Болезнь Паркинсона (PD) наиболее распространена, страдают 6 миллионов людей во всем мире [1,2]. Будучи клинически гетерогенной PD характеризуется основными признаками тремором в покое, брадикинезией и ригидностью. На поздних стадиях болезни симптомы сопровождаются нестабильностью положения, нарушениями походки, затруднениями глотания и речи, аутосомными нарушениями и у свыше 80% пациентов, когнитивными нарушениями [1]. Моторные симптомы болезни Паркинсона возникают в результате дегенерации приблизительно 60% допаминэргических нейронов substantia nigra pars compacta (SNpc), приблизительно 450 000 SNpc у взрослого человека, которые возникают параллельно потере 80% дофаминовых нейронов в striatum (caudate nucleus и putamen). Избирательная дегенерация SNpc нейронов вызывает снижение стимуляции прямых путей (обеспечиваемых c помощью D2-подобных рецепторов), ведущих как в повышенному GABAergic тону в output моторных ядрах базальных ганглиев, так и последующей более низкой активности талямуса в отношении облегчения инициации движений [1,2]. Избыточная глютаматэргическая активность субталямических ядер является следствием истощения dopamine, может добавлять рефлекс excitotoxic инсульта SNpc нейронам [3]. Некоторые компенсаторные механизмы в этой сложной сети маскируют начало проявления клинических симптомов пока 60-70% SNpc нейронов не будут разрушены [4]. Т.о., воздействие с целью защиты SNpc нейронов, остановки, реверсии или модификации прогрессирования PD обречены на неудачу до тех пор, пока диагноз не будет устанавливаться до начала признаков моторных нарушений [5]. Современные доступные терапии в основном сфокусированы на компенсации моторных симптомов. Соответственно, не моторные осложнения являются основной причиной недееспособности у пациентов с продвинутой PD. Моторные симптомы является не уникальными для PD, хотя PD является главной причиной паркинсоновых симптомов. Появление тремора может быть ятрогенного или психогенного происхождения и пациенты с существенным тремором иногда ошибочно диагностируются как пациенты с PD. Сходным образом, появление паркинсоновых признаков может указывать, что пациент имеет атипичную форму дегенеративного паркинсонизма, такую как множественная системная атрофия или прогрессивный супраядерный паралич [6].

PD является мультифакторной, сложной болезнью, при которой разные факторы конкурируют за патологический процесс. In vitro модели (созданные клеточные линии, первичные клеточные культуры или стволовые клетки) предлагают благоприятные контролируемые условия, но могут отсутствовать клеточные микроусловия, критические для развития болезни. Напротив, необходимые микроусловия могут присутствовать в животных моделях, несмотря на различия в структуре головного мозга и в методах, используемых для вызывания важных составляющих ограничений паркинсонизма [7]. Клеточные модели особенно пригодны для изучения одиночных патогенетических механизмов и участвующих генов/белков. В самом деле, исследования клеток предоставляют прирожденные преимущества быстрые и воспроизводимые и прямо нацеленные на специфические молекулярные пути основ прогрессирования PD [5].

Клеточная линия нейробластомы человека SH-SY5Y широко используется в качестве клеточной модели для воспроизведения нарушения гомеостаза dopamine, который являются , по-видимому, главным аспектом патогенеза PD. В самом деле, SH-SY5Y клетки обладают полной dopaminergic системой. В частности, они обладают хорошей активностью dopamine transporter (DAT) и низкой активностью везикулярного моноаминового транспортера типа 2, так что концентрация цитоплазматического dopamine может быть увеличена при применении экзогенного дофамина в культуральную среду [8,9]. Эффекты специфических PD-связанных белков были исследованы после воздействия dopamine или др. токсинов на клетки SH-SY5Y, также как и на др. catecholaminergic клеточные линии из нейробластомы человека, такие как SK-N-BE или BE2-M17 клетки. Далее нейрон подобные клеточные модели сегодня используются при исследования PD, включая PC12, линию клеток, происходящую из феохромоцитомы медуллы надпочечников крыс и MES, представляющую гибридные клетки mesencephalic-neuroblastoma крыс. Кроме того, первичные нейрональные культуры, происходящие из животных моделей, могут предоставить важную вспомогательную клеточную систему для исследований патогенеза PD на клеточном уровне, особенно если исследуется роль специфических генов с целью определения чувствительности нейронов к разным стрессовым условиям [10].

Кроме того, существует возможность использования в качестве нового терапевтического подхода стволовых клеток, также представляющих собой ценный инструмент для выявления лекарств. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) человека открывают возможность получения in vitro моделей дофаминовых нейронов. Разработка протоколов для индукции стандартизованных фенотипов iPS представляет удивительное продвижение вперед к получению специфичных для пациента линий стволовых клеток для изучения механизмов различных болезней [11].

Подходящими моделями для исследования биохимических механизмов течения PD являются инструментальные в поиске новых фармакологических мишеней с целью разработки терапии, влияющей на болезнь и роли не моторных составляющих PD [1,5,6]. Клеточные модели далеки от того, чтобы быть в состоянии воспроизвести всю сложность PD. Однако они могут предоставить ценную информацию по оценке животных моделей [7] и/или у человека [12].

Genetic aetiology of PD

PD больше не рассматривается как спорадическая, не генетическая болезнь, а семейственность стала исключительным критерием при постановке диагноза. С др. стороны, средовые факторы рассматриваются как сильно влияющие на этиологию PD , поскольку паркинсонизм вызывается митохондриальными токсинами [1]. Дополнительным подтверждением средовой гипотезы стало доказательство увеличения риска PD у пациентов после воспаления головного мозга. В 1996 получены четкие указания на генетически-связанную форму PD в семье с точковой мутацией в гене α-synuclein gene. В течение следующих 15 лет список мутаций, связанных с PD быстро вырос и генетические формы болезни ответственны ppf более чем 20% случаев PD. Некоторые локусы были ассоциированы с PD. Во многих случаях пенетрантность неполная, это затрудняет её идентификацию [1,2]. Тем не менее ассоциация с PD обычно распознается для белков, представленных в Табл.1. Накапливаются доказательства, указывающие, что молекулярные пути нейродегенерации, запускаемые c помощью каждой из мутаций, могут быть общими для нескольких генетических форм PD и могут также играть роль при общераспространенных спорадических заболеваниях [2]. Информация, получаемая c помощью генетических подходов, используется для получения новой информации о спорадических PD, поскольку генетические факторы могут вносить вклад в общие биохимические пути, участвующие в патогенезе PD pathogenesis. Поэтому важна способность интегрировать нейродегенеративный процесс в перспективе унификации.

Table 1. Parkinson's disease-related proteins. Gene and protein names are indicated for genetic PD forms, where the gene product has been identified. For gene products, official Uniprot protein names are listed. Proteins are cited in the text using their aliases. PARK locus Gene name Gene product Alias PARK1/PARK4 SNCA Alpha-synuclein ?-synuclein PARK2 PARK2 E3 ubiquitin-protein ligase parkin parkin PARK5 UCHL1 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 (UCH-L1) UCH-L1 PARK6 PINK1 Serine/threonine-protein kinase PINK1 PINK1 PARK7 PARK7 Protein DJ-1 DJ-1 PARK8 LRRK2 Leucine-rich repeat serine/threonine-protein kinase 2 LRRK2 PARK9 ATP13A2 Probable cation-transporting ATPase 13A2 ATP13A2 PARK11 GIGYF2 PERQ amino acid-rich with GYF domain-containing protein 2 GIGYF2 PARK13 HTRA2 Serine protease HTRA2 (HtrA2) HtrA2 PARK14 PLA2G6 85 kDa calcium-independent phospholipase A2 (IPLA2) IPLA2 PARK15 FBXO7 F-box only protein 7 FBXO7 PARK17 VPS35 Vacuolar protein sorting-associated protein 35 (hVPS35) hVPS35 PARK18 EIF4G1 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 1 (EIF-4G1) EIF-4G1 Gaucher's locus GBA Glucosylceramidase GBA

Аутосомно рецессивные паркинсонизмы в основном сцеплены с мутациями генов, кодирующих parkin, PINK1 и DJ-1, и ассоциированы с ранним началом. Носители этих мутаций обнаруживают усиление моторных симптомов PD до 50 лет и доступны для анатомического исследования, часто обнаруживают атипичную PD патологию, при которой могут отсутствовать тельца Леви (LB) [2]. Гомозиготные и компаундные гетерозиготные мутации в гене parkin обусловливают 50% семейных и 20% случаев PD с ранним началом, описано более 100 мутаций. Parkin участвует в мультибелковом E3 ubiquitin ligase комплексе и участвует как в деградации белка посредством ubiquitin-proteasome системы (UPS), так и в аутофагической дерегуляции дисфункциональных деполяризованных митохондрий. PINK1 также участвует в этом процессе и ответственен за рекрутирование parkin на дисфункциональные митохондрии [13]. Мутации в гене, кодирующем PINK1 являются вторыми наиболее распространенными причинами PD с ранним началом, объясняющие 7% случаев, тогда как мутации в гене. кодирующем DJ-1 являются редкими и вызывают рецессивную PD [2]. Множество функций приписывается DJ-1, peroxiredoxin-подобному антиоксидантному энзиму с защитной ролью, в основном ассоциированной с защитой от оксидативных стрессов [9]. Высокий цитопротективный эффект в ответ на умеренный оксидативный стресс недавно наблюдался в C-терминально расщепленной форме DJ-1 [14]. Гомозиготные и компаундные гетерозиготные мутации в гене для ATP13A2, который кодирует лизосомную катион-транспортирующую АТФазу, как было установлено, вызывают редкую атипичную форму рецессивного ювенильного паркинсонизма с деменцией (PARK9), также известной как синдром Kufor-Rakeb [2]. PARK9 ассоциирует с нейродегенерацией и накоплением железа в головном мозге, это указывает на роль ATP13A2 в функции митохондрий. Т.о., белок может участвовать в 'quality control', митохондрий, в котором также участвуют parkin, PINK1 и DJ-1 [15,16].

Аутосомно доминантные формы PD связаны с мутациями трех принципиальных генов: SNCA, кодирующего α-synuclein (PARK1 для точковых мутаций, PARK4 для дупликаций или трипликаций гена), LRRK2 (PARK8) и недавно открытый GBA. Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) является крупной протеин киназы с доменом GTPase, участвующим в путях внутриклеточной передачи сигналов. Мутации в LRRK2 наиболее широко распространенная причина доминантной семейной PD и объясняет 1% от всех спорадических случаев PD [5]; мутации вне энзиматических доменов не обнаруживают сегрегации по Менделевскому типу вместе с болезнью [17]. Мутации GBA, лизосомного энзима, в свою очередь связывают PD с нарушениями лизосомного хранения, как это имеет место в случае лизосомной ATPase ATP13A2. Гомозиготные и компаундные гетерозиготные мутации в гене для GBA сцеплены с болезнью Gaucher's, широко распространенным нарушением лизосомного хранения, в то время как гетерозиготные носители обнаруживают 10-кратное увеличение риска PD. Интересно, что среди евреев Ashkenazi PD пациенты в 20% имеют мутации GBA и в 15% имеют мутации LRRK2 [2].

Molecular mechanisms of PD pathogenesis

Молекулярные механизмы, ведущие к дегенерации нейронов SNpc neurons are известны неполностью; однако, имеются доказательства, указывающие, на нарушения митохондрий, дисфункцию UPS, изменения гомеостаза кальция и оксидативный стресс в качестве основных факторов [5,18]. Временные и механистические взаимоотношения среди этих факторов охарактеризованы недостаточно и всё ещё препятствуют прояснению схемы причина-эффект, ведущий к нейродегенерации при PD. Dopamine спонтанно окисляет, давая различные молекулы, которые могут действовать как эндогенные токсины; при этом nigral dopaminergic нейроны особенно чувствительны к оксидативным стрессам. железо, по-видимому, играет ключевую роль в повышении чувствительности пигментированных, neuromelanin-соедржащих нейронов SNpc; из дофамина происходящий пигмент neuromelanin, в свою очередь,, по-видимому, является критическим регулятором гомеостаза железа [19].

Гомеостаз дофамина может быть нарушен с помощью олигомеров α-synuclein (пред-фибриллярных промежуточных образований), которые ассоциируют с пузырьками и вызывают утечку dopamine [2]. Следовательно, любой процесс, контролирующий концентрацию α-synuclein может в принципе влиять на патогенетическую олигомеризацию белка и вызываемую дофамином токсичность. Сюда входят точковые мутации (PARK1); дупликации, трипликации гена α-synuclein (PARK4); протеосомные и аутофагические/лизосомные нарушения; и нарушения регуляции экспрессии на транскрипционном уровне [20,21]. С этой точки зрения dopamine/α-synuclein взаимодействия является главным игроком в патогенетическом процессе [8] (Fig. 1). Более того, агрегация и образование фибрилл α-synuclein может регулироваться с помощью нескольких посттрансляционных модификаций. Современная литература ассоциирует α-synuclein-dopamine quinone (DAQ) аддукты с образованием протофибрилл; однако, недавно было показано, что нековалентные аддукты обладают преимущественно случайной конформацией скручивания, которая сдвигает равновесие в образовании фибрилл в направлении растворимой, неупакованной формы [22]. Напротив, ковалентное добавление DAQ стабилизирует конформацию β-sheet, которая более склонна к агрегации в протофибриллы. В обоих случаях DAQ аддукты препятствуют белку в переходе от его физиологической конформации и возможно оказывают влияние на его функцию.

Figure 1. Evidence for biochemical mechanisms of neurodegeneration in PD gained from cellular models. The interplay between altered homeostasis of dopamine (DA) and ?-synuclein aggregation into protofibrils is at the basis of the oxidative stress condition. Protofibrils interact with DA storage vesicles and promote its release into the cytosol, where it promptly oxidizes to DAQ. ?-Synuclein variants derived from gene mutations (PARK1) or covalent modifications by DAQ are more prone to aggregate. Increased amounts of ?-synuclein, which might be up-regulated at the genetic (duplication/triplication of the gene, PARK4) or transcriptional level, also favour its aggregation. Proteolytic systems such as UPS and the autophagy system might fail in the control of protein levels, either for genetic reasons (loss of function of lysosomal proteins, i.e. ATP13A2 and GBA) or because they are engulfed by ?-synuclein adducts, possibly modified by the addition of DAQ. The overall result of this process is the increase of ROS together with an insufficient removal of damaged mitochondria through UPS and autophagy. ?-Synuclein aggregation also regulates mitochondrial dynamics in a process that is rescued by the Parkin/PINK1/DJ-1 complex. Because of oxidative stress conditions, damaged mitochondria will accumulate, leading to neuronal death. The same effect is reached when mitophagy is directly impaired without involvement of the ?-synuclein cascade, as is the case for mutations of the genes for parkin, PINK1 or DJ-1, or when mitochondrial functionality is specifically impaired in dopaminergic neurons (e.g. with MPP+). Arrows indicate causal relationships.

Роль фосфорилирования α-synuclein в патогенезе PD и др. synucleinopathies, таких как множественные системные атрофии, активно обсуждается. Фосфорилирование α-synuclein может происходить по разным остаткам тирозина и серина. Большая часть ?-synuclein в LB фосфорилирована по S129, хотя исследования in vitro недавно продемонстрировали, что любое фосфорилирование по S87, Y125, S129, Y133 и Y136 ингибирует образование α-synuclein фибрилл, указывая тем самым, что фосфорилирование не способствует агрегации ?-synuclein. В самом деле, фосфорилирование по S129 с помощью PD-родственной киназы LRRK2 может элиминировать индуцируемую α-synuclein nigrostriatal дегенерацию [23].

Генерация реактивных видов кислорода (ROS) путем изменения гомеостаза dopamine ведет к нарушениям митохондрий, это, в свою очередь, улучшает условия оксидативного стресса. Токсины, такие как 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) и rotenone способны повреждать dopaminergic клетки, поскольку они воспринимаются посредством DAT и блокируют дыхательную цепочку митохондрий с последующей активацией апоптической гибели клеток. Напротив, условия оксидативного стресса, такие как те. что запускаются агрегацией ?-synuclein, являются причиной деполяризации митохондрий (Fig. 1).

Нарушение очистки белков является основным свойством, которое вносит вклад в нейральные потери при PD [21,24]. Идентификация parkin в качестве ubiquitin E3 лигазы, вместе с сообщениями о мутациях энзимов деубиквитилирования ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) в редком случае из единственной PD семьи, подтверждает, что неспособность в UPS может вносить существенный вклад в патогенез PD. В самом деле, нарушенная UPS активность была обнаружена у PD пациентов. α-synuclein, или агрегированный в протофибриллы или ковалентно модифицированный с помощью продуктов dopamine окисления, может поглощать UPS, и тем самым приводить к аномальному накоплению непригодных субстратов. Модифицированный α-synuclein, как было установлено, вмешивается в механизм удаления аутофагированного белка [25]. Взаимодействие dopamine-α-synuclein аддуктов с аутофагосомами сталкивается с удалением поврежденных или неправильно упакованных белков и ведет к их накоплению. Соответственно, специфическое ингибирование очистки от аутофагированных белков ведет к накоплению агрегированных белков, таких как протофибриллы ?-synuclein (Fig. 1). В конечном счете и UPS и очистка от апоптических белков прирожденно менее эффективны в старости, т.о., усиливается патогенетический каскад [21,24].

Дисфункция митохондрий и аутофагия тесно связаны. В самом деле, поврежденные митохондрии удаляются с помощью аутофагии (mitophagy), чтобы снизить активацию апоптоза. Если этот процесс очистки нарушен или на лизосомном уровне (ATP13A2, GBA) или митохондриальном уровне (parkin, PINK1, DJ-1), то происходит ожидаемое усиление оксидативных стрессов.

По-видимому, не существует единственного пути патогенеза. Однако, мы полагаем, что основной путь (т.e. принципиальная ветвь разветвленного пути) может быть идентифицирован, который начинается с агрегации ?-synuclein и ведет к нарушению митохондрий. Этот биохимический каскад может быть активирован на разных стадиях при разных формах PD: в его начале, то проявляется классической патологией болезни или непосредственно в митохондриях, как это происходит при рецессивных паркинсонизмах [2] (Fig. 1). Примечательно, патология ?-synuclein , как недавно было установлено, распространяется на соседние клетки посредством нескольких механизмов трансмиссии от клетки к клетке, это объясняет возможное умножение патогенетического процесса.

Cellular models of PD pathogenetic mechanisms

Важным вопросом для исследований PD является выбор наилучшей модельной системы. Разработан ряд клеточных и животных моделей для выяснения специфических аспектов нейродегенеративного процесса и для лучшей характеристики последовательности патологических механизмов, поскольку они позволяют исследователям выявлять сложны патогенетический каскад в более простые молекулярные события. Некоторые клеточные модели способны воспроизводит биохимические альтерации, как результат мутации в связанных с PD белках, тогда как др. воспроизводят клеточные эффекты с PD связанных токсинов, таких как MPP+, природного гербицида rotenone, 6-hydroxydopamine, DAQ и самого dopamine, в комбинации или нет с генетическими факторами. Исследования клеточных моделей могут быть осуществлены посредством целенаправленных (молекулярных, биохимических или фармакологических) или беспристрастных (протеомных или транскриптомных) подходов [27]. Клеточные линии также природы для предварительного скрининга предполагаемых терапевтических соединений, и в отношении животных моделей, имеют преимущество в обладании генетическим фоном человека. Однако, они представлены упрощенной системой, которая не может полностью воспроизвести сеть dopaminergic нейронов или рекапитулировать полных ход патогенеза PD.

Apoptosis and oxidative stress

Дофаминовая нейрональная гибель в SNpc часто связана с увеличением оксидативного стресса, который сокрушает клеточные защитные механизмы и индуцирует апоптоз. α-synuclein может по-разному вносить вклад в этот патогенетический механизм. В самом деле, экспрессия или дикого типа или мутантного белка в разных линиях клеток демонстрирует, что α-synuclein модулирует dopamine токсичность, которая связана с ROS, продуцируемые с помощью dopamine окисления. Несмотря на это отсутствие ?-synuclein является вредным для жизнеспособности клеток и некоторых защитных функций [28]. α-synuclein участвует в переносе пузырьков в синапсах и обладает шаперно-подобной функцией в формировании SNARE комплексов [29], ингибирует активацию апоптоза посредством олигомеризации с цитохромом c на поверхности митохондрий [30] и осуществляет защитную функцию путем модуляции реакции S-фазного checkpoint на уровне ядра [28]. Многие из токсинов, которые обычно используются для генерации экспериментальных синдромов паркинсонизма увеличивают экспрессию α-synuclein [9]. В этой версии нормальная функция α-synuclein является частично нейропротективной и усиление активности, наблюдаемое при хронических нейродегенеративных болезнях является, по-видимому, компенсаторным механизмом, который приобретают нейроны, чтобы защитить самих себя от хронических оксидативных стрессов [8,28]. Вопрос, является ли взаимодействие между dopamine и α-synuclein благоприятным или нет, широко исследуется с использованием dopaminergic клеточных моделей, в которых скомбинированы генетические и токсические факторы. Результаты часто противоречивы [8,27]. Эти находки подтверждают мнение, что α-synuclein в зависимости от дозы модулирует чувствительность dopaminergic клеток к токсичности dopamine и к индуцированному dopamine апоптозу. Важно понять физиологические функции этого белка, также как уровни α-synuclein и dopamine варьируют в SNpc нейронах, особенно с возрастом. Наблюдаемые расхождения в литературе могут быть результатом избранной клеточной модели. Напр., всё ещё предмет дебатов, debate отражают ли стабильные клеточные линии лучше болезнь в её пролиферативном (опухоль-подобном) или дифференцированном (нейрон-подобном) состоянии (ретиноевая кислота в присутствии или отсутствии 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate обычно используется, чтобы дифференцировать SH-SY5Y клетки) [31]. Экспрессия dopamine рецепторов более высокая в недифференцированных клетках, тем самым ведет к поступлению более значительных количеств возможно токсического дофамина и 6-hydroxydopamine в клетки. Соотв., клетки нейробластомы более чувствительны к оксидативным стрессам и более информативны для этого патогенетического механизма. Напротив, дифференцированные клетки лучше воспроизводят др. специфические аспекты патофизиологии [10,31].

SH-SY5Y клетки были использованы в исследованиях специфически нацеленных на исследования роли различных белков в реакциях на оксидативные стрессы. Отмеченные признаки этих клеток (dopaminergic система, дифференцируемость) привели к созданию нескольких экспериментальных токсических моделей с целью протестировать действие потенциальных ингибиторов апоптоза после оксидативного инсульта. Проверка этих моделей позволила идентифицировать белки и функциональные категории, имеющие отношение к нейропротекции или нейродегенерации [27]. Напр., активация защитного unfolded protein response (UPR) и эндоплазматического ретикулума стрессовых путей помогает выдерживать умеренные оксидативные повреждения [32]. После оксидативного воздействия, DJ-1, как было установлено, транслоцируется в митохондрии и затем в ядро. Воздействие нетоксических уровней dopamine специфически модифицирует паттерн двухмерного электрофореза DJ-1, указывая тем самым на dopamine-зависимую модификацию белка в направлении активации защитных механизмов [9]. Взаимодействие высокой цитозольной нагрузки dopamine и повышенной экспрессии ?-synuclein выявляет биохимические альтерации, которые, как полагают, посредством биоинформационной сети обогащают процесс, это было связано с вовлечением пути NF-κB [8].

Тот факт, что LRRK2 является протеин киназой подтверждает, что PD может быть результатом дефицита механизмов сигнальной трансдукции. Несмотря на это, клеточные модели избыточной экспрессии у LRRK2 мутантов не позволяют однозначно идентифицировать участвующие пути трансдукции [33]. LRRK2 может специфически фосфорилировать α-synuclein по остатку S129. Эта посттрансляционная модификация была исследована на клеточных моделях. Апоптические SH-SY5Y клетки, обработанные rotenone, обнаруживают повышенные уровни фосфорилирования по S129 α-synuclein. Напротив, избыточная экспрессия S129A мутантного α-synuclein (т.e. мутантного не фосфорилированного в этой позиции) снижает активацию стресса эндоплазматического ретикулума и апоптоз [34]. Всё это подчеркивает, что фосфорилирование S129 является патогенетическим фактором. Сходным образом совместная трансфекция LRRK2 и α-synuclein в SH-SY5Y клетках индуцирует повешенную агрегацию и трансмиссию агрегатов α-synuclein в соседние клетки [35]. Однако эти находки противоречат некоторым наблюдениям, подтверждающими роль фосфорилированного по S129 α-synuclein как разновидности, обладающей нейропротективным действием [23].

Получение iPS от носителей мутаций помогает понять вклад различных генов в генерацию оксидативных стрессов и последующий апоптический процесс. Dopamine нейроны, происходящие из LRRK2 мутантных iPS, обнаруживают повышенную экспрессию α-synuclein и ключевых генов, чувствительных к оксидативным стрессам, и более высокую чувствительность к клеточной гибели после воздействия стрессовых агентов [36]. Более того, недавно были получены dopamine нейроны от пациентов с трипликацией α-synuclein, это предоставляет очень эффективный инструмент для изучения механистических событий дегенерации и новых терапевтических агентов[37].

Mitochondrial impairment

Нарушения митохондриальной функции участвуют с самого начала нейродегенерации при PD [1]. В частности, альтерации ферментативного комплекса I цепочки транспорта электронов, по-видимому, имеют специфическое отношение е этой болезни. Митохондриальная динамика может быть затронута несколькими способами, включая деполяризацию как результат митохондриальных токсинов, пертурбации гомеостаза деления-слияния, альтерации поврежденных митохондрий, удаляемых посредством mitophagy и пониженной функциональности как результат наследуемых или соматических мутаций в митохондриальной ДНК [38].

MPP+ и rotenone нейротоксины, используются для продукции моделей PD, оба нарушают функцию митохондрий, ингибируя активность комплекса I. Они вызывают специфическую дегенерацию dopaminergic нейронов, поскольку они активно участвуют посредством DAT. Возникновение митохондриальных повреждений вызывает продукцию ROS и довольно существенные оксидативные стрессы. Это создает связь между двумя основными патогенетическими механизмами PD [2]. Более того, специфические митохондриальные белки были обнаружены ковалентно модифицированными с помощью dopamine и его окисленной формы, DAQ. Такое состояние может запускать митохондриальные повреждения и играет роль в усилении ранимости dopaminergic нейронов [39].

Недавние in vitro исследования выявили роль фрагментации митохондрий в повреждениях нейронов и увязали это со связанными с PD белками: α-synuclein непосредственно нарушает динамику мембран и индуцирует фрагментацию митохондрий, которая устраняется с помощью коэкспрессии PINK1, parkin или DJ-1 [40]. Мнение, что α-synuclein является важным регулятором митохондриальной функции также подтверждается доказательствами, показавшими, что его избыточная экспрессия влияет на уровни экспрессии ассоциированных с митохондриями белков. Недавние исследования связали parkin, PINK1 и DJ-1 с аутофагией митохондрий (mitophagy). Функциональный PINK1, как было установлено, является предварительным условием для транслокации parkin в митохондрии, а комплекс PINK1/parkin, как было установлено, является критическим для собственно mitophagy [13]. Более того, DJ-1 участвует в этом процессе, хотя он действует параллельно пути PINK1/parkin, чтобы поддерживать функцию митохондрий [41]. В целом накопление поврежденных митохондрий, являющееся результатом нарушения mitophagy, может быть фактором, ведущим к аутосомно рецессивной PD [24]. Эксперименты, проведенные на SH-SY5Y клетках выявили, что PINK1 способен осуществлять свою защитную роль путем фосфорилирования Akt, посредством активации мишени из rapamycin complex 2 млекопитающих [42]. Недавнее исследование с использованием iPS клеток, полученных от пациентов с PINK1-сцепленной PD или от генетически нормальных субъектов, подтвердило снижение доставки parkin в митохондрии и возможное нарушение деградации деполяризованных митохондрий [11].

Линии гибридных клеток (cybrids), получаемые в результате слияния клеток, которые лишены mtDNA с тромбоцитарной mtDNA от пациентов [10], представляют ценную новую модель для выявления причин дефицита митохондрий у пациентов и для отслеживания молекулярных каскадов, генерируемых с помощью нейротоксинов. Эти исследования пролили новый свет на генерацию и чувствительность к оксидативным стрессам, а также на морфологи митохондрий. Генерация ROS с помощью митохондрий может быть причиной накопления мутаций в mtDNA, которые будут вызывать дисфункции комплекса I и PD нейродегенерацию [10].

Unfolded protein stress and removal of misfolded proteins

Аутофагия играет фундаментальную роль в удалении поврежденных митохондрий и в качестве механизма для удаления неправильно упакованных, неупакованных и поврежденных белков, в сотрудничестве с др. крупными протеолитическими системами (т.e. the UPS). Подобно др. нейродегенеративным болезням, PD характеризуется присутствием убиквитилированных включений, которые подчеркивают неспособность механизмов по удалению белков, включая (но не ограничивается) UPS [24]. В самом деле, доказательства накопления аутофагических вакуолей при PD могут указывать на дисбаланс аутофагии, или в результате избыточной активации или снижения завершения протеолитического пути. Недавние находки сцепленных мутаций с лизосомных энзимах (т.e. ATP13A2 and GBA) с PD подтвердили это мнение [2].

Связь между неспособностью к очистке от белков и PD исследовали на нескольких клеточных моделях. Присутствие неправильно упакованных белков выявляется как центральное событие в активации механизма защиты, ведущее к апоптозу при некоторых нейродегенеративных болезнях, включая PD. На этой основе активация этого механизма после избыточной экспрессии α-synuclein была исследована на SH-SY5Y клетках и на не-нейрональных HEK-293, которые лишены экспрессии α-synuclein; эти исследования показали, что неправильная упаковка и агрегация α-synuclein может действовать как первый молекулярный сенсор активации протеолитических путей и затем апоптическо клеточной гибели [43]. α-synuclein физиологически деградируется с помощью chaperone-mediated autophagy (CMA) , а дисфункция CMA приводит к агрегации α-synuclein и компенсаторной активации макрофагии. Более того, стабильная экспрессия A53T α-synuclein в PC12 клетках ведет к накоплению аутофагических вакуолей [24]. В конечном счете, α-synuclein, который был ковалентно модифицирован с помощью dopamine quinone видов, взаимодействует с CMA и ведет к накоплению нативного α-synuclein [25]. В последствии, накопление α-synuclein ведет к поглощению белка механизмом очистки, что усиливает UPR.

UPS рассматривается как основной игрок в патогенезе PD по трем причинам: UCHL1 рассматривается как белок, сцепленный с PD, parkin был идентифицирован как ubiquitin E3 лигаза, а пониженная протеосомная активность, описана у людей с PD. В модели PC12, протеосомный ингибитор PSI вызывает клеточный апоптоз и появление цитоплазматических LB-подобных включений, т.о., воспроизводятся две первичные особенности PD. Эти включения были охарактеризованы путем идентификации 56 белков, включая 20 ранее описанные белковые компоненты LB, 28 вновь идентифицированных белков и 8 неизвестных белков [44]. Недавно роль UPS в патогенезе PD получила новое подтверждение как главный фактор в mitophagy. В самом деле, дисфункциональные митохондрии активируют mitophagy посредством протесом: некоторые белки наружной митохондриальной мембраны и убиквитилированный parkin далее деградируют посредством UPS. Эти белки могут служить или в качестве ингибиторов фрагментации митохондрий (напр., mitofusins) или в качестве негативных модуляторов взаимодействия с аутофагосомами (напр., voltage-dependent anion channel, VDAC1) [13]. Поскольку оба процесса важны для активации mitophagy, то вполне возможно, что ингибирование UPS ведет к накоплению белкового груза, который д. быть элиминирован, и одновременно нарушает элиминацию дисфункциональных митохондрий.

Conclusions and perspectives

Cellular models can provide a wide portfolio of opportunities for studying pathogenetic mechanisms in PD and be particularly useful for unravelling the role of PD-related proteins or the mechanism of action of a specific neurotoxin. Cell culture models may be divided into three categories: established cell lines (either differentiated or not), stem cells and patient-derived cell models [10]. Independent of the technical differences among them, they can be regarded as powerful tools for exploring PD pathophysiology, provided that the limitations of such a simplistic approach are taken into account.

Cellular models have contributed to a comprehensive explanation of the PD pathogenetic cascade and delineation of the common functional aspects of the various PD-related proteins. The central role of ?-synuclein in the PD neurodegenerative process has led to the generation of many models aiming to elucidate its contribution to the dysregulation of various cellular processes. A problem in clarifying its role in PD pathogenesis is its physiological function, which still remains unclear. The protein has been localized in many different cellular structures and appears to have different functions. A dysregulation of ?-synuclein concentration, aggregation state and post-translational modifications may produce neural suffering both for the loss of its protective functions and for the gain of new toxic properties. ?-Synuclein is involved in all three main pathogenetic mechanisms underlying PD. Indeed, it is able to modulate dopamine toxicity and influence the cellular oxidative load, to interact directly with mitochondrial membrane and change mitochondrial network dynamics and to affect the UPR. DJ-1 also protects against oxidative toxicity specifically induced by dopamine. Moreover, together with parkin and PINK1, DJ-1 participates in the removal of damaged mitochondria. Parkin acts at the crossroad of the UPS and the mitophagy process. Its activity is necessary for triggering mitochondrial disposal by the elimination of outer membrane proteins via the UPS. Of note, all species that interfere with the cascade of events described above (e.g. mitochondrial toxins, ROS, UPS inhibitors, etc.) can mimic the pathogenetic mechanisms, thus leading to cellular phenotypes similar to those determined by genetic mutations of PD-related proteins.

On the basis of the overall view depicted above, classical cellular models appear to be the correct choice for preliminary studies aiming to investigate the molecular action of new drugs or potential toxins and, at the same time, aiming to understand the role of single genetic factors in the pathogenetic process at the cellular level. Still, it is important to stress the impossibility of reproducing the complexity of the disease in vitro. The availability of new cellular systems, such as cybrids or iPS cells, offers the chance of exploiting the advantages of an in vitro investigation, although more closely mirroring the affected cell population. These systems also represent a new step towards personalized medicine, with the aim of testing each drug in a model with the same genetic background of the patient.

Cellular models to investigate biochemical pathways in Parkinson’s diseaseTiziana Alberio, Leonardo Lopiano, Mauro FasanoFEBS Journal Volume 279, Issue 7, pages 1146–1155, April 2012

Cellular models to investigate biochemical pathways in Parkinson’s disease
Tiziana Alberio, Leonardo Lopiano, Mauro Fasano
FEBS Journal Volume 279, Issue 7, pages 1146–1155, April 2012