Retinitis pigmentosa (RP) гетерогенная группа наследственных дегенеративных нарушений сетчатки, затрагивает примерно 1 из 4000 в США [1]. Пациенты первоначально обнаруживают ночную слепоту и потерю периферического зрения, при этом вовлечение центральной части сетчатки наступает позднее. Клинические исследования выявляют атрофию retinal pigment epithelium (RPE) с bone spicule пигментацией на периферии сетчатки, восковой бледностью зрительного диска и разреженностью сосудов сетчатки. Идентифицированы мутации в более чем 45 генах, которые могут вызывать не синдромальный RP (https://sph.uth.edu/retnet/), включая rhodopsin, вызывают 25% аутосомно доминантных (adRP), USH2A, отвечают за 20% аутосомно рецессивных RP (arRP), и RPGR, отвечают за 70% X-сцепленных RP (XLRP) [2]. Хотя не синдромальный RP, по определению, имеет только глазное фенотипическое отклонение, не все болезнь-вызывающие гены преимущественно или исключительно экспрессируются в сетчатке. Напр., факторы, которые повсеместно экспрессируются и важны для общих процессов сплайсинга пре-мРНК, идентифицированы в качестве причины adRP.

Сплайсинг pre-mRNA эукариот является процессом, с помощью которого мешающие интронные последовательности удаляются, а оставшиеся экзонные сегменты соединяются, чтобы сформировать зрелые молекулы мРНК (Fig. 1a) [3]. Сплайсинг осуществляется на сплайсесомах, комплексах из 5 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) и дополнительных факторов, которые катализируют две реакции transesterification, необходимые для соединения каждого донорского сплайс-сайта, расположенного на 5' конце интрона, с его соотв. акцепторным сплайс-сайтом, расположенным на 3' конце интрона. Узловая точка аденозиновый остаток, расположенный внутри интрона, служит в качестве акцептора протонов (nucleophile) для первой реакции transesterification. U1 snRNP связывает 5' сплайс-сайта, U2 snRNP связывает аденозин узловой точки, и U2AF связывает интронный полипиримидиновый тракт 3' сплайс-сайта. Затем рекрутируются U4/U6/U5 tri-snRNP и происходит серия конформационных изменений, позволяющая соединиться соседним экзонам и удалить интронный lariat.

Figure 1. (a) Eukaryotic pre-mRNA splicing (b) Mechanisms of alternative splicing.

Приблизительно 80% экзонов человека менее 200 оснований в длину [4] и они разделены интронами, которые могут быть длиной во многие тысячи оснований, но несмотря на их сложность, сплайсинг пре-мРНК происходит с высокой точностью. Выбор места сплайсинга и распознавание обеспечиваются за счет строгой последовательности сплайс-сайта, присутствия цис-действующих регуляторных элементов и доступности транс-действующих факторов сплайсинга [5]. Согласно определению экзон позволяет сплайс-сайтам фланкировать каждый экзон, чтобы он мог быть распознан при спаривании посредством взаимодействий, соединяющих экзоны с snRNPs и др. сплайс-факторами. Не подвергающийся сплайсингу сайт последовательности РНК может также усиливать или ослаблять активность сплайсесом. Serine-argine (SR) белки являются энхансерами сплайсинга экзонов, которые связывают богатые пуринами экзонные последовательности splicing энхансерного элемента, чтобы способствовать как конституитивной, так и регулируемой сплайсинг активности за счет усиления использования слабых вышестоящих 3' сплайс-сайтов, стабилизируя связанные с интроном взаимодействия и способствуя связанным с экзонами взаимодействиям путем соединения с U2AF и U1 [6]. Ряд др. факторов идентифицирован в качестве энхансеров или репрессорных регуляторов сплайсинга, а комбинированное связывание этих разных сплайс-факторов, чьи уровни экспрессии также регулируются, ведет к высокой точности пространственно-временного определения границ exon/intron [7, 8]. Альтернативный сплайсинг может возникать в результате использования альтернативных 5' сплайс-сайтов, использования альтернативных 3' сплайс-сайтов, пропуска экзонов или сохранения интрона и 'b механизмы позволяют одиночному гену кодировать множественные белковые продукты, которые имеют очень отличающиеся функциональные свойства (Fig. 1b). Подсчитано, что, по крайней мере, 74% генов человека подвергаются альтернативному сплайсингу [9] и из них, по крайней мере, 10-30% имеют тканеспецифичные сплайс-изоформы [10]. Альтернативный сплайсинг сильно регулируется в тканеспецифичных и онтогенез-специфичных паттернах, а нейроны имеют особенно высокие количества по-разному сплайсируемых генов [11]. Подсчитано, что 15% точковых мутаций, вызывающих болезни, влияют на сплайсинг пре-мРНК [12].

Cis-acting splice site mutations

Мириады мутаций сайтов сплайсинга идентифицированы у пациентов с RP, Usher синдромом, дистрофией колбочек и палочек и др. дегенеративных заболеваниях (Table 1), и разработаны испытания, чтобы охарактеризовать функциональные эффекты некоторых из этих мутаций сайтов сплайсинга in vitro. Большинство мутаций нарушает согласованность последовательностей сата сплайсинга и вызывает пропуски экзонов, но некоторые приводят к включению интронов или использованию скрытых вышестоящих и нижестоящих сайтов сплайсинга. Возникающие в результате инсерции или делеции в последовательностях белков, часто сопровождаются сдвигом рамки считывания и преждевременным окончанием, разрушением консервативных или функциональных белковых доменов и ведут к дегенерации сетчатки. Детальное обсуждение этих цис-действующих мутаций сайтов сплайсинга приводится в Appendix S1. Существует также ряд моделей у грызунов дегенерации сетчатки, которые возникают в результате дефектов цис-действующего слайсинга или крупных делеций делеций в геномной ДНК, которые ведут к пропуску экзонов, включая rd16 мышей, у которых экзоны 35-39 в Cep290 пропускаются [13]; крысы RCS, у которых экзон 2 в Mertk пропускается [14]; rd6 мыши, у которых экзон 4 в Mfrp пропускается [15]; и rd7 мыши, у которых экзоны 4-5 в Nr2e3 пропущены [16].

Table 1. Splice site mutations associated with retinal degenerationa
Retinitis pigmentosa 
 

Gene        Mutation        Effect  
 


Rhodopsin        IVS4+2 G>T        Skipping of exon 4 due to disruption of donor splice site
         IVS4-1 G>A        Deletion of exon 5 and 143 bases of 3' untranslated region
         IVS4-1 G>T
         30 bp deletion including acceptor splice site of intron 4 and first 7 bases of exon 5, 150 bp insertion
Я-PDE        IVS2-1 G>T        Multiple alternatively spliced transcripts: intron 2 inclusion, alternative 3' splice site in intron 3
         IVS3+1 G>T
TULP1        IVS2+1 G>A
         IVS14+1 A>G
BBS8        IVS1-2 A>G        Skipping of photoreceptor-specific alternatively spliced exon 2a
EYS        IVS4+6 A>T
         IVS12+1 G>C
MERTK        IVS16+1 G>T        Skipping of exon 16, frameshift, premature termination in exon 17
RBP4        IVS2+1 G>A
ABCR        IVS30+1 G>T
         IVS40+5 G>A
OFD1        IVS9+706 A>G        Insertion of cryptic exon between exons 9 and 10, frameshift
Usher syndrome
USH1C        IVS5-2 delA
         IVS1+1 G>T
         IVS5+1 G>A
         IVS14+6 T>G        Skipping of exon 14; 31 base deletion from exon 14
CDH23        IVS29-1 G>T        Skipping of exon 30; 51 base deletion from exon 30
         c.4488 G>C        Alternative 5' splice site within intron 35, 80 amino acid insertion, premature termination
         IVS45-9 G>A        Insertion of 7 bases of intron 45
         IVS51+5 G>A        Skipping of exon 51
         c.7872 G>A        Insertion of 86 bases of intron 54
USH2A        IVS2-14 G>A        Insertion of 12 bases of intron 2
         c.949 C>A        193 base deletion of exon 6
         IVS10-2 A>G        Skipping of exon 11
         IVS12+5 G>A        Skipping of exon 12; alternative 5' splice site within exon 12, 30 base pair deletion
         IVS12-1 G>C        7 base deletion of exon 13
         c.2993G>A        Arg998Lys; skipping of exon 14
         IVS17+3 A>T        Skipping of exon 17
         c.4576-4579dupGGGT        50 base deletion of exon 21
         IVS25-6 T>A        Skipping of exon 26
         IVS26+1 G>C        Skipping of exon 26
         IVS40-8 C>G        7 base insertion of intron 40
         IVS40-3 C>G        2 base insertion of intron 40
         IVS43-17 A>G        39 base deletion of exon 44
         IVS53+3 A>G        82 base deletion from exon 53
         IVS66+39 C>T        Alternative 5' splice site within intron 66, 37 base insertion
MYO7A        c.592 G>A        Ala198Thr; skipping of exon 6
         IVS13-8 C>G        7 base insertion of intron 13; skipping of exon 14
         c.1935 G>A        Met645Ile; skipping of exon 16
         IVS19-1 G>T        Skipping of exon 20
         IVS22-9 A>G        8 base insertion of intron 22
         c.3503 G>C        Arg1168Pro; skipping of exon 27
         c.5856 G>A        Skipping of exon 42
         c.5944 G>A        Gly1982Arg; skipping of exon 43
Cone rod dystrophy and additional retinal degenerative diseases
RLBP1        c.342 G>A
         IVS3+2 T>C
ABCA4        IVS2+2 T>C
         IVS8-6 T>A
         IVS9-2 A>G
         IVS15+1 G>A
         IVS19-2 A>G
         IVS23+5 delG
         IVS23-1 G>A
         IVS25-2 A>G
         IVS29+1 G>A
         IVS29-15del23        Skipping of exons 28 and 29; skipping of exon 29; skipping of exon 29 and first 114 bases of exon 30
         IVS31-1 G>T
         IVS37+1 G>A
         IVS41-2 A>C
         IVS46-1 G>T
         IVS47+1 G>A
         IVS47+1 G>C
CDHR1        IVS13+2 T>G
C8orf38        IVS1-2 A>G
CACNA1F        IVS24+1 G>A        Premature stop in intron 24
         IVS28-1 GCGTC>TGG        Multiple aberrantly spliced products
         IVS40-2 A>G        Skipping of exon 41, premature stop in exon 42
CEP290        IVS26+1655 A>G        Insertion of cryptic exon between exons 26 and 27
         c.451 C>T        Skipping of exon 7; skipping of exon 7 and 8
MERTK        IVS1+1 G>A  
 

IVSX+n, nth base of intron X; IVS-n, nth base from the end of intron X; IVS, intervening sequence; c.n, nth base of CDS.
a
Refer to Appendix S1 for supplementary references for the respective diseases.

Alternative splice isoforms

Stickler syndrome type I, аутосомно доминантное заболевание, вызываемое мутацией в COL2A1, характеризуется возникновением радиальных околососудистых дегенераций сетчатки, врожденным syneresis стекловидного тела, высокой миопией, катарактой с ранним началом, глаукомой, юношеским остеоартритом, нейросенсорной глухотой и черепно-лицевыми аномалиями. В стекловидном теле COL2A1 включает экзон 2, тогда как экзон 2 отсутствует в большинстве др. тканей, включая и хрящи [17]. В большой семье из США с Stickler syndrome type I, причинной мутацией явилась последовательность Cys86X, преждевременный стоп-кодон в экзоне 2, подвергающемуся альтернативному сплайсингу [18]. Интересно, что этот мутантный транскрипт экспрессируется специфически в глазу, только 4 из 100 человек в этой семье обнаружили какие-либо проявления вне глаз, характерные для синдрома Stickler. Мутации сдвига рамки считывания в экзоне 2, приводящая к преждевременному окончанию, Cys57X, была также идентифицирована в French-Canadian семье со сходной аутосомно доминантной дегенерацией стекловидного тела и сетчатки [19].

Retinitis pigmentosa GTPase regulator (RPGR) располагается на соединяющей ресничке фоторецепторов и играет роль в организации микротрубочек и клеточного транспорта [20]. RPGR подвергается значительному альтернативному сплайсингу и имеет два основных транскрипта, широко экспрессируемая форма RPGRexon1-19 и специфичная для сетчатки форма RPGRORF15. Идентифицированы мутации RPGR в качестве причины 72% XLRP и 80% из этих мутаций появляется в богатом пуринами ORF15 [21]. Многие XLRP мутации, включая мутации сайта сплайсинга [22-25], были идентифицированы по всему RPGRORF15 транскрипту, подтверждая, что каждый из имеющихся экзонов необходим для функции сетчатки, но что интересно, ни одна мутация не была идентифицирована в экзонах 16-19 [26]. Соотношение варианта RPGRexon1-19 к RPGRORF15 важно для целостности сетчатки взрослых у мышей, а избыточная экспрессия RPGRexon1-19 ведет к тяжелой дегенерации сетчатки [27]. Было показано, что определенные укороченные формы RPGR могут иметь эффекты избыточности функции [28]. Др. альтернативно сплайсируемый экзон, exon 9a, был идентифицирован 418 пар оснований ниже 5' сайта сплайсинга интрона 9 и имеет длину в 136 оснований. Этот экзон присутствует приблизительно в 4% ретинальных транскриптов и обогащен в во внутренних сегментах колбочек. Интронная замена G на A между экзоном 9 и экзоном 9a идентифицирована в семье с XLRP она увеличивает процент транскриптов, содержащих экзон 9a [29]. Мутации тканеспецифических экзонов и мутации, которые влияют на превалирование тканеспецифичных транскриптов, позволяют мутациям в повсеместно экспрессируемых генах вызывать прежде всего глазные болезни [30] (Table 2).

Table 2. Alternative splice isoforms associated with retinal degeneration 
 

Gene        Mutation        Effect        References
IVSX+n, nth base of intron X; IVS-n, nth base from the end of intron X; c.n, nth base of CDS.
COL2A1        Cys86X        Premature termination in alternatively spliced exon        [18]
Cys57X        Premature termination in alternatively spliced exon        [19]
RPGR        ORF15, various        Various        [21-25]
IVS9+363 G>A        Increased inclusion of exon 9a        [29]

Splicing factor mutations

PRPF31 кодирует гомолог дрожжевого pre-mRNA сплайсинг фактора Prp31p, а мутации в этом гене были идентифицированы как причина adRP [31]. У S. cerevisiae, Prp31p не обязателен для образования U4/U6/U5 tri-snRNP, а вместо этого отвечает за рекрутирование tri-SNP на сплайсесомы. PRPF31у людей необходим для образования tri-SNP и активности сплайсесом [32]. 7 мутаций PRPF31 было идентифицировано в Британской семье с adRP, включая две интронные мутации, которые нарушают 5' и 3' сайты сплайсинга в интроне 6, Ala216Pro и Ala194Glu мутации в экзоне 7, две мутации сдвига рамки считывания ведут к преждевременному окончанию трансляции, и in-frame инсерция 11 аминокислот [33]. Делеция в 12 пар оснований в экзоне 5, вызывающая делецию in-frame в His111Lys112Phe113Ile114, которая включает высоко консервативный остаток His111, была идентифицирована в Китайской семье с adRP [34]. Замена G в A в последнем основании интрона 5 разрушает 3' сайт сплайсинга, вызывает делецию одного основания в первом кодоне экзона 6, сдвиг рамки и преждевременное окончание обнаружены в др. крупной Китайской семье с adRP [35]. Три нонсенс мутации в экзоне 8 были также идентифицированы в Испанской семье с adRP [36]. В группе Французских пациентов с adRP было установлено, что 6.7% имеют мутации в PRPF31 [37].

Исследования по оценке эффектов мутаций PRPF31 на сплайсинг pre-mRNA выявили целый ряд результатов. AD5 и SP117 мутанты PRPF31, которые имели делецию в 11 пар оснований после аминокислоты 371 и инсерцию одиночной пары оснований после аминокислоты 256, соотв., были совместно экспрессируемы с минигенной конструкцией RDS и FSCN2. Оба мутанта обнаруживали нарушение сплайсинга RDS интрона 1, но только AD5 мутант обнаруживал нарушение сплайсинга FSCN2 интрона 3 [38]. Мутанты PRPF31 , содержащие N-терминальной 371 или 256 аминокислоту, обнаруживали снижение сплайсинга интрона 3 rhodopsin, а в первичных клеточных культурах сетчатки это вело к снижению экспрессии белка rhodopsin и к апоптозу [39]. Напротив, PRPF31 Ala194Glu и Ala216Pro мутанты обнаруживали только легкие эффекты на сплайсинг in vitro [40]. Тем не менее, было высказано предположение, что более значительные дефициты могут проявляться при более высоких запросах в активности сплайсинга.

Мутации в PRPF8 также причастны к тяжелым с ранним началом adRP [41]. PRPF8 является компонентом U5 snRNP и может взаимодействовать с 5' сайтом сплайсинга, точкой ветвления adenosine и с 3' сайтом сплайсинга в pre-mRNA, подтверждая, что это может быть кофактор в каталитическом домене сплайсесом [42]. Идентифицировано 7 missense мутаций (His2309Pro, His2309Arg, Arg2310Lys, Pro2301Thr, Phe2304Leu, Arg2310Gly, and Phe2314Leu) в Южно-Африканской семье [41]. 3 мутации сдвига рамки считывания, мутация, разрушающая стоп-кодон, и Arg2310Gly missense мутация описана в Испанской семье [36]. Интересно, что все эти мутации расположены в PRPF8 в экзоне 42.

Несколько мутаций, вызывающих adRP было также идентифицировано в PRPF3, который кодирует U4/U6 ассоциированный с сплайсингом фактор, необходимый для сборки сплайсесом и стабильности U4/U6/U5 tri-snRNP [43, 44]. Идентифицированы 3 missense мутации: Ala489Asp [45], Pro493Ser и Thr494Met [43]. В то время как дикого типа PRPF3 не сильно обогащен в фоторецепторах, T494M мутантный PRPF3, как было установлено, формирует крупные агрегаты неправильно локализованных белков в фоторецепторах in vitro, это вызывает апоптоз, феномен, не обнаруживаемый эпителиальных или фибробластных линиях клеток, вообще-то обусловленный неспособностью к рециклингу фактора сплайсинга PRPF3 [44]. Все эти мутации образуют кластер в консервативном С-терминальном регионе, фланкированном сайтами связывания др. факторов сплайсинга, включая PAP-1 [46].

Две миссенс мутации, вызывающие adRP, His137Leu и Asp170Gly, также были описаны в PAP-1, в др. компоненте U4/U6/U5 tri-snRNP [47]. PRPF6 является дополнительным фактором сплайсинга, который взаимодействует с компонентами U4/U6/U5 snRNP, а мутация Arg729Trp была идентифицирована у пациента с adRP [48]. Иммортализованные лимфобласты от этого пациента обнаруживали внутриядерные агрегаты PRPF6, указывая. что мутация ведет к дефекту сборки или рециклинга tri-snRNP, а in vitro методы сплайсинга обнаруживают нарушение активности сплайсинга. Мутации Ser1087Leu [49] и Arg1090Leu [50] в SNRNP2000 также были идентифицированы в Китайских семьях с adRP, они нарушают способность SNRNP200 разматывать U4/U6 snRNAs (Table 3).

Table 3. Splicing factor mutations associated with retinal degeneration 




PRPF31        c.269-273 del        Frameshift, premature termination        [37]
c.331-342 del        Deletion of His111Lys112Phe113Ile114        [34]
IVS5-1 G>A        1 base deletion of exon 6, frameshift, premature termination        [35]
IVS6+2 T>C                 [37]
IVS6+3 A>G        Inactivate 5' splice site        [33]
IVS6-3 to IVS5-45 del        Inactivate 3' splice site        [33]
c.580-581 dup 33 bases        Frameshift, in-frame 11 amino acid insertion        [33]
c.581 C>A        Ala194Glu        [33]
c.666 dup        Frameshift, premature termination        [37]
c.646 G>C        Ala216Pro        [33]
c.709-734 dup        Frameshift, premature termination        [37]
c.732-737 delins 20 bases        Frameshift, premature termination        [36]
c.769-770 ins A (SP117)        Frameshift, premature termination; impaired splicing of RDS intron 1; impaired splicing of rhodopsin intron 3        [33, 36, 38, 39]
c.828-829 delCA        Frameshift, premature termination        [36]
c.873-897 dup        Frameshift, premature termination        [37]
c.997 delG        Frameshift, premature termination        [37]
c.1115-1125 del (AD5)        Frameshift, premature termination; impaired splicing of RDS intron 1 and FSCN2 intron 3; impaired splicing of rhodopsin intron 3        [33, 38, 39]
PRPF8        c.6901 C>A        Pro2301Thr        [41]
c.6912 C>G        Phe2304Leu        [41]
c.6926 A>C        His2309Pro        [41]
c.6926 A>G        His2309Arg        [41]
c.6928 A>G        Arg2310Gly        [36, 41]
c.6929 G>A        Arg2310Lys        [41]
c.6942 C>A        Phe2314Leu        [41]
c.6943-6944 delC        Frameshift, premature termination        [36]
c.6974-6994 del21        Frameshift, premature termination        [36]
c.6893-6896 delins7        Frameshift, premature termination        [36]
c.7006 T>C        Disruption of stop codon, protein extension        [36]
PRPF3        c.1466 C>A        Ala489Asp        [45]
c.1477 C>T        Pro493Ser        [43]
c.1481 C>T        Thr494Met        [43, 44]
PAP1        c.410 A>T        His137Leu        [47]
c.509 A>G        Asp170Gly        [47]
PRPF6        c.2185 C>T        Arg729Trp; defect in tri-snRNP assembly or recycling        [48]
SNRNP2000        c.3260 C>T        Ser1087Leu        [49]
c.3269 G>T        Arg1090Leu        [50] 


IVSX+n, nth base of intron X; IVS-n, nth base from the end of intron X;
 c.n, nth base of CDS.

Существует ряд моделей для объяснения, как мутации в повсеместно экспрессируемых факторах сплайсинга, все ассоциированные с U4/U6/U5 snRNP, могут приводить к специфичным для сетчатки аутосомно доминантным болезням, включая гаплонедостаточность, нарушение сборки сплайсесом, нарушение взаимодействия со специфичным для фоторецепторов кофактором сплайсинга или токсичность в результате избыточности функции [51]. Prpf3-Thr494Met, Prpf8-His2309Pro и Prpf31-нокаутные мышиные модели фактора сплайсинга adRP, все они демонстрируют некоторые аспекты дегенерации сетчатки с относительно поздним началом [52]. В мышиных моделях первыми затронутыми клетками, по-видимому, являются RPE, но неясно имеет ли это место и у человека. Одно исследование показало, что мутации фактора сплайсинга, вызывающие adRP, нарушают относительное соотношение snRNAs, состав U4/U6/U5 snRNPs и сборку сплайсесом и, следовательно, д. иметь системный эффект на сплайсинг pre-mRNA, к которому по непонятным причинам толерантны др. ткани, но не сетчатка [53]. Уровни экспрессии PRPF3, PRPF31, PRPC8 и 5 snRNPs выше в сетчатке, чем в др. тканях у нормальных взрослых мышей, указывая тем самым, что сетчатка является одной из наиболее метаболических активных тканей тела и может иметь более высокую базовую потребность в сплайсинге, чем др. ткани [54]. Мутации факторов сплайсинга могут проявляться в сетчатке уникально как adRP из-за дефицита сплайсинга pre-mRNA, которая появляется только в случае высокой потребности.

Small molecules to modulate pre-mRNA splicing

Аберрантный сплайсинг pre-mRNA вносит существенный вклад в болезни человека и в разработки новых терапевтических стратегий по модуляции сплайсинга pre-mRNA. Разработана доставка с помощью лентивирусов U1snRNA, чтобы связывать мутантные донорские сайты сплайсинга, обнаружила слабую эффективность при восстановлению сплайсинга BBS1 [55] и RPGR [24] в фибробластах, полученных от пациентов с синдромом Bardet-Biedl и XLRP, соотв. Стратегии siRNA были исследованы, чтобы целенаправленно воздействовать на варианты сплайс-изоформ полученных от мутаций сайта сплайсинга, ассоциированных с adRP, в rhodopsin [56]. Антисмысловые олигонуклеотиды и родственные подходы были также разработаны, чтобы модулировать сплайсинг при мышечной дистрофии Duchenne, spinal muscular atrophy (SMA), синдроме Hutchinson-Gilford progeria и миотонической дистрофии [57, 58].

Некоторый определенный успех был достигнут при использовании малых молекул, чтобы модулировать сплайсинг. SMA, аутосомно рецессивное заболевание, характеризующееся спускающейся дегенерацией двигательных нейронов, приводящей к прогрессирующей проксимальной мышечной атрофии и слабости, вызывается мутациями потери функции в SMN1. SMN2 кодирует почти идентичный белок, но его мРНК обычно пропускает экзон 7 и это ведет к продукции укороченного белка, который не может компенсировать пониженные уровни функционального SMN1 [59]. При скрининге малых молекул Epstein-Barr virus-трансформированных лимфоидных клеток, полученных от пациентов с SMA, sodium butyrate был идентифицирован как модулятор сплайсинга SMN2, это повышало включение экзона 7 и продукцию транскриптов полной длины и белка SMN2 [60]. В том же исследовании воздействие sodium butyrate на мышиную модель SMA улучшило тонус мышц хвоста и пролонгировало выживание. Anthracycline aclarubicin [61] и tetracycline-подобное соединение PTK-SMA1 [62] также обнаруживало увеличение включения экзона 7. Происходящие из бактерий pladienolides [63], FR901464 и herboxidiene являются ингибиторами компонента сплайсесом SF3b и предупреждают связывание U2 snRNA с точкой ветвления adenosine, приводя к аберрантному сплайсингу и апоптозу в раковых клетках [64]. Производные, такие как sudemycins также демонстрируют противоопухолевую активность в линиях опухолевых клеток человека и xenograft моделях [65].

Tau является белком, ассоциированным с микротрубочками, который подвергается альтернативному сплайсингу у человека, а мутации, которые способствуют включению экзона 10 ассоциированы с лобно-височной деменцией и паркинсонизмом. Cdc2-like kinases 1-4 (CLK 1-4) фосфорилирует SR белки и способствует пропуску экзона 10 а tau, подтверждая, что пригодно использование малых молекул для модулирования фосфорилирования SR белков или киназ и фосфатаз, которые регулируют их, в терапевтических стратегиях, чтобы целенаправленно воздействовать на аберрантный сплайсинг pre-mRNA [66, 67]. Соединение benzothiazole, наз. TG003 является ингибитором семейства CLK и блокирует активность SR белка SF2/ASF [68]. Ингибирование CLK1 с помощью TG003 снижает репликацию вируса гриппа за счет ингибирования сплайсинга вирусной M2 pre-mRNA [69]. TG003 также может способствовать пропуску экзона 31 гена dystrophin в миобластах, происходящих от пациентов с преждевременными стоп-кодонами в этом экзоне [70]. Vascular endothelial growth factor (VEGF) обладает про-ангиогенной формой, VEGF165, и противо-ангиогенной формой, VEGF165b, которые продуцируются как изоформы альтернативного сплайсинга. SRPIN340, ингибитор SR протеин киназы SRPK1/2, способствует анти-ангиогенной форме и м. ингибировать ангиогенез у модельных мышей для изучения неоваскуляризации сетчатки [71]. Наконец, скрининг малых молекул в качестве модуляторов сплайсинга в линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека показал, что уменьшающий в моче калий amiloride способен обращать онкогенный сплайсинг BCL-X, HIPK3 и RON/MISTR1 [72].

Concluding remarks

It is clear that abnormalities of alternative splicing can play an important role in the development of RP and other retinal degenerative diseases. The advent of next-generation sequencing technologies and massively parallel high-throughput RNA sequencing (RNA-seq) opens unprecedented opportunities to study tissue-specific alternative splicing, characterize disease-relevant cis-acting splice variants, and assess the impact of trans-acting splicing factor mutations across the transcriptome. A more thorough understanding of the contribution of aberrant splicing to retinal degeneration is crucial to the development of novel therapeutic strategies. Small molecule and other modulators of alternative splicing have shown promise in the context of a variety of human diseases, and provide hope that it will be possible to develop analogous approaches for the treatment of retinal degenerations and other forms of ophthalmic disease that are due to abnormalities of RNA splicing.

Alternative splicing and retinal degeneration M M Liu, D J Zack Clinical Genetics Volume 84, Issue 2, pages 142–149, August 2013

Alternative splicing and retinal degeneration
M M Liu, D J Zack
Clinical Genetics Volume 84, Issue 2, pages 142–149, August 2013