Retinitis pigmentosa (RP) хорошо известная наследственная дистрофия сетчатки, ведущая к прогрессивной потере зрения и, в конечном итоге, завершается полной слепотой из-за клеточной гибели фоторецепторов. RP ограничивается глазами, в частности сетчаткой и фоторецепторами. Его частота подсчитана как 1/4000 [1-3]. RP вызывается прогрессивной потерей палочек, сопровождаемой потерей колбочек. Затронутые индивиды начинают с ощущения ночной слепоты в первые две декады жизни. Сужение периферических зрительных полей ведет к 'tunnel vision', прогрессивная потеря visual acuity (VA) ведет к полной потере всех видов зрения [4]. При исследовании дна RP классически характеризуется атрофией сетчатки, optic nerve head pallor, сужением сосудов и разнообразными периферическими пигментными отложениями сетчатки, включая bone spicules. RP может быть ограничен глазом (не синдромальный) или дегенерация сетчатки, неотличимая от RP может быть ассоциирована с синдромом. Синдромальные признаки могут быть очевидными или едва заметными. Также синдромальные признаки могут присутствовать во время постановки диагноза или могут появляться значительно позднее. Примерами являются Bardet-Biedl syndrome (BBS), Usher Syndrome (USH) и Senior-Loken Syndrome (SLS). Характер наследования RP может быть аутосомно доминантным [autosomal dominant retinitis pigmentosa (adRP); 5-25%], аутосомно рецессивным [autosomal recessive retinitis pigmentosa (arRP); 5-20%], редко дигенным, митохондриальным или X-сцепленным [X-linked retinitis pigmentosa (xlRP); 5-15%] [5]. На сегодня известны 36 генов, участвующих в arRP, которые объясняют только ~50% случаев (RetNet), иллюстрируя, что многие мутации и новые гены всё ещё предстоит открыть. RPE65, который экспрессируется в retinal pigment epithelium (RPE), PDE6A and PDE6B, оба являются субъединицами phosphodiesterase в фототрансдукционном каскаде, EYS и USH2A, находятся среди наиболее хорошо известных или широко распространенных этиологических генов [5, 6].

Интересно, что некоторые гены, ассоциированные с RP (у пациентов без системных болезней) могут быть также мутантными при синдромных заболеваниях, таких как BBS1 и USH2 [7, 8] и SLS, которое является аутосомно рецессивным заболеванием, затрагивающим, прежде всего, почки и сетчатку, приводящим к nephronophthisis (NPHP) и RP, соотв. [9]. Особый интерес при RP и этих синдромах вызывает группа генов и белков, которые функционируют в и локализуются в ресничках, т. наз. гены ресничек. В outer segments (OS, которые представляют собой модифицированные реснички) фоторецепторов, сложены диски, дающие приют белкам для зрительной функции, в том числе и некоторым важным для RP продуктам ciliary генов, напр. RPGR, RPGRIP1, USH2A, CEP290, LCA5 и TULP1.

Мы идентифицировали атипичную форму arRP в French-Canadian семье (Fig. 1) и исключили мутации всех известных arRP генов. Мы предположили, что эта семья несет мутацию в новом RP специфическом гене и впоследствие идентифицировали гомозиготные мутации в WDR19. Ко времени открытия (August 2011), не было опубликованных статей, связывающих этот ген с какой-либо болезнью человека и в особенности с arRP. При переоценки этой семьи мы установили, что некоторые RP пациенты имеют субклинические кисты почек, которые позволили нам выдвинуть предположение, что этот ген может быть мутантным у RP пациентов с явной почечной недостаточностью, при нарушении, наз. SLS. Мы затем осуществили анализ мутаций этого гена у группы пациентов с RP в Quebec и у группы с синдромальной формой RP, а именно, SLS и идентифицировали больше RP семей и несколько SLS семей с мутациями. К этому времени Bredrup et al. в их оригинальной статье и Huber et al., в своём обзоре, описали участие WDR19, гена ресничек в разнообразных цилиопатиях, включая Sensenbrenner, Jeune синдром и изолированную NPHP [10, 11]. Сходным образом, Halbritter et al. сообщили о первом случае болезни Caroli, которая является редким наследственным нарушением, для которого больше всего характерно врожденное кистозное расширение внутрипеченочных желчных протоков, вторичное по отношению к эктазии, вызывает WDR19. Однако отсутствовали исследования, подтверждающие вовлечение WDR19 в arRP и в SLS [12].

Figure 1. (a) Family A pedigree. (b) Retinal photo showing an atrophic maculopathy and severe narrowing of the blood vessels and temporal pallor of the optic nerve head. (c) Fundus autofluorescence showing the 'bear claw' maculopathy and hypo-fluorescence in the fovea. (d) Optical coherence tomography of the macula showing extensive loss of the inner segment/outer segment junctions and photoreceptors, with inner retinal changes, retinal thinning and foveal debris. (e) Renal ultrasound showing the renal cyst of the probands of family A.

В процессе идентификации нового гена для RP и SLS, мы также идентифицировали новую генотип-фенотип корреляцию в семьях с arRP. Мы проиллюстрировали, что комбинация Arrayed Primer Extension (APEX) технологии, картирования гомозиготности с помощью генотипирования single nucleotide polymorphism (SNP) и next generation sequencing (NGS), могут быстро и реально привести к открытию нового гена.

Discussion

Реснички и жгутики являются субклеточными 'антена-подобными' органеллами, которые проецируются с клеточной поверхности. Они сильно законсервированы в ходе эволюции, т.к. играют важную роль в подвижности клеток, рецепции сенсорных стимулов и в процессах раннего развития. У человека реснички почти повсеместно присутствуют на многих разных типах клеток. OS фоторецепторов в сетчатке представляют собой модифицированные реснички. Дефекты в их структуре или функции ведут к широкому кругу нарушений развития и болезням, включая RP и SLS [18-21]. Сборка и в дальнейшем поддержание структуры и функции ресничек и жгутиков зависят от процесса IFT, который доставляет белки на место действия (в фоторецепторах это OS). Филогенетически высоко законсервированный IFT представляет собой двунаправленный аппрат, необходимый для развития, поддержания и передачи сигналов ресничек. Антероградное (от основания к кончику) и ретроградное перемещение (от кончика обратно к основанию) нуждается в трех компонентах; моторных белках, IFT частицах и грузах (белках, предназначенных для OS). Для антероградного перемещения используются кинезиновые моторы и IFT-B частицы, тогда как для ретроградного перемещения динеиновые моторы и IFT-A частицы. Ретроградное перемещение обеспечивает не только рециклинг белков, но и также участвует в передаче сигналов sonic hedgehog [22]. Как IFT A и B частицы собираются в основании реснички, как выбирается правильный груз и соединяется с IFT частицами и перемещается к кончику реснички, обменивается и затем высвобождается в основании на др. стороне реснички это область интенсивного исследования и интереса.

WDR19, также известен как DYF-2 (у C. elegans) экспрессируется в сетчатке, в частности, в фоторецепторах, но также во многих др. тканях и кодирует IFT144 белковые частицы. IFT144 является компонентом IFT-A , участвующим в ретроградном перемещении груза в ресничке. IFT-A компоненты (гены), как было установлено, преимущественно мутанты при болезнях скелета. WDR19 кодирует крупный белок в 1342 аминокислоты, 37 экзонов и три разных типа доменов в IFT144 белке. Имеется 6 WD40 доменов, которые являются короткими структурными мотивами из 40 аминокислот, заканчивающихся в tryptophan-aspartic-acid дипептиде (W-D), два трансмембранных домена (TM) и 6 tetratricopeptide (TPR) доменов. Общей функцией всех WD40 содержащих белков является координация сборки мультибелкового комплекса. TPR домены обеспечивают межбелковые взаимодействия и мультибелковые комплексы.

Когда мы начинали это генетическое исследование, WDR19 мутации не были известны в ассоциации с болезнями человека. Во время нашего исследования связь между WDR19 и болезнями человека была установлена Bredrup et al. [10]. Поскольку это критическая функция ресничек и она консервативна у человека и C. elegans [22, 23], мы предположили, что это главный ген кандидат для arRP. Затем мы идентифицировали новые гомозиготные миссенс мутации (p. Leu710Ser) в WDR19 в двух неродственных French-Canadian RP семьях. Это иллюстрирует, что WDR19 является критическим для жизнеспособности или поддержания фоторецепторов и было предположено, что p.Leu710Ser представляет собой мутацию основательницу в Quebec популяции. Наше дальнейшее исследование подтвердило, что WDR19 мутации являются редкой причиной arRP. Поразительным является необычный 'bear track' макулопатии в обеих семьях (Figs 1 and 3), указывающий на новую генотип-фенотипическую корреляцию. Находки субклинических почечных кист у некоторых RP пациентов в одной из семей (Fig. 1) оказались необычными, побудившие нас исследовать более тяжелые цилиопатии. Мы предположили, что более тяжелые мутации WDR19 приведут к более тяжелому системному заболеванию, включая SLS, это подтвердилось, когда мы идентифицировали мутации сдвига рамки считывания в WDR19 у пациентов с SLS.

По нашему это первое исследование, описавшее прямое вовлечение WDR19 в arRP, а также в SLS. Фактически, оба заболевания, как известно, частично базируются на патологии ресничек. При arRP фоторецепторы, которые являются поврежденными структурами, происходят из ciliary предка. SLS является синдромом NPHP, ассоциированным с RP. NPHP характеризуется анемией, полиурией, polydipsia, isosthenuria и кистами в основном на кортико-медуллярной границе почек. Последнее является формой цилиопатии, которая развивается благодаря избыточной потере вакуолей нормальной тканью [24].

Как только мы подтвердили, что мутации WDR19 являются редкой причиной RP и SLS, то мы предположили, что более тяжелые фенотипические проявления у людей также д. быть результатом повсеместно экспрессируемого гена. Во время нашего исследования, Bredrup et al. подтвердили наши подозрения, идентифицировав мутации WDR19 при Sensenbrenner, Jeune синдроме и изолированной NPHP [10]. Удивительно, их группа также идентифицировала мутацию p.Leu710Ser и при некоторых других болезнях цилиопатиях. Они сообщили о компаундных гетерозиготных мутациях при Sensenbrenner синдроме (p.Leu710Ser и p.Arg1103X), комбинирующих Leu710Ser missense мутацию из нашего исследования с nonsense мутацией, которая , скорее всего, ведет к укорочению pre-mature WDR19 белка. Sensenbrenner также известен как краниоэктодермальная дисплазия-1, аутосомно рецессивное нарушение с сагитальным краниосиностозом (ранним закрытием скальпа и орбитального шва), и лицевыми, эктодермальными и скелетными аномалиями. Наиболее выступающим фенотипическим признаком при Sensenbrenner являются необычные костные дефекты с дизморфизмом лица, короткими конечностями, аномалиями зубов, вялостью кожи и грыжами. Пациенты с Sensenbrenner могут иметь нормальную сетчатку и нормальные почки или они могут давать RP или nephronophtisis.

Они также обнаруживают теже самые гомозиготные missense мутации при синдроме Jeune (p.Leu710Ser), редком аутосомно рецессивной потенциально летальной врожденной карликовости, также известном как семейная asphyxiating торакальная дистрофия. В фенотипе снова доминируют скелетные аномалии, а гибель часто обусловлена узкой грудной клеткой и респираторной недостаточностью. Может наблюдаться болезнь почек. Наконец они обнаруживают компаундные гетерозиготные мутации при изолированных NPHP (p. Val345Gly и p. Tyr1023X), снова комбинация missense и nonsense мутации [10].

У 7 пациентов, описанных в этом исследовании, три имели новые мутации в WDR19 (Table 2). В частности, p.Val68Asp возникла в изолированном случае дистрофии сетчатки и NPHP, тогда как p.Ala30Pro и p.Gly109Glu ведут к нескольким фенотипам с вовлечением скелетных и кардиальных аномалий, а также пищеварительных осложнений и нарушением познавательной способности, соотв. Оставшиеся 4 пациента имели мутации, ранее описанные разными группами [10-12]. Помимо своих отличающейся тяжести и синдромальных проявлений, все мутации обладали общей патофизиологической связью с дисфункциональной цилиопатией в специфических системах органов. Что диктует вовлечение специфических систем органов по сравнению с др. может быть связано с самой мутацией, а также присутствием модифицирующих генов/ мутаций.

Большой научный интерес имеет то, что p. Leu710Ser мутации в двух наших arRP семьях оказались теми же самыми, что и идентифицированные Bredrup et al. в семьях с Sensenbrenner и Jeune синдромами [10]. Помимо важного клинического факта, что эта мутация может легко тестироваться в качестве первого генетического теста у пациентов с RP с кистами и у новых детей, с диагнозом более тяжелых и смертельных синдромов Jeune и Sensenbrenner, предполагаются эффекты модификаторов. Это данные по спектру тяжести фенотипов (RP, RP с кистами, изолированные nephronophtisis, SLS, Sensenbrenner и летальный Jeune синдром) связаны с теми же самыми missense мутациями (p. Leu710Ser) строго подтвеждает присутст вие модифицирующих генов/мутаций, дополнительных ciliary мутаций, генетического груза или микросредовых вариаций [25-28]. Напр., изменения в дегенерации сетчатки среди цилиопатий были ассоциированы с мутациями в RPGRIP1L. Сходным образом, мутации в AHI1, как было установлено, вызывают изменчивость ретинальных фенотипов при NPHP16 [25, 29, 30]. Фактически, Hildebrandt et al. подтвердили возможное присутствие гена модификатора у пациентов с NPHP-ассоциированной цилиопатией [22]. Кроме того, в их исследовании на Dync2h1 нокаутных мышах, Ocbina et al. показали присутствие 'rescue route', базирующегося на мутациях в Ift172 и Ift122 [31]. Такие мутации д. служить как модификаторы эффектов генов, кодирующих IFT-ассоциированные белки и тем самым вносить тяжесть в фенотипический спектр. Мутация p. Leu710Ser не найдена в белковом домене WDR19, но Leucine законсервирован на всём пути вниз по эволюционной лестнице до нематоды C. elegans (Fig. 2). Однако его эффекты более тяжелые, т.к. Bredrup et al. нашли, что в культурах фибробластов от пациентов с Sensenbrenner, отсутствовал IFT144 белок в ресничках, указывая тем самым на полную потерю функции IFT144 в результате мутации p. Leu710Ser [10]. Эта missense мутация может, следовательно, действовать как нулевой аллель.

Conclusion

In conclusion, we show that WDR19 mutations are a rare cause of arRP and SLS. Our results suggest that there is a large phenotypic disease and severity spectrum associated with WDR19 mutations. These manifestations range from isolated cases of arRP, arRP with cysts, isolated NPHP to syndromal manifestations seen in SLS and even very severe manifestations such as those in Sensenbrenner syndrome and the lethal Jeune syndrome. In the process of re-evaluating and delineating the WDR19 mutation phenotype in arRP, we discovered a novel genotype–phenotype correlation, a very distinct ‘bear claw maculopathy’ (Figs 1 and 3). It will be interesting to investigate the maculopathies referred to in SLS patients and in those noted in the Bredrup et al. study. It is important to re-evaluate patients after the genotype has been determined, and to search for subtle subclinical phenotypes. Syndromic disease genes may also cause isolated diseases without the systemic manifestations.