Посещений:
КАРДИОМИОПАТИИ И ДЕСМОСОМЫ

Роль мутаций десмоплакина

Protein expression studies of desmoplakin mutations in cardiomyopathy patients reveal different molecular disease mechanisms
TB Rasmussen, J Hansen, PH Nissen, J Palmfeldt, S Dalager, UB Jensen, WY Kim, L Heickendorff, H Mшlgaard, HK Jensen, KE Sшrensen, UT Baandrup, P Bross, J Mogensen
Clinical Genetics Volume 84, Issue 1, pages 20–30, July 2013

Mutations in the gene for desmoplakin (DSP) may cause arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) and Carvajal syndrome (CS). Desmoplakin is part of all desmosomes, which are abundantly expressed in both myocardial and epidermal tissue and serve as intercellular mechanical junctions. This study aimed to investigate protein expression in myocardial and epidermal tissue of ARVC and CS patients carrying DSP mutations in order to elucidate potential molecular disease mechanisms. Genetic investigations identified three ARVC patients carrying different heterozygous DSP mutations in addition to a homozygous DSP mutation in a CS patient. The protein expression of DSP in mutation carriers was evaluated in biopsies from myocardial and epidermal tissue by immunohistochemistry. Keratinocyte cultures were established from skin biopsies of mutation carriers and characterized by reverse transcriptase polymerase chain reaction, western blotting, and protein mass spectrometry. The results showed that the mutation carriers had abnormal DSP expression in both myocardial and epidermal tissue. The investigations revealed that the disease mechanisms varied accordingly to the specific types of DSP mutation identified and included haploinsufficiency, dominant-negative effects, or a combination hereof. Furthermore, the results suggest that the keratinocytes cultured from patients are a valuable and easily accessible resource to elucidate the effects of desmosomal gene mutations in humans.


Рисунки к статье

Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC) и dilated cardiomyopathy (DCM) это наследственные сердечные заболевания со сложной генетической этиологией. Клинические и генетические исследования выявили существенное перекрывание в выраженности этих болезней, включая высокий риск внезапной кардиальной смерти из-за желудочковой аритмии и недостаточности сердца [1-4].
Недавние исследования идентифицировали ассоциированные с болезнью мутации в генах, кодирующих десмосомные белки как у пациентов с ARVC, так и DCM [3, 5-8]. Более того, совместное наследование множественных вариантов последовательностей десмосомных генов было описано как ассоциированное с очень тяжелым кардиальным фенотипом [5, 6, 9]. Поскольку десмосомные белки экспрессируются как в миокарде, так и эпидермисе, то ARVC и DCM иногда ассоциируют с кожными проявлениями, такими как ладонно-подошвенная кератодермия и густые и курчавые волосы, как описывается при болезни Naxos и синдроме Carvajal (CS) [10, 11].
Десмосомы являются с мембранами связанными слипчивыми соединениями, которые обильно экспрессируются в миокарде и многослойном эпителии, подобном эпидермису [12]. Они гарантируют механическую целостность и обеспечивают передачу сил между клетками, благодаря закреплению с помощью промежуточных филамент на клеточных мембранах соседних клеток [13]. Desmoplakin является составляющим всех десмосом и огромное количество белка локализуется в цитоскелете, тогда как минорная часть может быть изолирована от цитоплазмы в виде DSP частиц предшественниц [14]. Белок существует в двух изоформах, DSP1 и DSP2, образуемых за счет альтернативного сплайсинга, а DSP1 является единственной изоформой, экспрессируемой в миокарде, тогда как и DSP1 и DSP2 экспрессируются в эпидермисе [12].
Чтобы лучше понять молекулярные механизмы болезни, ведущие к ARVC и DCM необходимо знание о паттерне экспрессии белков человека, ассоциированных с мутациями DSP. Однако, трудно получить сердечную ткань от индивидов с мутациями, которая могла бы объяснить, почему мало осуществлено исследований мутаций DSP у пациентов с кардиомиопатией [5, 15]. Пока эффекты мутаций десмосомных генов чаще всего изучаются в искусственных системах экспрессии с использованием трансфицированных культур клеток и трансгенных мышей с избыточной экспрессией мутантного белка [16]. Поскольку кератиноциты экспрессируют все специфичные для сердца изоформы десмосомных белков, то вполне возможно, что изменения в миокардиальной экспрессии десмосомных белков в результате мутаций будут отражаться сходными изменениями в эпидермисе [17].
Проверяли экспрессию разных мутаций DSP в культурах кератиноцитов из затронутых семей и сравнивали результаты с immunohistochemistry (IHC) десмосомных белков в выборках ткани из миокарда и эпидермиса одних и тех же индивидов.

Discussion


Desmoplakin мутации часто ассоциируют с biventricular ARVC фенотипом, и патогенные DSP мутации были недавно идентифицированы у пациентов с конечной стадией DCM [1, 4]. Большинство описанных здесь пациентов имеют клинические аномалии, указывающие на вовлечение левого желудочка. Гистологическая проверка выявила изменения в виде замещений из жировой и фиброзной ткани у двух показательных пациентов, тогда как фибротические рубцы и гипертрофия миоцитов без жировой инфильтрации наблюдалась в миокарде CS пациентов и index пациента из семьи 3. Эти находки подчеркивают клиническое, гистологическое и генетическое перекрывание между фенотипами ARVC и DCM, ассоциированными с DSP мутациями [1, 3, 4, 6, 8].
Предыдущие исследования пациентов с CS показали, что данное заболевание вызывается гомозиготными или компаундными гетерозиготными DSP мутациями, а носители гетерозиготных мутаций остаются здоровыми без признаков или симптомов данного заболевания [11, 27]. Генетические исследования наших CS пациентов выявили новую мутацию сдвига рамки считывания в последнем экзоне DSP. Последующие исследования белка из кератиноцитов, культивируемых от пациентов, показали, что мутация вызывает C-терминальное укорочение DSP и что мутантный белок включается в десмосомы миокарда и эпидермиса. Эти результаты подтверждают, что CS фенотип может возникать благодаря нарушению взаимодействий между C-терминальной частью DSP и промежуточными фрагментами. Интересно, что гетерозиготные матери наших CS пациентов не экспрессировали существенных количеств мутантного DSP белка и имели нормальный фенотип, несмотря на 50% уменьшение DSP белка дикого типа. Эта находка указывает на способность продуцировать WT DSP у гетерозиготных носителей, облегчая деградацию мутантного DSP белка и тем самым подавляя развитие болезни.
Генетические исследования семьи 2 с ARVC выявили новую DSP-p.R1269X non-sense мутацию, которая ассоциировала с неполной пенетрантность, поскольку у 85-летнего носителя мутации не обнаружено признаков болезни. RT-PCR мРНК из кератиноцитов носителей мутации показал, что мутантный c.3805C>T DSP1 транскрипт деградирует, это объясняет пониженную миокардиальную и эпидермальную экспрессию DSP1 изоформы. Ранее сходная мутация в том же самом домене DSP (p.R1267X) была описана у гомозиготного пациента с CS , который не обнаруживал заметной экспрессии DSP1 [27]. Пациент умер от сердечной недостаточности в возрасте 3 дет. Три его родственника были носителями гетерозиготной мутации и имели нормальный фенотип, несмотря на гаплонедостаточность по DSP1. Благодаря тому факту, что индивиды с гаплонедостаточностью по DSP1 могут оставаться здоровыми, очевидно, что index пациент из семьи 2 , несущий мутацию p.R1269X, унаследовал дополнительный ещё не идентифицированный вариант, что привело к возникновению пенетрантного ARVC фенотипа [5, 6, 9]. Отец пробанда здоров в возрасте 85 и два др. носителя мутации p.R1269X имели лишь пограничные признаки ARVC. Это подтверждает, что статус носителя этой мутации толерантен, а патогенность данной мутации испытывает влияние со стороны др. неизвестных факторов.
Генетические исследования семьи 3 с ARVC выявили новую in-frame делецию в DSP и редкий PKP2 вариант [6]. Все дигенные носители, за исключением одного молодого индивида полностью удовлетворяли диагностическим критериям ARVC, тогда как индивиды, несущие только DSP мутацию или вариант PKP2, имели нормальный фенотип. WB из культивируемых кератиноцитов и IHC из миокардиальной и эпидермальной ткани от носителей мутации DSP обнаруживали уменьшение экспрессии и DSP1 и DSP2. Экспрессия PKP2 белка оставалась той же самой как у индивидов с нормальным генотипом, так и носителей PKP2-p.T526M варианта. Однако у дигенных пациентов, несущих DSP-p.K324_E325del мутацию и вариант PKP2-p.T526M, эксперименты nLC-MS показали, что приблизительно 20% от DSP в цитоскелете было мутантными (Fig.3S3). Эта находка находится в контрасте со здоровыми носителями только DSP мутации, которые имели пониженные количества общего DSP белка и экспрессировали только WT DSP. Хотя количество затронутых индивидов было ограниченным в этой семье, вполне возможно, что совместная экспрессия PKP2-p.T526M варианта облегчает включение мутантного DSP белка в десмосомы. Это мнение было подтверждено тем фактом, что PKP2 участвует в рекрутировании DSP в межклеточные соединения и указывает на то, что редкий вариант последовательности может, в самом деле, обладать модифицирующими эффектами на экспрессию белка [30].
В семье 4, пробанд несет распознаваемые варианты последовательности внутри DSP, а также DSG2. Мутация DSG2 ранее была описана в нескольких семьях с ARVC [6, 26]. Вариант DSP был описан только у затронутых индивидов, носителей мутации дополнительного десмосомного гена и недавно был обнаружен в здоровом контроле [5, 9, 20]. Исследования белка из клеток и тканей с помощью IHC, WB и nLC-MS показали, что DSP-V30M белок экспрессируется совместно с WT DSP и включается в цитоскелет в количествах равных количеству WT DSP белка. Результаты WB и IHC показали нормальную тканевую экспрессию и локализацию DSG2 белка у дигенных носителей мутации DSG2-p.R46Q/DSP-p.V30M. Эти результаты показывают, что мутантный белок DSG2-R46Q экспрессируется и инкорпорируется в десмосомы. Более того, эта находка подтверждает, что часть экспрессируемого DSG2 остается нерасщепленной и сохраняет N-терминальную pro-peptide цепь, которая может взаимодействовать со сборкой функциональных десмосом. Это может приводить к ухудшению взаимодействий с др. десмосомными кадгеринами [29].
Предыдущее исследование также анализировало мутацию DSP-p.V30M в линии сквамозных карциномных клеток человека с помощью временной трансфекции [30]. Иммуноокрашивание показало, что белок DSP-V30M снижен на границах клеток и авт. предположили, что мутация приводит к неправильной локализации мутантного DSP. Эти находки не согласуются с результатами этого исследования, в котором мутантный белок полностью включался в десмосомы. Расхождение может прекрасно иллюстрировать, что искусственная клеточная модельная система не обязательно отражает регуляцию экспрессии in vivo, сплайсинг мРНК и механизмы контроля качества белка. Это заставляет использовать клетки или ткани человека, полученные от затронутых индивидов для изучения клеточных эффектов мутаций, ассоциированных с болезнью. Недавнее исследование с помощью IHC выборок миокардиальной ткани от трех пациентов с ARVC с разными мутациями DSP [15]. Авт. сообщили, что DSP миссенс мутация была ассоциирована с нормальным паттерном экспрессии DSP, тогда как иммунореактивный сигнал был редуцирован в выборках от двух индивидов, несущих DSP non-sense мутации. Эти находки согласуются с нашими исследованиями и подтверждают гипотезу , что эффекты как гаплонедостаточности, так и доминантно-негативные эффекты мутантных белков, скорее всего, являются механизмами болезни при ARVC. Однако при CS с рецессивным наследованием, члены семьи, которые были гетерозиготными по мутации, имели нормальное сердце, хотя они и были гаплонедостаточными в отношении WT DSP белка [27]. Следовательно, наиболее вероятно, что гаплонедостаточность по DSP сопровождается дополнительными геномными вариантами, способствующими развитию болезни [5, 6, 9]. Эти обстоятельства также могут помочь объяснить низкую пенетрантность (менее 50%) DSP мутаций, наблюдаемых у членов семей, описанных здесь и ранее [7].
Интересно, что разнообразные десмосомные белки, которые также включают миокардиальные изоформы, экспрессируются в кератиноцитах. Это исследование показало, что аномалии белков в кардиальной ткани от пациентов с десмосомными кардиомиопатиями присутствуют также в их кератиноцитах. Поэтому возможно использование культур кератиноцитов человека, полученных от затронутых индивидов, для изучения экспрессии белка и расширяет наше знание относительно молекулярных механизмов болезни. Результаты проиллюстрировали, что патогенные эффекты мутаций DSP, включая гаплонедостаточность, а также доминантно-негативные эффекты и эффекты вариации последовательностей в др. десмосомных белках, скорее всего, влияют на включение мутантного DSP белка в десмосомы. В целом это исследование показало, что десмосомные кардиомиопатии часто ассоциируют со сложным способом наследования и чрезвычайно изменчивым паттерном экспрессии белка, это помогает объяснить гетерогенные клинические проявления болезни.