MicroRNAs (miRNAs) являются ~21-nucleotide (nt)-длиной, однонитчатые некодирующие РНК, основной функцией которых является посттранскрипционная регуляция генной экспрессии. Будучи собранной в RNA-induced silencing complex, каждая miRNA может ингибировать экспрессию сотен мишеней мРНК, путем индукции репрессии трансляции и/или деградации мРНК (1). miRNAs животных распознают частично комплементарные сайты связывания, которые обычно располагаются в 3' untranslated region (3'UTR) мРНК мишеней. В частности, комплементарность miRNA seed региона, соответствующего nts 2-8 на 5' зрелой miRNA, является основным детерминантом в распознавании мишени и является достаточным для запуска молчания (2).

MiRNAs первоначально транскрибируются с эндогенных генов в виде длинных первичных транскриптов (pri-miRNAs), которые содержат обширные шпилечные структуры. Эти pri-miRNAs затем подвергаются преобразованию с помощью Microprocessor комплекса в предшественник шпильку (pre-miRNA), который экспортируется в цитоплазму и расщепляется с помощью RNaseIII Dicer, чтобы дать зрелую дуплексную miRNA (3). Обычно одна нить дуплекса преимущественно выбирается для вступления в комплекс замалчивания (RISC), чтобы регулировать экспрессию генов, тогда как др. нить, известная как пассажирская нить или miRNA*, как считалось, обычно деградирует. Однако, недавние доказательства продемонстрировали, что виды miRNA* часто присутствуют на физиологически значимых уровнях, могут ассоциировать с белком замалчивания Argonaute и могут ингибировать мРНК мишени как в культивируемых клетках, так и у трансгенных животных (4-8).

Семейство miR-183 состоит из трех miRNAs (miR-183, miR-96 и miR-182), которые скоординированно экспрессируются с одного генетического локуса у позвоночных. Гомологичные miRNAs (miR-228 и mir-263b) также присутствуют у позвоночных (9). Важно, что это высоко консервативное семейство miRNAs обнаруживает экспрессию в нейросенсорных органах с ресничками в данном типе и, как было установлено, вносят вклад в дифференцировку и функцию механосенсорных волосковых клеток во внутреннем ухе позвоночных (10,11). Напр., у рыбок данио, семейство miR-183 предпочтительно экспрессируется в волосковых клетках внутреннего уха и боковой линии, а также в обонятельных и ретинальных сенсорных клетках (12,13). Избыточная экспрессия miR-96 или miR-182, но не miR-183, , как было установлено, вызывает удвоение отоциста, эктопические или расширенные сенсорные участки и добавочные волосковые клетки. Напротив, нокдаун любой из трех miRNAs ведет к редукции в числе волосковых клеток внутреннего уха и вызывает дефекты полукружных каналов, а также присутствие аномальных neuromasts боковой линии (11).

В геноме человека семейство miR-183 собрано в кластер в регионе в 4.5 kb на хромосоме 7q32, внутри локуса, который сцеплен с аутосомно доминантной non-syndromic hearing loss (NSHL) (DFNA50, OMIM #613074). В 2009, были обнаружены две мутации в seed регионе miR-96 в двух испанских семьях с аутосомно доминантной прогрессирующей NSHL. Обе мутации (+13G>A и +14C>A) затрагивают нуклеотидные последовательности, которые полностью консервативны среди позвоночных (от рыб до человека) и сегрегировали с потерей слуха в затронутых семьях. Было проанализировано влияние этих мутаций на процессинг miR-96 и распознавание мишени в HeLa и NIH-3T3 клетках, было установлено, что обе мутации приводят к снижению уровней зрелых miRNA и препятствуют их способности вызывать молчание генов (14). Дальнейшие доказательства важности экспрессии и функции miR-96 в патогенезе потери слуха были получены в генетических исследованиях на мышах, у которых замена одиночного основания в seed регионе гомолога miR-96, как было установлено, вызывает прогрессивную потерю слуха и дефекты волосковых клеток у мышей, моделирующих нейросенсорную глухоту, названную diminuendo (15,16). Работа Mencia et al. (14) предоставила первые доказательства, что точковые мутации в miRNA могут быть ответственны за менделирующие признаки. Однако, вплоть до сегодняшнего дня скрининг мутаций в семействе miR-183 осуществлялся только в оригинальном исследовании, включая 567 испанских семей с наследуемой потерей слуха (14)-и в одиночном повторном исследовании на 150 американских семьях с аутосомно доминантными NSHL, где не было обнаружено мутаций (17). Следовательно, позитивное подтверждение находок Mencia et al. всё ещё отсутствует.

В данном исследовании мы идентифицировали новую мутацию, вызывающую NSHL, в гене MIR96 при скрининге крупной итальянской популяции. В отличие от ранее описанных мутаций, этот вариант не затрагивал miR-96 seed регион, а изменял парную miR-96* последовательность. С помощью серии функциональных исследований мы продемонстрировали, что этот вариант существенно нарушает продукцию зрелой miR-96 путем изменения вторичной структуры pre-miRNA и косвенно влияет на нормальную регуляцию мишеней для miR-96. Наши результаты подтвердили, что количественный дефект miR-96 может быть достаточным, чтобы вызывать глухоту. Однако, как было установлено, новая мутация также снижает уровни экспрессии miR-96* и, по-видимому, изменяет распознавание своих мишеней, вклад этого вида miRNA в патогенез NSHL не исключен.

DISCUSSION

Мы описали новую мутацию в гене MIR96, которая вызвала аутосомно доминантную постречевую прогрессивную NSHL в итальянской семье. Это треться мутация, описанная для этого гена у человека и в др. популяции в отличие от исходного сообщения (14). Вариант +57(T>C) также является первой мутацией в гене MIR96, которая не затрагивает miR-96 seed регион, ни её зрелой последовательности. Наши результаты показали, что эта мутация изменяет корректное созревание предшественника miR-96, приводя к уменьшению уровня обеих их зрелых форм. В частности, мутация +57(T>C), как полагают, создает крупное выпячивание во вторичной структуре miR-96 шпильки, 5 nts 3' по отношению к месту разрезания с помощью Dicer (Fig. 2A), это указывает на то, что оно может мешать процессингу с помощью Dicer. Др. исследование показало, что общие SNPs внутри miRNA генов могут приводить к нарушению процессинга miRNA и могут быть ассоциированы с повышенной чувствительностью к заболеваниям человека (23-25). Интересно, что один из SNP внутри miR-146a, которая отвечает за повышенный риск развития рака щитовидной железы, не только препятствует процессингу pre-miRNA, но и также влияет на seed регион парной miR-146a*, подобно мутации miR-96(+57T>C) . Нить miR-146a* экспрессируется как в нормальной, так и опухолевой тироидной ткани и изменяет регуляцию мишеней для miRNA* у гетерозигот по сравнению с гомозиготами, это указывает на возможный механизм, лежащий в основе предрасположенности к опухолям (26).

В случае мутации miR-96(+57T>C), однако прямая роль miR-96* в патогенезе NSHL всё ещё не доказана. Фактически, ни один из предполагаемых сайтов мишеней для miR-96* не был оценен с помощью luciferase-based метода (Supplementary Material, Fig. S5). Определение профиля экспрессии miR-96* в панели тканей человека и мыши показало, что хотя экспрессия осуществляется на очень низких уровнях, miR-96* обнаруживает некоторую стпень дифференциальной экспрессии, подтверждая. что она может регулироваться тканеспецифическим образом (Supplementary Material, Fig. S6). В кортиевом органе мышей miR-96* может быть клонирована, но не может реально быть оценена количественно с помощью RT-PCR в реальном времени. Необходимы более обширные и детальные эксперименты для выяснения роли, если таковая имеется, этой miRNA* во внутреннем ухе, а также оценки участия мутантной miR-96*в NSHL.

Даже если мутации в miR-96 не являются общераспространенной причиной глухоты, как продемонстрировано в данной и предыдущих работах (14,17), описание новых причинных вариантов может помочь в выяснении патогенетических механизмов, лежащих в основе DFNA50-ассоциированного фенотипа. В частности, функциональный анализ мутации +57(T>C) подчеркивает вклад количественных дефектов miR-96 для патогенеза потери слуха, независимо от дополнительных качественных дефектов (т.e. изменений в действительно зрелой последовательности miR-96). В самом деле, тонкая регуляция уровней miR-96 во внутреннем ухе позвоночных, по-видимому, является критической для корректной функции и развития волосковых клеток, как продемонстрировано экспериментами по нокдауну у рыбок данио (11) и с помощью фенотипических отличий между гетерозиготными и гомозиготными мышами diminuendo (15,16). Интересно также, что три затронутые семьи (the two Spanish and the here reported Italian one) обнаруживают некоторую степень фенотипической изменчивости, это указывает на то, что патогенные механизмы, лежащие в основе в каждой из семей могут быть, по крайней мере частично, отличными. В частности, семья, несущая мутацию +57(T>C) характеризуется поздним началом (между 25 и 40 гг) и медленным прогрессированием нарушения слуха. Кроме того, присутствие, мутации у трех молодых индивидов последнего поколения (Fig. 1B), которые пока обладают нормальным слухом при аудиологическом анализе (Supplementary Material, Fig. S1), указывает на неполную пенетрантность, хотя в будущем возможно, что болезнь разовьется и у них. Фенотипические различия от ранее описанных семей могут быть частично объяснены молекулярными находками: количественный дефект экспрессии miR-96 может приводить к задержке или снижению пенетрантности нарушения слуха, тогда как мутации непосредственно нарушающие распознавание miR-96 своей мишени, д., по-видимому, приводить к более раннему дефекту слуха. В этом отношении необходимо отметить, что мыши diminuendo, носители мутации miR-96 seed региона, не оказывают существенного эффекта на уровни экспрессии miR-96 (15).

In conclusion, deciphering the different pathogenic mechanisms linking MIR96 mutations to progressive hearing loss will be crucial for helping to develop new personalized therapeutic approaches for people carrying these mutations.