Семейство коннексинов (Cx) состоит из трансмембранных белков, как известно, обеспечивающих прямой межклеточный обмен ионами и малыми метаболитами за счет образования каналов щелевых соединений между соседними клетками (Goodenough and Paul, 2009). Эти белки кодируются 20 и 21 генами у мыши и человека, соотв. (Table 1; Dobrowolski and Willecke, 2009; Pfenniger et al., 2011). Cx гены классифицируются в соответствии с гомологией последовательностей и подразделяются на 5 подсемейств: α (GJA), β (GJB), γ (GJC), δ (GJD) и ε (GJE) (Cruciani and Mikalsen, 2006; Abascal and Zardoya, 2013). Cx белки идентифицируются на базе их молекулярного веса в kilodaltons (напр., Cx37 = 37 kDa). Общая структура Cx состоит из 4-х трансмембранных доменов (TM1-4), двух внеклеточных петель (EL1-2) и одной внутриклеточной петли (IL). Как амино-терминальная (NT) и карбоксил-терминальная (CT) части белка расположены в цитоплазме (Figure 1; Sosinsky and Nicholson, 2005; Yeager and Harris, 2007; Beyer et al., 2012). 6 совместимых субъединиц Cx олигомеризуются в гексамерный коннексон, который может быть организован в гомомерную или гетеромерную форму в зависимости от того, состоят из 6 идентичных Cxs или разного типа Cx, соотв. (Laird, 2006; Koval et al., 2014). При специфических условиях коннексоны могут функционировать как полуканалы, обеспечивающие проницаемость для ионов и малых метаболитов, таких как АТФ, cAMP, IP3 и glutamate (Goodenough and Paul, 2003; Saez et al., 2010), Но чаще всего соединение двух коннексонов образует полный канал щелевого соединения между соседними клетками; гидрофильная внутренняя часть каналов делает возможной транспорт ионов и малых мессенджер молекул до 1 kDa (Figure 1). Разные факторы регулируют открытие каналов Cx, включая проходящее через соединение эл. напряжение, фосфорилирование и др.пост-трансляционные модификации, pH и концентрация внутриклеточного кальция (Ca2+) (Marquez-Rosado et al., 2012; D'Hondt et al., 2013; Harris and Contreras, 2014). Повышенное внимание привлечено к 'протеомы щелевых соединений', 'connexin interactome' или 'connexome', белковой взаимодействующей сетью с Cx в качестве центрального медиатора (Laird, 2010; Fowler et al., 2013; Agullo-Pascual et al., 2014). Кардиальный интеркалированный диск, напр., по-видимому, выступает в качестве такого взаимодействующего комплекса щелевых соединений, десмосомы и натриевые каналы, которые совместно контролируют электрическое купирование, межклеточную адгезию и возбудимость (Agullo-Pascual et al., 2014; Veeraraghavan et al., 2014). Поддержание полуканала и/или функциональной способности щелевого соединения и целостности важны для консервации межклеточных коммуникаций и тем самым гомеостаза в широком числе тканей. Мутации в генах Cx, вызывающие нарушения образования щелвых соединений и/или функции канала, как известно, играют роль в разных патологических состояниях у человека (Dobrowolski and Willecke, 2009; Pfenniger et al., 2011; Table 1).

Table 1. Mouse and human connexin genes and major associated human diseases

Figure 1. Connexins form gap junction channels and hemichannels (A) Connexins are integral membrane proteins constituted by four transmembrane domains (TM1-4), two extracellular loops (EL1 and EL2), one intracellular loop (IL) and cytoplasmic amino-terminal and carboxy-terminal domains (NT and CT, respectively). (B) Connexons are formed by the oligomerization of six connexin subunits and may function under specific conditions as hemichannels. (C) Two connexons from neighbouring cells can dock together in the extracellular space and form a gap junction channel. These channels enable the transfer of ions and small metabolites between cells.

Cardiovascular Cxs

Общепринято, что главные Cxs в сердце, кровеносных сосудах и лимфатической васкулатуре этоCx37, Cx40, Cx43, Cx45 и Cx47 (Figure 2). Cx37 и Cx40 обычно обнаруживаются в эндотелиальных клетках (ECs) (Brisset et al., 2009). Кроме того, Cx43 экспрессируется в специфических эндотелиальных регионах, таких как точки ветвления артерий (Gabriels and Paul, 1998) и капилляров (Sarieddine et al., 2009). Cx40 вместе с Cx43 и в меньшей степени Cx45, экспрессируются также в кардиомиоцитах и сосудистых гладкомышечных клетках (VSMCs) (Gros and Jongsma, 1996; Severs et al., 2004). Во взрослом сердце, Cx40 и Cx43 присутствуют в интеркаляционных дисках, при этом Cx40 экспрессируется в предсердиях, тогда как Cx43 обнаруживается и в предсердиях и желудочках (Vozzi et al., 1999). Наконец, Cx47 экспрессируется в лимфатических эндотелиальных клетках (LECs) (Wick et al., 2007; Kanady et al., 2011). Cxs и щелевые соединения имеют важное значение в сердце, где распространение потенциала действия зависит от тока, текущего быстро от клетки к клетке, приводя тем самым к скоординированному сокращению. Кроме того, Cxs являются критическими для факторов обмена между кардиальными клетками во время развития сердца. В подтверждение этому были осуществлены исследования на Cx40-дефицитных мышах, показавших, что отсутствие этого Cx вызывает предрасположенность к кардиальным порокам (Gu et al., 2003). Кроме того, новорожденные мыши, лишенные Cx43 погибают вскоре после рождения из-за пороков трактов оттока из желудочков (Reaume et al., 1995). Уровни Cx45 низкие в сердце взрослых. Однако, Cx45 используется на ранних стадиях сосудистого развития (Kruger et al., 2000). В аортальных ECs, Cx40 может играть роль зависимом от эндотелия расширении сосудов, путем регуляции высвобождения nitric oxide (Alonso et al., 2010). В VSMCs крупных артерий, Cx43 может быт вовлечен в модуляцию клеточных делений, т.к. было продемонстрировано, что мыши с VSMC-нацеленной делецией Cx43 обнаруживают усиленную пролиферативную активность в клетках этого типа (Liao et al., 2007). Напротив, снижение в VSMC пролиферации наблюдается также у мышей, у которых экспрессия Cx43 была снижена на 50% (Cx43^+/- мыши) (Chadjichristos et al., 2006).

Figure 2. Schematic description of the cardiovascular system and overview of the expression patterns of connexins isoforms in the cardiovascular cells. RA, right atrium; LA, left atrium; RV, right ventricle; LV, left ventricle.

Cx37, Cx40 и Cx43 также экспрессируются в небольших кровеносных сосудах, таких как сопротивляющиеся артерии (Looft-Wilson et al., 2012), где щелевые соединения регулируют зависимый от эндотелия тону сосудов (Sandow et al., 2002). Более того, недавние исследования на мышах сообщили, что Cx37 и Cx47 экспрессируются в ECs, покрывающих венозные и лимфатические клапаны, тогда как Cx43 экспрессируется во всех частях этих сосудов (Kanady et al.,2011; Sabine et al., 2012; Munger et al., 2013). Это указывает на то, что Cxs могут быть важны для формирования венозных и лимфатических клапанов. В самом деле, недавние исследования показали, что дефицит Cx37 блокирует образование и венозных и лимфатических клапанов (Kanady et al., 2011; Sabine et al., 2012; Munger et al., 2013). В дополнение к своим физиологическим функциям сердечно-сосудистые Cxs являются важными игроками в сосудистых заболеваниях человека, таких как атерросклероз, миокардиальный инфарркт (MI) и гипертензия (Brisset et al., 2009). Однако, сердечно-сосудистая система не уникальна в экспрессии упомянутых выше Cxs. оэтоу понятно, почему мутации или полиморфизмы генов, кодирующих сердечно-сосудистых Cxs ассоциируют с патологическими состояниями в разных др. тканях.

GJC2 (Cx47) mutations cause Pelizaeus-Merzbacher-like disease and lymphoedema GJC2 in 'early' mouse experiments

GJC2 (previously GJA12; MIM: 608804) был клонирован в 2001, он кодирует белок в 46.551 Da, характерный для Cx47 (Teubner et al., 2001). Функциональные свойства Cx47 были первоначально изучены на клетках HeLa и ооцитах Xenopus. В этих клетках Cx47 образует электрически соединенные (coupled) [унитарная проводимость 55 pS (основное состояние) и 8 pS (остаточное состояние)] щелевые соединения, пропускающие neurobiotin (NB), Lucifer Yellow (LY) или 4',6-diamidino-2-phenylindole (Teubner et al., 2001). In vivo Cx47, по-видимому, в основном экспрессируется в регионах головного мозга и тканях спинного мозга (Teubner et al., 2001). Детальное исследование элегантно проиллюстрировало экспрессию GFP под контролем промотора GJC2 в миелинизированных регионах головного мозга (в основном олигодендроцитах) (Odermatt et al., 2003). Др. сообщили о сходном паттерне экспрессии Cx47 после этиъ первоначальных исследований (Menichella et al., 2003; Nagy et al., 2003; Kleopa et al., 2004). Одно из этиъ исследований сообщало, что гены миелина регулируются параллельно с GJC2 и показало, что GJC2-дефицитные мыши характеризуются гипомиэлинизацией (Menichella et al., 2003). Более того, экспрессия Cx47 временно усиливается в зонах демиелинизаци в модели повторной миелинизации (Parenti et al., 2010). Поэтому было предположено, что мутации потери функции в GJC2 могут участовать в болезнях, характеризующихся гипомиелинизацией в ЦНС человека.

Links between GJC2 mutations and Pelizaeus-Merzbacher-like disease

Лейкоэнцефалопатии с гипомиелинизацией, гетерогенная группа нарушений, типичным примером которой является Pelizaeus-Merzbacher disease (PMD), характеризуются аномальным образованием миелина в ЦНС. PMD пациенты могут обладать нистагмом (неконтролируемыми движениями глаз), нарушениями двигательного развития, атаксией (отсутствием произвольных скелетно-мышечных движений), дизартрией (затруднения речи), прогрессивной спастичностью и диффузными изменениями белого вещества головной мозга (Meyer et al., 2011). PMD вызывается мутациями в гене PLP (Hudson, 1989), но группа пациентов с признаками PMD может не обладать мутациями PLP. Такие пациенты страдают от Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). PMLD оказалась сцепленной с мутацией в HSPD1 (Magen et al., 2008), с разными аутосомно рецессивными мутациями в GJC2 и некоторыми мутациями в промоторе GJC2 (Table 2 and Figure 3; Orthmann-Murphy et al., 2007; Henneke et al., 2008; Al-Yahyaee et al., 2012; Yalcinkaya et al., 2012; Biancheri et al., 2013; Kammoun Jellouli et al., 2013; Shimojima et al., 2013). Кроме того, мутации в GJC2 сцеплены с наследственной спастической параплегией; со слабым, но сходным фенотипом (Orthmann-Murphy et al., 2009). GJC2 мутации вызывают изменения в Cx47 в рахзных отличающихся доменах белка. Т.е., PMLD-сцепленные мутации могут обнаруживаться в NT, ELs и IL, в TMs и CT в Cx47. Это важно, поскольку специфические домены Cxs являются критическими для специфических аспектов биологии Cx. ELs в Cxs являются, напр., критическими для соединений коннексон-коннексон. Напротив, части CT могут быть важными для межбелковых взаимодействий Cxs с др. белками (Duffy et al., 2002; Pfenniger et al., 2010).

Table 2. Functional effects of human PMLD-linked GJC2 mutations

Figure 3. Schematic representation of mutations associated with Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD), hereditary spastic paraplegia and lymphoedema along the structure of Cx47. PMLD-related GJC2 mutations were initially identified in the coding sequence of GJC2. However, binding of SOX10 regulates GJC2expression (Schlierf et al., 2006). Consequently, mutations in the SOX10 binding sequence could also be related to PMLD. Indeed, several studies showed PMLD-linked mutations in the SOX10 transcription site (Osaka et al., 2010; Meyer et al., 2011; Combes et al., 2012; Kammoun Jellouli et al., 2013). Furthermore, a mutation in the canonical splicing region of GJC2 has been reported (Al-Yahyaee et al.,2012). A link between GJC2 copy numbers and PMLD was also addressed but not established (Ruf and Uhlenberg, 2009). This is not surprising as the study included only 14 PMLD patients (Ruf and Uhlenberg, 2009) and GJC2 mutations are only a rare cause of PMLD (Henneke et al., 2008).

Links between GJC2 and lymphoedema

GJC2 мутации сцеплены не только с PMLD, но и связаны с лимфатическими отёками (Ferrell et al., 2010; Ostergaard et al.,2011; Finegold et al., 2012) (reviewed in: Brouillard et al., 2014; Meens et al., 2014). Лимфатические отёки, связанные с аномальным накоплением жидкости в интерстициальных пространствах, подразделяются на первичные и вторичные. Первичный лимфатический отёк возникает в результате наследственных аномалий образования лимфатических сосудов. Вторичный лимфатический отёк вызывается повреждениями лимфатической системы в результате, напр., лечения рака (удаление лимфатических узлов, дренирующих опухоли), ожогов, воспаления или неподвижности. Пациенты, страдающие от первычных и вторичных лимфатических отёков, характеризуются локальными инфекциями и физическими повреждениями и могут повышать риск лимфангиосарком.

Лимфатические сосуды отличаются по многим аспектам от артерий и вен в системном кровообращении. Напр., LECs обнаруживают отличающиеся паттерны экспрессии генов по сравнению с кровеносными ECs (Wick et al., 2007). Интересно, что экспрессия GJC2 увеличивается в 5.3-раз в кожных LECs человека по сравнению с кожными ECs человека (Wick et al., 2007). Хотя различия в экспрессии GJC2 между LECs и ECs относительно малы (возможно объясняется это тем фактом, что Cx47 экспрессируется только LECs, покрывающих лимфатические клапаны (Kanady et al.,2011)), Ferrel et al. (2010) расценивают это как намёк на поиск мутаций в GJC2 в семьях, страдающих от первичных лимфатических отёков. 5 мутаций, сцепленных с лимфатическими отёками, было найдено в GJC2 (Table 3 and Figure 3), из которых только одна (G146S) ранее была сцеплена с PMLD (Ferrell et al., 2010; Finegold et al., 2012). Одна из этих мутаций наследуется как аутосомно доминантная мутация (Finegold et al.,2012), тогда как др. мутации, по-видимому, рецессивны (Ferrell et al., 2010; Finegold et al., 2012). Эти мутации присутствуют в ELs и представляют особый интерес, т.к. д. влиять на соединение коннексон-коннексон. Конечно, Cx47 является не только Cx, сцепленным с первичными лимфатическими отёками, поскольку мутация в GJA1, в гене, кодирующем Cx43, была недавно обнаружена в семье, склонной к лимфатическим отёкам в Великобритании (Brice et al., 2013).

Table 3. Functional effects of human lymphoedema-linked GJC2 mutations

Гены, участвующие в первичных лимфатических отёках могут также модулировать вторичные лимфатические отеки. Напр., мутации в рецепторах высокого сродства для фактора роста гепатоцитов были описаны у пациентов с первичным лимфатическим отёком и у неродственных пациентов со вторичными лимфатическими отёками (Finegold et al., 2008). Поэтому пациенты, страдающие от вторичных лимфатических отёков, были исследованы в отношении появления мутаций в GJC2 (Finegold et al., 2012). Мутация G146S в GJC2 была идентифицирована у пациента со вторичными лимфатическим отёком. Более того, идентифицированы три новые уникальные мутации в GJC2 (Table 3 and Figure 3; Finegold et al., 2012). Наконец, был выявлен полиморфизм в GJC2. Однако, этот полиморфизм появляется у пациентов со вторичными лимфатическими отёками, у пациентов с раком груди и в контроле не рака груди со сходными частотами (Finegold et al., 2012).

Итак, мутации GJC2 оказались сцеплены с PMLD и лимфатическими отеками в разных исследованиях. Однако, эти исследования не предоставили механистическую информацию от эффектах мутаций GJC2 на функцию канала Cx47. Отсюда некоторые группы изучали эффекты мутаций в GJC2 на функцию Cx47 в дефицитных по коммуникациям трансфицированных клетках (напр. HeLa или N2A клетки) и у мышей, трансгенных по определенной мутации (Orthmann-Murphy et al., 2007; Orthmann-Murphy et al., 2009; Diekmann et al., 2010; Tress et al., 2011; Finegold et al., 2012).

Functional consequences of GJC2 mutations

В 2007, генные конструкции, кодирующие некоторые PMLD-сцепленные мутации GJC2 (т.e. P87S, Y269D и M283T) экспрессируются в клетках HeLa (Orthmann-Murphy et al., 2007). Очевидно, что все три мутантных белка располагаются в эндоплазматическом ретиклуме (ER), тогда как дикого типа (WT) Cx47 присутствует на клеточной мембране. Более того, HeLa клетки, экспрессирующие мутантный GJC2, не пропускают LY или NB, иллюстрируя отсутствие функционального соединения между клетками. Наконец, детальные эксперименты по фиксации потенциала (patch clamp) выявили, что мутанты, экспрессируемые в N2A клетках в сомом деле не генерируют функциональных каналов. Так, олигодендроциты в этом (Orthmann-Murphy et al., 2007) и др. (Menichella et al., 2003; Nagy et al.,2003; Odermatt et al., 2003; Kleopa et al., 2004) исследованиях экспрессировали Cx47, было сделано заключение, что P87S, Y269D и M283T мутации, которые продуцируют нефункциональные каналы in vitro, скорее всего, нарушают межклеточные коммуникации между олигодендроцитами и астроцитами in vivo. Та же самая группа воспроизвела части этой работы в исследовании, сфокусированном на I33M (Orthmann-Murphy et al., 2009). I33M или P87S экспрессируются в HeLa или N2A клетках и было изучено образование щелевых соединений, купирование краски и электрическое купирование. Снова, P87S не давали функциональных каналов и располагались в ER. I33M однако, формировали щелевые соединения, определяемые с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания. Эти щелевые соединения оказались однако непроницаемыми для LY и NB. Интересно, что patch clamp исследования показали, что I33M не образует гомотипических каналов (I33M/Cx43), это наблюдение было охарактеризовано с помощью повышенной открытой проницаемости у сравниваемых Cx47/Cx43 каналов. Cx47 может не только функционировать как канал щелевых соединений, но и может также формировать полуканалы. Следовательно, функциональные эффекты миссенс мутаций GJC2 (G149R, G236R, T265A и T381I) и одной сложной GJC2 мутации (A98G_V99insT) были исследованы в отношении функции полуканалов (Diekmann et al., 2010). Все мутации за исключением G236R с легкость экспрессировались в HeLa или OLI-neu клетках. Эти мутанты (i) оставались в ER (T265A и A98G_V99insT), (ii) присутствовали в щелевых соединениях (T398I) или (iii) доставлялись и в ER и щелевые соединения (G149S). Функция полуканалов была изучена с использованием анализа voltage clamp на ооцитах Xenopus, которым инъецировали WT или мутантный Cx47. Мутантные G265R, T265A и A89G_V99insT обнаруживали снижение токов в полуканалах и тем самым предсказывали потерю функции полуканалов. Мутация T398I не ингибировала функцию полуканалов, но вызывала деполяризацию остаточного потенциала мембраны. Авт. предположили, что этот полуканал может быть случайно открытым (Diekmann et al., 2010). Recently, Kim et al. (2013), обеспечивая тем самым эффекты мутаций GJC2 (I46M, G149S, G236R, G236S, M286T и T398I) на расположение в клетке мутантных белков и на свойства каналов. Все мутанты присутствовали в межклеточных контактах между клетками HeLa. Однако большинство (I46M, G236R, G236S и M286T) были неспособны формировать функциональные гомотипические или гетеротипические (с Cx43) каналы. Напротив, Q149S и формировали гомотипические и гетеротипические (с Cx43) каналы со свойствами, сходными с таковыми Cx47 (Kim et al., 2013).

Последствие in vivo одной PMLD-миссенс мутации было изучено, при этом мышиный ортолог (M282T) M286T экспрессировался у C57Bl/6 мышей (Tress et al., 2011). Cx47^M282T/M282T мыши обнаруживали нейропатологические аномалии (дегенерацию клеток Пуркинье и белого вещества), которые сопровождались поведенческими аномалиями (оцениваемыми по поведению в открытом поле и rotarod tasks). Более того, эксперименты по купированию краски осуществляемые на олигодендоцитах, показали M282T сниженное купирование (coupling) между олигодендроцитами ex vivo. Кроме того, Cx47^M282T/M282T мыши обнаруживали снижение образования миелина и сильно напоминали человеческий фенотип. Наконец, дифференцировка олигодендроцитов была снижена у трансгенных животных.

In vitro функциональные эффекты мутаций, связанных с лимфатическим отёком, были описаны в исследовании, сконцентрированном на G146S, G183C, P381S и H409Y (Finegold et al., 2012). Все мутанты располагаются в межклеточных контактах в клетках HeLa. G146S-трансфицированные клетки HeLa обладают более быстрым закрытием ран. H409Y-трансфицированные LECs человека характеризовались снижением купирования краски, тогда как купирование краски в P381S-трансфицированых LECs повышено. Это подтверждает, что эти определённые мутации могут изменять способность у мутантов формировать гомотипические каналы. Однако, LECs могут эндогенно экспрессировать несколько Cxs (Kanady et al., 2011; Kanady and Simon, 2011; Sabine et al., 2012). Поэтому возможно, что мутации, затрагивающие гетеротипические каналы, состоят из мутантных и эндогенно экспрессируемых Cxs. Наконец, G183C-трансфицированные клетки HeLa характеризуются повышенным электическим купированием (что отмечалось и Finegold et al., 2012) как погрешности напряжения при исследовании patch clamp на целых клетках, которые довольно большие при высоких токах купирования (coupling currents).

Итак, разные исследования выявили функциональные последствия в виде PMLD и/или сцепленными с лимфатическими отеками GJC2 мутациями (Orthmann-Murphy et al., 2009; Diekmann et al., 2010; Finegold et al., 2012; Kim et al., 2013).

GJA1 (Cx43) mutations cause oculodentodigital dysplasia Cx43 in the cardiovascular system

Ген GJA1, расположенный на участке хромосомы 6q22-q23, кодирует Cx43, наиболее широко распространенный Cx. Cx43 обнаружен в более, чем 35 различных типах клеток и тканях и известно его критическое участие в онтогенетических процессах. В миокарде Cx43 появляется на день эмбриогенеза 9.5; он впервые выявляется в желудочках, а несколько дней позднее и в предсердиях. После рождения его локализация в миокардиальных клетках строго организована, т.е., Cx43 перемещается в интеркалированные диски, uly он формирует щелевые соединения и сосуществует с механическими соединениями, такими как слипчивые соединения и десмосомы (Angst et al., 1997). Во взрослом сердце Cx43 экспрессируется в предсердиях, желудочках, нижних веточках пучка Гиса и волокнах Пуркинье. Он играет главную роль в координации распространения электрических импульсов по желудочкам. Cx43^-/- мыши доживают до рождения, но погибают вскоре после рождения из-за закупорки тракта оттока из правого желудочка (Reaume et al., 1995). Этот порок связан с дефектом миграции кардиальных клеток нервного гребня (Huang et al., 1998; Sullivan et al., 1998) и с non-crest нейроэпителиальными клетками (Kretz et al., 2006; Liu et al., 2006). Конечно, даже 90% снижение Cx43 в кардиомиоцитах не влияет на сердце в покое (Danik et al.,2004).

GJA1 mutations and oculodentodigital dysplasia

Oculodentodigital dysplasia (ODDD)-сцепленные мутации в GJA1 были впервые описаны в 2003 Paznekas et al. (2003). Основным фенотипическим отклонением этого аутосомно доминантного синдрома являются аномалии глаз, носа, зубов и костей, слияния пальцев и дисфункция нейронов. Кстати, описано 73 ODDD-сцепленных мутаций GJA1 (Paznekas et al., 2009; Thibodeau et al., 2010; Furuta et al., 2012; Van Norstrand et al., 2012; Brice et al., 2013; Laird, 2014) и они в подавляющем большинстве (88%) представлены доминантными миссенс мутациями. Cx43 состоит из 382 аминокислот и мутации были найдены по всей последовательности. В зависимости от выбора Cx43 мембранной топологии (Paznekas et al., 2009; Abrams and Scherer, 2012), распределение мутаций следующее: имеются 8-10 мутаций в NT, 7-9 в TM1 домене, 11-14 в EL1, 4-6 в TM2 домене, 20-22 в IL, 1-3 в TM3 домене, 6 в EL2, 2-3 в TM4 домене и 3-4 в CT (Figure 4). Мутации Cx43, которые вызывают выраженные изменения в локализации и/или свойствах Cx43, затрагивают аминокислоты, которые высоко консервативны между видами. такие как Y17S, G21R, G22E, R76S, Y98C, I130T и G138R (Paznekas et al., 2003). Функциональные последствия Cx43 мутаций изучены для 20 из этих мутаций.

Figure 4. Schematic representation of mutations associated with oculodentodigital dysplasia (ODDD) along the structure of Cx43.

Effects of GJA1 mutations on Cx43 channel function

Некоторые исследования in vitro изучали последствия мутаций GJA1 на i) клеточную локализацию Cx43 и ii) свойства каналов (полуканалов и каналов щелевых соединений). Определенные мутации затрагивают образование бляшек щелевых каналов Cx43, др. затрагивают свойства каналов (электрическое взаимодействие и/или образование красителя в результате сочетанной реакции (dye coupling)) третьи затрагивают оба. Хотя имеются некоторые незначительные отличия между исследованиями, возможно обусловленные использованием разных типов клеток (т.e. N2A клеток, HeLa клеток, C6 глиомных клеток или кардиомиоцитов) выявляется общая картина, что эти мутации в GJA1 нарушают образование бляшек щелевых соединений и тем самым купирование краски и электрическое купирование. Таблица 4 представляет неполные данные относительно мутаций GJA1 на локализацию Cx43 в клетках, свойства полуканалов и свойства щелевых соединений. Мутации, которые затрагивают целостность внутриклеточных частей Cx43 (NT, IL и CT), по-видимому, в основном нарушают собственно функцию каналов щелевых соединений Cx43. Напр., было продемонстрировано, что мутации в NT части Cx43 (G2V, D3N, L7V, L11P, Y17S и P18S) не влияют на доставку Cx43 на клеточную поверхность, но делают щелевые соединения не функциональными (Shao et al., 2012). В самом деле, HeLa или NRK клетки, экспрессирующие одну из этих мутаций, обнаруживают снижение переноса LY между клетками и проводимость через щелевые соединения близкой к нулю (Shao et al., 2012). Сходные результаты описаны для мутаций в IL (I130T, K124E и G138R). Эти мутации не модифицируют образование бляшек щелевых соединений, но приводят к образованию нефункциональных каналов в N2A клетках (Seki et al., 2004; Roscoe et al., 2005). Интересно, что G138R, по-видимому, увеличивает активность полуканала, измеряемую по высвобождению АТФ (Dobrowolski et al., 2007). Однако I130T, по-видимому, редуцирует функцию полуканалов, измеряемую по потреблению propidium iodide (PI) (Lai et al.,2006). Довольно неожиданно, что только 4 ODDD мутации идентифицированы в CT в Cx43. Наиболее охарактеризованная мутация - это мутация сдвига рамки считывания 260 (fs260), которая приводит к экспрессии укороченного Cx43. Fs260 ассоциирована с уменьшенным количеством бляшек щелевых соединений и, следовательно, с тяжестью нарушения электрического купирования в N2A клетках (Gong et al., 2006) или снижением распространения краски в эпидермальных кератиноцитах крыс (Churko et al., 2010). Принимая во внимание критическую роль Cx43 в сердце, кажется парадоксальным, что пациенты с ODDD лишь редко присутствуют при морфологических миокардиальных аномалиях или кардиальных аритмиях.

Table 4. Functional effects of human GJA1 mutations

GJA1 mutations and consequences for the cardiovascular system

В своем труде 'Mutation Update', Paznekas et al. (2009) проводят детальный обзор кардиальных свойств, ассоциированных с семьями ODDD. Поразительно, только 5 семей с ODDD из 54 выявленных представлены членами с онтогенетическими аномалиями сердца, такими как дефекты предсердной перегородки (G21R), дефектом межжелудочковой перегородки (T154A) и стенозом лёгочного ствола (V96A, R202H) и/или электрическими аномалиями, подобными блоку сердца первой степени (G21R) блоку правой ветви пучка (G21R, Q49P). Причина практического отсутствия кардиальных фенотипических отклонений у ODDD пациентов остается неясной, но может включать компенсаторное увеличение экспрессии др. Cxs. Необходимом, однако, иметь в виду, что недавний скрининг 300 пациентов с аномалиями тракта оттока не выявил каких-либо мутаций в GJA1, подтвердив, что Cx43 мутации не связаны широко с врожденными пороками сердца (Huang et al., 2011).

Недавно Thibodeau et al. (2010) идентифицировали соматическую мутацию GJA1 (c.932delC), приводящую к сдвигу рамки считывания с 36 аминокислотами после преждевременного стоп кодона в ткани предсердий у пациентов с идиопатической фибрилляцией предсердий (AF). У пациетов с AF, нормальная продолжительность QRS и отсутствует желудочковая аритмия. Иммуноокрашивание ткани предсердий пациентов показало мозаичный паттерн окрашивания, т.е с областями с нормальной локализацией Cx43 в интеркалированных дисках и областями с существенным внутриклеточным окрашиванием. Исследования трансфекции с меченными Cx43 подтвердили, что мутантный Cx43 сохраняется преимущественно в Гольджи аппарате и вызывает внутриклеточное удержание Cx43 и также Cx40. Электрофизиологические исследования не выявили проводимости в щелевых соединениях в N2A клетках, трансфицированных c.932delC-Cx43, а в основном сниженное электрическое купирование при совместной экспрессии с Cx43 или Cx40. Авт. предположили существование специфичных для предсердий генетических мутаций в Cx43 в качестве потенциальной причины спорадических, не семейных случаев единичных AF.

В 2012, Van Norstrand et al. идентифицировали две новые GJA1 миссенс мутации (E42K и S272P) у двух пациентов из когорты из 292 пациентов с синдромом внезапной гибели детей (SIDS) (т.e. внезапной гибели детей у детей менее 1 года, которые остаются необъясненными) (Van Norstrand et al., 2012). Авт. использовали меченные белки в N2A клетках, чтобы продемонстрировать, что эти две мутации не ассоциированы с дефектом доставки Cx43 или образования бляшек щелевых соединений. Помимо иммунноокрашивания, осуществленного на миокардиальной ткани, было показано, что E42K ассоциирована с пятнистым распределением Cx43; некоторые области экспрессируют как обычно Cx43, тогда как соседние области не обнаруживают сигнала от Cx43. Эксперименты Patch clamp показали, что N2A клетки, трансфицированные E42K, обнаруживают полное отсутствие электрического купирования, которое не восстанавливается совместной экспрессией с Cx43. N2A клетки, трансфицированные мутацией S272P, однако обнаруживают электрическое купирование, сходное с таковым при трансфекции клеток Cx43. Ясно, результаты этого исследования подтверждают, что GJA1 мутации ассоциируют с SIDS. Однако причинные взаимоотношения ещё предстоит продемонстрировать.

Развитие Cx43 мутантных мышей ODDD помогает лучше понять последствия этих мутаций для развития и функции сердца. Две мутантные мышиные модели, несущие человеческие ODDD мутации (G138R, I130T), были описаны как вызывающие сердечно-сосудистые дефекты (Kalcheva et al., 2007; Dobrowolski et al., 2008). В 2007, Kalcheva et al. получили мышиную модель ODDD путем внесения I130T в геном мыши (Kalcheva et al., 2007). Хотя выживаемость in utero этих мутантных мышей была менее, чем ожидалось в соответствии с Менделевским распределением, сердца мутантов, которые рождались, были морфологически нормальными и их контрактильные функции не были нарушены. I130T приводит к снижению тотальной экспрессии Cx43 в сердцах мышей, при этом предпочтительно теряются фосфорилированные формы Cx43. Следовательно, мыши, несущие I130T, обнаруживают снижение образования бляшек щелевых соединений между кардиальными клетками in vivo, снижение проводимости через соединения и снижение купирования краски между изолированными неонатальными кардиомиоцитами. Ex vivo эксперименты демонстрируют снижение скорости проведения в целом сердце и более высокую чувствительность к спонтанным и индуцибельными желудочковыми тахиаритмиями. Dobrowolski et al. (2008) получили ODDD мышиную модель, экспрессирующую G138R с фенотипическими проявлениями, которые наблюдаются у пациентов с ODDD, такими как синдактилия, гипоплазия эмали, черепно-лицевые аномалии и бедность волос. Более того, кардиальный специфический мутант для G138R (Cx43+/FloxG138R:alphaMyHC-Cre) погибает преждевременно между 2 и 6.5 мес. после рождения. Только 20% из этих мышей обладают более маленькими сердцами по сравнению с сердцами мышей WT, но ни одно из них не обнаруживает морфологических аномалий миокарда. Несмотря на это, ex vivo анализ по Langendorff перфузных сердец показал, что сердца от G138R мышей обнаруживают спонтанные и устойчивые желудочковые аритмии. ECG анализ во время этих ex vivo перфузий подчеркнул существенные изменения в P, PQ, QRS интервалах и продолжительности QTc и в R и RS амплитудах, указывая на нарушения распространения импульсов. Аритмии in vivo также наблюдались у G138R мутантных мышей, и с более высокой частотой и тяжестью в условиях гипоксии. В сердцах G138R мышей, Cx43 менее фосфорилирован (P2 фосфорилированная изоформа отсутствует) и присутствует как в интеркалированных дисках, так и в латеральных мембранах кардиомиоцитов. Важно, что экспрессия в предсердиях Cx40 и экспрессия в желудочках Cx45 не были затронуты у G138R. Следовательно, G138R приводит к 94% снижению купирования краски между кардиомиоцитами. Кроме того, эксперименты по двойному voltage clamp, осуществляемые на клетках HeLa, трансфицированных G138R, показали полное отсутствие электрического купирования между парами клеток. Наконец, клетки, экспрессирующие G138R, обнаруживают повышенное высвобождение АТФ и потребление PI после стимуляции средой, свободной от Ca²⁺ по сравнению с клетками, экспрессирующими Cx43. Активность АТФ-высвобождающих каналов была ассоциирована с хроническим эффектом на кардиомиоциты. Авт. предположили, что повышенная активность АТФ-высвобождающих каналов в G138R-мутантных кардиомиоцитах может вызывать аритмогенез у G138R мутантных мышей. В 2005, Flenniken et al. открыли доминантную G60S мутацию в Cx43 в геноме мыши, которую они назвали Jrt (Flenniken et al., 2005). Эти gja1^Jrt/+ мыши обнаруживают драматическое снижение экспрессии Cx43 в их сердцах и потерю каналов щелевых соединений в интеркалированных дисках между кардиомиоцитами (Flenniken et al., 2005). Это снижение в основном обусловлено потерей фосфорилированных форм Cx43 (Manias et al., 2008). У мышей, несущих G60S, Cx43 в основном присутствует в аппарате Гольджи, а электрическое купирование между кардиомиоцитами существенно снижено на 50% (Manias et al., 2008). G60S мутантные мыши обладают морфологическими миокардиальными аномалиями, такими как patent foramen ovale, и усиленная минерализация, фиброз и воспаление (Flenniken et al., 2005). Интересно, что некоторые мутантные мыши обнаруживают аномальное кардиальное проведение, такие как удлинение продолжительности QRS, эктопические сердцебиения или удлиненные PR интервалы, но эти наблюдения редки (Flenniken et al.,2005). Однако, старые мутантные мыши (в возрасте 50-67 недель) обнаруживают недостаточность правого желудочка и молодые и старые мутантные мыши обладают повышенным временем pre-ejection и ejection, повышенным диастолическим chamber dimension и пониженной толщиной диастолической стенки. Хотя эти мыши обнаруживают многие классические симптомы человеческой болезни ODDD, необходимо отметить, что G60S мутация никогда не обнаруживалась у человека.

Поскольку Cx43 экспрессируется повсеместно в теле, то эффекты мутаций Cx43 в др. типах клеток помимо кардиомиоцитов, также были исследованы. В мочевом пузыре Cx43 экспрессируется в фибробластах, миофибробластах (Ikeda et al., 2007) и гладкомышечных клетках (Lorentz et al.,2012). Сообщения между клетками с помощью щелевых соединений, как полагают, участвуют в нормальной функции мочевого пузыря путем регуляции передачи электрических стимулов от одного мышечного пучка к следующему (Sui et al., 2002; Fry et al., 2007). Используя I130T и G60S мутантных мышей, было показано, что фосфорилирование Cx43 снижено в мочевом пузыре и что G60S мыши обнаруживают большее внутриклеточное распределение Cx43 по сравнению с мышами WT (Lorentz et al., 2012). Кроме того, экспрессия Cx43 снижена в гладкомышечных клетках мочевого пузыря, полученных от мышей G60S и I130T, это сопровождается снижением распространения краски между этими клетками (Huang et al., 2014). Интересно, что сокращения гладкомышечных клеток мочевого пузыря от мутантов G60S и I130T значительно снижены по сравнению с мышами WT, а способность этих клеток репрограммироваться после стимулов растяжения у мышей нарушена (Huang et al., 2014). Хотя некоторые исследования описывают эффекты мутаций Cx43 на ECs и гладкомышечные клетки, прямое следствие этих мутаций на функционирования сосудов in vivo пока неизвестно.

В целом, исследования, проведенные с мутациями GJA1 показывают, что они редко ассоциируют с морфологическими аномалиями миокарда у человека. Отсутствие кардиального электрического фенотипа у ODDD пациентов остается неясным, но дальнейшее развитие мутантных по Cx43 мышей д. помочь лучшему пониманию последствий этих мутаций для развития и функционирования сердца.

GJA5 (Cx40) mutations cause AF Cx40 in the cardiovascular system

Ген GJA5 (MIM: 121013) клонирован в 1994 (Kanter et al., 1994). Он располагается на участке хромосомы 1q21.2 и кодирует белок щелевого соединения в 358 аминокислот, характеризуемый как Cx40 (Kanter et al., 1994; Gelb et al., 1997). В 2003, Dupays et al. идентифицировали два сплайс-варианта в гене Cx40 человека, которые отличаются по 5'-нетранслируемому региону (Dupays et al., 2003). Далее они показали, что транскрипт использует экзон 1A, преимущественно экспрессируемый в ECs, и транскрипт, использующий экзон 1B, в основном присутствующий в цитотрофобластах. Оба транскрипта экспрессируются во всех исследованных регионах сердца, но наивысшие уровни обнаруживаются в предсердиях (Dupays et al., 2003). В самом деле, детальные иммунофлюоресцентные исследования выявили, что экспрессия Cx40 в сердце в основном ограничена предсердиями и проводящей системой сердца; заметно её отсутствие в миокарде желудочков (Gros and Jongsma, 1996). Cx40 является белком щелевых соединений преимущественно в предсердиях. Однако, Cx43 обильно экспрессируется также на низких уровнях, характерных для Cx45 в здоровом сердце. Подобно щелевым соединениям желудочков, щелевые соединения предсердий проходимы для токов от одного миоцита к соседнему и являются критическими для скоординированного распространения электрической активности. Исследования Cx40-дефицитных мышей(Cx40^-/-) подтвердили доминирующую роль Cx40 в проведении импульсов в предсердиях и в проводящей системе сердца. Повсеместная делеция Cx40 вызывает существенные изменения ECG, включая удлинение волны P, PQ (или PR) интервала, продолжительности QRS и QTc (Kirchhoff et al., 1998; Simon et al., 1998; Hagendorff et al., 1999; Verheule et al., 1999; VanderBrink et al.,2000). Интересно, что мыши Cx40^-/-, по-видимому, чувствительны к предсердным аритмиям (Kirchhoff et al., 1998; Verheule et al., 1999; Bagwe et al.,2005). Более того, общий показатель пороков сердца повышается с 18% у Cx40^+/- мышей до 33% у Cx40^-/- мышей (Gu et al., 2003). Наиболее распространёнными нарушениями были, происходящие из conotruncal источника (соответствующим двойному выходу из правого желудочка или тетраде Фалло), но наблюдались также и дефекты эндокардиальных подушек и др. пороки. Интересно, что дупликации на хромосоме 1q21.1, которые содержат GJA5, ассоциируют с повышенным риском тетрады Фалло (Greenway et al., 2009; Soemedi et al., 2012) , а недавно первая миссенс мутация в гене GJA5 оказалась сцепленной с этой болезнью (Guida et al., 2013). Эта P265S вариация, располагается в CT в Cx40 (Figure 5),по-видимому, предупреждает образование щелевых соединений в межклеточных контактах. Более того, микроинъекции P265S в эмбрионы рыбок данио нарушали общую морфологию сердечной трубки у 37% эмбрионов (по сравнению с 6% у эмбрионов с инъекцией Cx40). Итак, эти находки идентифицировали GJA5 как новый ген чувствительности к тетраде Фалло.

Figure 5. Schematic representation of mutations associated with atrial fibrillation (AF), progressive familial heart block type I (PFHBI) and tetralogy of Fallot (TOF) along the structure of Cx40.

GJA5 mutations and AF

AF, наиболее распространенное нарушение сердечного ритма, оно увеличивается с возрастом и является наиболее частой причиной сердечного приступа (stroke) (Anderson et al., 2013). Хотя AF довольно часто ассоциирует со структурными болезнями сердца, существенная пропорция пациентов с AF не обнаруживает клинических доказательств сердечно-легочного заболевания, включая гипертензию. Интересно, что большая пропорция пациентов с AF имеет болезнь в анамнезе, указывая на наследственную природу (Fox et al., 2004). Соотв. различные семейные формы AF обусловлены генетическими мутациями или полиморфизмами в ионных каналах сердца, включая аномалии в GJA5.

Effects of GJA5 mutations on Cx40 channel function

Gollob et al. (2006) секвенировали GJA5 из геномной ДНК, экстрагированной из выделенной ткани предсердий и из лимфоцитов периферической крови от 15 пациентов с идиопатической AF с ранним началом. 4 гетерозиготные миссенс мутации в GJA5 были идентифицированы у 4 из 15 пациентов. У трех пациентов эти мутации были найдены в кардиальной ткани только, указывая на соматические мутации и у одного пациента найдена мутация зародышевой линии в ДНК кардиального и лимфатического происхождения. Мутации в GJA5 предсказуемо приводили к аминокислотным заменам в TM регионах Cx40, это G38D в TM1, P88S и A96S в TM2 и M163V в CL вблизи к TM3 (Figure 5). Секвенирование ДНК лимфоцитов от 120 здоровых субъектов и кардиальной ДНК у пациентов после хирургического вмешательства без AF в анамнезе не выявило доказательств замен G38D, P88S и M163V, тогда как A96S была идентифицирована в ДНК от одной контрольной персоны. Методы трансфекции на клетках N2A показали, что P88S предупреждает эффективный транспорт Cx40 на клеточную поверхность. Сходным образом, G38D обнаруживает внутриклеточное сохранение и немногочисленные щелевые соединения в межклеточных контактах, тогда как A96S и M163V обнаруживают сходные количества локализации Cx40 в бляшках щелевых соединений, как и в случае Cx40. В соответствии с повышенным внутриклеточным сохранением мутантных белков, электрофизиологические записи выявили отсутствие межклеточного купирования между трансфицированными P88S парами клеток, а G38D трансфицированные N2A клетки обнаруживали более низкое проведение через щелевые соединения, чем после трансфекции нормальным Cx40. M163V обнаруживали нормальные уровни электрического купирования, но проводимость через щелевые соединения была заметно снижена у A96S трансфицированных клеток (по сравнению с трансфекцией Cx40 ) , несмотря на их довольно обычное субклеточное распределение. Более того, электрическое купирование было также заметно снижено, когда A96S экспрессировался совместно с Cx40, указывая на доминантную негативную природу этой мутации. В целом, авт. впервые продемонстрировали, что мутации в GJA5 могут вызывать предрасположенность у пациентов к идиопатическим AF за счет нарушения сборки Cx40 в щелевые соединения или нарушения электрического купирования. A96S также недавно обнаружена у одного субъекта из кагорты в 342 пациентов из Скандинавии с ранним началом (менее 60 лет) только с AF (Christophersen et al., 2013). Интересно, что недавнее исследование выявило, что Cx40 A96S мутация вызывает снижение скорости проводимости предсердий и постоянные эпизоды индуцированной AF у мышей (Lubkemeier et al., 2013).

Недавнее исследование 218 китайских неродственных семей с AF сообщило о трех новых мутациях в GJA5, т.е. V85I, L221I и L229M, предположительно вызывающих изменения вTM2, TM4 и CT (вблизи TM4), соотв. (Yang et al., 2010a; Figure 5). Анализ родословных показал, что мутации наследуются параллельно с передачей AF как аутосомного признака с полной пенетрантностью в трех затронутых семьях. Установлено, что аминокислоты в позициях 85, 221 и 229 высоко консервативны среди ортологов Cx40, это подтверждает возможное функциональное значение этих мутаций. Функциональное значение L229M недавно было исследовано на трансфицированных N2A клетках группой Donglin Bai (Sun et al., 2013). Интересно, что мутанты не обнаруживали какого-либо очевидного дефекта купирования при экспрессии в отдельности или совместно с Cx40, но специфически снижали проводимость через щелевые соединения при совместной экспрессии с Cx43. Это исследование также сообщило об идентификации новой мутации в GJA5, I75F, в группе из 68 неродственных китайских пациентов только с AF. Эта новая мутация в EL1 (вблизи TM2) в Cx40,по-видимому, не влияет на сборку белка в щелевые соединения, но при этом отсутствует электрическое купирование (стыковка) между N2A клетками, экспрессирующими только мутантный белок. Более того, существенное снижение электрического купирования наблюдается, когда I75F экспрессируется совместно с Cx40 или Cx43. Наконец, анализ китайской семьи с 7 AF индивидами привел к идентификации предположительно причинной мутации в гене GJA5, Q49X (Yang et al., 2010b). Мутация вызывает укорочение Cx40 и совместно сегрегирует с 7 AF пробандами аутосомно-доминантным способом. Исследования по трансфекции с N2A и Hela клетками установили, что мутант Q49X неспособен формировать функциональные щелевые соединения, поскольку он остается внутри клетки в ER (Sun et al., 2014). В целом, можно заключить, что множественные мутации, обнаруженные в GJA5 в разных популяциях и приводящие к функциональным дефектам или образования щелевых соединений или электрического купирования в ассоциации Cx40 с наследуемой AF установлено впервые. Возникает вопрос, могут ли мутации GJA5 играть роль в проводящей системе сердца, в которой Cx40экспрессируется на высоком уровне.

Интересно, что мутация в GJA5 недавно найдена у пациента с прогрессивным семейной блокадой сердца типа I (доминантно наследуемое нарушение системы Гиса-Пуркинье, что приводит к тяжелому дисбалансу сердечного ритма, включая внезапную кардиальную гибель) (Makita et al.,2012). Эта гетерозиготная миссенс мутация в GJA5 предсказуемо приводит к аминокислотной замене Q58L в EL1 в Cx40. Интересно, что присутствие Glutamine аминокислоты в позиции 58,по-видимому, сильно законсервировано среди ортологов Cx40 , также как и у Cx43 и Cx45. Экспрессия Q58Lв клетках N2A приводит к диффузной локализации мутантного белка вблизи плазматической мембраны без образования щелевых соединений. Более того, Q58L изменяет биофизические свойства каналов щелевых соединений Cx40. В целом это исследование четко подчеркивает важность Cx40 в распространении потенциала действия в специализированной проводящей системе.

Генетические полиморфизмы были обнаружены как в промоторных регионах GJA5 (промотор A: rs35594137 и rs11552588; промотор B: rs1046588). Метод репортеров в клетках с избыточной экспрессией Cx40 показал, что эти полиморфизмы влияют на активность промоторов Cx40, снижая экспрессию генов приблизительно наполовину, при этом вариации внутри метода колеблются от 20% до 65% снижения (Groenewegen et al.,2003; Firouzi et al., 2006a; Juang et al., 2007; Wirka et al., 2011). Эти полиморфизмы были также ассоциированы преимущественно с AF (пароксизмальными или хроническими) в Тайваньской популяции (Juang et al., 2007) а также с повышенной ранимостью в отношении идиопатических AF в Нидерландах и США (Firouzi et al., 2004; Wirka et al., 2011). Однако, у пациентов с необъяснимой церебральной ишемией высокое превалирование полиморфизма Cx40 как маркера, лежащего в основе идиопатической AF, по-видимому, отсутствует (Chaldoupi et al., 2009). Наконец, совместное наследование генетических полиморфизмов может модифицировать клинические проявления наследуемых аритмий. В этом отношении двугенное наследование полиморфизмов Cx40 промотора A в сочетании с мутациями в SCN5A, гене, кодирующем субъединицу кардиального Na канала, привлекло особое внимание к врожденному предсердному бездействию (Groenewegen et al., 2003; Makita et al., 2005).

Интересно, что полиморфизмы промоторов Cx40 оказались также ассоциированы с повышенным риском гипертензии у мужчин в исследовании небольшой популяции при сравнении двух групп из 88 нормотензивных и 89 гипертензивных датчан (Firouzi et al., 2006b). Упомянутое ранее исследование подтвердило результаты, полученные на Cx40-дефицитных мышиных моделях (de Wit et al., 2003; Krattinger et al., 2007; Wagner et al.,2007), и тем самым могло привести к идентификации новых терапевтических мишеней при гипертензии. Однако, эти находки не были подтверждены в крупной Швейцарской популяции (Pfenniger et al., 2012). Более того, несмотря на явную противо-атерогенную роль Cx40 у мышей (Chadjichristos et al., 2010), недавние исследования также не смогли выявить ассоциацию полиморфизмов Cx40 промоторов и болезни коронарных сосудов (CAD), стабильности атеросклеротических бляшек или острых MI в Швейцарских, Датских или Иранских популяциях (Pfenniger et al., 2012; Seifi et al., 2013). Хотя очевидно, что Cx полиморфизмы влияют на функцию каналов, такие как Cx37 C1019T полиморфизм (see below), могут иметь более важное значение для сосудистых болезней, чем полиморфизмы, затрагивающие экспрессию уровня белка, как в случае полиморфизмов Cx40 промоторов.

GJA4 (Cx37) polymorphisms cause vascular disease Cx37 in the cardiovascular system

Ген GJA4 (MIM: 121012),первоначально был клонирован в 1993 (Reed et al., 1993),располагается на хромосоме человека 1p35.1 (Van Camp et al.,1995). GJA4 кодирует Cx37, полипептид из 333 аминокислот с предсказуемым молекулярным весом в 37.238 Da. Как упоминалось, Cx37 экспрессируется на высоком уровне в ECs покрывающем крупные артерии и также найден в др. типах клеток, таких как ооциты, определенные типы воспалительных клеток (напр. макрофагов) и тромбоциты (Chanson and Kwak, 2007; Angelillo-Scherrer et al., 2011). У мыши, Cx37 формирует щелевые соединения между ооцитом и гранулёзными клетками и необходим для оогенеза и овуляции. Фактически, Cx37^-/- мыши обнаруживают нарушения овуляции и развитие избыточных неадекватных corpora lutea, приводящие к бесплодию (Simon et al., 1997). Принимая во внимание высокую экспрессию Cx37 по всей сосудистой системе, не удивительно, что не было обнаружено очевидных сердечно-сосудистых дефектов у Cx37^-/- мышей.

Cx37 экспрессируется на низких уровнях в циркулирующих моноцитах мыши и человека (Wong et al., 2006). Более того, экспрессия Cx37 усиливается как только моноциты вступают в атеросклеротические повреждения и дифференцируются в нагруженные липидами макрофаговые ксантомные клетки (Kwak et al., 2002) . В моноцитах Cx37 действует как негативный регулятор клеточной адгезии. Фактически адгезия Cx37-дефицитных моноцитов с ECs усиливается и их способность инфильтрироваться в атеросклеротические повреждения увеличивается (Wong et al., 2006).

В 2011, Angelillo-Scherrer et al. сообщил и о присутствии Cx37 в тромбоцитах мыши и человека (Angelillo-Scherrer et al., 2011), это позднее было подтверждено др. независимыми исследованиями Vaiyapuri et al., 2012). Более того, авт. показали, что генетическая делеция Cx37 у мышей снижает время кровотечения (после отсечения хвоста) и усиливает образование тромбов (in both thromboembolism and arterial injury models) по сравнению с мышами WT (Angelillo-Scherrer et al., 2011). В тромбоцитах Cx37-обеспечиваемое купирование с помощью щелевых соединений между тромбоцитами, действует как негативный регулятор склонности к тромбозам. Соответственно, когда тромбоциты становятся предметом блокаторов щелевых соединений Cx37 (специфических mimetic пептидов или неспецифических химических ингибиторов), то агрегация тромбоцитов существенно увеличивается (Angelillo-Scherrer et al., 2011).

Принимая во внимание критическую роль Cx37 в эндотелии, моноцитах, макрофагах и тромбоцитах, не удивительно, что генетические вариации, затрагивающие функцию Cx37-построенных каналов, ассоциируют с сосудистыми воспалительными болезнями человека.

Effect of GJA4 polymorphisms on Cx37 channel function

Генетический полиморфизм в GJA4 впервые был описан Richard and colleagues (Richard et al., 1997). Этот полиморфизм одиночных нуклеотидов (SNP), сдвиг C в T происходит в позиции 1019 (C1019T) в GJA5 и вызывает замещение Proline на Serine аминокислоту 319 (P319S) в цитоплазматическом хвосте Cx37. Это SNP должно или затрагивать функцию канала из-за альтерации его состояния фосфорилирования или модификации его взаимодействий с др. белками. В самом деле, Cx37-319S представлен мотивом фосфорилирования, а Cx37-319P является частью Proline повтора, важного для третичной структуры белков. Фактически, становится очевидным, что Cx37-319P вариант открыт для фосфорилирования по Serine 321 с помощью GSK-3, и что это событие фосфорилирования регулирует межклеточные коммуникации посредством щелевых соединений в трансфицированных SK-HEP-1 клетках (Morel et al., 2010). Более того, электрофизиологические измерения, проведенные на трансфицированных HeLa и N2A клетках показали, что Cx37-319P каналы обладают более высокой проводимостью через одиночный канал, чем Cx37-319S каналы (Derouette et al., 2009; Pfenniger et al., 2010). Усиление функции полуканала Cx37-319P совпадает с повышением высвобождения АТФ и нарушением клеточной адгезии (Wong et al., 2006; Derouette et al., 2009). Как и последствия его эффектов на свойства полуканалов, полиморфизм C1019T, по-видимому, ассоциирует с патологией сосудов у человека (Table 5).

Table 5. Human disease associated with Cx37 C1019T polymorphism

Cx37 polymorphisms and cardiovascular disease

Атеросклероз и его последствия, CAD, MI и апоплексические удары, являются ведущей причиной смертности в Западных странах (Roger et al., 2012). Атеросклероз это многофакторное заболевание, затрагивающее средние и крупные артерии. Эта болезнь вызывается иммуно-воспалительной реакцией, во время которой эндотелий подвергается воздействию факторов риска, таких как гиперхолестеролемия, гипертензия, курение или диабет, инициируются критические повреждения артериальной стенки. Последующая 'реакция на повреждения' приводит к образованию атеросклеротических бляшек, состоящих из воспалительных клеток, пролиферирующих VSMCs и внеклеточного матрикса (Hansson, 2005; Badimon et al., 2011). Хотя рост бляшек может приводить к существенному стенозу артерий, что ограничивает кровоток, приводя к острым нарушениям, таким как MI и инсульты часто в результате разрыва бляшки и последующего тромбоза, что может приводит к полной закупорке артерии.

Многочисленные генетические полиморфизмы, включая Cx37 C1019T полиморфизм, участвуют в развитии атеросклеротической болезни. Boerma et al. (1999) идентифицировали повышенную частотуаллеля 1019C у индивидов с атеросклеротическими бляшками в их кародитных артериях. Т.о., авт. полагают, что полиморфизм Cx37 может представлять собой прогностический маркер развития атеросклеротических бляшек (Boerma et al., 1999). Затем многие исследования изучали ассоциацию между полиморфизмом C1019T и клиническими проявлениями атеросклероза. Большинство этих исследований подтвердили участие или 1019C или 1019T аллеля в CAD и MI (Yeh et al., 2001; Yamada et al., 2002; Listi et al., 2005; Lanfear et al., 2007; Listi et al., 2007; Wong et al., 2007; Han et al., 2008a; Seifi et al., 2013), хотя немногие группы сообщали об отсутствии корреляции полиморфизма Cx37 с атеросклерозом (Horan et al., 2006; Collings et al., 2007; Hubacek et al., 2010). Интересно, что 1019C аллель (Cx37-319P форма) обычно ассоциирует достоверно с возникновением атеросклеротических повреждений в артериях (Boerma et al., 1999; Wong et al., 2007; Han et al., 2008b). Напротив, аллель1019T (Cx37-319S форма), по-видимому, ассоциирует не только с сосудистыми заболеваниями (Yeh et al., 2001; Hirashiki et al., 2003; Lanfear et al., 2007), но и также с MI (Yamada et al., 2002; Listi et al., 2005, 2007). Как упоминалось выше, моноциты, трансфицированные Cx37-319S обнаруживают нарушения высвобождения АТФ посредством своих полуканалов, приводя к усилению клеточной адгезии (Wong et al., 2006). Этот мехнизм подтверждается тем фактом, что АТФ быстро метаболизируется с помощью внеклеточных энзимов в adenosine, который обладает противо-воспалительными свойствами за счет связывания его с A2B рецепторами, которое снижает адгезию (Eltzschig et al., 2003). Как следствие вариант Cx37-319P может быть защитным от MI за счет редукции рекрутирования моноцитов в атеросклеротические повреждения, включая бляшки, которые могут быть менее уязвимыми к повреждениям.

Строгая ассоциация между полиморфизмом Cx37 и болезнью периферических артерий была также описана у мужчин и женщин, страдающих от диабета (Katakami et al., 2009; Pitha et al., 2010). Однако, роль этого полиморфизма при ишемических инсультах и повторных сужениях просвета всё ещё противоречива. Хотя некоторые исследования не выявили коррелияции между полиморфизмом C1019T и этими двумя патологиями (Horibe et al., 2004; Juo et al., 2012), др. недавние публикации подтверждают такую ассоциацию. Leu et al. (2011) осуществили ультразвуковое исследование B-mode carotid артерий у 3330 здоровых взрослых и проанализировали эффекты генетических вариантов Cx37 с помощью multivariate regression модели спустя 10.7 лет после исследования субъектов ишемическими инсультами. Во время этого периода наблюдения 80 пациентов с ишемическими инсультами (2.4%) были идентифицированы и те, которые несли T аллель GJA4 обнаруживали увеличение толщины intima/media по сравнению с теми, что несли C аллель. Более того, аллель Т достоверно ассоциировал с повышенным риском ишемических инсультов. Это исследование предоставило доказательство, что аллель 1019T в GJA4 может быть прогностическим признаком ишемического инсульта. Сходным образом, Guo et al. (2013) недавно установили ассоциацию между полиморфизмом C1019T и появлением повторных стенозов после стентирования в Китайской популяции. В этом исследовании авт. исследовали ассоциацию между полиморфизмом Cx37 и возобновлением стеноза у CAD пациентов. Среди 532 отобранных пациентов, 67 обнаруживали повторно стеноз, а 465 нет. Поразительно при сравнении со здоровым контролем, частота C аллеля была выше у CAD пациентов. Более того, частота аллеля C в Cx37 достоверно увеличивалась у пациентов с повторным стенозом после стентировния. Фактически риск повторного стеноза превосходил втрое у мужчин, носителей аллеля C (CC + CT) по сравнению с TT гомозиготами. Следовательно, это подтверждает, что 1019C SNP может быть также фактором риска для повторных стенозов.

Conclusions

More and more gene mutations of cardiovascular Cxs genes have been linked to diseases such as lymphoedema, and ODDD. A role for polymorphisms cardiovascular Cxs genes is also well established for a SNP in GJA4 that is, amongst other polymorphisms, linked to atherosclerosis. Obviously, these kinds of studies do not provide mechanistical insights regarding molecular mechanisms that cause pathologies. Nevertheless, they are important; they could for example lead to patient risk stratification based on genetic screening.

Cxs are exciting potential therapeutical targets but specific Cx-targetting drugs have not yet reached the market. Probably the biggest challenge is finding which drugable molecular pathways are affected by Cxs. Studies on links between mutations and polymorphisms in Cx genes and pathologies can help in this respect; they may provide guidance regarding which mutation or pathway to study.

Cxs are of utmost importance for various physiological processes but have only very recently been discovered in for example LECs. In addition, the Cx interactome is currently understudied. Thus, an exciting future for Cx researchers is laying in front of us. In that future we, as researchers and clinicians, should remember that the whole is always more than the sum of its parts. For that reason, clinical science on, for example links between mutations and pathologies, and basic science on the molecular mechanisms involved will hopefully continue to work hand-in-hand to quickly answer relevant questions.

Mutations in cardiovascular connexin genes Filippo Molica, Merlijn J.P. Meens, Sandrine Morel1 and Brenda R. Kwak1 Biology of the Cell Volume 106, Issue 9, pages 269-293, September 2014

Mutations in cardiovascular connexin genes
Filippo Molica, Merlijn J.P. Meens, Sandrine Morel1 and Brenda R. Kwak1
Biology of the Cell Volume 106, Issue 9, pages 269-293, September 2014