Retinitis pigmentosa (RP) наиболее распространенная форма наследственной ретинопатии [1-3], затрагивающая более 1.5 миллионов человек во всем мире. RP использует все три способа Менделевского наследования: autosomal dominant retinitis pigmentosa (adRP), autosomal recessive retinitis pigmentosa (arRP) и X-linked retinitis pigmentosa (XLRP), а также дигенный [4] и митохондриальный способы наследования [5, 6]. Мутации почти 20 генов ассоциированы с adRP [6-8]. В последние две декады скрининг мутаций в генах кандидатах, ассоциированных с adRP у индивидуальных пациентов был проведен в разных популяциях. Разные методы, такие как single-strand conformational polymorphism (SSCP), denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) или denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) , сопровождаемые премым геномным секвенированием или массивов мутаций, были использованы для изучения мутаций у adRP пациентов [9]. В современной клинической практике секвенирование генов кандидатов используется при болезни у индивидуальных пациентов, это крайне важно для постановки диагноза.
Использование технологии next-generation DNA sequencing (NGS) всё чаще оказывается необходимым для секвенирования генов, чтобы охарактеризовать мутации, вызывающие моногенные болезни [10-12]. Мы недавно разработали сравнительно недорогой эффективный метод (submitted for publication), чтобы анализировать мутации в 12 распространенных генах (объясняющих свыше 95% известных мутаций) , ассоциированных с adRP, в масштабируемой Roche 454 GS Junior (Roche, Applied Science, Barcelona, Spain) настольной платформе секвенирования, которая пригодана для секвенирования субнабора генов в индивидуальных выборках с использованием NGS техники.
В некоторых Западных популяциях почти 50% пациентов с молекулярной диагностикой adRP являются носителями известной мутации в гене кандидате [7, 8, 13]. Однако 50% проанализированных пациентов не обнаруживали какой-либо причинной мутации в известных ассоциированных с adRP генах, указывая на геномные альтерации в гене ещё не охарактеризованном. Массивное параллельное секвенирование нескольких генов кандидатов было использовано у пациентов с ранее исключенными мутациями в известных генах кандидатах adRP [8]. Это исследование проанализировало 21 index adRP пациентов на мутации в 40 генах кандидатах с помощью массивно генерации polymerase chain reaction (PCR) ампликонов и анализа с помощью двух разных NGS платформ и впервые было продемонстрирован потенциал использования NGS для детекции мутаций в новых генах, ассоциированных с adRP.
Хотя полное геномное секвенирование одного индивида д. быть мощным подходом для поиска мутации, вызывающей болезнь, затраты и усилия всё ещё делают его непрактичным для рутинного использования по поиску генов болезни. В случае подхода с геном кандидатом мишень секвенирования может быть значительно меньшей, чем весь геном. По этой причине amplicon подход, который использует специфические пары праймеров для мультиплексной целенаправленной амплификации с помощью PCR, может быть эффективным для целенаправленного исследования нескольких десятков генов, но находится ниже той шкалы, требующей больше усилий для разработки праймеров и оптимизации PCR реакций. Чтобы преодолеть затраты и усилия по получению праймеров, предложен один крупный подход, на array-based отлавливании, который базируется на способности создания традиционных in situ синтезированных микромассивов нуклеотидов для использования в качестве коллекции для гибридизации отловленных зондов. Эта технология отбирает целенаправленно последовательности с помощью гибридизации с микромассивом олигонуклеотидов и обнаруживает значительный потенциал для эффективного обогащения специфических крупных высокой сложности интересующих геномных регионов [14, 15]. Недавно описаны два разных подхода с использованием специфической ДНК гибридизации и NGS при RP [16, 17].
Мы использовали отлавливание ДНК и NGS в группе из 5 adRP index пациентов. Наш подход состоял из анализа генов кандидатов adRP скорее, чем целого экзома. Т.о., мы впервые отобрали в качестве генов кандидатов те, которые обнаруживали высокий уровень экспрессии в сетчатке. Однако мы также включили гены, участвующие в функции сплайсинга pre-mRNA, поскольку мутации в некоторых из этих генов были ассоциированы с adRP [18-22], хотя они экспрессируются широко. В предыдущем исследовании [23] мы охарактеризовали набор генов с дифференциальной экспрессией в лимфоцитах от контрольных и RP пациентов в отношении мутации в pre-RNA сплайсинг-факторе PRPF8.
Discussion
Хотя мы и ограничили наш анализ 448 генами кандидатами, значительное количество (4730) генетических вариантов было идентифицировано в выборках от 5 проанализированных пациентов. После фильтрации наших данных мы всё ещё обнаруживали 55 новых вариантов последовательностей, 6 из которых оказались ложно положительными после Sanger секвенирования. Т.о., в исследованных выборках в среднем обнаружено по 10 новых вариантов последовательностей в генах кандидатах RP. Предсказание патогенного эффекта этих вариантов осуществляли с помощью polyphen или sift алгоритмов, выявивших несколько потенциальных болезнь вызывающих вариантов на выборку. Эти предсказания базировались на предполагаемой потере функции белка. Однако при доминантной болезни adRP патогенный механизм может оказаться связанным с избыточностью функции или доминантно-негативным эффектом скорее, чем с гаплонедостаточностью, вызываемой потерей функции. Соотв., предсказание патогенного эффекта генетических вариантов с помощью polyphen или sift было ограниченным при adRP. Более того, сегрегация вариантов в семьях исключала большинство этих вариантов генов кандидатов как причины adRP. Это безусловно ограничивает использование этого подхода для крупных семей с несколькими RP-затронутыми членами и исключает эффективный анализ для adRP в изолированных случаях.
В нашем анализе мы определили три варианта, которые могли бы в принципе быть причиной болезни. В семье 93, новая p.L270R мутация в гене IMPDH1 ко-сегрегировала с болезнью и, скорее всего, являлась причиной RP в этой семье. Мутация p.M96T в гене NRL в семье 645 была обнаружена в нашем исследовании. Мы уже описывали её и как упоминалось эта мутация в NRL должна была вызывать adRP с неполной пенетрантностью в этой семье [45]. Хотя ни один из др. вариантов последовательности, которые были найдены сегрегирующими в этой семье с RP, возможно не может быть исключен в качестве др. варианта вне гена кандидата как причина RP в этой семье.
В показательном случае семьи 65 мы обнаружили мутацию p.A76V в NRL, которая ранее рассматривалась как вызывающая болезнь RP [44]. Эта мутация не присутствовала у одного члена с RP и присутствовала у незатронутого члена семьи. Следовательно, вариант p.A76V, по-видимому, не является причиной adRP в этой семье.
В семьях 95 и 83, мы выявили PDE6G и C2orf71, соотв., вариант, который присутствовал у всех затронутых членов семьи. Мутации в этих генах ранее уже были ассоциированы с arRP [46-49]. Однако варианты, выявленные в PDE6G и C2orf171, были найдены у гомозиготных незатронутых носителей или в контроле, это говорит о том, что ни один из вариантов не вызывает болезни.
NGS подтвердил огромное количество генетических вариантов у индивидов. Наши результаты показали огромное количество полиморфизмов и редких вариантов в генах кандидатах, которые могут быть вовлечены в функцию сетчатки. Хотя только два болезнь вызывающих генетических варианта adRP было найдено в наших выборках, наш анализ выявил множественные варианты, которые предсказываются как потенциально патогенные. Эффект этих генетических вариантов на структуру и функцию сетчатки в основном неизвестен. Существующая вариабельность функции генов в сетчатке может объяснить высокую гетерогенность клинических проявлений RP, даже у пациентов из одной и той же семьи. Полученные данные с помощью NGS анализа могут стать потенциальным источником для фенотип-генетических корреляций. Наши результаты выявили возможные болезнь вызывающие мутации в двух adRP семьях несмотря на высокое количество проанализированных ретинальных генов кандидатов, показав генетическую сложность adRP. Т.о., экзомное секвенирование выборок с adRP может служить методом для выбора, увеличивающего шансы обнаружения вызывающего болезнь варианта гена.
Наши результаты подтверждают, что хотя NGS может выявить большие количества (потенциально все) существующие генетические варианты у индивидов, характеристика новых болезнь вызывающих вариантов д. быть подтверждена, напр., сегрегацией в семье.
