) , а TGFB2 , как известно, модулирует процессы репарации эпителия и накопления коллагена вне клеток (Thompson et al, 2006). наконец, KCNE2 предположительно участвует в транспорте ионов в эпителиальных клетках воздушных путей (Cowley & Linsdell, 2002).

Member of RAS oncogen family (RAB4B), Egl nine homolog 2 (EGLN2), melanoma inhibitory activity (MIA), cytochrome P450 2A6 (CYP2A6)

Др. крупный мета-анализ GWA исследований был осуществлен для таких признаков как COPD, pre-bronchodialator FEV₁ и тяжелые COPD, диагностированные в 3499 случаях по сравнению с 1922 контрольными индивидами (Cho et al, 2012). Субъекты были получены из следующих 4-х популяций: ECLIPSE, NAS и NETT, Bergen (Norway) cohort и COPDGene исследования. Illumina платформы были использованы для генотипирования, а недостающие SNPs были расчитаны, используя 1000 Genomes данные. Это исследование идентифицировало новый локус на Chr 19q13 (rs7937), который достиг геномной достоверности с p-значением 10^-9. Ассоциация этого локуса была подтверждена на 2859 субъектах из базирующейся на семьях ICGN когорты, подкрепив тем самым уже имеющееся существенное доказательство для этого нового локуса. Гены внутри этого геномного региона RAB4B, EGLN2, MIA и CYP2A6. RAB4B, EGLN2 и MIA потенциально интересны из-за их экспрессии в легких развивающихся животных и человека (Groenman et al, 2007; Lin et al, 2008; Otulakowski et al, 2009), CYP2A6 ранее уже был связан с раком легких и было показано его участие в метаболизме никотина (Hukkanen et al, 2005; London et al, 1999; Nakajima et al, 1996), в частности основного метаболизма никотина cotinine (Thorgeirsson et al, 2010).

Genes identified by gene-association studies

Ранние исследования генных ассоциаций для COPD часто конфликтовали из-за разнообразия методологических подходов (Silverman, 2006), в особенности из-за малых размеров выборок и отсутствия популяций реплик. Тем не менее такого типа исследования были весомыми. Hunninghake et al (2009) осуществили исследование ассоциаций, в котором изучали ассоциации между вариантами MMP12 и фенотипом легочной функции FEV₁ (Hunninghake et al, 2009). В отличие от большинства предыдущих исследований ассоциаций это исследование четко учитывало возраст, пол, вес и длительность курения и использовало очень большое количество пациентов. Было изучено более 8300 субъектов с более 20,000 FEV₁ измерениями, осуществленными на 7 изученных когортах [(1). Genetics of Asthma in Costa Rica Study; (2) Childhood Asthma Management Program (CAMP); (3) Children, Allergy, Milieu, Stockholm, Epidemiological Survey; (4) BEOCOPD; (5) NETT; (6) Lovelace Smokers Cohort; (7) NAS]. Этот сценарий существенно улучшил силу идентификации настоящих болезненных вариантов. В самом деле, минорный аллель (G) из SNP (rs2276109) в промоторной области MMP12 в 11q22.3 оказался достоверно ассоциированным с FEV₁ во всех 7 когортах и в особенности у взрослых курильщиков и с риском возникновения COPD у взрослых курильщиков.

MMP12, как полагают, играет центральную роль в COPD благодаря её elastase активности и тому факту, что MMP12 нулевые мутантные мыши были целиком защищены от индуцируемой курением сигарет эмфиземы (Hautamaki et al, 1997). Идентифицированный в промоторе MMP12 вариант обусловливает снижение активности промотора путем снижения связывания AP-1, что ведет к снижению экспрессии MMP12 (Wu et al, 2003). Как и предсказывалось, снижение экспрессии MMP12 защищает от COPD. Интересно, что это исследование также подтвердило, что MMP12 является геном кандидатом в случае астмы, особенно у курильщиков.

Animal models to dissect COPD sub-phenotypes

Phenotype analysis

Животные модели оказались фундаментальными в формулировании elastase/antielastase гипотезы 45 лет тому назад, которая остается краеугольным камнем патогенеза COPD. В то время Gross et al (1965) вводили papain экспериментальным животным, приводя в результате к увеличению воздушных пространств, определяющему эмфизему (Gross et al, 1965). В последствии разнообразные животные модели были использованы для дальнейшего понимания COPD. Модели включали воздействие на животных молекулярных, химических и средовых агентов, которые приводили к увеличению воздушных пространств (Shapiro, 2000). В частности, elastases (Janoff et al, 1977; Kao et al, 1988; Senior et al, 1977), сигаретный дым (Snider et al, 1986; Wright & Churg, 1990), и сравнительно недавно, индукторы апоптоза (Kasahara et al, 2000) оказались довольно информативными. Избыточная и пониженная экспрессия белков с использованием трансгенных, gene-targeted мышей и природных мутантных мышей оказались чрезвычайно пригодными для изучения патогенеза COPD (D'Armiento et al, 1992; Shipley et al, 1996). Ни одна в отдельности животная модель не воспроизводит COPD человека целиком, но некоторые обнаруживают признаки ассоциации с болезнью (Hautamaki et al, 1997). Преимуществом в изучении COPD по сравнению с многими др. заболеваниями является то, что мы знаем его причину - воздействие сигаретного дыма. Однако структура легких мышей не идентична структуре легких человека. Напр., имеют меньше подслизистых желез, они имеют значительно меньше разветвлений воздушных путей и не содержат респираторных бронхиол. Однако после воздействия сигаретного дыма у мышей развиваются важные изменения, сходные с человеческими, включая воспаление с нейтрофилами, макрофагами и T клетками, сопровождаемое увеличением воздушных пространств, которое легко обнаруживается у большинства, но не во всех линиях к 6 мес. (Hautamaki et al, 1997). В отношении воздушных путей после воздействия сигаретного дыма, мыши теряют реснички, развивается гипертрофия бокаловидных (goblet) клеток и обнаруживается подслизистый фиброз. Важно, что все эти изменения зависят от индивидуальных линий мышей. В самом деле, фенотипы, определяемые во многих линиях мышей, могут быть использованы в GWA сканировании (в исследованиях генетического картирования, подобных GWA исследованиям у людей), чтобы идентифицировать генетические варианты, вызывающие болезнь.

Murine genome-wide scans

Использование мышей в GWA исследованиях может помочь ускорит идентификацию генетических основ сложных болезней человека. Идентификация генетических основ, ответственных за фенотипические варианты, на модельных мышах наиболее успешна, если использовать насыщенные SNP панели и фенотипические измерения нескольких лабораторных линий. Было предположено, что успешные геномные исследования у мышей нуждаются, по крайней мере, в 30 разных линиях (Cervino et al, 2007). В последние годы исследователи осуществили крупно-масшабные фенотипические исследования для нескольких признаков болезни во многих линиях. Сегодня осуществляется высоко-производительное фенотипирование, чтобы охарактеризовать фенотипические изменения в легких в ответ на острое и хроническое воздействие сигаретного дыма. Успешность геномного сканирования у мышей зависит от доступности и аккуратности генотипической информации. SNP панели доступны благодаря множественным учреждениям. Напр., несколько миллионов SNPs для почти 100 линий мышей предлагаются проектом HapMap SNP (http://snp.cshl.org/) и Center for Genome Dynamics (http://cgd.jax.org/). Эти высокой плотности SNP панели получены с полным охватом SNP исследуемых линий с помощью оценочных значений (imputations). В зависимости от алгоритма imputation, используемого для предсказания недостающих SNP, методы imputation варьируют в отношении своих величин ошибок (Wang et al, 2012). Альтернативный источник информации по non-imputed генотипу доступен для 18 линий от Welcome Trust Sanger Institute (Keane et al, 2011; Yalcin et al, 2011).

Наконец, мыши прекрасная модель для применения продвинутой биоинформационной техники, чтобы верифицировать правильность потенциальных локусов. Идентифицированные гены могут быть легко исследованы в отношении различий в экспрессии на SNP и мРНК уровне, а также белковом уровне (т.e. Western blot или immunohistochemistry). Алгоритмы предсказания, такие как SIFTот J. Craig Venter Institute (http://sift.jcvi.org/) или PolyPhen2 от Sunyaev лаю в Harvard (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) может помочь идентифицировать функционально важные non-synonymous SNPs. Наконец, верификация вновь открытых генов возможна на генетически преобразованных мышах (напр., трансгенных и кондиционных нокаутных мышах). Изучение генетических основ COPD на мышах может помочь выявить молекулярные пути, которые трудно открыть из-за этических ограничений, когда исследуются когорты людей. Подтверждение важности MMP-12 у человека базируется на исследованиях на мышах.

Future directions

Although we have come a long way since the discovery of AAT, much about the genetic basis of COPD remains to be discovered. The driving factor for understanding COPD susceptibility is to identify true genetic variants. This requires advances in the way we perform genome-wide studies with respect to both phenotyping and genotyping. To understand obstructive lung diseases such as COPD our attention is directed towards improved and more discrete phenotyping. Use of electronic health records will also allow investigators to link individual variation in disease manifestations to underlying genetics. Another limiting factor for successful genome-wide studies is the accuracy and density of the genotype information. The aim is to utilize whole-genome DNA and RNA sequence data so that no imputations become necessary and the SNP density is at its maximum. As cost continues to decrease, use of whole-genome technology is becoming practical for patient populations.

Once genes are identified, we must then put them into molecular pathways or networks and identify the role of these pathways in disease pathogenesis. Unbiased approaches are critical to identify genes and pathways not yet considered. However, many of the discovered genes are not well described and teasing out their function and role in COPD is not always straightforward. This problem is manifest in this Review, where it is not yet possible to place the genes in coherent networks that truly inform about the mechanisms of COPD. Once critical pathways are identified, investigators can work on means to inhibit those pathways leading to disease modifying therapy. Understanding the genetics of COPD is also necessary for the development of personalized medicine. We look forward to a day when genetic information is a routine part of patient care informing the physician of one's disease susceptibility, course, potential complications, co-morbidities and treatment. This, and the elimination of cigarette smoking, will ultimately lower the burden of COPD.

Emerging genetics of COPD Annerose Berndt, Adriana S. Leme, Steven D. Shapiro EMBO Molecular Medicine Volume 4, Issue 11, pages 1144–1155, November 2012

Emerging genetics of COPD
Annerose Berndt, Adriana S. Leme, Steven D. Shapiro
EMBO Molecular Medicine Volume 4, Issue 11, pages 1144–1155, November 2012