Huntington's disease (HD) (OMIM: 143100) является наследственным нейродегенеративным нарушением, характеризующимся непроизвольными движениями, деменцией, и изменениями особенностей характера (personality). HD передается как аутосомно доминантное нарушение, для которого экспансия CAG тринуклеотидных повторов внутри кодирующего региона гена huntingtin (HTT) является причиной данного заболевания [1]. Повторы CAG кодируют полиглютаминовый домен в Htt белке и приводят к гибели нейрональных клеток, затрагивая преимущественно хвостатое ядро (caudate nucleus) и putamen, хотя потеря нейронов широко распространена в головном мозге HD [2], [3]. В то время как биологические процессы, приводящие к нейродегенерации при HD недостаточно понятны, нарушения регуляции транскрипции, как полагают, является центральным в патогенезе HD. Описаны широко распространенные альтерации в экспрессии генов [4] а некоторые исследования подтвердили, что экспрессия генов может быть изменена на одной или более стадиях процессинга, трансляции, посттрансляционных модификациях и поставки РНК [5], [6].

MicroRNAs (miRNAs) небольшие не кодирующие РНК, действующие как трансляционные регуляторы экспрессии мРНК. miRNAs могут ингибировать экспрессию генов или направлять мРНК или на хранение или на деградацию [7]. Недавно, нарушение регуляции miRNAs было связано с нейрологическими и нейродегенеративными нарушениями [8], а некоторые исследования определяли роль miRNAs при HD. Marti et al [9] выполнили miRNA-секвенирование для двух объединённых выборок HD и для двух объединенных контрольных выборок и обнаружили изменение экспрессии для большого количества miRNAs. Измененная экспрессия miRNAs, оценена количественно с использованием технологии микромассивов, на клеточных моделях HD [10]-[12] и на мышиных моделях HD [12]-[15], но всестороннее изучение экспрессии miRNA и мРНК с использованием следующего поколения секвенирования не было осуществлено на пациентах с HD

Чтобы исследовать (1) присутствие измененной экспрессии miRNA (2) потенциальную роль miRNAs на изменение экспрессии мРНК при HD, мы осуществили секвенирование miRNA и секвенирование мРНК, используя Illumina massively параллельное секвенирование 12 HD и 9 нейрологически нормальных контрольных выборок головного мозга. Это стало первой геномной количественной оценкой экспрессии miRNA HD и контрольного головного мозга и первой комбинированной тотальной экспрессии miRNA с тотальной экспрессией мРНК, полученной с помощью массивного параллельного секвенирования.

Discussion

Up-regulation of expression for five miRNAs in HD brain

Мы описали секвенирование следующей генерации малых РНК, идентифицировав 1,417 видов зрелых миРНК в префронтальной коре (Brodmann Area 9) 12 HD пациентов и 9контрольных. 5 из них, miR-10b-5p, miR-196a-5p, miR-196b-5p, miR-615-3p и miR-1247-5p, усиливали свою активность в геноме HD при геномной оценке (FDR q-value менее 0.05), а 3 из этих пяти, miR-196a-5p, miR-196b-5p и miR-615-3p, экспрессировались почти не нулевом уровне в контрольном головном мозге. Усиление активности miR-10b-5p было выявлено в выборках секвенирования миРНК и подтверждено на независимых репликационных выборках. Несколько исследований проведено по выяснению роли миРНК при сравнении HD с контрольными выборками головного мозга.

Packer et al. [11], изучали массив из 365 зрелых миРНК, содержащий ранее описанную miR-196a-5p достоверно увеличивающуюся почти в 6 раз в области Бродмана 4 головного мозга HD grade 1. Недавно исследование Cheng et al. [13] обнаружило повышенную экспрессию miR-196a, супрессирующую экспрессию мутантного HTT как в моделях HD на нейрональных клетках, так и в трансгенных мышиных моделях HD. Эти находки подтвердили, что повышенная экспрессия miR-196a может быть адаптивной реакцией, способствующей выживанию нейронов и пригодной для терапевтического применения при HD. Miyazaki et al. [35] изучали miR-196a при spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA), нейродегенеративном заболевании, вызываемом экспансией сходных полиглютаминовых повторов в гене андрогенного рецептора (AR). Они обнаружили повышенную экспрессию miR-196a с помощью аденоассоциированным вирусным вектором обеспечиваемой доставки уменьшенных уровней мРНК AR, приводящей к улучшению нейрологических функций у трансгенных SBMA мышиных моделей. Итак, эти находки подтвердили нейрозащитную роль miR-196a и их нацеленность и возможное терапевтическое использование для множественных нейродегенеративных болезней с полиглютаминовой экспансией. miR-196a-5p и miR-10b-5p находились среди 56 миРНК, оценённых в отношении избыточной экспрессии мутантного HTT в недифференцированных NT2 клетках [36]. В соотв. с программой исследований миРНК "PubmiR," [37] miR-196b-5p, miR-1247-5p и miR-615-3p не были ранее описаны при изучении миРНК у HD.

Проведен ряд недавних исследований уровней миРНК при HD, у HD трансгенных мышей или клеточных моделей; однако мы не воспроизводили результаты, полученные в этих исследованиях. Gaughwin et al.[36] описали повышение miR-34b в выборках плазмы у HD, но мы не обнаружили изменений ни miR-34b-3p, ни miR-34b-5p в головном мозге HD на геномном уровне. Мы оказались неспособны подтвердить какие-либо миРНК, описанные в последних исследованиях микромассивов, включая 9 миРНК, описанных как подавляемых у двух мышиных моделей HD (YAC128 и R6/2) by Lee et al. [14], используя микромассив из 567 миРНК или 38 миРНК, с измененной экспрессией у HD трансгенных мышей в микромассиве из 382 миРНК [15]. Johnson et al. [10]-[12] описанные miR-29a и miR-330, обнаруживали достоверное увеличение экспрессии в HD выборках, ни одна из них не была обнаружена измененной в данном исследовании [10]. В RT-qPCR исследовании сравнение 90 миРНК у мышей Hdh (Q111/Q111) в клетках полосатого тела и у контрольных мышей [12], [38], ни одна из 27 описанных, как дифференциально экспрессирующихся миРНК, не обнаруживали отличий в уровне в нашем исследовании. Наиболее широко распространенная измененная миРНК в исследованиях HD, miR-132, была описана как подавляемая [10], [14], [39], так и активируемая [11], но не обнаружено различий в экспрессии в нашем исследовании.

Поскольку некоторое отсутствие соответствия может быть следствием различий между человеком и животными моделями HD, также возможно, что некоторые отличия являются следствием использования разных технологий. Микромассивы могут иметь разные уровни детекции для некоторых миРНК от тех, что наблюдаются при секвенировании миРНК. Наконец, почти все исследования использовали методы микромассивов. Микрочипы, которые изучают только 365 (e.g. Packer et al. [11],) до 567 миРНК (e.g. Lee et al. [14]) не обеспечивают и не приспособлены к требованиям множественных контрастов по сравнению с нашим геномным анализом (напр., выявляющем 1417 miRNAs).

miR-10b-5p, miR-196a-5p, miR-196b-5p and miR-615-3p implicate Hox cluster genes

4 (miR-10b-5p, miR-196a-5p, miR-196b-5p и miR-615-3p) из пяти дифференциально экспрессирующихся миРНК оказались связаны с генами Hox кластеров: (1) эти 4 оказались расположенными в межгенных регионах Hox кластеров, (2) 11 Hox генов рассматриваются как мишени для этих 4-х миРНК (3) Hox гены, соседствующие с дифференциально экспрессируемыми миРНК, и экспрессируются по другому и (4) множественные гены Hox кластеров дифференциально экспрессируются при HD противовес контрольному головному мозгу (Table 4).

Из 11 Hox генов-мишеней, 8 не отличались своей экспрессией в зависимости от условий. Единственная мишень, HOXD1 обнаруживала снижение экспрессии при HD (FC = ?2.45). HOXD1 описан как мишень для 4-х из 5 миРНК [40], это может объяснить его репрессию при HD.

Три Hox гена-мишени усиливали свою активность при HD (HOXB7, HOXD4 HOXD10). Возможно, что эти усиливающие свою активность Hox гены обладают сходными регуляторными механизмами, т.к. повышенная экспрессия миРНК не вызывает ожидаемого miRNA-обусловленного молчания генов и супрессии наблюдаемого усиление активности генов мишеней для миРНК. Совместная эволюция Hox генов и связанных с Hox миРНК может в дальнейшем подтвердить, что они обладают общими регуляторными элементами или механизмами [41]. Более того, Hox гены и связанные миРНК, как было установлено, обладают сходными паттернами активации транскрипции и активируются ретиноевой кислотой [42]-[46]. Хотя miR-10b-5p считается нацеленной на HOXD4, они могут обладать паттернами совместной экспрессии. В частности, Phua et al. [45] описали miR-10b и HOXD4 как совместно экспрессирующиеся во времени во время дифференцировки нейронов. Здесь мы видели сходное усиление активности и паттерн совместной экспрессии у HD, где miR-10b и HOXD4 оба экспрессировались на высоком уровне.

Hox гены являются семейством транскрипционных факторов, вносящих вклад в основные морфологические изменения во время эмбрионального развития и необходимых для закладки переднезадней оси тела у билатерально развивающихся видов [47]. Они широко используются в большинстве аспектов раннего развития и заметно экспрессируются в развивающемся головном мозге [48]. Hox-связанные miRNAs могут также обнаруживать одинаковый пространственно-временной паттерн экспрессии во время эмбриогенеза [49].

Hox гены регулируются ретиноевой кислотой, а также др. факторами, включая basic fibroblast growth factor [50], стероидные гормоны [51], [52] и polycomb repressive complex group [53]. Белки Polycomb group (PcG) собираются в крупные замалчивающие комплексы и контролируют активность по модифицированию гистонов. Hox гены репрессируются с помощью PcG комплексов, особенно с помощью Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), который триметилирует гистон H3 в лизине 27 (H3K27me3) [53].

Seong et al [54] наблюдали нокаут huntingtin у мышиных эмбрионов, лишенных репрессии HOXB1, HOXB2 и HOXB9 и обнаружили уменьшение глобальных H3K27me3, тогда как knock-in увеличенных повторов у мышей обнаруживал увеличение сигнала H3K27me3, подтверждая, что мутантный huntingtin может изменять собственно активность PRC2. Эти находки открывают возможность, что повышенная экспрессия миРНК и Hox генов, обнаруженная здесь, связана с усилением H3K27me3 или с ухудшением репрессии с помощью PcG. Однако роль Hox во взрослом, HD головном мозге пока неясна. Повышенная транскрипционная активность Hox может быть компенсаторной, помогающей сохранить или повторно установить клеточную полярность или может быть косвенным результатом нарушения эпигенетической регуляции.

miR-10b-5p response in HD may be protective

Чтобы функционально оценить находки по секвенированию миРНК, мы выбрали оценку miR-10b-5p. Мы полагали, что эта миРНК наиболее биологически активно дифференциально экспрессирующаяся миРНК. miR-10b-5p обнаруживает наивысшие базовые уровни экспрессии и наивысшие изменения в укладке при разных условиях. Кроме того, уровни miR-10b-5p не были увеличены при PD, сравнимых агрегатах белков, нейродегенеративной болезни, ни в PD выборках с патологией в префронтальном кортексе, эквивалентной с таковой при HD.

Чтобы определить, обладает ли miR-10b-5p защитным или вредным эффектами на жизнеспособность нейронов мы эктопически экспрессировали miR-10b-5p в окончательно дифференцированных PC12 Q73 клетках. Поскольку уровни 5 дифференциально экспрессирующихся миРНК были повышены, мы ощущали избыточную экспрессию miR-10b-5p лучше всего представленную в фенотипе, наблюдаемом в HD головном мозге.

Мы определили, что повышенная экспрессия miR-10b-5p повышает жизнеспособность PC12 Q73 клеток. Более того, мы установили, что повышенная экспрессия miR-10b-5p повышает жизнеспособность в присутствии индуцируемого апоптозом соединения, MG 132. В этом эксперименте по жизнеспособности клеток с повышенной экспрессией miR-10b-5p были сравнены не вызывающие сомнений клетки и с достоверно более высокой экспозицией токсина. Эти находки предоставили подтверждение гипотезы, что повышенные уровни miR-10b-5p могут быть реакцией по защите нейронов на увеличение полиглютаминовых повторов, наблюдаемых при HD, и могут указывать на роль миРНК ы патологии HD.

miR-10b-5p, miR-196a-5p, miR-196b-5p and miR-615-3p have overlapping biological functions

Используя анализ путей, мы показали, что miR-10b-5p, miR-196a-5p, miR-196b-5p и miR-615-3p нацеленные гены, как полагают, участвуют в апоптозе, а также в развитии и функционировании нервной системы. В нейробластомной SH-SY5Y клеточной линии уровни экспрессии miR-10a, miR-10b и miR-615-5p достоверно повышены во время воздействия all-trans-retinoic-acid (ATRA), указывая, что miR-10a/b и miR-615-5p могут играть роль в дифференцировке нейронов [44]. SH-SY5Y клетки, обработанные антисмысловыми miR-10a или miR-10b обнаруживают нарушения роста и морфологии нейритов, но не обнаруживают изменений в общей пролиферации клеток [44]. miR-10a и miR-10b обнаруживают высокую экспрессию в линиях клеток SK-N-BE, LAN5 и SH-SY5Y во врем воздействия ATRA, а эктопическая экспрессия miR-10ab является зеркальным отражением фенотипа ATRA [42]. Итак, эти исследования выявляют связь этих миРНК с дифференцировкой, миграцией и ростом нейронов.

В нашем прошлом исследовании [16], мы выявили повышение отростков нейритов в HD префронтальном кортексе. Относительно контроля, HD пирамидальные нейроны обнаруживают достоверно повышенное количество первичных дендритных сегментов, увеличение общей длины дендритов и больше веточек дендритов, чем в контрольных нейронах. Здесь мы сообщаем от 4-х миРНК, которые наблюдались в клеточных моделях, дающих сходный фенотип. Возможно, что повышенная экспрессия этих миРНК и родственных мишеней представляют собой адаптивную реакцию нейронов, подвергшихся стрессу от токсических увеличенных полиглютаминовых белковых фрагментов.

miR-10b-5p, miR-196a-5p, miR-196b-5p and miR-615-5p are related to HD pathogenesis

4 из 5 усиливающих активность миРНК обнаруживают ассоциацию с клиническими признаками HD (размер CAG повторов, возраст начала моторных нарушений и возраст гибели для miR-10b-5p; размер CAG повторов и возраст начала болезни для miR-196a-5p, возраст начала для miR-196b-5p и возраст гибели для miR-615-3p). Из-за почти нулевого уровня экспрессии в контроле, невозможно оценить взаимоотношения miR-196a-5p, mir-196b-5p и miR-615-3p с возрастом гибели, но miR-10b-5p не коррелирует с возрастом гибели в контроле. Т.о., повышенная экспрессия этих миРНК, по-видимому, не связана с нормальным старением, а скорее всего это компонент регуляции и транскрипции генов в контексте нейродегенерации. Растет литература, подчеркивающая присутствие токсических эффектов HD гена в основном перед началом симптомов, вообще-то с момента зачатия [55]-[57].

Поскольку возраст гибели представляет собой воздействие на протяжении всей жизни индивида эффектов HD гена, то мы полагаем, что ассоциация miR-10b-5p и miR-615-3p с возрастом гибели может представлять собой воздействие в течение жизни эффектов HD мутации. Если взаимоотношение экспрессии, измененной миРНК с возрастом гибели подтверждает мнение, что HD ген может оказывать эффект в течение жизни от увеличенных CAG-повторов, то это создает возможность, что HD мутация может влиять на развитие нейронов в развивающемся головном мозге посредством действия одной или нескольких из этих миРНК и генов кластеров Hox.

Target genes of over-expressed miRNAs show increased expression in HD

Мы описали 5 миРНК, активность которых усиливается при HD и всё же наши ожидания найти мРНК мишени для этих миРНК снизились, мы наблюдали повышенную экспрессию многих из их общих мРНК мишеней. Мы полагаем, что эти эффекты не связаны с различиями в изученных клеточных популяциях, поскольку анализ проточной цитометрии, измеряющий количество нейронов, не выявил достоверных отличий между разными условиями. Скорее мы можем предположить, что позитивные взаимоотношения между миРНК и мРНК мишенями являются результатом HD-специфических альтераций процессинга мРНК.

Трансляция - это высоко динамический процесс. Цитоплазматическая мРНК активно используется для трансляции, может циклически меняться к не транслируемому состоянию и накапливаться в стрессовых гранулах или processing bodies (P-телах). Во время клеточных стрессов мРНК может секвестрироваться в P-тела или стрессовые гранулы, чтобы остановить трансляцию посредством аппарата репрессии трансляции или замалчивания миРНК, до тех пор стрессовые условия не будут устранены [7], [58]-[60]. P-тельца могут также выполнять важную роль в транспорте РНК. Поскольку нейроны высоко поляризованы, цитоплазматический транспорт мРНК важен для локальной трансляции, чтобы дискредитировать регионы клетки. Во время транспорта, как полагают, мРНК замалчиваются с помощью миРНК после быстрого обмена в синапсах [60]-[62].

В HD кортикальных нейронах excitotoxicity, оксидативные повреждения, аберрантная экспрессия генов и энергетические дефекты приводят к стрессовым состояниям в ответ, клетки могут секвестрировать мРНК в P-тельца и стрессовые гранулы. Среди 55 Hox изученных генов, только 15 достоверно обнаруживают снижение дифференциальной экспрессии (Table 4). Т.о., повышенные уровни большинства проанализированных генов-мишеней для эти х 4-х миРНК могут быть реакцией, т.к. они секвестрируются в P-тельца для хранения как часть защитного процесса увеличения клеточной жизнеспособности [7].

Не была изучена роль P-телец или стрессовых гранул при HD. Однако наблюдалось на живых кортикальных нейронах, что дикого типа huntingtin локализуется совместно в P-тельцах, особенно в нейрональных РНК гранулах, вместе с Argonaute 2, эндонуклеазой, необходимой для РНК-обеспечиваемого молчания генов с помощью RNA-induced silencing complex (RISC) [63], [64]. Следовательно, разумно предположить, что мутантный huntingtin может нарушать миРНК-обусловленную деградацию мРНК и/или локальную трансляцию специфических мРНК.

Имеются доказательства, что miRNA-mRNA регуляторные механизмы могут быть изменены при др. нейродегенеративных болезнях также. Проверка экспрессии miRNA-mRNA при болезни Альцгеймера и в контрольном префронтальном кортексе, найдено огромное количество позитивно секретированных миРНК с мРНК мишенями. Геномные варианты при TDP-43 и FUS, гены, кодирующие белки стрессовых гранул, были обнаружены как вызывающие семейный Amyotrophic lateral sclerosis [65], [66], а некоторые др. белки стрессовых гранул (TIA-1, G3BP) также могут быть патогенными [67].

miRNAs as potential biomarkers in HD

Эти исследования подтвердили потенциальные взаимоотношения этих миРНК с экспансией CAG повторов, возрастом начала или возрастом гибели. миРНК чрезвычайно стабильны. Период полужизни большинства миРНК предполагается в среднем 5 дней, а плазматические миРНК обнаруживались стабильными после воздействия высокой температурой, чрезвычайным pH, долговременного хранения при комнатной температуре или после множественных циклов замораживания [68]-[70]. Если эти миРНК пересекали гематоэнцефалический барьер и могут быть обнаружены на разумных уровнях в сыворотке и плазме от мутантов, носителей гена HD, они могут служить в качестве биомаркеров болезни.