Посещений:
БОЛЕЗНЬ ГИРШПРУНГА

Генетическая обусловленность

The developmental genetics of Hirschsprung's disease
K-F Bergeron1, DW Silversides2, N Pilon
Clinical Genetics Volume 83, Issue 1, pages 15–22, January 2013

Hirschsprung's disease (HSCR), also known as aganglionic megacolon, derives from a congenital malformation of the enteric nervous system (ENS). It displays an incidence of 1 in 5000 live births with a 4:1 male to female sex ratio. Clinical signs include severe constipation and distended bowel due to a non-motile colon. If left untreated, aganglionic megacolon is lethal. This severe congenital condition is caused by the absence of colonic neural ganglia and thus lack of intrinsic innervation of the colon due in turn to improper colonization of the developing intestines by ENS progenitor cells. These progenitor cells are derived from a transient stem cell population called neural crest cells (NCC). The genetics of HSCR is complex and can involve mutations in multiple genes. However, it is estimated that mutations in known genes account for less than half of the cases of HSCR observed clinically. The male sex bias is currently unexplained. The objective of this review is to provide an overview of the pathophysiology and genetics of HSCR, within the context of our current knowledge of NCC development, sex chromosome genetics and laboratory models


Рисунки к статье


Нарушения подвижности кишечника (напр. gastroesophageal reflux, irritable bowel syndrome и chronic constipation) довольно часты в популяциях Сев. Америки. Напр., распространенность синдрома усиленной перистальтики и хронических запоров между 20-25% и 12-19%, соотв. [1-3]. Подвижность ЖКТ контролируется enteric nervous system (ENS), которая оперирует в основном независимо от ЦНС. ENS является самой большой и довольно сложной частью периферической нервной системы, располагающейся по всей длине ЖКТ. ENS координирует исключительно перемешивающие и перистальтические сокращения кишечника посредством взаимодействий с энтерическими гладкомышечными клетками.
Hirschsprung's disease (HSCR) [4] является одной из наиболее тяжелых форм органических запоров.

Structure and function of the ENS


ENS является нервной системой прирожденной для пищеварительной системы. Она состоит из тысяч взаимосвязанных небольших ганглиев, внедренных в стенку всего ЖКТ (Fig. 1a). Каждый ганглий состоит из нейронов и ассоциированных глиальных клеток. Обширные нервные дуги (circuits) ENS способны к локальной автономной функции [5]. Кроме того, ENS работает и совместно с ЦНС посредством широко распространенных двухсторонних соединений, чтобы контролировать пищеварительную систему в контексте локальных и общих для всего тела физиологических потребностей [5, 6]. Эти связи осуществляются как вагусными, так и симпатическими волокнами вдоль мезэнтерических сосудов (Fig. 1b).

Figure 1. Structure of the enteric nervous system. (a) Simplified cross-section of the gut showing the relative positions of the different muscle, neural and mucosal layers. Adapted from Heanue and Pachnis [19]. (b) Side view of a SRYp[1.4?kb]-YFP [54] transgenic mature mouse intestine displaying intrinsic as well as extrinsic (along mesenteric vessels) in vivo innervations. The magnified section shows the fluorescently-labeled neurons of the muscle layers and reveals the typical lattice-like organization of the myenteric plexus.

Стенка кишечника состоит из слизистого слоя, слоя гладких мышц и серозного слоя. Мышечный слой состоит, по крайней мере, из двух листков из параллельных мышечных волокон, обычно расположенных под прямым углом др. к др. : циркулярный слой обращается вокруг кишки, а продольный слой идет вдоль неё. Большинство нейронов ENS обнаруживается в слизистом и мышечном слоях, образуя две основные сети из нервных ганглиев, распространяющихся от пищевода до ануса и известных как подслизистое сплетение и мышечно-энтерическое сплетение, соотв. (Fig. 1a). Мышечно-кишечное сплетение располагается между продольным и циркулярными листками мышц стенки кишки и осуществляет первичный контроль над подвижностью ЖКТ. Подслизистое сплетение, как указывает его название, погружено под слизистую. Его принципиальная роль заключается в ощущении среды внутри просвета, регулирует кровоток ЖКТ и контролирует функцию эпителиальных клеток.
Энтерические нейроны могут быть классифицированы на три широких класса согласно их функции: прирожденные первичные афферентные нейроны (обозначаемые также как сенсорные нейроны), промежуточные и двигательные нейроны. Сенсорные нейроны воспринимают информацию от рецепторов в слизистой и мышцах, отвечая на механические, термальные, осмотические и химические стимулы [7]. Хеморецепторы слизистой чувствительны к кислотам, глюкозе и аминокислотам, это позволяет получать информацию о содержании просвета, тогда как сенсорные рецепторы в мышцах реагируют на растягивание и напряжение. Промежуточные нейроны интегрируют информацию от сенсорных нейронов и предоставляют её двигательными нейронам. Все вместе двигательные нейроны непосредственно контролируют подвижность ЖКТ, кровоток и секрецию за счет непосредственных взаимодействий с многочисленными эффекторными клетками, включая гладкомышечные клетки. Подтипы мышечно-кишечных двигательных нейронов включают возбуждающие и ингибирующие нейроны, взаимодействующие как с продольным, так и циркулярным мышечными слоями. Нейроны, возбуждающие циркулярные двигательные мышцы содержат холинергические маркеры и tachykinins, такие как субстанция P, тогда как ингибирующие двигательные нейроны содержат nitric oxide synthase (NOS), а также вазоактивные кишечные пептиды [8]. Энтерические глиальные клетки предоставляют поддержку для нейронов. Однако, в отличие от индивидуальных Шванновских клеток, энтерические глиальные клетки заключают в оболочку аксоны группами. Энтерические глиальные клети отличаются заметно от от др. глиальных клеток периферической нервной системы и сходны с астроцитами ЦНС в отношении экспрессии S-100 белка и glial fibrillary acidic protein (GFAP) [9]. Эти наблюдения привели некоторых исследователей к классификации ENS как отличающейся нервной системы вне периферической нервной системы, сильно напоминающей вторичную ЦНС.

Neural crest cells: the multipotent precursors of the ENS


Клетки, образующие ENS, происходят из временной, специфичной для позвоночных популяции мультипотентных клеток, наз. клетками нервного гребня (NCC). Эти клетки первоначально специфицируются на границе не нейральной эктодермы (будущего эпидермиса) и нервной пластинки (будущей ЦНС) [10]. Во время нейруляции изгибание нервной пластинки помещает NCC на дорсальный край формирующейся нервной трубки (NT). NCC постепенно подвергаются эпителиально-мезенхимному переходу, это ведет к передне-задней волне отслоения и миграции из NT. Это приводит в конечном итоге к колонизации многочисленных эмбриональных структур (Fig. 2a). NCC могут дифференцироваться в несколько разных типов клеток, включая меланоциты (пигментные клетки), периферические нейроны и глию, черепно-лицевые хондроциты и некоторые кардиальные клетки, кстати, немногие. Однако, популяция NCC гетерогенна и NCC не полностью эквивалентны в отношении их потенциала дифференцировки [11]. Поэтому NCC подразделяются на несколько субпопуляций в соответствии с их происхождением вдоль передне-задней оси: краниальные, кардиальные, вагусные, туловищные и пояснично-крестцовые. Дифференцировка NCC контролируется с помощью комбинации их происхождения вдоль этой оси с воздействием на них регионально отличающихся средовых сигналов. Напр., краниальные NCC вносят обширный вклад в краниальные нервы (нейроны и глия), мезенхиму головы (хрящи, кости и соединительная ткань) и во внутреннее ухо (сенсорные волосковые клетки и меланоциты в stria vascularis) помимо генерации меланоцитов кожи.

Figure 2. Neural crest cell migration. (a) Wnt1-Cre::R26R-YFP [65] double transgenic mouse embryo at embryonic day (e) 9.5. The dashed line indicates the level at which the transverse section shown in the inset was made. Fluorescently labeled neural crest cells (NCC) originate from the dorsal neural tube (NT in the inset) and migrate extensively through the embryo to colonize various structures (white arrows in the inset). Note that the enteric nervous system (ENS) is entirely derived from NCC of the vagal and sacral levels (red and blue arrows). (b) Vagal (red arrows) and sacral (blue arrows) NCC initially reach gut tissue from the NT via a dorsal to ventral migratory route. Colonization is then completed by migration within the embryonic gut mesenchyme. Note that, during a relatively short window of time, a subset of enteric NCC of vagal origin also takes a shortcut from the midgut to the hindgut via the mesentery. Adapted from Farlie et al. [66]. (c) Gata4p[5?kb]-GFP [65] transgenic mouse colons at different stages of development showing the migration of enteric NCC to form the colonic ENS between e11.5 and e15.5. The distal-most part of the colon is outlined in red to facilitate visualization of the whole colon tissue. White arrows indicate the directional migration of enteric NCC of vagal origin. Note that colonization of the hindgut by sacral NCC is preceded by an accumulation of these NCC bilateral to the caudal hindgut at e13.5 (middle panel).

Большая часть ENS происходит из vagal NCC, которые формируются по соседству с сомитами 1-7. Эти вагусные NCC первоначально мигрируют от дорсального до вентрального направления, чтобы колонизировать пердню кишку (будущие пищевод и желудок), где теперь они называются enteric (e) NCC. Как показано на Fig. 2b, вагусные NCC колонизируют переднюю кишку посредством двух отличающихся паттернов миграции, более задние vagal NCC вносят вклад только в небольшой набор eNCC передней кишки [12].Колонизация передней кишки из передней части vagal NCC обеспечивается от ростральной до каудальной миграцией внутри мезенхимы, чтобы проникнуть в среднюю кишку (будущий тонкий кишечник) и заднюю кишку (будущие толстая и прямая кишка) [13, 14] (Fig. 2b,c). Колонизация кишечника с помощью eNCC происходит в течение относительно продолжительного периода (от дня эмбриогенеза 9 до 15 у мышей и от 4 по 7 неделю у человека) и осуществляется параллельно ростом и перестройкой кишечных тканей. Этот период времени, по-видимому, важен для собственно колонизации задней кишки, поскольку субпопуляция eNCC распространяется в проспективный тонкий кишечник и будущую толстую кишку посредством мезентерия во время периода развития, в течение которого эти регионы кишечника временно оказываются рядом. Эти trans-mesenteric eNCC составляют большую часть ENS задней кишки [15]. Наконец, небольшой субнабор ENS также возникает из пояснично-крестцовых NCC (формируемых по соседству, начиная с сомита 28 и далее). Это небольшое количество NCC колонизует заднюю кишку в каудальном и ростральном направлении (Fig. 2b,c), но оно неспособно компенсировать отсутствие колонизации за счет vagal NCC [16]. Во время и после миграции, eNCC подвергаются существенно пролиферации и дифференцировке вплоть до 1 мес. после рождения, чтобы сформировать зрелую ENS [17].

An introduction to HSCR


HSCR обусловливается отсутствием myenteric нервных ганглиев в терминальных регионах кишечника, приводя к тоническим сокращениям поврежденных сегментов, это в свою очередь ведет к обструкции и к обширному расширению кпереди от этой точки. Специфический паттерн миграции eNCC, как полагают, является главным причинным фактором патогенеза HSCR. Соответственно, толстая кишка, обнаруживается намного дальше от естественного источника vagal eNCC, это последний колонизируемый сегмент кишечника и наиболее чувствительный к отсутствию ганглиев. Однако животные модели показали, что дефицит миграции клеток не единственная причина аганглиоза. В самом деле, дефицит пролиферации клеток, жизнеспособности или дифференцировки eNCC также могут приводить к аганглиозу кишки, начиная от прямой кишки и до разных уровней выше [18, 19].
Показатель HSCR приблизительно один на 5000 живорожденных [20]. Мужчины затрагиваются значительно чаще, чем женщины в соотношении 4:1. В 12% случаев, HSCR ассоциирует с хромосомными аномалиями, такими как трисомия 21, и в 18% случаев является частью синдрома в повторяющихся комбинациях с др. дефектами [20].
Дети, страдающие HSCR часто диагностируются в первые два мес. жизни по симптомам нарушенной подвижности кишечника, такими как неспособность прохождения мекония (в течение первых 48 ч жизни), запоры и боли в животе или вздутие. Однако, HSCR может быть диагностирован и позднее в жизни (у детей или даже взрослых) у индивидов, в течение всей жизни страдающих запорами. Сегмент, лишенный ганглиев, включает дистальную часть прямой кишки и разной длины непрерывную проксимальную часть кишки [21]. Соотв., HSCR классифицируется на 4 подкатегории: у 80% индивидов, аганглиоз ограничивается ректосигмовидным отделом толстого кишечника (болезнь короткого сегмента). Показатель этой подкатегории в 5 раз чаще встречается у мужчин, чем у женщин. Приблизительно в 15-20%, аганглиоз распространяется дальше сигмовидной части толстого кишечника (болезнь длинного сегмента). При этом мужчины обнаруживают меньшую склонность к этой форме (2:1) HSCR. Приблизительно у 5% индивидов аганглиоз затрагивает весь толстый кишечник (total colonic aganglionosis). Редко аганглиоз распространяется на тонкий кишечник или даже ещё дальше (total intestinal aganglionosis).
Современное лечение HSCR было предложено в 1948 [22], оно связано с хирургическим удалением сегмента, лишенного ганглиев, и воссоединением проксимальной части кишки с анусом (процедура, названная 'pull-through'). Альтернативно, индивиды с обширным кишечным аганглиозом и необратимой кишечной недостаточностью могут быть кандидатами на трансплантацию кишечника [23]. Однако эти хирургические вмешательства существенно превращают летальный дефект в хроническое страдание, которое часто сопровождается запорами, загрязнениями фекалиями и энтеритами [24]. Поэтому назрела необходимость в новых терапевтических стратегиях, таких как терапия стволовыми клетками [25]. В самом деле, предшественники нервного гребня млекопитающих (включая человека), происходящие из кишечника плодов и новорожденных, способны формировать разные нейрогенные и глиогенные структуры в культуре и, будучи трансплантированы в аганглионную часть кишки грызунов, восстанавливают функцию ганглиев [26-28]. Энтерические глиальные клетки являются особенно интересными кандидатами для трансплантации в поврежденные отделы кишечника, т.к. они обладают нейрогенным потенциалом даже у взрослых мышей [29, 30].

Gene mutations linked to HSCR


Генетика HSCR сложная: хотя Менделевский способ наследования был описан для синдромной HSCR, изолированные формы HSCR (более 70% пациентов) выступают как модель генетических нарушений со сложным паттерном наследования. Мутации в нескольких генах участвуют в HSCR и обнаруживают тенденцию к неполной пенетрантности. В целом, известные мутации объясняют чуть больше 50% семейных (в основном long-segment HSCR) и около 20% спорадических случаев (в основном short-segment HSCR), т.о. внося только небольшую пропорцию в генетическое наследование HSCR [31]. HSCR-ассоциированные гены и локусы чувствительности, а также животные модели тщательно анализировались ранее [19, 20, 32]. Обстоятельный и обновленный список представлен в Table 1, но не будет обсуждаться детально.

Table 1. Human and mouse loci associated with intestinal aganglionosis or hypoganglionosis См. в Оригинале статьи
Большинство известных ассоциированных с HSCR генов кодируют игроков двух главных сигнальных путей: RET (proto-oncogene REarranged during Transfection) и EDNRB (endothelin receptor, type B) путей (Table 1). Оба этих пути регулируют жизнеспособность, дифференцировку, миграцию и пролиферацию клеток, происходящих из нервного гребня [33-36]. Более того, продемонстрировано взаимодействие, между RET и EDNRB путями в координации развития ENS как in vitro , так и in vivo [33, 37, 38]. RET является главным геном, ассоциированным с HSCR: большинство пациентов несет или гетерозиготные мутации в кодирующем регионе или гипоморфный аллель в консервативной энхансерной последовательности в его первом интроне. Мутации в RET объясняют около 15% пациентов со спорадической HSCR и 50% семейных случаев [20].
В 18% случаев HSCR обнаруживается как симптом более крупного онтогенетического синдрома с Менделевским способом наследования [20]. Большинство из этих HSCR-ассоциированных синдромов являются нейрокристопатиями, т.е. онтогенетическими дефектами NCC, ведущими к болезням [39]. Принимая во внимание обширный вклад NCC в развитие эмбриона, такие ассоциации не удивительны. Классическим примером является синдром Waardenburg-Shah, который характеризуется лишенным ганглиев мегаколоном в комбинации с нейросенсорной потерей слуха (и с проблемами баланса у некоторых пациентов), а также аномалями пигментации волос, кожи и глаз. Три гена участвуют в возникновении WSS: SOX10, а также два члена EDNRB сигнального пути (EDNRB и ET3) [40].

The male sex bias of HSCR


Преобладание 4:1 мужского пола для HSCR не совсем понятно на молекулярном уровне, частично из-за того что это плохо воспроизводится на животных моделей. Более слабое преобладание у самцов (около или менее 2:1) лишь случайно выявляется у одиночных и двойных мутантных животных моделей при аганглиозе короткого сегмента с вовлечением гипоморфных аллелей Ret и Ednrb. Интересно, что эти модели, которые зависят от дозы гена и генетического фона, демонстрируют, что пол коррелирует со степенью аганглиоза [38, 41, 42].
Ранее было предположено, что X-сцепленный ген может отвечать за половое предпочтение HSCR. В этом отношении примечательно, что небольшой субнабор пациентов, страдающих от гидроцефалии, ассоциированной с мутациями X-сцепленного гена L1CAM, также страдают от HSCR [43]. Однако показатель HSCR среди пациентов с мутациями в гене L1CAM низок (около 3%) и не идентифицировано мутаций в L1CAM или любом др. X-сцепленном гене в исследованиях геномных ассоциаций [20, 44]. Интересно, что мышиных моделях, L1cam, как было установлено, действует как ген модификатор мутаций, вызывающих аганглиоз, Sox10, но не для мутаций основных ассоциированных с HSCR генов Ret и Gdnf [45]. Эти наблюдения подтверждают, что генетические основы предпочтения мужского пола для HSCR, скорее всего, сложные и сегодня высказана новая гипотеза, что могут быть вовлечены Y-сцепленные гены. Среди очень немногих генов в Y хромосоме, которые не участвуют в определенных аспектах сперматогенеза, Sex determining region Y (SRY) является таким кандидатом.
SRY экспрессируется генитальном гребне самцов, где он функционирует как ключевой генетический переключатель детерминации пола у млекопитающих [46]. SRY был первым идентифицированным SOX геном [47], и дал название семейству (SOX: SRY-related HMG bOX). Хотя и недостаточно оцененная экспрессия SRY вне генитального гребня, она была обнаружена в разных типах клеток, включая развивающиеся и зрелые нейроны [48-51]. На функциональном уровне было предположено, что SRY белок может конкурировать с др. SOX белки посредством своего хорошо законсервированного HMG-box домена, который участвует в связывании ДНК, а также в межбелковых взаимодействиях [52]. Соотв. было предположено, что SRY может участвовать в этиологии множественных нейрологических нарушениях с предпочтительным проявлением у мужчин, таких как болезнь Паркинсона, аутизм и шизофрения [53]. Эндогенная экспрессия SRY не была описана в нормальном развитии ENS. Однако, примечательно, что промотор SRY некоторых видов (включая человека) содержит последовательность, которая может определять паттерн экспрессии NCC (включая eNCC) у трансгенных мышей [54]. Все эти наблюдения подтверждают, что у некоторых индивидов экспрессия гена SRY может быть несоответствующим образом включена в предшественниках ENS, где она может воздействовать на критическую функцию, по крайней мере, одного из др. SOX членов, SOX10. Эта возможность строго подтверждается недавними данными, показавшими, что SRY белок обнаруживается в HSCR тканях и может репрессировать промотор RET за счет превентивного образования SOX10-содержащего транскрипционного комплекса [55]. Следовательно, среди пол-специфических генов, которые могут вносить вклад в преобладание HSCR у мужчин, кандидат SRY д. быть рассмотрен серьёзно.

New mouse models for HSCR and associated syndromes


Мутации кодирующей последовательности большинства известных на сегодня HSCR-ассоциированных генов вызывают длинного сегмента, а также синдромные HSCR, но неспособны объяснить передачу более частой короткого-сегмента формы [56]. Это указывает на важность некодирующих вариаций и подразумевает, что дополнительные гены участвуют в развитии ENS, которые всё ещё далеки от обнаружения. Чтобы идентифицировать новые локусы, участвующие в развитии NCC и формировании ENS, мы создали новые мышиные модели посредством случайного трансгенного инсерционного мутационного подхода. С этой целью м ы использовали мышей инбредной FVB/n линии, которые были albino из-за гомозиготной мутации в их гене Tyrosinase. Миниген, включающий функциональную Tyrosinase последовательность инъецировали в качестве трансгена [57]. Животных отбирали по восстановлению окраски, поскольку конкурентные аномалии пигментации указывали на дефекты развития NCC. Этот подход дал множественные линии с пятнами пигментации, из которых две, как было установлено, имеют нарушения в новом локусе, регулирующем развитие NCC, и обладают фенотипом, напоминающим HSCR человека.
TashT мыши обнаруживали пятнистую пигментацию у всех индивидов, независимо от зиготности. Интересно, что аганглиогенный мегаколон развивался у части гомозигот со строгим преобладанием у самцов; самки затрагивались редко. Более того, пенетрантность этого дефекта можно было повысить экзогенными стрессами. TashT трансгенная инсерция располагается в хромосоме 10 мыши в крупном регионе, свободном от генов вблизи к границе cytoband B2-B3. Этот регион синтеничен хромосоме 6q16.3 человека, которая лишена известных локусов, ассоциированных с HSCR. Пятнистые мыши имели немного пятен со слабой пигментацией. Часть индивидов второго поколения обнаруживала увеличение дефектов пигментации и аганглионный мегаколон, сопровождаемый гиперактивным фенотипом кружения, симптом нарушений баланса. Эта новая линия мышей является т.о., моделью для Waardenburg-Shah syndrome (WSS), комбинации HSCR с гипопигментацией и аномалиями внутреннего уха. Трансгенная инсерция Spot локализована в 10 хромосоме мыши в cytoband D2. Этот регион синтеничен хромосоме 12q15 человека, который лишен каких-либо известных HSCR- или WSS-ассоциированных генов.

Conclusions


Clinical expression of HSCR suggests it is a multifactorial disease, involving at least one major gene (i.e. RET) and genetic structural variants (modifier loci) conferring risk to HSCR. Intriguingly, in some mouse models of short-segment HSCR typically involving gene-dosage dependence, there is no direct correlation between the extent of aganglionosis and severity of the megacolon phenotype. A fraction of animals possessing a substantial aganglionic colon segment even fail to present with signs of intestinal dysmotility or abdominal distension, especially within females [38] (unpublished observations). Moreover, non-genetic exogenous factors like oxidative stress [58, 59] and vitamin A deficiency [60] compromise NCC development and can contribute to the etiology of HSCR, at the very least in animal laboratory models. Altogether, these observations suggest that our understanding of HSCR pathophysiology is still incomplete and that further studies are required to identify additional genetic and non-genetic factors. In this regard, it is anticipated that our work with the mouse models described above will lead to a new understanding of ENS formation in health and disease, with the objective of converting basic research discoveries into improved clinical management (screening, diagnosis and treatment) of HSCR as well as other gut motility disorders.