Посещений:
БОЛЕЗНЬ АЛЬЦГЕМЕРА

Роль рецепторов P2Y

P2Y receptors in Alzheimer's disease
Laurie Erb, Chen Cao, Deepa Ajit and Gary A. Weisman
Biology of the Cell Volume 107, Issue 1, pages 1-21, January 2015

Alzheimer's disease (AD) is the most common cause of dementia, affecting more than 10% of people over the age of 65. Age is the greatest risk factor for AD, although a combination of genetic, lifestyle and environmental factors also contribute to disease development. Common features of AD are the formation of plaques composed of beta-amyloid peptides (A?) and neuronal death in brain regions involved in learning and memory. Although A? is neurotoxic, the primary mechanisms by which A? affects AD development remain uncertain and controversial. Mouse models overexpressing amyloid precursor protein and A? have revealed that A? has potent effects on neuroinflammation and cerebral blood flow that contribute to AD progression. Therefore, it is important to consider how endogenous signalling in the brain responds to A? and contributes to AD pathology. In recent years, A? has been shown to affect АТФ release from brain and blood cells and alter the expression of G protein-coupled P2Y receptors that respond to АТФ and other nucleotides. Accumulating evidence reveals a prominent role for P2Y receptors in AD pathology, including A? production and elimination, neuroinflammation, neuronal function and cerebral blood flow
Болезнь Альцгеймера (AD) хроническое нейродегенеративное нарушение, характеризующееся прогрессивным снижением когнитивной активности, наиболее часто встречающаяся форма деменции в западном сообществе. Глобальный показатель AD подсчитан приблизительно 24 миллиона во всем мире с предполагаемым удвоением числа каждые 20 лет вплоть до 2040 (Mayeux and Stern, 2012). Нейропатологические повреждения, проявляющиеся при AD, включают сенильные амилоидные бляшки и нейрофибриллярные узелки (tangles), и сопровождаются реактивным микроглиозом, дистрофичными нейритами и потерей нейронов и синапсов (Serrano-Pozo et al., 2011). Основными компонентами сенильных бляшек являются нейротоксические beta-амилоидные пептиды (Aβ ), которые происходят в результате расщепления амилоидного белка предшественника (APP) с помощью β - и γ-secretases (Haass and Selkoe, 2007; Mayeux and Stern, 2012). Напротив, нейрофибриллярные узелки в основном образуются за счет внутриклеточного накопления τ белка (Selkoe, 2001; Liu et al., 2005). Исследования на животных, моделирующих AD выявили, что воспаления нейронов играют критическую роль в прогрессировании AD. Хорошо известно, что Aβ индуцирует в микроглии продукцию nitric oxide (NO), реактивные виды кислорода (ROS), способствующие воспалению цитокины [напр., tumour necrosis factor (TNF)-α , interleukin (IL)-1β , IL-6 и IL-18] и prostaglandins (напр., PGE2), которые вносят вклад в гибель нейронов (Akiyama et al.,2000). Более того, исследования также показали, что клетки, участвующие в иммунном ответе в ЦНС (CNS), такие как дендритные клетки, микроглия и астроциты, способны определять Aβ посредством передачи сигналов Toll-like receptor (TLR). TLR2, в частности, играют ключевую роль в запуске событий воспаления нейронов, которые приводят к активации зависимых от сигналов транскрипционных факторов, управляющий экспрессией нижестоящих генов, ассоциированных в воспалительным путем (Liu et al., 2005). Помимо нейровоспалительного фенотипа AD часто предшествуют проявления в цереброваскулярной системе, включая накопление Aβ в кровеносных сосудах головного мозга (церебральная амилоидная ангиопатия) и снижение кровотока в головном мозге (CBF), что приводит к гипоксии, прорыву гематоэнцефалического барьера (BBB) и в конечном итоге к атрофии головного мозга и гибели (Iadecola, 2004; Zlokovic, 2008; Bell et al., 2009; Kelleher and Soiza, 2013; Sagare et al., 2013). Исследования на мышах и людях показали. что Aβ пептиды вызывают сильные сужения кровеносных сосудов головного мозга (Niwa et al., 2001; Paris et al., 2003), подтверждая тем самым, что сосудистые факторы играют роль в раннем патогенезе AD.
Пуринергическая передача сигналов посредством активации A1-3 adenosine рецепторов, P2X cation channel рецепторов для АТФ и P2Y нуклеотидных рецепторов со специфичностью субтипов к АТФ, АДФ, УТФ и УДФ-глюкозе (Table 1), участвует в воспалении нейронов, сосудистой регуляции и прогрессии многих нейродегенеративных болезней, включая AD (Burnstock, 2008; Erlinge and Burnstock, 2008; Rahman, 2009; Takenouchi et al., 2010; Weisman et al., 2012a; Burnstock and Ralevic, 2014). Table 1. Known agonists and antagonists of P2YRs



Changes in P2Y receptor expression and nucleotide release in AD


P2Y receptor expression in human and animal models of AD


Экспрессия всех 8 подтипов P2YRs (P2Y1,2,4,6,11,12,13,14) была описана в головном мозге (Weisman et al., 2012a). У AD пациентов и модельных AD мышей наблюдаются изменения в паттерне экспрессии P2Y1,2,4 рецепторов. Иммуногистохимическая локализация P2Y1R в нейрофибриллярных узелках, нейритных бляшках и нитях нейропиля, которые связаны с AD, описаны в выборках головного мозга людей с AD (Moore et al., 2000b). Lai et al. (2008) оценивали экспрессию P2Y2,4,6 рецепторов в выборках головного мозга людей с AD с помощью immunoblot анализа и установили, что низкие уровни белка P2Y2R, сравнимы с такого же возраста контролем, тогда как уровни P2Y4R и P2Y6R оставались неизменными. Однако, отсутствие специфичности для коммерчески доступных антител к P2Y2R и P2Y6R также была описано (Ben Yebdri et al.,2009; Yu and Hill, 2013). У TgCRND8 мышей, моделирующих AD, которые экспрессируют Шведские (K670N/M671L) и Индианские (V717F) мутации в APP человека, экспрессия мРНК P2Y2R повышена в головном мозге в возрасте 10 недель и снижена после 25 недельного возраста по сравнению с контролем того же возраста (Ajit et al., 2013). У AD модельных мышей, экспрессирующих Шведскую мутацию APP и мутацию γ-secretase (PS1dE9), повышение экспрессии P2Y4R в кортикальных срезах головного мозга наблюдалось в активированной микроглии, по сравнению с покоящейся микроглией (Li et al., 2013). Это исследование также продемонстрировало, что микроглиальные P2Y4R вносят вклад в пиноцитоз растворимых Aβ ? подтверждая, мышиный P2Y4R является нейрозащитным за счет стимуляции микроглией обеспечиваемой очистки Aβ (Li et al., 2013).

Effects of Aβ on P2YR expression and nucleotide release


Aβ , как было установлено, усиливает высвобождение АТФ и/или экспрессию P2YR в микроглии и эритроцитах. В первичных кортикальных астроцитах крыс, олигомерные Aβ 1-42 (oAβ 1-42) вызывают высвобождение эндогенного АТФ (Peterson et al., 2010). У мышей в клетках первичной микроглии фибриллярные Aβ (fAβ 1-42) и oAβ1-42 агрегаты вызывают высвобождение АТФ (Kim et al., 2012) и в клетках микроглии N13, пептид Aβ25-35 вызывает зависимое от дозы высвобождение АТФ (Sanz et al., 2009). Aβ-индуцированное высвобождение АТФ из клеток микроглии, зависят от экспрессии йонотропного P2X7 рецептора, который, как полагают, высвобождает АТФ путем образования мембранных пор (Sanz et al., 2009). Экспрессия P2Y2R усиливается в первичной микроглии мышей, обработанных fAβ1-42 или oAβ1-42 агрегатами (Kim et al., 2012). В сосудистой сети вызывает высвобождение АТФ из эритроцитов в кровоток (Bergfeld and Forrester, 1992), а 24 ч воздействие на эритроциты человека Aβ ингибирует высвобождение АТФ из клеток лишенных кислорода (Misiti et al., 2008). P2Y рецепторы экспрессируются в сосудистом эндотелии человека, включая P2Y1,2,4,6R, запуск дилятации сосудов посредством высвобождения NO, endothelium-derived hyperpolarising factor (EDHF) и простациклина (Burnstock and Ralevic, 2014); т.о., активация этих рецепторов может помочь противостоять сосудосуживающим эффектам Aβ .

Role of P2Y receptors in the regulation of AD symptoms and biomarkers


Effects of P2Y receptors on Aβ metabolism APP production and cleavage


Хотя остается неясным, влияют ли нуклеотиды и P2YRs на продукцию и/или высвобождение APP в нейронах, АТФ и УТФ, как было установлено повышают зависимую от extracellular signal-regulated kinase (ERK) продукцию и секрецию APP в первичных кортикальных астроцитах крыс (Tran, 2011), по-видимому, путём активации P2Y2R и P2Y4R. Не-селективные P2YR антагонисты, suramin и reactive blue 2 (RB2), ингибируют экспрессию 130 kDa APP в той же самой степени, но suramin более эффективен в снижении экспрессии 110 kDa APP , тогда как RB2 более эффективнее в ингибировании высвобождения APP (Tran, 2011). Принимая во внимание, что suramin является более мощным антагонистом для P2Y2R, а RB2 более мощным антагонистом для P2Y4R, было предположено, что эти два P2YRs могут выполнять разные роли в регуляции продукции и высвобождения APP.
Расщепление APP c помощью β- и γ-secretases дает нейротоксические пептиды, Aβ1-40 и Aβ1-42, тогда как расщепление APP c помощью α- и γ-secretases дает фрагменты Aβ17-40/42? не вызывающие амилоидоз (Sisodia, 1992; Roberts et al., 1994; Vassar et al., 2009). Конкуренция между α-secretases (т.e., ADAM9/10/17) и β-secretase (т.e., BACE1) в процессинге APP подтверждена (Skovronsky et al.,2000; Deuss et al., 2008; O'Brien and Wong, 2011; Lichtenthaler, 2012) и продукция нейротоксических Aβ редуцируется c помощью активности α-secretase (Caccamo et al., 2006; Kuhn et al., 2010). Активация P2Y2R усиливает α-secretase-обеспечиваемый процессинг APP в первичных кортикальных нейронах крыс и в клетках астроцитомы человека, это зависит от двух членов семейства ADAM: ADAM10 и ADAM17 (Camden et al., 2005; Kong et al., 2009; Leon-Otegui et al., 2011). Регуляция активности ADAM10/17 c помощью P2Y2R нуждается в активности phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) и ERK1/2, тогда как участие protein kinase C (PKC) варьирует в зависимости от типа клеток (Camden et al., 2005; Kong et al., 2009).

Matrix metalloprotease activity and Aβ degradation


Matrix metalloprotease-9 (MMP-9) является секретируемой протеазой, которая разрывает внеклеточный матрикс в нормальных физиологических условиях, но экспрессируется на более высоких уровнях у пациентов с AD (Lorenzl et al., 2003) и располагается совместно с бляшками Aβ (Backstrom et al., 1996). Aβ в астроцитах индуцирует продукцию и активирует MMP-9 (Talamagas et al., 2007; Hernandez-Guillamon et al., 2009; Mizoguchi et al., 2009), которая в свою очередь деградирует Aβ пептиды (Backstrom et al., 1996) и фибриллы in vitro (Yan et al., 2006), и уплотняет бляшки in situ (Yan et al., 2006). Однако гомозиготный нокаут MMP-9 у мышей или применение GM6001, широкого спектра ингибитора MMP, выявил улучшение вызываемой Aβ потери памяти, подтверждая, что активность MMP-9 способствует Aβ-индуцируемому нарушению когнитивной деятельности (Mizoguchi et al.,2009). Недавно Kinoshita et al. (2013) сообщили, что продукция MMP-9 в первичных астроцитах крыс увеличивалась в ответ на лечение c помощью apyrase, RB2 и коклюшного токсина (PTX, a Gi-inhibitor). С помощью фармакологических исследований агонистов и антагонистов P2Y , P2Y14R был идентифицирован как связанный с продукцией MMP-9, а нокдаун P2Y14R приводил к значительному увеличению экспрессии MMP-9. Воздействие на астроциты c помощью apyrase, RB2 или PTX, также повышало экспрессию цитокином-индуцируемого нейтрофильного хемоаттрактанта-3, TNF-α, tissue inhibitory metalloproteinase (TIMP)-1 и monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). В то время как TIMP-1 , как известно, соединяется с MMP-9 и ингибирует его протеолитическую активность (Hernandez-Guillamon et al., 2009), TNF-α индуцирует высвобождение MMP-9 из астроцитов in vitro (Kinoshita et al., 2013). Эти находки подтверждают защитную роль P2Y14R при AD посредством супрессии экспрессии MMP-9.

Effects of P2Y receptors on neuroinflammation


Достигнуто согласие, что воспаление нейронов участвует в AD, хотя его роль остается неясной, выступает ли оно в качестве первичной причины прогрессирования болезни или защитной реакцией (Rivest, 2009; Wyss-Coray and Rogers, 2012). Поскольку клинические испытания противовоспалительных лекарств всё ещё не убедительны в качестве лечения AD (Wyss-Coray and Rogers, 2012), модуляция воспаления эффективна на животных моделях AD (McGeer et al., 2005; Rozemuller et al., 2005; Klegeris et al., 2007).

Cytokine and chemokine production


В моноцитах и микроглии Aβ индуцирует секрецию способствующих воспалению цитокинов, включая IL-1β , IL-6 и TNF-α, также как и хемокины, включая CC chemokines CCL2/macrophage inflammatory protein-α/β (MIP-1α/β ), MCP-1 и CXC хемокин IL-8 (Walker et al., 1995; Fiala et al., 1998; Akiyama et al., 2000). Среди этих цитокинов, IL-1β особенно важен для регуляции экспрессии др. цитокинов, способствующих воспалению (напр., TNF-α, IL-6, и интерфероны) и хемокинов (напр., CXCL1 и CXCL2) (Rothwell and Luheshi, 2000; Shaftel et al., 2008). In vivo, избыточная экспрессия IL-1β в гиппокампе ускоряет поставку фагоцитов и очистку от бляшек Aβ у мышиной модели AD (Shaftel et al., 2007). In vitro, Aβ вызывает высвобождение IL-1β из микроглии, которое зависит от экспрессии P2X7R (Sanz et al., 2009). Воздействие Aβ также увеличивает экспрессию P2Y2R в микроглии (Kim et al., 2012) нейронах (Kong et al., 2009; Peterson et al., 2013), это, скорее всего, запускается c помощью P2X7R-обеспмечиваемого высвобождения IL-1α (Chakfe et al., 2002; Suzuki et al., 2004; Choi et al., 2007; D'Alimonte et al., 2007; Mingam et al., 2008; Sanz et al., 2009; Takenouchi et al., 2009; Takenouchi et al., 2011).
P2Y1 рецепторы важны для регуляции продукции цитокинов и хемокинов у крыс, моделирующих церебральные инсульты, и, следовательно, могут также влиять на воспаление нейронов, возникающее при AD. В модели церебральных инсультов применение P2Y1R специфического агониста MRS2365 существенно увеличивает объем инфаркта (измеряемый по повреждению головного мозга) после 30-мин. закрытия middle cerebral artery (MCAO), тогда как применение P2Y1R антагонистов MRS2179, A3P5PS и MRS2279 существенно снижает объем инфаркта (Kuboyama et al.,2011). Более того, усиление активности цитокинов и хемокинов, включая IL-6, TNF-α, CCL2/MCP-1 и interferon-inducible protein-10 (IP-10)/CXCL10, оказывалось подавленным после MCAO за счет применения MRS2179. P2Y1R-зависимое усиление активности цитокинов и хемокинов и церебральных инфарктов, как было установлено, происходит посредством пути передачи сигналов NF-κB (Kuboyama et al., 2011). Сходным образом, Chin et al. (2013) наблюдали воспаление нейронов гиппокампа и микроструктурные альтерации, а также длительно длящийся дефицит в познавательной функции после 90-мин MCAO у крыс и мышей дикого типа. Однако MCAO у P2Y1R-/- мышей вызывает дефекты сенсорно-моторной функции, но когнитивное поведение, воспаление нейронов гиппокампа и микроструктура остаются неизменными. Кроме того, воздействие P2Y1R-специфического антагониста MRS2500 помогает мышам дикого типа сохранять когнитивную функцию после MCAO (Chin et al., 2013).

Microglia recruitment


Клетки микроглии являются макрофагами ЦНС, которые дифференцируются из моноцитов. В качестве первичных иммунных эффекторных клеток в ЦНС активированная микроглия, как полагают, играет нейрозащитную роль при AD за счет миграции в направлении Aβ бляшек (Perlmutter et al., 1990; Frautschy et al., 1998; Bolmont et al., 2008; Meyer-Luehmann et al., 2008; Zheng et al., 2010) и очистки нейротоксичных Aβ c помощью эндоцитоза (Shie et al., 2005; Bolmont et al., 2008; Kim et al., 2012) и деградации (Jiang et al., 2008). Важность микроглии в снижении уровней Aβ подтверждена не только на мышиных моделях AD, но также у Aβ-иммунизированных AD пациентов, которые обнаруживают снижение количества бляшек и повышение накопления микроглиальных клеток (Schenk et al., 1999; Nicoll et al., 2003; Boche et al., 2010). Популяция микроглии в ЦНС может быть умножена за счёт рекрутирования происходящих из крови макрофагов/моноцитов (Simard et al., 2006; Hao et al., 2011). In vitro BBB модель, представленная нижней и верхней камерой, разделенными монослоем эндотелиальных клеток, моноциты, предварительно обработанные Aβ1-42 , c 'brain side' (нижняя камера) рекрутируют моноциты с 'blood side' (верхней камеры), процесс, как полагают, связан с индукцией c помощью Aβ1-42 секреции хемокинов (Fiala et al., 1998).
В ранних исследованиях in vitro внеклеточный АТФ или АДФ усиливали колебания (ruffling) мембраны и миграцию культивируемой микроглии(Honda et al., 2001). Позднее локальный АТФ был установлен как причина быстрой хемотактической реакции в микроглии на локальные повреждения головного мозга и АТФ индщуцировал дальнейшее высвобождение АТФ из окружающих астроцитов, что существенно для реакции микроглии (Davalos et al., 2005). Хотя подтип рецептора P2, ответственный за миграцию микроглии в места повреждений, не был выявлен, воздействие энзима, гидролизирующего АТФ, apyrase, или P2YR ингибиторов, RB2 и PPADS, выявило эффективное подавление, тогда как ингибирование c помощью suramin было неполным (Davalos et al., 2005). АДФ-индуцированные колебания мембраны и хемокины микроглии ингибируются c помощью P2Y12/13R антагониста ARC69931 или за счёт повышения внутриклеточных уровней цАМФ, указывая, что P2Y12/13R-обеспечиваемая продукция хемокинов микроглии нацелена на АДФ (Nasu-Tada et al., 2005). Более того, β1 integrin, как полагают, вовлечен, поскольку он доставляется на мембранные оборки (ruffles) после стимуляции АДФ (Nasu-Tada et al., 2005).
Важность P2Y12R в поляризации микроглии, миграции и удлинении отростков в направлении нуклеотидов in vitro и in vivo позднее было подтверждено Haynes et al. (2006). Они показали. что первичная микроглия дикого типа головного мозга, но не от P2Y12R-/- мышей, подвергается образованию мембранных отростков (ruffling) после воздействия нуклеотидов АТФ, АДФ или 2MeSADP. В живом головном мозге P2Y12R-/- мышей, отростки микроглии удлиняются в направлении экзогенного источника АТФ или мест фокального лазерного устранения, где существенно снижен АТФ по сравнению с контролем (Haynes et al., 2006). Нарушения хемотаксиса в микроглие в направлении АТФγS (гомолога АТФ) в первичной миккроглии крыс после воздействия MRS2395, избирательного антагониста P2Y12R, также было описано (Li et al., 2013). Эти наблюдения согласуются с ранним сообщением, что P2Y12R-экспрессирующая микроглия накапливается вокруг поврежденных нейронов in vivo (Sasaki et al., 2003). Интересно, что 'покоящаяся' (хотя и довольо динамичная) микроглия экспрессирует больше P2Y12R, чем активированная микроглия (Haynes et al., 2006), тогда как иммунореактивность P2Y12R не обнаруживается в макрофагах селезенки или абдоминальной полости (Sasaki et al., 2003; Haynes et al., 2006). Следовательно, функция P2Y12R может избирательно мотивировать покоящуюся микроглию к хемотаксису в ЦНС .
Хотя микроглиальный P2Y1R не обнаружим, цитокины и хемокины, высвобождаемые с помощью астроцитов, экспрессирующих P2Y1R, приводят к инфильтрации макрофагов и активации микроглии в ишемическом головном мозге крыс, которые изменены с помощью P2Y1R антагониста MRS2179 (Kuboyama et al., 2011). Важность P2Y1R в астроцитах оспаривается внеклеточным АТФ, который, как полагают, участвует в АТФ-индуцированной активации ERK в ответ на вызванные растяжениями повреждениями (Neary et al., 2003).
P2Y6R был первым, как полагают, обеспечивающим только фагоцитоз, но не хемотаксис или миграцию микроглии (Koizumi et al., 2007). Однако, Kim et al. (2011) установили в первичных культурах микроглии, астроцитов и на культурах кортикальных срезов, что УДФ, селективный агонист P2Y6R, вызывает экспрессию хемокинов CCL2 (MCP-1) и CCL3 (MIP-1α ), которые важны для инфильтрации моноцитов в поврежденный головного мозг. Два активируемых кальцием транскрипционные факторы, NFATc1 и c2, скорее, чем NF-κB, ответственны за UDP-индуцируемую экспрессию хемокина. Более того, UDP-обработанные астроциты рекрутируют моноциты в in vitro при трасмиграционном подходе (Kim et al., 2011). Исходя из их регуляции миграции микроглии, P2Y1,6,12,13Rs в микроглии могут вносить вклад в патофизиологию AD, хотя прямые доказательства всё ещё отсутствуют.
Существуют многочисленные доказательства важной роли P2Y2R в рекрутировании микроглии в головного мозг во время развития AD. Хотя UTP,как было установлено, недостаточен, чтобы индуцировать образование ruffle в первичной микроглии крыс (Honda et al., 2001; Haynes et al., 2006), он усиливает миграцию первичной микроглии мыши in vitro (Kim et al., 2012). У TgCRND8 мышей, моделирующих AD, экспрессия CD11b, маркера активированной микроглии, повышена в гиппокампе головного мозга, но снижена, когда экспрессия P2Y2R супрессирована (Ajit et al., 2013).

Aβ uptake and degradation by microglia


Фагоциты, включая микроглию, используют два типа clathrin-независимого эндоцитоза: пиноцитоз для потребления жидоисти и фагоцитоз для потребления твердых частиц. Пиноцитоз в дальнейшем подразделен на два отдельных пути: микропиноцитоз и макропиноцитоз, диаметр пузырьков которых и механизмы отличаются. Экспериментально было установлено, что микроглией обеспечиваемая очистка растворимых Aβ посредством макропиноцитоза происходит in vitro и in vivo (Mandrekar et al., 2009). Очистка нерастворимых fAβ и fAβ -содержащих бляшек осуществляется посредством микроглиального фагоцитоза в то время, когда fAβ взаимодействуют с рецепторным комплексом клеточной поверхности, формируемом с помощью B-класса рецептора чистильщика CD36, α 6β 1 integrin и CD47/integrin ассоциированного белка (Bamberger et al., 2003; Koenigsknecht and Landreth, 2004).
UDP-активируемый P2Y6R,как было установлено, стимулирует фагоцитоз в первичной микроглии крыс, в котором участвует рецептор CysLT (Koizumi et al., 2007). Этот P2Y6R-обеспечиваемый микроглиальный фагоцитоз был подтвержден с помощью метода фагоцитоза in vivo, при котором флюоресцентно меченные микросферы инъецировали крысам, получающим kainic кислоту, модель повреждения головного мозга (Koizumi et al., 2007). Недавно получение time-lapse изображений визуализировало P2Y6R-обеспечиваемую подвижность мембраны клеток микроглии. Использование 100 µM UDP стимулировало как непосредственное образование ламеллия-подобных структур, так и длительно длящейся активной подвижности клеточной мембраны (Uesugi et al., 2012). Более того, UDP обработкой вызыванное образование крупных вакуолей, которые поглощают флюоресцентно меченный dextran, растворимые Aβ 1-42 или микросферы, которые демонстрируют, что P2Y6R обусловливает макропиноцитоз и фагоцитоз. Эти эндоцитотические процессы, использующие PKC-независимые функции и protein kinase D (Uesugi et al., 2012).
В моноцитах и макрофагах P2Y2R является критическим сенсором нуклеотидов, высвобождаемых апоптическими клетками, чья функция очистки с помощью фагоцитоза усиливается (Elliott et al., 2009). В соответствии с этим фагоцитоз и деградация нерастворимых fAβ1-42 и oAβ1-42 агрегатов с помощью первичной микроглии усиливается после UTP стимуляции, которая активирует P2Y2R, также как genb α v integrin, Rac и Src, реакции нейрозащиты (Kim et al., 2012). Имеется сходство между сигнальным каскадом tyrosine kinase-Vav-Rac1 после связывания fAβ -CD36 в микроглии (Wilkinson et al., 2006) и сигнальным каскадом Vav2-Rac1, активируемым ассоциацией P2Y2R и α v integrin (Bagchi et al., 2005). Поэтому было предположено, что P2Y2R и CD36 взаимодействуют с CD47 и ассоциированными с ним интегринами, чтобы индуцировать фагоцитоз нерастворимых Aβ микроглией (Kim et al., 2012).
Li et al. (2013) установили, что воздействие UTP, АТФ или АТФγ S, негидролизуемого гомолога АТФ, эффективно стимулирует пиноцитоз в первичной микроглии крыс. Во-первых, P2Y4R и P2Y2R крыс, как полагают, участвуют в отличие от человека, где АТФ является антагонистом P2Y4R, у крыс АТФ является агонистом P2Y4R с меньшим потенциалом, чем UTP (Kennedy et al., 2000). Используя специфические siRNAs, б ыло установлено, что P2Y4R отвечает за пиноцитоз. Такой P2Y4R-обеспечиваемый пиноцитоз происходит спонтанно без экзогенной стимуляции нуклеотидами, чтобы интернализовать растворимые Aβ1-42, но не Aβ 42-1 контроль (Li et al., 2013). Это связано с фармакологическими различиями между P2Y4Rs мыши и человека, было бы важно оценить , обеспечивают ли P2Y4Rs человека микроглиальный пиноцитоз растворимых Aβ .

Oxidative stress


Реактивные виды кислорода, а именно superoxide (O2_) и hydrogen peroxide (H2O2), неизбежные побочные продукты клеточного дыхания. ROS реагируют с молекулами внутри клеток, включая ДНК и вызывая повреждения клеток, т.к. оксидативные стрессы. Одним из основных поставщиков оксидативных стрессов является NADPH oxidase (NOX) комплекс, который продуцирует O2-.
Оксидативный стресс, как известно, вносит вклад в патогенез AD и недавно рассмотрен в обзоре (Mao and Reddy, 2011). Антиоксиданты и нацеленная на NOX терапия обнаруживает позитивные эффекты в противодействии оксидативным стрессам in vitro и у крыс, моделирующих AD (Simonyi et al., 2010). первичные кортикальные нейроны, подвергнутые действию Aβ1-42? обнаруживают существенную продукцию ROS, которая нуждается в активности NOX (Shelat et al., 2008). Первичные нейроны гиппокампа после воздействия генерального NOX ингибитора apocynin и растворимого oAβ1-42, выживают лучше, чем нейроны, обработанные только oAβ1-42 (Bruce-Keller et al., 2010). AD пациенты с легкими когнитивными нарушениями характеризуются продолжительно высокой экспрессией и активностью NOX в височных извилинах, чем в контроле, тогда как выборки преклинических или поздних стадий AD не обнаруживают различий (Bruce-Keller et al., 2010). Следовательно, NOX-обеспечиваемый путь redox может быть патологическим механизмом в основном на ранних стадиях AD в ранимых регионах головного мозга, это может объяснить предыдущие клинические испытания с антиоксидантами, которые оказались неспособны существенно затормозить прогрессию AD (Pratico, 2008).
Микроглия, как известно, экспрессирует подтипы NOX1, NOX2 и NOX4, а воздействие на мышиные микроглиальные BV2 клетки с помощью P2Y2/4R специфического агониста UTPγS увеличивает экспрессию NOX1 и NOX2, но не NOX4 (Mead et al., 2012). UTPγ S также усиливает продукцию O2-, тогда как P2Y1R агонист MRS2365 не оказывает эффекта. Интересно, что UTPγS-индуцированная продукция O2- ингибируется с помощью apocynin, но не с помощью thioridazine (ингибитора ferrocytochrome субъединицы NOX) или wortmanin (ингибитора PI3K-обусловленной регуляции NOX2), тогда как rottlerin (ингибитор PKC-обусловленной регуляции NOX1) слегка усиливает UTPγ S-индуцируемую продукцию O2-. Чувствительная к Apocynin продукция O2- в первичной микроглии крыс индуцировалась с помощью BzАТФ (Mead et al., 2012), стабильного гомолога АТФ и мощного агониста P2X7R, но также агониста для P2Y2R крыс (Wildman et al., 2003).
Чтобы защитить клетки от оксидативных стрессов, heme oxygenase-1 (HO-1) и biliverdin reductase-A могут быть индуцированы, чтобы нейтрализовать ROS. В выборках гиппокампа от умерших пациентов с AD, уровни белка HO-1 и фосфорилирования серина были достоверно выше, чем у того же возраста контрольных индивидов (Barone et al., 2012). Потенциальные роли для нуклеотидов и P2YRs в защите от оксидативных стрессов при AD были предположены Espada et al. (2010), которые установили, что HO-1 активируется в первичных мозжечковых гранулярных нейронах (CGN) крыс и мышей после воздействия АДФ или его стабильного аналога 2MeSADP. Среди трех 2MeSADP-реактивных подтипов P2YR, P2Y12R едва экспрессируется в CGN и было установлено, что P2Y13R , а не P2Y1R обеспечивает ADP/2MeSADP-индуцируемую экспрессию HO-1, используя избирательные антагонисты для P2Y13R и P2Y1R, MRS2211 и MRS2179, соотв. Было также показано, что активация транскрипционного фактора Nrf2 является критической для 2MeSADP-вызываемой защиты CGN от индуцируемой H2O2 гибели (Espada et al., 2010). Напротив, Fujita et al. (2009) установили, что АТФ и 2MeSADP не влияют на гибель клеток первичных нейронов гиппокампа крыс, после воздействия H2O2. Однако, когда эти нейроны культивировали совместно с первичными астроцитами, то H2O2-индуцированная гибель клеток существенно снижалась после предварительной обработки АТФ или 2MeSADP. используя P2Y1R-специфическую siRNA, было показано, что эта нейропротекция от оксидативных стрессов обеспечивается за счет активации P2Y1R астроцитов и высвобождения IL-6 в ответ на внеклеточный АТФ (Fujita et al., 2009).

Effects of P2Y receptors on neuronal function


P2Y рецепторы в нейронах, как было установлено, обеспечивают нейрозащитные реакции посредством регуляции роста аксонов, выпячивания нейритов и синаптической трансмиссии. Все подтипы рецептора P2Y экспрессируются в нейронах или олигодендроцитах при разных условиях (Moore et al., 2000a; Amadio et al., 2007; Heine et al., 2007; Koles et al., 2011; del Puerto et al., 2012; Weisman et al., 2012b). Хотя относительно мало исследований, изучавших роль этих P2Y рецепторов в контексте AD, исследования определили функциональные реакции в нейронах, обусловленные каждым из подтипов P2Y рецептора, которые, как полагают, являются защитными перед лицом воспаления или др. патологических инсультов в головном мозге. Кроме того, выявлен широкий диапазон агонистов и антагонистов, которые довольно избирательны к специфическим подтипам P2Y рецептора (Weisman et al., 2012b) и которые в конечном итоге могут быть использованы для лечения AD и др. нейродегенеративных болезней.

Expression of P2Y receptors in neurons


P2Y1R для ADP широко экспрессируется в головном мозге млекопитающих, включая кору головного мозга и гиппокамп (Simon et al., 1997; Moran-Jimenez and Matute, 2000; Moore et al., 2000a; Koles et al., 2011), регионы преимущественно нарушаемые при AD (Zilka et al., 2006; Lee et al., 2010; Obulesu et al., 2011; Wyss-Coray and Rogers, 2012). P2Y1R,как было установлено, экспрессируется в глютаматергических и глицинергических нейронах (Rodrigues et al., 2005; Jimenez et al., 2011), олигодендроцитах (Agresti et al., 2005), клетках нейральных предшественников (Mishra et al., 2006), ганглиях дорсальных корешков и нейронов рогов (Sanada et al., 2002; Ruan and Burnstock, 2003; Kobayashi et al., 2006). В головном мозге человека с AD, P2Y1Rs в нейронах совместно располагаются с tau узелками и бляшками Aβ (Moore et al., 2000b).
Низкие уровни экспрессии P2Y2R для АТФ и UTP были продемонстрированы в нейронах коры головного мозга и гиппокампа (Moore et al., 2001; Verkhratsky et al., 2009). Однако, экспрессия P2Y2R, как было установлено, существенно повышается в кортикальных нейронах после воздействия способствующего воспалению цитокина IL-1β , чьи уровни повышаются у AD пациентов и у животных моделей AD, по сравнению с нормальным контролем (Cacabelos et al., 1994; Lee et al., 2010). Интересно, что P2Y2R также активируется в клетках млекопитающих и тканях в условиях, связанных с воспалением и повреждениями (Koshiba et al., 1997; Turner et al., 1997; Seye et al., 2002; Shen et al., 2004; Schrader et al., 2005; Kong et al., 2009), включая и спинной мозг (Rodriguez-Zayas et al., 2010) и головного мозг (Franke et al., 2004). Эти находки подтвердили, что усиление активности P2Y2R в нейронах в ответ на клеточные поврежден ия играет потенциальную роль в нейропротекции.
Недавнее исследование показало, что P2Y4R и P2Y6R могут функционировать как гомо- и гетеромеры с нейронах (D'Ambrosi et al., 2007). И мРНК P2Y4R и P2Y6R обнаруживаются в пирамидальных нейронах гиппокампа крыс (Rodrigues et al., 2005), тогда как мРНК P2Y6R экспрессируется в superior cervical ganglion мыши (Calvert et al., 2004) и не1йронах ганглиев дорсальных корешков крыс (Sanada et al., 2002; Ruan and Burnstock,2003). Рецепторы P2Y4 и P2Y6 (D'Ambrosi et al., 2007; Koles et al., 2011) экспрессируются в др. типах нейронов ЦНС (Moore et al., 2001; Verkhratsky et al., 2009).
Экспрессия P2Y11R для АТФ была описана в пирамидальный нейронах гиппокампа крыс, клетках Пуркинье мозжечка (Rodrigues et al.,2005; Volonte et al., 2006)и др. типах нервных клеток (Moore et al., 2001; Verkhratsky et al., 2009). Активация P2Y11R,как было установлено, ингибирует апоптоз, индуцируемый патогенами или воспалением, подтверждая роль в нейродегенерации (Vaughan et al., 2007). Др. исследования показали, что P2Y12R, как известно, регулирует агрегацию тромбоцитов (Jantzen et al., 1999; Xu et al., 2002; Dorsam and Kunapuli, 2004; Wallentin, 2009), он экспрессируется и в нейронах (Moore et al., 2001; Rodrigues et al., 2005; Verkhratsky et al., 2009; Jimenez et al., 2011) и олигодендроцитах (Amadio et al., 2006). P2Y13Rs для АДФ экспрессируется в разных типах нервных клеток (Moore et al., 2001; Verkhratsky et al., 2009; Jimenez et al., 2011), было предположено, что они играют здесь роль в жизнеспособности клеток (Weisman et al., 2012b). P2Y14Rs для UDP-glucose выявлен в нейронах (Moore et al., 2001; Verkhratsky et al., 2009), и сенсорные нейроны, как было установлено, экспрессируют P2Y13 и P2Y14, а также P2Y1 рецепторы (Malin and Molliver, 2010).

Neuroprotective responses mediated by P2Y receptors


Клеточные функции, связанные с активацией различных подтипов P2YR в нейронах, по-видимому, в основном нейрозащитные, это подтверждает, что эти рецепторы могут быть эффективными фармакологическими мишенями, чтобы задерживать прогрессирование AD. Однако эти пути не были исследованы тщательно как нейрозащитные функции P2YRs в глиальных клетках головного мозга. Тем не менее активация специфических подтипов P2YR в нейронах показала стимуляцию роста нейритов, удлинения аксонов и не приводящий к амилоидозу процессинг APP и повышение жизнеспособности клеток.
Скоординированная регуляция аксонального роста с помощью P2Y1 и P2Y13 рецепторов продемонстрирована в нейронах гиппокампа крыс, где удлинение аксонов стимулируется с помощью P2Y1R посредством Gq-зависимой активации PI3K и удлинение аксонов ингибируется с помощью P2Y13R посредством Gi-зависимой активации аденилат циклазы, путей, которые нацелены на противодействие нейродегенеративным эффектам нейрофибриллярных узелков (tangles) (del Puerto et al., 2012). Исследования с первичными кортикальными нейронами крыс показали, что удлинение нейритов стимулируется с помощью P2Y2R-обеспечиваемых взаимодействий с αvβ3/5 интегрином, приводя к активации пути, участвующего в G12-зависимой активации Rho и в фосфорилировании актин-деполимеризующего белка cofilin (Peterson et al., 2013), который, как известно, способствует удлинению нейритов (Meberg et al., 1998; Meberg and Bamburg, 2000; Aizawa et al., 2001; Endo et al., 2003; Endo et al., 2007; Figge et al., 2012). Активация P2Y2R в присутствии фактора роста нервов, как было установлено, усиливает зависимую от tyrosine kinase A дифференцировку нейронов и ускоряет образование нейритов в клетках PC12 и нефронах ганглиев дорсальных корешков (Arthur et al., 2005). Следовательно, способность P2Y2Rs активироваться с помощью цитокина IL-1β, чьи уровни повышены в головном мозге при AD, строго подтверждает, что острое воспаление стимулирует P2Y2R-обеспечиваемую нейропротекцию (т.e., усиливает удлинение аксонов и выросты нейритов) в ответ на высвобождение внеклеточных нуклеотидов из активированной глии или апоптических клеток в воспаленном окружении при ранней AD.
Активация P2Y2R в первичных кортикальных нейронах и клетках нейробластомы усиливает α-secretase-зависимую деградацию APP, чтобы давать растворимые APPα пептиды скорее, чем нейротоксические пептиды Aβ1-42? реакция, которая может быть предупреждена с помощью предварительного воздействия ингибиторов металлопротеиназ ADAM10/17, т.е., TNF-α конвертирующего энзима (Camden et al., 2005; Kong et al., 2009). Было показано, что нейропатология при AD (напр., потеря синапсов) коррелирует со снижением экспрессии P2Y2R теменной коре у умерших с AD (Lai et al., 2008), в сравнении с контролем, это сходно с усилением нейровоспалительного и нейродегенеративного фенотипа, наблюдаемого у мышей TgCRND8, моделирующих AD, после нокаута P2Y2R (Ajit et al., 2013). P2Y2R также защищает от индуцируемой травмой гибели клеток астроцитов (Burgos et al., 2007), посредством P2Y2R-обеспечиваемого фосфорилирования про-апоптического фактора Bad и снижения соотношения экспрессии мРНК bax/bcl-2 (Chorna et al., 2004), которое, как известно, участвует в механизмах клеточного выживания. Т.о., потеря защитных функций, регулируемых с помощью P2Y2R в нейронах головного мозга и глиальных клетках человека и мыши, по-видимому, способствует прогрессии AD и подтверждает, что активация P2Y2Rs может служить задержке нейродегенерации, вызываемой воспалением в головном мозге при AD.
Др. потенциальные нейрозащитные реакции, обеспечиваемые активацией P2YR в нейронах, включают усиление Na+ - и Cl--зависимого транспорта глицина в синаптической щели с помощью активации P2Y1, P2Y12 и P2Y13 рецепторов (Jimenez et al., 2011) и повторную сенсибилизацию ионотропных P2X2 рецепторов (Chen et al., 2010) и vanilloid type 1 channels (TRPV1) в сенсорных нейронах с помощью активации P2Y2R (Wang et al., 2010). Активации P2Y11R в глютаматергических нейронах также может задерживать клеточный апоптоз с помощью cAMP-зависимого механизма (Vaughan et al., 2007), тогда как активация P2Y13R ингибирует фосфорилирование glycogen synthase kinase-3 и усиливает PI3K/Akt-зависимый ядерный транспорт β-catenin, приводя к повышению экспрессии генов клеточной жизнеспособности (Ortega et al., 2008). Активация P2Y13R также, как было установлено, индуцирует экспрессию Nrf2 и защищающего клетки HO-1, чтобы предупредить вызываемую оксидативным стрессом гибель нейронов (Espada et al.,2010). В недавнем обзоре (Koles et al., 2011), показано, что активация P2YRs может повышать dopamine (Krugel et al., 1999; Krugel et al., 2001; Heine et al., 2007) и высвобождение глютамата(Price et al., 2003), но также может ингибировать высвобождение нейротрансмиттров (De Lorenzo et al., 2006) в коре головного мозга (Cunha et al., 1994; von Kugelgen et al., 1994; Bennett and Boarder, 2000; Luthardt et al., 2003; Rodrigues et al., 2005) и гиппокампе (Koch et al., 1997; Mendoza-Fernandez et al., 2000; Csolle et al., 2008). Это широкое разнообразие регуляторных эффектов на нейротрансмиссию, вызываемое активацией индивидуальных подтипов рецепторов P2Y, нуждается в дальнейшем исследовании особенно в контексте нейродегенеративных заболеваний, таких как AD.
Хотя P2YRs, включая P2Y1 и P2Y12 рецепторы, экспрессируются в олигодендроцитах (Agresti et al., 2005; Amadio et al., 2006), мало известно о функциональной роли этих P2Y рецепторов в этом важном нейрозащитном типе клеток, которые регулируют миелинизацию аксонов и др. функции (Liu et al., 2013). Поскольку AD фенотип связан с дисфункцией олигодендроцитов (Higuchi et al., 2005; Rowe et al., 2007; Kohama et al., 2012; Liu et al., 2013), исследование функций P2YR в этих клетках может выявить новые фармакологические мишени на путях, обеспечиваемых олигодендроцитами. Экспрессия P2Y12R в олигодендроцитах, как было установлено, снижается с демиелинизацией в сером веществе коры в выборках головного мозга, поврежденного множественным склерозом (Amadio et al., 2010), а снжение экспрессии P2Y2R было описано в головном мозге человека при AD (Lai et al., 2008). Т.о., потеря функций рецепторов P2YR, по-видимому, коррелирует с дисфункцией нейронов, ассоциированной с нейродегенеративными болезнями, и необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить, действительно ли подходы, которые способствуют активации и поддержанию активности специфических подтипов P2YR в нейронах, будут приводить замедлению начала нейрологического дефицита при AD.

Neurovascular dysregulation in AD


Доказательства последних 10 лет подтвердили, что дисфункция сосудов головного мозга играет центральную рольв развитии AD (Iadecola, 2004; Zlokovic, 2008; Bell and Zlokovic, 2009; Kelleher and Soiza, 2013; Sagare et al., 2013). Нарушение BBB наблюдается более часто у пациентов с AD, чем у того же возраста контрольных индивидов без AD (Claudio, 1996; Matsumoto et al.,2007) , а техника получения изображений головного мозга выявила, что имеется типичное снижение CBF во время развития AD (Alsop et al.,2000; Warkentin et al., 2004; Ruitenberg et al., 2005; Schuff et al., 2009). У трансгенных мышей с избыточной экспрессией Шведской мутации APP, нарушения поведения и памяти появляются в возрасте 6 мес., а амилоидные бляшки в возрасте 9-12 мес. (Hsiao et al., 1996; Kawarabayashi et al., 2001; Westerman et al., 2002). Однако снижению CBF предшествуют события, наблюдаемые с возраста 2 мес. и включают нарушения авторегуляции сосудов головного мозга и ослабление повышения CBF, вызываемого зависимыми от эндотелия расширителями сосудов (Niwa et al., 2000b; Niwa et al., 2002). Эти эффекты на сосуды головного мозга значительнее у трансгенных мышей, которые экспрессируют высокие уровни в головном мозге Aβ и появляются в отсутствие когнитивных нарушений или амилоидных бляшек (Niwa et al., 2000b; Niwa et al., 2002). Более того, нарушения сосудов головного мозга может быть воспроизведено у нормальных мышей с помощью локального воздействия Aβ1-40 на неокортекс (Niwa et al., 2000a). В изолированных мозговых артериях грызунов и человека Aβ вызывает сужение сосудов, которое может быть устранено очистителями от свободных радикалов, такими как superoxide dismutase (SOD1) (Niwa et al., 2001; Paris et al., 2003). Воздействие SOD1 также устраняет дисфункцию сосудов головного мозга у мышей с избыточной экспрессией мутантного APP (Iadecola et al., 1999), подтверждая, что Aβ вызывает сужения сосудов путем продукции свободных радикалов. Эти наблюдения подтверждают гипотезу, что растворимые Aβ являются критическим фактором для дисфункции сосудов головного мозга при AD, которая возникает рано в ходе болезни, до отложения Aβ в амилоидных бляшках.
Гипоксия является прямым следствием снижения CBF и является общим компонентом для многих факторов риска AD, включая инсульты, атеросклероз, гипертензия и сахарный диабет. Исследования in vivo показали, что воздействие на мышей избыточной экспрессии мутантного APP, чтобы существенно ускорить с помощью гипоксии появление симптомов AD и биомаркеров, включая потерю памяти и увеличение отложений β-amyloid бляшек и уровня в головном мозге Aβ b BACE1, секретазы, которая является критической для генерации Aβ (Sun et al., 2006). Более того, эксперименты in vitro показали, что гипоксия повышает уровень hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) и BACE1 в клетках нейробластомы SH-SY5Y и что промотор BACE1 содержит чувствительный к гипоксии элемент, который связывается и активируется с помощью HIF-1α (Sun et al., 2006). Следовательно, снижение CBF и возникающая в результате гипоксия облегчают патогенез AD путем усиления продукции HIF-1α b HIF-1α-индуцибельных белков, включая BACE1 (Zhang et al., 2007), VEGF (фактор роста эндотелия сосудов, который увеличивает проницаемость сосудов и нарушение BBB) (Yeh et al., 2007), endothelin-1 (мощный фактор сужения сосудов) (Hisada et al., 2012), RAGE (рецептор для продвинутых конечных продуктов glycation, которые транспортируют Aβ из кровотока в подлежащую ткань) (Pichiule et al., 2007), serum response factor и myocardin (транскрипционные факторы, которые супрессируют экспрессию LRP1, главного транспортера Aβ из сосудистых клеток в головном мозге в кровоток) (Chow et al., 2007; Bell et al., 2009) и PERK (киназа эндоплазматического ретикулума, которая деактивирует фактор инициации трансляции eIF2α и репрессируют глобальный синтез белка, который необходим для синаптической пластичности и функции памяти) (Costa-Mattioli et al., 2009; Ma et al., 2013).

Cerebrovascular effects of nucleotides and P2Y receptors


Передача пуринергических сигналов регулирует сосудистый кровоток в теле и головном мозге (Erlinge and Burnstock, 2008; Burnstock and Ralevic, 2014). Уже давно выявлено высвобождение АТФ из срезов активного головного мозга (Pull and McIlwain, 1972) и показано его стимулирование потребления кислорода и повышения CBF (Forrester, 1978). В целом регуляция тонуса сосудов головного мозга с помощью нуклеотидов (т.e., сужение сосудов в противовес расширению) зависит от источника нуклеотидов. Когда АТФ высвобождается в качестве нейротрансмиттера или ко-трансмиттера с noradrenaline из околососудистых симпатических нервов, то он вызывает сужение сосудов путем активации P2X1 и P2Y2,4,6 рецепторов на сосудистые гладкомышечные клетки (Burnstock and Knight, 2004; Burnstock and Ralevic, 2014). Когда АТФ и УТФ высвобождаются в просвет сосудов, напр.. из эндотелиальных клеток в ответ на изменения кровотока, вызываемые упражнениями (Hashimoto et al., 1999; Farias et al., 2005) или гипоксией (Bodin and Burnstock, 1995), из эритроцитов в ответ на гипоксию (Bergfeld and Forrester, 1992) или из активированных тромбоцитов и иммунных клеток (Beigi et al., 1999; Eltzschig et al., 2006; Piccini et al., 2008), то они вызывают расширение сосудов путем активации P2Y1,2,4,6 рецепторов эндотелиальных клеток (Burnstock and Ralevic, 2014). исследования разных сосудистых систем, включая сосуды головного мозга, показали, что воздействие внутри просвета АТФ или УТФ (одинаково мощных агонистов P2Y2R) вызывает зависимое от эндотелия расширение кровеносных сосудов и снижение кровяного давления, что характеризует активацию эндотелиального P2Y2R (Terada et al., 1976; Kennedy and Burnstock, 1985; Miyagi et al., 1996; Ralevic and Burnstock, 1996; Guns et al., 2006; Rieg et al., 2007; Dietrich et al., 2009; Rieg et al.,2011). P2Y1,2,4,6 рецепторы, которые экспрессируются в сосудистом эпителии человека и грызунов (Wihlborg et al., 2003; Guns et al., 2005), увеличивают кровоток путем высвобождения NO, prostaglandins и EDHF (Lustig et al., 1992; Buvinic et al., 2002; Wihlborg et al., 2003; Guns et al., 2006).
Эффекты нуклеотидов на тонус сосудов головного мозга варьируют, однако в зависимости от вида, размера и возраста изучаемых кровеносных сосудов. Напр., в изолированных артериях мягкой мозговой оболочки человека 10-7 до 10-5 M UTP и UDP вызывают временное, зависимое от эндотелия расширение и независимое от эндотелия сужение при более высоких концентрациях (Hardebo et al., 1987), подтверждая, что P2Y2,4,6 рецепторы участвуют. В артериях головного мозга человека, лишенных эндотелия, активация P2Y6 рецептора вызывает сужение сосудов (Malmsjo et al., 2003). АТФ- и АДФ-индуцируемое расширение артерий, изолированных у обезьян было зависимым от эндотелия в височных артериях, но в основном не зависело от эндотелия артериях головного мозга (Toda et al., 1991). В артериолах головного мозга бабуинов и кошек периваскулярное и введение в каротидную артерию АТФ увеличивает CBF в концентрациях в пределах от 10-11 до 4 х 10-8 M (Forrester et al., 1979). В strips средней мозговой артерии телят UTP вызывает сужение, если эндотелий удаляется, но вызывает расширение посредством NO, если эндотелий присутствует (Miyagi et al., 1996). ADP-вызываемое расширение малых мозговых артерий кроликов оказалось зависимым от эндотелия (Brayden, 1991). В изолированных артериолах головного мозга крыс микроаппликации АТФ вызывают временные снжения посредством P2X1 рецепторов гладких мышц и поддерживают расширение, которое первоначально обусловлено активацией P2Y рецептора эндотелия (Dietrich et al., 2009). У старых крыс в артериях головного мозга наблюдается подавление P2X1 и повышение уровней мРНК P2Y1 и P2Y2 рецепторов в гладкомышечных клетках, тогда как подавление уровней мРНК P2Y1 и P2Y2 рецепторов наблюдается в эндотелиальных клетках (Miao et al., 2001), подтверждая, что возраст влияет на реакцию сосудов головного мозга на нуклеотиды. Хотя изучение мозговых капилляров недоступно, капиллярный кровоток в субвентрикулярном регионе головного мозга мыши в ответ на UTP было изучено. Используя laser Doppler flowmetry, Lacar et al. (2012) показали, что инъекции в желудочек UTP временно снижает кровоток. Более того, они продемонстрировали, что воздействие UTP на только что приготовленные срезы головного мозга увеличивает уровни кальция в перицитах, приводя к сужению капилляров (Lacar et al., 2012).
Недавнее исследование ex vivo Dietrich et al. (2010) на пенетрирующих мозговых артериолах крыс показало, что сосуды в основном ответственны за контроль резистентности сосудов головного мозга, что проявлялось в эффекта сужения и расширения сосудов после не вводимого в просвет АТФ и растворимого Aβ. Они установили, что такое применение АТФ вызывает временное сужение сосудов и устойчивое расширение сосудов. Более того, они продемонстрировали, что вводимый не в просвет Aβ вызывает достоверное сужение сосудов посредством ROS-зависимого механизма и что совместное применение АТФ и Aβ усиливает временное АТФ-индуцируемое сужение сосудов и уменьшает устойчивое вызываемое АТФ расширение сосудов (Dietrich et al.,2010). Это подтверждает, что эндотелиальные P2YRs играют важную роль в противодействии сужению сосудов головного мозга и снижению CBF, вызываемому с помощью Aβ как только он начинает накапливаться во время ранних стадий AD.

In vivo effects of the loss of P2Y2 receptor expression in an AD mouse model


Предыдущие исследования ткани головного мозга умерших людей с AD выявили снижение экспрессии P2Y2Rs, по сравнению с не-AD контролем (Lai et al., 2008). Интересно, что недавнее исследование показало первоначальное усиление активности P2Y2R во время ранней стадии болезни (10-25 недель) у TgCRND8 мышей, хорошо охарактеризованной модели AD. Однако, экспрессия P2Y2R снижается в возрасте 25-48 недель с прогрессированием болезни (Ajit et al., 2013), подтверждая, что P2Y2R-обеспечиваемая нейрозащита доступна на ранней ст. AD, но теряется на поздней ст. болезни.

Mortality


Гетерозиготная делеция P2Y2R у TgCRND8 мышей, моделирующих AD, приводит ускорению патологии и преждевременной гибели (10-12 недель) по сравнению с TgCRND8 мышами, экспрессирующими полный набор P2Y2R. Более того, гомозиготная делеция P2Y2R у TgCRND8 мышей приводит к острому снижению доли выживших, причем смерть наступает в возрасте 4-5 недель (Ajit et al., 2013). Др. исследование показало, что клеточное распределение P2Y1R изменяется в головном мозге людей с AD, при этом P2Y1R локализуется на нейрофибриллярных узелках, нитях нейропиля и нейритных бляшках (Moore et al., 2000b). Однако функциональные последствия перераспределения P2Y1R при AD нуждаются в дальнейшем исследовании. Тем не менее эти наблюдения показывают потенциальную благоприятную роль P2YRs в предупреждении AD.

Aβ accumulation


Хроническое воспаление вносит вклад в нейродегенерацию при AD (Akiyama et al., 2000; Ho et al., 2005; Griffin, 2006); однако острое воспаление важно для репарации ткани и может ограничивать повреждения головного мозга (Monsonego and Weiner, 2003), частично способствуя очистке Aβ. Накопление Aβ является характерным признаком AD и современные терапевтические стратегии нацелены на механизмы очистки Aβ. Предыдущие исследования показали, что усиление активности P2Y2R и активация усиливают потребление фибриллярных Aβ1-42 клетками микроглии за счет взаимодействия P2Y2R с αv интегринами, которые приводят к активации Rac1, сигнального белка , как известно, регулирующего фагоцитоз (Kim et al.,2012). Эти результаты были подтверждены гетерозиготной делецией P2Y2R у TgCRND8 мышей, которые ускоряют накопление растворимых Aβ в головном мозге по сравнению с контрольными того же возраста TgCRND8 мышами с полным набором P2Y2R. Эти исследования подтвердили роль P2Y2R в фагоцитозе и деградации Aβ в головном мозге особенно когда гетерозиготная делеция P2Y2R у TgCRND8 мышей не меняет уровней APP или энзимов превращающих APP белок, ADAM10, ADAM17или BACE1. Скорее всего, усиленное накопление Aβ после делеции P2Y2R связано с неэффективной очисткой от Aβ.

Microglial cell recruitment


В условиях воспаления нервов, ассоциированных с AD, присутствующая микроглия становится активной, пролиферирует и мигрирует в направлении и окружает бляшки Aβ (Bolmont et al., 2008), а происходящие из крови макрофаги инфильтрируют головной мозг (Simard et al., 2006; Hao et al., 2011). Эта активированная микроглия, как полагают, играет нейрозащитную роль благодаря фгоцитозу и деградации нейротоксичных форм Aβ (Jiang et al., 2008). Критическая роль микроглии в контроле уровней Aβ продемонстрирована на мышах, моделирующих AD и AD пациентов, у которых иммунизация Aβ, как было установлено, снижает нагрузку бляшек и увеличивает накопление микроглиальных клеток (Schenk et al., 1999; Nicoll et al., 2003; Boche et al., 2010).
Усиление активности и активация P2Y2Rsв первичных микроглиальных клетках мыши, обработанных олигомерными Aβ, усиливает миграцию микроглиальных клеток в направлении Aβ и увеличивает потребеление и деградацию Aβ (Kim et al., 2012), нейрозащитный механизм, который замедляет прогрессирование болезни in vivo. Соответственно гетерозиготная делеция P2Y2Rs у TgCRND8 мышей снижает количества CD11b+ и CD45+(Figure 1) микроглиальных клеток, окружающих бляшки Aβ в головном мозге, подтверждая, что снижение экспрессии P2Y2R приводит к неэффективному накоплению микроглиальных клеток и к активации, которая как ожидается обладает негативными эффектами на функцию нервов (Kim et al., 2012).



Figure 1. Heterozygous knockout of the P2Y2R attenuates CD45+microglial cell accumulation in the brains of TgCRND8 mice Microglial cell activation in the brains of 10-wk-old TgCRND8 mice, and a non-transgenic littermate control (Tg?), TgCRND8 mice heterozygous forP2Y2R (Tg+P2Y2R+/?) and non-transgenic littermate control mice heterozygous for P2Y2R (Tg?P2Y2R+/?) were investigated by subjecting hippocampal brain sections to immunofluorescence analysis using anti-CD45 antibody (red) and Hoechst nuclear stain (blue). Results indicate a decrease in microglial cell accumulation in TgCRND8 mouse brain with deletion of theP2Y2R. Images are representative of results from three independent experiments and scale bar = 10 µm.



Neurological symptoms


Аномальные рефлексы при limb- flexion и paw-clasping не являются специфическими маркерами нейрологического дефицита, которые были использованы для оценки нейродегенерации при AD и болезни Гентингтона (Mangiarini et al., 1996; Komatsu et al., 2006). Нарушения осанки и походки описаны ранее уже на ранних стадиях AD (Pettersson et al., 2002).
P2Y2R делеция у мышей TgCRND8 приводит к аномальному limb-flexion и paw-clasping в возрасте 10-12 недель (Ajit et al., 2013). Однако эти симптомы отсутствуют в этом возрасте у мышей TgCRND8с полным набором P2Y2R, подтверждая нейрозащитную роль P2Y2R при AD. Кроме того, гетерозиготная делеция P2Y2R у мышей TgCRND8 приводит к потере координации движений. Анализ походки с использованием Noldus CatWalk системы показал, что P2Y2R делеция у TgCRND8 мышей снижает скорость поворотов (i.e., the speed of the paw while not in contact with the walkway) и длину шага (i.e., the distance between successive paw placements), по сравнению с того возраста TgCRND8 мышами. Кроме того, индекс регулярности, измеряющий interpaw координацию, определяется как количество нормальной последовательности шагов относительно количества помещений стоп, достоверно снижено при гетерозиготности по делеции P2Y2R у TgCRND8 мышей. Эти результаты строго подтверждают гипотезу, что P2Y2R играет нейрозащитную функцию у TgCRND8 мышей, моделирующих AD, и подкрепляют исследования по оценке эффектов делеций иных подтипов P2YR у животных моделей дегенеративных болезней, включая и AD.

Conclusions


G protein-coupled P2Y nucleotide receptors play a role in neuroinflammation, CBF and the progression of many neurodegenerative diseases, including AD, as described in this review. All eight known P2Y receptor subtypes are expressed in the brain where they regulate a variety of neuronal, neuroinflammatory and neurovascular functions, including non-amyloidogenic APP processing, the production of cytokines and chemokines, the migration of microglia, microglial cell-mediated endocytosis and degradation of neurotoxic Aβ, responses to oxidative stress, axonal outgrowth and neurite extension in neurons, the regulation of neurotransmission, and the endothelium-dependent dilation of cerebral blood vessels. Aβ can increase the release of nucleotides from cells and stimulate the upregulation of P2Y receptors. Overall, the collective results from numerous studies suggest that P2YRs can regulate neuroprotective effects, particularly under neuroinflammatory conditions. Therefore, there is considerable interest in targetting P2YRs to prevent the progression of neurodegenerative diseases, such as AD. Interestingly, deletion of the P2Y2R in a mouse model of AD accelerates mortality, enhances neurological deficits and Aβ accumulation in the brain and decreases the migration of microglial cells to Aβ plaques (pathways coupled to P2Y2R activation in the brain are shown in Figure 2). Similarly, reduced P2Y2R expression has been reported in post-mortem brain samples from AD patients, as compared with normal controls, suggesting that loss of P2Y2R expression in humans correlates with the AD phenotype. These findings encourage further research to evaluate the contribution of each P2Y receptor subtype to AD progression as a means to develop novel therapeutic approaches to delay the onset and retard pathological manifestations of this debilitating disease that is anticipated to impact 50 million people worldwide within the next few decades.

Figure 2. P2Y receptor function in AD

(A) Overview of cell types involved in neuroinflammation and the neurovascular unit. Areas b-e in panel (A) are magnified in panels (B-E). Although intimately involved, neuron-associated astrocytes and oligodendrocytes and microvessel-associated pericytes are not shown for simplicity. Aβ alters cellular release of nucleotides, including increased АТФ release from microglia and decreased АТФ release from hypoxic erythrocytes. In perivascular neurons, АТФ is released from synaptic vesicles and causes vasoconstriction by activating P2X1 and P2Y2,4,6 receptors on vascular smooth muscle cells. P2Y1,2,4,6 receptors in vascular endothelial cells promote vasodilation by responding to АТФ in the blood stream. The endothelial P2Y2R facilitates monocyte adhesion to the vascular wall, through VEGFR-2-dependent upregulation of vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) as well as monocyte extravasation. Activation of neuronal P2Y1,2receptors promote neurite extension and stabilization, whereas P2Y13R inhibits neurite extension. Neuronal P2Y2R facilitates non-amyloidogenic processing of APP through ADAM10/17-dependent production of soluble APPβ (sAPPβ). P2Y1,12,13 receptors enhance glycine transport in the synaptic cleft and P2Y11R activation in glutamatergic neurons delays apoptosis. P2YRs increase dopamine and glutamate release, but can also inhibit neurotransmitter release in the cerebral cortex and hippocampus. In microglia, P2Y1,2,6,12,13 receptor activation increases microglial cell migration and P2Y2,6 receptors promote A? uptake and degradation. In astrocytes, P2Y1,6 receptors stimulate the production of proinflammatory cytokines and chemokines, P2Y2,4 receptors increase the production and secretion of APP and P2Y14R increases expression of MMP9, which degrades Aβ.