Table 1. Clinical Findings of the Studied Family



Figure 1. Clinical, structural and functional effects of the SIX6 p.L37P mutation. (a) Iris coloboma (arrow) in the left eye of individual IV-4 (upper left image); colobomatous optic disc anomaly (excavated disc), straight retinal vessels arising from the periphery of the optic disc, mild peri-papillary chorioretinal atrophy, and irregularly bordered, oval-shaped, pigmented macular atrophy in both eyes and chorioretinal coloboma in the inferior region of the left eye of individual IV-4 (upper middle and right images); in an axial T2-weighted MR image, coloboma shown as a focal, posterior outpouching defect of the vitreous centered at the optic nerve head (arrow) in individual IV-4 (lower left image); excavated optic disc together with peripheral, raised retinal vessels and pigmentary chorioretinal (arrow) changes surrounding the optic disc in both eyes of individual IV-7; oval-shaped, sharp-bordered and pigmentary macular atrophy in the right eye of individual IV-7 (lower middle and right images). (b) Pedigree and haplotypes that co-segregate with the phenotype. +/+, wildtype; +/-, heterozygous; -/-, homozygous for p.L37P. (c) Sanger sequencing shows c.110T>C (p.L37P) mutation in SIX6. (d) The TA and DB domains of SIX6 are respectively colored green and blue. The sidechain moieties of L37/P37 residues and their putative counterpart V14 located within the α-hairpin are colored red. The expanded windows reveal a close-up view of the potential effect of p.L37P mutation on the structure of the TA domain. (e) p.L37P mutation does not affect SIX6 nuclear localization. Mouse E14 RPCs were transduced with GFP, SIX6-GFP or SIX6L37P-GFP fusion proteins, as labeled, and counterstained with DAPI to mark nuclei (example nuclear outlines in dotted white lines). In GFP-transfected cells, the GFP is localized throughout the nuclei, cytoplasm and even into cytoplasmic cellular extensions (arrows). GFP was nuclear localized after both SIX6-GFP or SIX6L37P-GFP fusion protein expression. F) SIX6L37P overexpression reduces the number of differentiated RGCs (Brn3+,Edu+) compared with SIX6WT overexpression. Asterisk indicates p

Генотипирование 8 членов семейства с помощью Affymetrix 5.0 SNP-chips выявило autozygous регион на chr14: 59247009-75949378 (Hg19) (Fig.1b). Два гена в этом интервале, CHX10 (MIM142993) и SIX6 (MIM606326), ранее были описаны как причина микрофталмии или анофталмии у человека [1]. Sanger секвениование обоих генов показало, что все три затронутых индивида были гомозиготны по новому варианту, c.110T>C (p.L37P) (NM_007374.2, NP_031400.2), в SIX6 (Fig. 1c). Этот вариант наследуется вместе с фенотипом во всем семействе в качестве рецессивного признака и отсутсвует среди 342 контрольных индивидов той же национальности. Он также отсутствует в Exome Variant Server и dbSNP137. Лейцин в позиции 37 полностью законсервирован у разных видов (Fig. S1, Supporting Information). Ни один из локусов, содержащих ген, известный как причина рецессивной макулярной болезни, включая PRPH2 (MIM179605), ABCA4 (MIM601691) и CNGB3(MIM605080) не сегрегировал совместно с фенотипом. Два др. аутозиготных региона более 1 MB не содержат генов, известных как причина болезни глаз (Table S1, Supporting Information).

Мы построили и сравнили структурные модели SIX6WT и SIX6L37P, используя кристаллическую структуру SIX1 в качестве матрицы (PDBID: 4EGC). SIX6 принадлежит к семейству SIX транскрипционных факторов с TA-DB модулярной архитектурой, где TA является N-терминальным трансактивационным доменом, а DB является C-терминальным ДНК-связывающим гомеодоменом [2]. Трансактивация белков семейства SIX зависит от их TA домена, связвающего др. ядерные белки, такие как EYA2 и DACH2 [3]. Наши модели подтверждают, что мутация p.L37P располагается внутри N-терминальной α-шпильки, представленной первыми двумя α-спиралями TA домена в SIX6 (Fig. 1d). У SIX6^WT, эта α-шпилька поддерживается с помощью van der Waals контакта между V14 и L37 на её открытом конце. Внесение мутации p.L37P д. привести к разворачиванию N-terminal α-спирали внутри этой α-шпильки приблизительно на один виток из-за неспособности пролина участвовать в образовании водородных связей внутримолекулярной основы (Fig. 1d). Всё это вместе с ограничением конформационной гибкости пролина д. приводить к потере внутримолекулярного van der Waals контакта с V14, нарушая тем самым целостность α-шпильки , которая потенциально д. управлять сборкой ансамбля SIX6 с его лигандами.

Далее мы исследовали потенциальные молекулярные и клеточные механизмы, с помощью которых мутация p.L37P может индуцировать фенотипические отклонения глаз, используя в качкстве модели клетки ретинальных предшественников (RPCs) мышей в возрасте 14 дней эмбриогенеза (E14). Мы задались вопросом, действительно ли мутация p.L37P нарушает локализацию в ядре за счет экспрессии SIX6WT и SIX6L37P, слитых с GFP меткой. И нормальный и мутантный SIX6 локализовались в ядре (Fig. 1e), подтверждая, что мутация не нарушает расположение белка. Сравнимые уровни экспрессии GFP-слитого белка и трансдуцированные клетки при болезненных состояниях подтверждают, что мутация SIX6L37P несущественно дестабилизирует белок и не приводит к существенной клеточной токсичности.

Далее мы предположили, что мутация может влиять на дифференцировку клеток ретинальных ганглиев (RGC) во время раннего развития. Мышиные E14 RPCs культивировали и трансдуцировали GFP, SIX6WT и SIX6L37P (это время, когда двухцистронный флюоресцентный белок маркирует скорее, чем слитые белки), делая возможной дифференцировку в течение 5 дней в культуре и затем иммуноокрашивали RGC маркером Brn3, GFP (чтобы пометить и определить количественно трансдуированные клетки) и EdU (чтобы пометить и определить количественно клетки, происходящие из предшественников, которые подверглись, по крайней мере, одному клеточному делению in vitro) (Fig. S2). SIX6WT оказался недостаточным, чтобы способствовать дальнейшей дифференцировке RGCs (Fig.1f), что согласуется с экспрессией SIX6 в эмбриональных RPCs[4]. Однако мутанты SIX6L37P обнаруживали снижение количества дифференцированных RGCs (Fig. 1f). Поскольку этот эффект д. отражать различия между человеческими и мышиными клетками, то относительные уровни экспрессии гена между экспрессируемыми и эндогенными аллелями или контекстом среды, то возможно, что мутация, располагаюшаяся в TA домене SIX6 вмешивается в функции его партнеров по связыванию.

Six6, как было установлено, регулирует пролиферацию клеток ранних предшественников во время формирования сетчатки млекопитающих и во время развития гипофиза [5, 6]. Нокаутные по Six6 мыши обнаруживают аномалии зрительного нерва и дисфункцию гипофиза, снижение плодовитости и аберрантное развитие suprachiasmatic ядра [5, 6]. Описаны две SIX6 мутации, ассоциированные с микрофталмией [7, 8]. Здесь мы описали гомозиготную миссенс мутацию, ассоциированную с уникальным глазным фенотипом, характеризующимся аномалиями зрительного диска, макулярной атрофией и колобомой радужки и хориональной части сетчатки (chorioretina). Эти данные подчеркивают участие SIX6 специфически в RGC и более широко в развитии глаз.