Посещений:
КОННЕКСОНОПАТИИ



нарушения структуры и функции каналов

Connexinopathies: a structural and functional glimpse
• Isaac E. Garcia†, • Pavel Prado†, • Amaury Pupo†, • Oscar Jara, • Diana Rojas-Gomez, • Paula Mujica, • Carolina Flores-Munoz, • Jorge Gonzalez-Casanova, • Carolina Soto-Riveros, • Bernardo I. Pinto, • Mauricio A. Retamal, • Carlos Gonzalez and • Agustin D. Martinez
BMC Cell Biology VOLUME 17 SUPPLEMENT 1 DOI: 10.1186/s12860-016-0092-x

Mutations in human connexin (Cx) genes have been related to diseases, which we termed connexinopathies. Such hereditary disorders include nonsyndromic or syndromic deafness (Cx26, Cx30), Charcot Marie Tooth disease (Cx32), occulodentodigital dysplasia and cardiopathies (Cx43), and cataracts (Cx46, Cx50). Despite the clinical phenotypes of connexinopathies have been well documented, their pathogenic molecular determinants remain elusive. The purpose of this work is to identify common/uncommon patterns in channels function among Cx mutations linked to human diseases. To this end, we compiled and discussed the effect of mutations associated to Cx26, Cx32, Cx43, and Cx50 over gap junction channels and hemichannels, highlighting the function of the structural channel domains in which mutations are located and their possible role affecting oligomerization, gating and perm/selectivity processes.

в оригинал статьи

Connexin gap junction channels (GJCs) и плуканалы (HCs) являются важными для клеточных коммуникаций. GJCs делают возможными межклеточные обмены ионами и малыми молекулами (напр., IP3, cAMP, cGMP, ATP) и разнообразными метаболитами (напр., сахарами, аминокислотами, глютатионом) (rev. [1]). Одни и те же молекулы и ионы могут проходить через HCs, но в этом случае они действуют как аутокринные и паракринные сигналы (rev. [2, 3]). Мутации генов коннексинов (Cxs) ассоциируют с генетическими нарушениями, такими как аномалии кожи, кардиомиопатии, нейродегенеративные и онтогенетические болезни, катаракты и в большинстве случаев наследственной глухоты (rev. [4, 5, 6]).
Каждый HC образуется c помощью олигомеризации 6 Cxs субъединиц, а соединение конец-в-конец двух HCs формирует GJCs. Расположение на мембране Cxs обеспечивается 4 трансмембранными доменами (обозначаются как TM1-TM4), соединенными c помощью двух внеклеточных петель (ECL) и одной внутриклеточной петли (ICL). Сегменты амино конца (NT) и карбоксильного конца (CT) являются цитоплазматическими (Fig. 1a). Несмотря на то, что Cxs обладают высокой гомологией, имеются важные отличия аминокислотных последовательностей ICL и CT. Эти сегменты содержат мотивы для регуляторных киназ и белков, связывающихся с цитоскелетом [7, 8]. Олигомеризация между соотв. изоформами также вносит вклад в ассортимент Cx-базирующихся каналов; напр., гетеромерные GJCs (HCs составляют более одного типа Cxs) и/или гетеротипические каналы (два гомомерных HCs, каждый состоящий из разных типов Cxs). Эти комбинации могут давать GJCs с определенными функциональными и регуляторными свойствами. В нескольких работах подчеркивается, что TM3 в Cx32 [9, 10, 11] и Cx43 [12], и что TM1 и NT сегменты в Cx26 [12, 13] являются критическими для регуляции олигомеризации Cxs. Кроме того, солевые мостики между остатками Glu-146 (TM3) и Arg-32 (TM1) в Cx32; и между Lys-22 (TM1) и Glu-209 (TM4) в Cx26, могут поддерживать внутрипротомерную стабильность [14]. Несмотря на это кристаллическая структура Cx26 показывает, что основные взаимодействия между протомерами происходят на внеклеточной стороне TM2 и TM4. Более того, араматический кластер, формируемый c помощью внеклеточных петель и TM3 , также участвует в межпротомерном взаимодействии [15]. Однако, совместимость олигомеризации между Cxs ассоциирует со специфическими остатками в NT регионе [13, 16].

Fig. 1 Localization of loss-of-function mutations for Cx26 GJC. a Cartoon representation of a Cx26 monomer, colored with a blue-green gradient from the N- to the CT region. Localization of loss-of-function mutations are colored in red. bLateral (c) Top (d) Bottom view of the same subunit of (a), in the context of the HC assemble. The HC surface is transparent and white. The figure was generated with PyMol and edited with Gimp
Cxs олигомеризуются, чтобы сформировать пору, чья самая узкая часть обнаруживается в ECLs, вблизи зоны швартовки (docking) [15, 17]. Как упоминалось выше, различия в аминокислотных последовательностях между Cxs могут влиять на свойства каналов. Предполагается, что пронизывающие мембрану регионы Cxs не только важны для внутри и между протомерными взаимодействиями, но и они также могут предопределять функциональные свойства, такие как пропускная способность, проницаемость и структура пор. Относительно состава пор имеются некоторые противоречия относительно того, какие домены TMs участвуют. Некоторые работы подчеркивают важность TM3 в Cx32 каналах [11, 18] и TM1 в Cx46 каналах [19, 20] как принципиальных компонентов спиральных пор. В подтверждение роли TM1 в качестве выстилки поры были предположено, что зависимый от напряжения механизм loop-gating в Cx32*Cx43 EL1 химере (в которой ECL1 из Cx43 замещен ECL1 из Cx32), использует ротацию TM1 вместе с наклоненными внутрь шестью протомерами [21]. Разрешение в 3.5 µ кристаллической структуры Cx26 показало, что TM1 является главным составляющим поры [15] (Fig. 1). Структура также показала, что TM2 выстилает пору, но в меньшей степени, тогда как TM3 и TM4 обращены лицом к гидрофобному окружению мембраны. TM1 наклонен, это сужает диаметр поры до 14 µ от цитоплазматической до внеклеточной стороны мембраны [15]. Недавно, осуществлена молекулярная динамичная очистка кристаллической структуры Cx26, Kwon and co-workers (2011) [22] показали, что узкая часть поры д. быть даже меньше.
Как было предположено ранее для Cx32 [23] и затем подтверждено Maeda and co-workers для Cx26 [15], домен Cx-NT располагается внутри поры, лицом к TM1s и образует воронкообразную структуру, которая может ограничивать диаметр поры во время процесса пропускания [15]. Стабилизация внутри поры NT достигается за счет гидрофобных взаимодействий между остатками Trp-3 (NT) и Met-34 (TM1) от соседних протомеров [15]. Это взаимодействие, как полагают Oshima and co-workers (2007), которые установили в поре выдающуюся плотность электронов в середине поры, генерируемую c помощью мутации глухоты Cx26M34A. Снижение в таких порах плотности электронов наблюдается, когда остатки 2-7 (Cx26M34A-del2-7) были делетированы [24], подтверждая, что NT главный участник в закрытии пор.
Эксперименты с использованием химерных HC из Cx32*Cx43ECL1, предоставили ещё больше информации о механизме пропускания базирующихся на Cx каналов [21]. В этой химере замена Cys на остаток Ala в положении 40 и 43, расположенных на границе TM1/E1, формирует дисульфидные мостики с соседними протомерами, если клетки погружены в растворы, то ожидается удержание HCs закрытыми (5 mM Ca2+ или 10µM Cd2+). Эти результаты строго подтверждают роль этих остатков в механизме "loop-gating" и внеклеточной регуляции Ca2+ в HCs [21, 25].

GJCs and HCs gating regulation


Как регулируются пропускная способность и проницаемость в Cxs каналах является предметом интенсивных споров. Кстати предположены три типа механизма пропускания: 1) Домен NT выступает в качестве сенсора напряжения: который закупоривает преддверие канала и участвует в быстром или V(j)-пропускании [15, 26], 2) Loop gating: при котором внеклеточные двухвалентные катионы (напр., Ca2+) соединяются с внеклеточными петлями и блокируют HCs путем стабилизации закрытой конформации петель ворот (loop gate) [25, 27], and 3) Модель ball-and-chain: которая предполагает, что CT является частью механизма ball-and-chain, чтобы регулировать пропускную способность HCs. Последний механизм использует конформационные перестройки CT, вызываемые напряжением или химическими (pH, redox, phosphorylation) стимулами, которые способствуют связи между этим сегментом и ICL, и регулируют механизм быстрого V(j)-пропускания [28-33]. Эт о взаимодействие нуждается в образовании альфа спиральных структур на ICL пептиде, с которыми CT связывается после внутриклеточной ацидификации [30].
Учитывая значение упомянутых выше механизмов для функции каналов, очень важно понимать, как мутации Cxs сцеплены с болезнями, нарушающими эти процессы. Далее мы опишем генетические заболевания, ассоциированные с четырьмя Cxs. Из-за нехватки места мы не включаем информацию о др. важных Cxs с мутациями, ассоциированными с болезнями, такими как мутации Cx46, связанные с врожденной катарактой [6, 34] или с повышенным риском возникновения болезней, подобных полиморфизмам в генах Cx37, ассоциированные с сердечно-сосудистыми болезнями [35].

Disease associated to Cx26 mutations


Генетика нейро-сенсорной потери слуха ассоциирована в основном с мутациями в Cx26 [36] (Table 1). Два клинических фенотипа возникают в результате мутаций Cx26: 1) несиндромальная глухота, при которой пациенты обнаруживают от слабой до тяжелой глухоты с отсутствием др. патологических проявлений; и 2) синдомальная глухота, при которой нейро-сенсорная потеря слуха сопровождается рядом тяжелых тканевых дефектов, таких как наблюдаемых при ладонно-подошвенной кератодермии [37, 38], keratitis ichthyosis deafness syndrome (KID) [39-42], Vohwinkel синдром [43], histrix-подобный ихтиоз с синдромом глухоты и синдром Bart-Pumphrey [44, 45].

Table 1 Effect of mutations in Cx26 (GJB2) on the functional state of HCs and GJCs evaluated in a heterologous expression system, the domain that is affected and its phenotype
Среди попыток идентифицировать патогенный механизм синдрома KID, получены две трансгенные животные модели. Они экспрессируют мутации Cx26S17F и Cx26G45E в коже и/или улитке [46, 47] и дают сходные фенотипические отклонения, отличающиеся от таковых у людей. Экспериментальные результаты строго подтверждают, что возможные механизмы в коже могут быть связаны с нарушениями гомеостаза кальция в коже и нарушениями водного обмена, обусловленные аномальным составом липидов в роговом слое [48]. Для объяснения потери слуха предложено несколько гипотез. Они включают потерю гомеостаза Ca2+ и высвобождения АТФ [49, 50], нарушение проницаемости для Ins(1,3,4) P3 [51], потерю эндокохлеарного потенциала за счет дефицита рециклинга K+ между эпителиальной сетью GJ и stria vascularis [52], и онтогенетические нарушения или дегенерацию улитки, вызываемую массивной клеточной гибелью [53, 54]. Обзоры см. [4, 55].

Disease associated to Cx32 mutations


Cx32 экспрессируется в нескольких типах клеток, включая клетки, формирующие миелин, как в периферической, так и ЦНС (CNS); в Шванновских клетках и олигодендроцитах, соотв. Мутации в этом белке ассоциируют с широко распространенной X-сцепленной наследуемой формой Charcot-Marie-Tooth disease (CMT), патологией, обозначаемой как CMT1X , которая объясняет 10 % случаев CMT [56-58]. Благодаря X-сцеплению, мужчины обнаруживают от умеренной тяжести до тяжелых симптомов [59, 60], тогда как более умеренные фенотипы обнаруживаются у гетерозиготных женщин [61, 62].
В периферической нервной системе мутации в Cx32 вызывают прогрессирующую мышечную атрофию и разнообразные сенсорные потери, симптомы, ассоциирующие с низкой аксональной проводимостью и потерей дистальных частей аксонов [63]. Однако продолжительное время проведения сенсорных импульсов в центр возникает как следствие миссенс мутаций Cx32 [64-66].
Cx32 располагается в аксональных параузлах (paranodes) и Schmidt-Lantermann вырезках (incisures) [67-69] периферических нервов. Следовательно, GJC, образуемые c помощью этого белка, не соединяют соседние клетки, но соединяют смежные обороты не компактного миелина. Эти каналы действуют подобно пути избирательной диффузии, существенно снижая расстояние между ядром и аксональной мембраной миелиновых слоев [67, 70].
Периферические патологические механизмы, ассоциированные с мутациями Cx32 возможно участвуют в потере функции GJC (Table 2), или за счет внутриклеточного удержания или за счет продукции каналов с аберрантными свойствами [70-72]. Такое отсутствие функциональности может снижать перенос сигнальных молекул, таких как цАМФ, между аксональными частями и ядром Шванновских клеток [73].

Table 2 Effect of mutations in Cx32 (GJB1) on the functional state of HCs and GJCs evaluated in a heterologous expression system, the domain that is affected and its phenotype
Более того, по крайней мере некоторые эффекты мутаций Cx32 были ассоциированы с избыточностью функции GJC (Table 2). Несмотря на это базируется на косвенных электрофизиологических исследованиях, осуществленных на двух пациентах, которые не экспрессировали Cx32; эти пациенты обнаруживают зрительными и звуковыми сигналами возбуждаемые реакции с нормальным временем проведения в центр [74, 75]. Однако, отсутствие центральных функциональных нарушений у большинства CMT1X пациентов и у Cx32-KO животных подтверждает гипотезу избыточности функции GJC у пациентов, у которых болезнь также затрагивала ЦНС [61, 76, 77]. Однако, необходимы дальнейшие исследования о функциональных свойствах каналов Cx32, чтобы подтвердить эту гипотезу.

Disease associated to Cx43 mutations


Oculodentodigital Dysplasia (ODDD) одной из важных болезней человека, связанных с мутациями Cx43 (Table 3). ODDD является аутосомно наследуемым онтогенетическим нарушением, затрагивающим лицо, глаза, зубы и конечности (rev. [1, 78]). Эта патология связана с мутацией гена Cx43 (GJA1) в зародышевой линии [79]. Фенотипы варьируют от лишь синдактилии типа III до ODDD без синдактилии [80, 81], camptodactyli [79], кардиальных нарушений, умеренной умственной задержки [82] и скелетных аномалий, которые могут быть ассоциированы с нарушениями дифференцировки остеобластов [83].

Table 3 Effect of mutations in Cx43 (GJA1) on the functional state of HCs and GJCs evaluated in a heterologous expression system, the domain that is affected and its phenotype
На сегодня описано более 74 мутаций, связанных с ODDD. Однако, менее чем половина из этих мутаций была охарактеризована. Миссенс мутации Cx43, ассоциированные с ODDD распространяются по Cx43 аминокислотной последовательности без четкого паттерна (Table 3). Однако, большинство мутаций концентрируются в первой половине белка, лишь немногие локализуются в CT регионе (Table 3). Домен CT содержит несколько остатков, которые могут быть фосфорилированы и это делает возможной регулировку процессов таких как коммуникации, доставка в плазматическую мембрану и сборка и деградация белка щелевых соединений [84]. CT взаимодействует также с ZO-1 [85], v-Scr [86] и др. белками, включая цитоскелетные белки [87].
Некоторые мутации, ассоциированные с ODDD, располагаются в регионе ICL Cx43 (Table 3), демонстрируя важность этого домена для функции Cx43 каналов. ICL является критической как для pH-обеспечиваемой пропускной способности, так и для архитектуры поры канала [88]. Напр., ODDD мутация Cx43G138R, которая располагается в этом домене, приводит к нефункциональности GJCs, если экспрессируется в клетках N2A [89, 90, 91, 92]. Напротив, мутация повышает активность HC, определяемую по измерению высвобождения АТФ [91]. Более того, модельные мыши, несущие эту мутацию (Cx43G138R) имеют фенотип, который напоминает наблюдаемые у людей черепно-лицевые альтерации, двухстороннюю синдактилию, небольшие зубы (микродонтия), неспециализированная гипоплазия эмали, остеопению и редкие волосы [93].
Принципиальная роль Cx43 GJCs в миокарде делает возможным быстрое и скоординированное электрическое возбуждение, важное для распространения потенциала действия по сердцу. Cx43 располагается в основном в интеркалярных дисках миокарда желудочков. Геометрическое расположение дисков, а также общее количество GJCs, по-видимому, является детерминантом для характерного анизотропного проведения миокарда желудочков. Миокард предсердий экспрессирует высокие уровни Cx43 и Cx40 в дополнение к небольшим количествам Cx45 [94]. Кроме того, сообщалось, что клетки, формирующие проводящую систему (ответственную за быструю локализацию электрического сигнала из сино-атриального узла в желудочки), экспрессируют Cx43, Cx45, Cx40 и Cx30 [95, 96]. Однако, пациенты с мутациями в Cx43 редко обнаруживают кардиальные проблемы (Table 3). Кроме того, врожденные болезни сердца не всегда ассоциированы с мутациями Cx43 [97]. Пока лишь немногие мутации Cx43 оказались сцеплены с болезнями сердца. Напр., Ser364Pro, которая приводит к viscera atrial heterotaxia [98], ограничивает GJCs коммуникации в трансфицированных клетках. Последующая работа Thibodeau et al. [99] выявила мутации сдвига рамки считывания у пациента с фибрилляциями предсердий. Эта модификация использует делецию одиночного нуклеотида (c.932delC) с 36 аберрантными аминокислотами с последующим стоп кодоном. Интересно, что мутация отсутствовала в лимфоцитах периферической крови и иммуногистологический анализ ткани левого предсердия показал области с нормальными GJCs, но в то же самое время области с господствующими внутриклеточными недостатками Cx.

Disease associated to Cx50 mutations


Волокна и эпителиальные клетки в хрусталике глаза соединены посредством Cx50 GJCs [100-102]. Такое общение необходимо для поддержания ионных условий, необходимых для предупреждения образования катаракты [103], патологии, вызывающей помутнение хрусталика, ограничение количества света, достигающего сетчатки. Мутации Cx50 (Table 4) были идентифицированы у членов семей с наследственными катарактами. Фенотип может варьировать между пациентами, при этом миссенс мутации и сдвига рамки считывания идентифицируются чаще всего (revi. [6]).

Table 4 Effect of mutations in Cx50 (GJA8) on the functional state of HCs and GJCs evaluated in a heterologous expression system, the domain that is affected and its phenotype

Все мутации Cx50 вызывают потерю функции GJCs, за исключением G46V, которая вызывает избыточность функции GJCs [104]. Эти мутации д. вызывать. как неправильную локализацию, так нарушения функции GJCs и HCs (напр., пропускной способности или избирательности заряда) [105, 106, 107]. На клеточном уровне возможно, что мутации Cx50 затрагивают межклеточные коммуникации, обеспечиваемые гетеромерными Cx46-Cx50 GJCs. Эта идея базируется на результатах, демонстрирующих, что эти Cxs локализуются совместно в GJCs бляшках [108-110]. Активность дефектных GJCs д. изменять транспорт растворов между клетками и разрушать гомеостаз Ca2+ [111, 112]. Аномальный транспорт ионов особенно ионов Na+, вызывает набухание хрусталика и усиливает циркуляцию жидкости внутри структуры. Прогрессирование этой аномалии может влиять на транспорт питательных веществ и очистку от вредных метаболитов, запуская развитие катаракты [112].

Location of mutations associated to diseases and their functional consequences on GJC and HCs


Учитывая преимущества естественно возникших мутаций в Cxs и предыдущие исследования, сфокусированные на эффектах ассоциированных с болезнями мутаций на состояние GJCs и HCs, мы увидели сходство и различия между Cxs относительно положения мутации, ассоциированной с соотв. болезнью и её функциональные следствия на GJCs и HCs.
Таблицы суммируют экспериментальные результаты влияния на GJCs и HCs, полученные на разных Cxs и разных болезненных условиях. Они показали, что независимо от болезни и Cx, все мутации вызывают потерю функции GJCs, частично или полностью. Снижение активности GJCs может быть следствием снижения количества каналов на прикасающихся мембранах или изменения функциональных свойств одиночных каналов.
Было установлено, что потеря функции GJCs, вызываемая мутациями Cx, достаточна для возникновения патологии. Однако, неясно, связана ли степень потери функции с тяжестью болезни. Считается, что существует хорошая позитивная корреляция между тяжестью Cx-сцепленной болезни и потерей функции соотв. GJCs. К сожалению, экспериментальные данные не подтверждают это утверждение. С одной стороны, позитивная корреляция может быть обнаружена, если анализ ограничивается некоторыми миссенс не синдромальными мутациями Cx26 (V37I и A40G). Поскольку эти генетические модификации индуцируют GJCs с потерей функции (A40G) и активные каналы с пониженной проницаемостью (V37I) [113], они вызывают тяжелую глухоту и умеренные болезненные проявления, соотв. [4]. Однако, четкая корреляция не может быть установлена, когда анализируются др. мутации, такие как некоторые мутации Cx32, ассоциированные со слабым и умеренным (Null111-116) и от умеренного до тяжелого (R220X) CMTX1 фенотипов. Как ожидалось, проницаемость этих каналов для разных окрашивающих трассеров снижена, тогда как размер зонда (probe) увеличен [114]. Однако, в отличие от каналов, содержащих Null111-116 мутацию проницаемость R220X-Cx32 GJCs для малых зондов (neurobiotin) дикого типа [115]. В том же самом регионе (TM1-ECL1) др. мутации вызывают нефункциональные GJCs и HCs (eg. E48K, D47N, S50P) [110, 116-118]. Напротив, Cx50 W45S действует как доминантно негативный канал, если экспрессируется совместно с Cx50, снижая GJCs сцепление между клетками хрусталиковых волокон [106]. Приведенные доказательства подтверждают, что механизмы болезни могут возникать при незначительных изменениях в проницаемости GJCs, которые невозможно обнаружить при обычном электрофизиологическом исследовании и методом купирования окраски.
Чтобы узнать расположение мутаций в структуре канала, мы создали несколько молекулярных моделей из разных Cxs c помощью гомологичного моделирования, принимая во внимание кристаллическую структуру Cx26 GJC, опубликованную Maeda et al., (2009). в качестве матрицы [15]. Из-за отсутствия экспериментальной структуры человеческих Cx32, Cx43 и Cx50, мы создали похожие структурные модели, используя Modeller [119], базируясь на структуре человеческого Cx26 в качестве матрицы (pdb: 2ZW3) (Figs. 2 and 3). Отсутствующие остатки из структуры человеческого Cx26 мы вставили c помощью Modeller. Остов экспериментальной структуры Cx26 полностью законсервирован. 10 моделей были созданы в каждом случае и те с наинизшим показателем discrete optimized protein energy (DOPE) были выбраны в качестве финальных моделей. Рис. 1 показывает мономер Cx26 в контексте коннексона, а также расположение остатков, мутантных при генетической глухоте, которые вызывают потерю функции GJCs. Ясно, что хотя мутации потери функции могут быть расположены где угодно в протомере, они концентрируются с NT к TM2 доменам (Fig. 1), регионы, которые выстилают пору и являются критическими для напряжением контролируемо пропускной способности [120]. Более того, др. мутации в трансмембранных регионах, по-видимому, расположены в местах соприкосновений между белками и белками и липидами (interfaces) (Fig. 1b, c). Такое расположение может быть важным для взаимодействий между и внутри протомеров [121], которые могут стабилизировать канал или вносить вклад в сборку канала GJCs. Для Cx32, характер расположение мутаций, которые вызывают потерю функциональных GJCs, очень сходен с наблюдаемым для Cx26 (Fig. 2b), подтверждая строгое сходство структурных свойств между этими двумя Cxs. Для Cxs 43 и 50, мутации, которые вызывают потерю функции GJCs. более ограничены. Тот факт, что они располагаются главным образом на участке от NT до ECL1 (Fig. 2c, d) подтверждает важность этого региона для функции канала во всем семействе Cx. Однако, ICL Cx43 также представляется важным для ряда мутаций, вызывающих потерю функции GJCs (Table 3).

Fig. 2 Mutations affecting function of GJCs. Models of single Cxs chains are represented as cartoons, and colored with a blue-green gradient from the N- to the CT region, for (a) Cx26 (b) Cx32, (c) Cx43 and (d) Cx50. Positions of loss of function mutations are colored as red and gain of function mutations as yellow. The figure was generated with Pymol and edited with Gimp

Fig. 3 Mutations affecting function of HCs. Models of single Cxs chains are represented as cartoons, and colored with a blue-green gradient from the N- to the CT region, for (a) Cx26 (b) Cx32, (c) Cx43 and (d) Cx50. Positions of loss of function mutations are colored as red and gain of function mutations as yellow. The figure was generated with PyMol and edited with Gimp

Mutations affecting HCs function


HCs играют важную роль в физиологических и патологических условиях, поскольку они предоставляют пути для передачи паракринных и аутокринных сигналов между клеткой и внеклеточной средой [2, 122]. Следовательно, правдоподобным лежащим в основе механизмом коннексинопатий является возможность, что некоторые болезненные состояния возникают в результате дисфункции HCs. Напр., аберрантная избыточная функция HCs ассоциирует с синдромальными мутациями Cx26, которые приводят к синдрому keratitis ichthyosis deafness (KID) [13, 123, 124]. Для др. Cxs (Cx32, Cx43 и Cx50), описано очень немного случаев, что затрудняет определение общего механизма болезни (Tables 1, 2, 3and 4). Исключения составляют некоторые мутации Cx32 (S85C и F235C), которые вызывают аберрантную избыточную активность HC при CMTX1 [125, 126], такое поведение сходно с KID-сцепленными мутациями Cx26, т.e., вызывается избыточная функция HCs [125] и потеря функции GJCs [127]. Хотя мутация S85C вызывает аномальное открытие HCs [128], эта мутация не связана с каким-либо определенным тяжелым фенотипом CMTX1 [129].
Большинство мутаций, вызывающих избыточность функции HCs собираются в кластеры исключительно в остатках, выстилающих пору, в NT, TM1 и ECL1. Они также локализуются в меньшей степени в TM2 (Fig. 3). В случае Cx26, несколько мутаций, связанных с тяжелыми клиническими проявлениями KID, располагаются в переходной зоне между TM1 и ECL1, домене, участвующим в, напряжением контролируемой, пропускной способности и в контроле HCs с помощью внеклеточного Ca2+ [25]. Более того, кластер синдромальных мутаций обнаружен в домене NT белка, который участвует в быстрой пропускной способности HCs [24, 130]. Несмотря на это роль др. регионов HCs д. быть исследована далее. Напр., Cx32 мутация F235C, располагаемая в CT белка, также вызывает избыточность функции HCs [126].
Избыточная функция HCs также наблюдалась в Cx43, связанном с коннексинопатиями, поскольку мутации I31M (TM1), G138R (ICL) и G143S (ICL), все способствуют избыточности функции (Table 3). Как упоминалось выше, ICL участвует в регуляции быстрой V(j)-пропускной способноси, которая зависит от взаимодействия с CT [28, 29, 30, 31, 32]. Более того, Dobrowolski and co-workers (2008) [93] обнаружили повышенное высвобождение АТФ в культивируемых кардиомиоцитах у G138R-мутантных мышей, с нарушениями сердца. Было предположено, что HCs с избыточной функцией в G138R-мутантных кардиомиоцитах может быть одной из причин аритмии сердца. Как и ожидалось, некоторые мутации вызывают потерю функции HCs (Table 1 and Fig. 3). Напр., мутации, связанные с не синдромальной нейро-сенсорной потерей слуха, дают нефункциональные HCs [113]. В самом деле, имеются некоторые синдромальные мутации, которые обнаруживают нефункциональные HCs, которые обнаруживают избыточность функции только при совместной экспрессии со своим партнером дикого типа или при аберрантном взаимодействии с Cx43 [13, 131].
Наконец, необходимо учитывать, что в нормальных тканях клетки д. экспрессировать несколько изоформ Cxs, возникает возможность взаимодействия между изоформами Cxs. Недавние результаты, полученные Dr. Martinez' lab [13] и группой Dr. White's [131], подтвердили, что взаимодействия между мутантными Cx и совместно экспрессируемыми Cxs образуют гетеротипические/гетеромерные каналы, что необходимо учитывать при объяснении клинических фенотипов коннексинопатий. Т.о., взаимодействия мутантных белков с белками дикого типа Cxs могут ослаблять или усиливать клинические проявления. Эта возможность может быть подкреплена, если мутации затрагивают критический сегмент, участвующий в совместимой олигомеризации, давая аберрантные гетеромерные HCs, которые обеспечивают патологические условия и эффективные терапевтические комплексы. Согласно этому сценарию дополнительные исследования, пытающиеся выявить патологический механизм коннексинопатий, д. учитывать это при изучении Cxs в гетеромерных скорее, чем гомомерных состояниях, которые более сильно напоминают нативные клеточные условия.

Conclusions


Most mutations causing connexinopathies generates total or partial loss of GJCs function. However, it is unclear if the severity of disease correlates with the level of GJCs loss of function. Mutations associated with loss of function GJCs are distributed along the entire protein sequence with no clear pattern of clustering at any segment, which suggest that GJC functionality is very sensitive to minor changes in Cxs protein, and that subtle changes in GJC functionality are sufficient to cause diseases. Less in known about the effect of mutations associated to connexinopathies on the functional state of HCs. The clearest correlation between gain of function HCs and disease has been found in most types of syndromic deafness associated to Cx26, in particular in KID syndrome. For others Cxs, few mutations are associated to gain of HCs function, however, we can not discard that this condition may be underestimated because most studies in the past have been more focused in GJCs than HCs. Therefore, it is yet difficult to make a general statement that represent all Cxs associated to connexinopathies. Nevertheless, it is clear that all mutations eliciting gain of HCs function are clustered in pore-associated domains like the NT and the TM1/ECL1, which are critical regions for gating and regulation.