Болезни сердечно-сосудистой системы наиболее распространенная причина болезненности и смертности в индустриальных нациях (European World Health Organisation, WHO/Europe). Затраты на уход за заболеваниями сердечно-сосудистой системы в Европе составляют 200 billion евро в год (согласно www.cordis.europa.eu). Хотя классическое фармакологическое лечение улучшает сердечно-сосудистые последствия и выживаемость пациентов с сердечной недостаточностью [напр.. использование beta-блокаторов и ACE (angiotensin (Ang)-converting enzyme) ингибиторов], прогноз у затронутых индивидов остается плохой примерно 2 миллиона сердечно-сосудистых смертей Европейском Союзе в год. Подсчитано, что свыше 50 миллионов людей страдают от сердечной недостаточности в Европейском Союзе.

Это подчеркивает необходимость дальнейшего понимания лежащих в основе механизмов и разработки новейшего эффективного лечения сердечных болезней. Разнообразие сердечно-сосудистых заболеваний, таких как болезни коронарных артерий, гипертензия, инфаркт миокарда, болезни сердечных клапанов, миокардиты и генетические формы кардиопатий часто приводят к фенотипически сходному конечному пункту, сердечной недостаточности (Hill & Olson, 2008). Воздействие на сердце различных стрессов ведет к ремоделированию сердца с финальными вредными последствиями (Fig 1). На клеточном уровне обнаруживается активация и пролиферация фибробластов с последующим увеличением секреции фактора роста и продукции внеклеточного матрикса (ECM), ведущих к фиброзу и будущему снижению кардиальной функции (Hill & Olson, 2008). Ухудшение кровоснабжения и низкая плотность капилляров, а также воспалительные процессы вносят дальнейший вклад в развитие сердечной недостаточности (Fiedler et al, 2011; Heymans et al, 2009). В самом деле, изменения кардиальных фибробластов и эндотелиальных клеток строго влияет на кардиомиоциты и тем самым на общую кардиальную функцию. http://onlinelibrary.wiley.com/store/10.1002/emmm.201100191/asset/image_n/nfig001.jpg?v=1&t=gz8640l5&s=141e214e04cabd2b784197c0c493991ff6b95487 Figure 1. Identified miRNAs to be of therapeutic interest during cardiovascular disease.

Недавние исследования открыли важные и неожиданные роли семейства малых регуляторных молекул РНК, известных как microRNAs (miR; miRNAs) в регуляции различных аспектов кардиальной функции (Bonauer et al, 2009; Care et al, 2007; da Costa Martins et al, 2010; Fiedler et al, 2011; Thum et al, 2008b; van Rooij et al, 2007). MiRNAs не кодируют белков, это малые РНК в 20-23 нуклеотида (nt). которые существуют практически у всех организмов и эволюционно законсервированы (Ambros, 2001), что подтверждает их важную роль в основных биологических процессах. Сначала первичные miRNAs (pri-miRNA) генерируются в клеточном ядре с помощью аппарата транскрипции и затем преобразуются с помощью RNase-III-type энзима Drosha, чтобы сформировать т. наз. предшественники miRNAs (pre-miRNAs; Lee et al, 2003; Thum et al, 2008a). После экспорта в цитоплазму miRNAs преобразуются с помощью рибонуклеазы Dicer в малые в 20-23 nt дуплексные miRNA. Наконец, miRNAs включаются в RNA-induced silencing complexes (RISC), чтобы замалчивать экспрессию генов на пост-транскрипционном уровне путем взаимодействия с мРНК, это ведет к деградации мРНК или ингибированию трансляции и в конечном итоге приводит к целенаправленной репрессии белка мишени. Детали биогенеза и регуляции сердечно-сосудистых miRNAs недавно были рассмотрены в обзоре (Bauersachs & Thum, 2011). Паттерны экспрессии miRNA изменяются при разных сердечно-сосудистых заболеваниях (Bonauer et al, 2009; Care et al, 2007; da Costa Martins et al, 2010; Fiedler et al, 2011; Thum et al, 2007, 2008b; van Rooij et al, 2007, 2008).

У пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями циркулирующие внеклеточные miRNAs присутствуют в телесных жидкостях (Fichtlscherer et al, 2010; Gupta et al, 2010; Widera et al, 2011; Zampetaki et al, 2010). Несмотря на существование рибонуклеаз, miRNAs остаются стабильными в сыворотке и др. жидкостях тела в результате загрузки miRNAs в белковые, липидные или липопротеиновые комплексы, такие как экзосомы или микропузырьки. Т.о., они могут быть использованы как биомаркеры, но могут также функционировать как медиаторы болезни (Gupta et al, 2010; Hunter et al, 2008; Valadi et al, 2007). Поскольку мишенями miRNAs являются не только одиночные mRNAs, но и целые сети из часто функционально родственных транскриптов, то они становятся интересными как новые кандидаты для разработки базирующихся на miRNA терапевтических стратегий при сердечно-сосудистых заболеваниях.

Historical perspective and chemical structures of miRNA modulators

Чтобы ингибировать miRNAs in vivo, синтетические комплементарные олигонуклеотиды в 8-25 nt длиной против основной (seed) последовательности и соседних нуклеотидов miRNA были синтезированы. Обычно нуклеиновые кислоты быстро деградируют в биологических компартментах; поэтому различные химические модификации были протестированы в смысле стабилизации их структуры и увеличения эффективности связывания и клеточного потребления. Химические модификации в основном включали 2-O-methyl-модифицированные олигонуклеотиды и locked nucleic acid (LNA)-модифицированные олигонуклеотиды, где 2-oxygen соединен в 4-позиции посредством methylene линкера, чтобы в результате дать tight bicycle и закрыть его в C3-endo (RNA) sugar конформацию (Elmen et al, 2008a; Krutzfeldt et al, 2007, 2005). Кроме того, баланс между phosphodiester- и phosphorothioate связями между нуклеотидами, важный для стабильности олигонуклеотидов в качестве phosphorothioates, обнаруживает повышенную стабильность (Faria & Ulrich, 2008).

Как показано в Table 1, 2-O-methyl модификация используется очень часто, чтобы повысить стабильность и эффективность олигонуклеотидов. Холестериновая конструкция прицеплялась. чтобы улучшить клеточное потребление (Krutzfeldt et al, 2005; Thum et al, 2008b) и этот подход был успешно использован для воздействия на кардиальную ткань in vivo (Table 1). Недавно представлено великолепное историческое описание развития miRNA терапии (van Rooij, 2011). Группа Stoffel впервые описала нокдаун miRNA млекопитающих с использованием конъюгированных с холестеролом antagomirs, чтобы ингибировать специфичную для печени miRNA, miR-122 (Krutzfeldt et al, 2005). Кроме того, эта группа исследовала эффективность нокдауна многих др. antagomirs и впервые показала, что базирующиеся на холестероле химические модификации также способны к нокдауну экспрессии miRNA в кардиальной ткани после внутривенных инъекций (Krutzfeldt et al, 2005). После этого поворотного исследования, Care et al использовали базирующийся на cholesterol antagomir против miR-133, что приводило к кардиальной гипертрофии у мышей (Care et al, 2007). Др. группа показала первый успешный терапевтический подход с использованием antagomir против, концентрирующейся в фибробластах miR-21, чтобы предупредить кардиальный фиброз (Thum et al, 2008b). Затем это было успешно использовано многими др. исследованиями с использованием ингибиторов miRNA чтобы улучшить сердечно-сосудистую функцию (Table 1). Table 1. Cardiovascular therapeutic miRNA modulation in vivo Field of studies Reference miRNA miRNA modulator chemistry Company Dose Timing Species/organ Outcome n.a., not available. Early studies and hypertrophy and cardiac fibrosis Krutzfeldt et al (2005) let7, 22 16, 122 192.194 2?-O-methyl?+?3?cholesterol Done by authors 80?mg/kg body weight Up to 22 days Mice Administration of antagomirs against miR-16, miR-122, miR-192 and miR-194 resulted in a marked reduction of corresponding miRNA levels. In mice treated with antagomir-16, miR-16 was efficiently silenced in all tissues tested (including heart) except brain Care et al (2007) 133 2?-O-methyl?+?3?cholesterol Dharmacon 80?mg/kg body weight continously via osmotic minipumps 1 month Mice In vivo inhibition of miR-133 caused cardiac hypertrophy da Costa Martins et al (2010) 199b 2?-O-methyl?+?3?cholesterol n.a. 80?mg?kg body weight/day, i.p. Three daily injections Mice, heart In vivo inhibition of miR-199b normalized significantly attenuated cardiac functional impairment, fibrosis and NFAT activity; Dyrk1 is a miR199b target Yang et al (2011) 98 Adenoviral miR-98 or anti-miR-98 contructs Done by authors 109?pfu, intracardial (LV) injection 14 days Mice MiR-98 overexpression reduced AngII-mediated fibrosis and amount of apoptotic myocytes Thum et al (2008b) 21 2?-O-methyl?+?3?cholesterol Regulus Therapeutics 80?mg/kg body weight, jugular vein Three daily injections Mice Antagomir-21 decreased development of cardiac fibrosis and improved cardiac function Thum et al (2011) 21 2?-O-methyl?+?3?cholesterol, F/MOE Modification, 8?mer LNAs Regulus Therapeutics 10-80mg/kg body weight Two injections Mice Differential effects of miRNA inhibitor chemistries on cardiac fibrosis and heart function Patrick et al (2010) 21 LNA-modified, unconjugated and fully phosphorothiolated oligonucleotides, 8-mer Santaris Pharma 25?mg/kg Three daily injections Mice No effect on cardiac remodeling and fibrosis van Rooij et al (2007) 29b 2?-O-methyl?+?3?cholesterol, miR mimics n.a. 80?mg/kg body weight Two injections, tail-vein Mice MiR-29 downregulation increases fibrosis Boon et al (2011) 29 LNA-modified oligonucleutides, 16-mer Exiqon 20?mg/kg Intravenous injection Mice MiR-29 downregulation prevents aortic dilatation Neointima formation Cheng et al (2009) 145 Adenoviral miR-145 construct Done by authors 5???109?pfu/ml One local injection Mice Inhibition of neointima formation Cordes et al (2009) 145 Pre-miR-145 lentivirus System Biosciences 1???107 infectious units External gel application Mice Inhibition of neointima formation Ji et al (2007) 21 2?-O-methyl Integrated DNA Technologies 30?µg/carotid artery local Delivery at days 3 and 7 Mice Inhibition of neointima formation Liu et al (2010) 221/222 2?-O-methyl Integrated DNA Technologies 10?µg/carotid artery Local delivery at do?+?gel Mice Inhibition of neointima formation Lipid metabolism Krutzfeldt et al (2005) 122 2?-O-methyl?+?3?cholesterol Done by authors 80?mg/kg body weight Three daily injections Mice Cholesterol reduction Marquart et al (2010) 33 MiR-33 inhibitor (no chemistry mentioned) miRagen Therapeutics 5?mg/kg/day Three consecutive days Mice Increase in plasma HDL levels Najafi-Shoushtari et al (2010) 33a LNA-modified oligonucleutides n.a. 20?mg/kg/day i.v. Three consecutive days Mice Increase in plasma HDL levels Rayner et al (2010) 33 Lentiviral anti-miR-33 construct System Biosciences 2???109?pfu/mouse retroorbitally Single injection Mice Increase in plasma HDL levels Rayner et al (2011) 33a/b 2?-F/MOE modification Regulus Therapeutics 5?mg/kg s.c. Twice weekly for 2 weeks, then weekly Monkeys Increase in plasma HDL levels Decrease in VLDL triglycerides Endothelial biology Bonauer et al (2009) 92a 2?-O-methyl?+?3?cholesterol VBC Biotech 8?mg/kg body weight (5 injections) 14 days Mice Inhibition of miR-92a led to enhanced blood vessel growth and functional recovery of damaged tissue Caporali et al (2011) 503 Adenoviral decoy-miR-503 Invitrogen 109?pfu, one muscular injection 3-21 days Mice Inhibition of miR-503 normalizes post-ischemic flow van Solingen et al (2009) 126 2?-O-methyl?+?3?cholesterol Dharmacon 1.0?mg/mouse i.v. 10 days Mice MiR-126 inhibition reduced angiogenic response McArthur et al (2011) 200b n.a. Dharmacon 1.4?µg/week 4 weeks Rat retina Increased VEGF production Fiedler et al (2011) 24 2?-O-methyl?+?3?cholesterol Regulus Therapeutics 80?mg/kg body weight, retroorbital injection 14 days Mice Endothelial miR-24 blockade improves capillary density, limits infarct size and improves heart function Cell survival Porrello et al (2011) 15b,16 Locked nucleic acid-modified anti-miRNAs miRagen Therapeutics 25?mg/kg body weight Three injections Mice Knockdown of miR-15 family was associated with an increased number of mitotic cardiomyocytes Ren et al (2009) 320 2?-O-methyl?+?3?cholesterol Dharmacon 80?mg/kg body weight Single tail vein injection, 3 days Mice In vivo treatment with antagomir-320 reduced infarction size and increased Hsp20 in the heart Cardiac rhythm Lu et al (2010) 328 Adenoviral miR-328 precursor; antagomir: 2?-O-methyl?+?3?cholesterol Overexpression GenScript and by authors Antagomir: Ribobio Co. Overexpression: 109?pfu, multiple Intraatrial injections; antagomir 80?mg/kg/d i.v. for 3 days Dogs: 12?h Mice: 14 days Dogs (overexpression) Mice (antagomir) Antagomir-328 abrogated or stopped atrial fibrillation and improved cardiac function post-myocardial infarction

Альтернативные модификационные стратегии включают использование LNA химических технологий, которые, как было установлено, осуществляют эффективный нокдаун на уровне miRNA мишеней. LNA модификации олигонуклеотидов приводят к формированию термодинамически очень сильных дуплексов с комплементарной РНК (Grunweller & Hartmann, 2007) и поэтому являются биологически высоко эффективными (Table 1). Напр., системная доставка неконъюгированного LNA-antimiR сильно замалчивает miR-122 как у мышей, так и не человекообразных приматов (Elmen et al, 2008a, 2008b) и эти antimiRs были успешно использованы в модели болезни гепатита C у приматов (Lanford et al, 2010). Важно, что использование этой технологии сегодня находится в первой фазе I и II клинических испытаний (Santaris Pharma, www.ClinicalTrials.gov). В частности, в клинической фазе II испытаний лечатся пациенты с гепатитом C с помощью базирующегося на LNA специфического ингибитора miR-122 и вскоре ожидаются результаты.

Т.о., как antagomir, так и LNA-модифицированные олигонуклеотиды могут эффективно находить miRNAs in vivo, хотя LNA-модифицирующие химические технологии, по-видимому, нуждаются в более низких дозах, исходя из их высокого сродства связывания. Недавно получены очень короткие 8-mer полностью модифицированные LNA олигомеры, направленные против только основного (seed) региона miRNA (Obad et al, 2011; Patrick et al, 2010). Этот подход может быть успешным, когда осуществляется поиск множественных членов семейства miRNA с одной и той же желательной seed последовательностью. Однако, фармакокинетика т.наз. крошечных miRs, по-видимому, отличается в разных типах органов; в то время как длительно сохраняющиеся высокие концентрации после применения крошечных miR-21 мы наблюдали в органах, таких как печень и почки, чрезвычайно быстрое снижение тканевой доступности наблюдалось в легких и сердце (Obad et al, 2011), указывая, что оптимальный таргетинг разных органов может нуждаться в разных химических технологиях. Это может объяснить, почему лечение с помощью 22 nt-длиной базирующихся на cholesterol- или (fluoro)O-methoxyethylphosphorothioate (F/MOE) antagomirs против miR-21 оказалось успешным, чтобы предупредить кардиальный фиброз, вызванный давлением и перегрузками у мышиных моделей (Thum et al, 2011, 2008b), тогда как использование базирующихся на LNA 8 nt-long antimiRs не предупреждало (Patrick et al, 2010).

Дополнительные стратегии по снижению экспрессии miRNA используют miRNA стиратели или губки (Wang, 2011). Принцип заключается в использовании векторной конструкции, которая обладает множественными сайтами связывания miRNA, при этом интересующая miRNA может соединяться с ним и тем самым оказывается более недоступной для связывания мишеней.

Помимо замалчивания miRNAs, усиление их активности и/или улучшение может представлять терапевтический интерес. Однако подходы, чтобы оптимизировать miR mimics в терминах стабилизации и эффективности избыточной экспрессии miRNA оказались скорее разочаровывающими. miR-mimic состоит из двунитчатого олигонуклеотида, включая зрелую последовательность miRNA и комплементарную пассажирскую нить. При первой попытке van Rooij с коллегами локально инъецировали miR-29 mimics в сердце после инфаркта миокарда и наблюдали умеренное усиление активности miR в результате этого подхода (van Rooij et al, 2008). Здесь четко улучшенная химическая стабилизация и/или конъюгация с поставляемыми молекулами необходима, чтобы вызывать сильные биологические эффекты. Дальнейшая стратегия по повышению уровней miRNA применена, чтобы использовать доставку miRNA посредством adeno-associated viruses (AAVs; Hinkel et al, 2011). Определенные AAV серотипы обладают уникальным свойством тропизма к предпочтительному типу клеток, не приводя к существенным воспалительным реакциям (Wang et al, 2011). Напр., AAV9, который концентрируется в сердце после применения (Bish et al, 2008). Т.о., после вирусной доставки посредством специфических AAV серотипов отобранные miRNAs могут быть обогащены в ткани мишени, это может быть важным для таких miRNAs. которые подавляются во время сердечно-сосудистой болезни. Специфическое к типу клеток возвращение такого инструмента доставки miRNA может быть достигнуто использованием ткане-специфических промоторов для экспрессии.

Delivery of miRNA therapeutics, pharmacokinetics and costs

Большинство олигонуклеотидов после химических технологий растворимо в воде и/или растворе соли и может быть инъецировано животным с помощью разных подходов и маршрутов использования (see Table 1). Внутривенное введение через хвостовую вену, яремную вену или retro-orbital венозное сплетение используются наиболее часто. Однако недавние исследования показали, что внутрибрюшинные инъекции базирующихся на cholesterol antagomirs (da Costa Martins et al, 2010) или базирующихся на LNA химических технологиях могут быть использованы для замалчивания miRNAs в сердце (Table 1). Недавнее исследование сравнивало внутривенное, внутрибрюшинное или подкожное введение для инъекции 25 mg/kg antimiR-208a (Montgomery et al, 2011). Все три способа введения давали сильное ингибирование miR-208a на 1, 4, 7 и 14 день при отсутствии достоверных отличий в детекции antimiR-208a между разными способами введения для плазмы, сердца, печени или почек. Немного экспериментов по введению, напр., в аорту, но очевидно, что более высокие концентрации необходимы (Boon et al, 2011). Др. исследование сравнивало эффекты разных доз базирующихся на холестероле antagomirs на потребление специфическими типами клеток и на замалчивание miR-24 (Fiedler et al, 2011). В этом исследовании дозы 80 mg/kg antagomir против miR-24 приводили к молчанию экспрессии miR-24 как в кардиомиоцитах, так и кардиальных эндотелиальных клетках , тогда как более низкие дозы в 5 mg/kg снижали экспрессию miR-24 избирательно в эндотелиальных клетках, но не в кардиомиоцитах, исходя из Cy³-мечения и исследований фракций клеток (Fiedler et al, 2011). Поскольку эндотелиальные клетки, которые формируют кардиальные капилляры, являются первыми клетками, куда antagomirs доставляются кровотоком, низкие дозы могут быть преимущественно использованы, чтобы воздействовать на этот клеточный компартмент, тогда как более высокие концентрации затем воздействуют на капилляры, окружающие клетки. Альтернативное заключение это, что существуют измененные механизмы потребления cholesterol- и/или олигонуклеотидов в разных сердечно-сосудистых клетках, но информация об этом ограничена.

Дозирование безусловно зависит от используемой химической технологии и обилия miRNA в органе мишени. Т.о., оптимальные концентрации, необходимо определять индивидуально для разных miRNAs. Специфичная для типов клеток доставка может быть также достигнута в будущем путем сцепления miRNA ингибиторов и/или miR-mimics со специфическими для типов клеток антителами, пептидами. липидами или др. специфичными для типа клеток про-трофическими молекулами.

Информация о тканевом распределении и фармакогенетике модуляторов miRNA сегодня скудная. Obad et al сравнивали тканевое распределение и эффекты различных доз 8 nt-длиной базирующихся на LNA antimiR-21 (Obad et al, 2011). Др. исследование показало существенные различия клеточно-специфическом молчании, базирующемся на использовании доз базирующихся на холестероле antagomirs, с эндотелиальными клетками специфически затрагиваемыми более низкими дозами (Fiedler et al, 2011). Используя LNA-based антогониста miR-208a, группа van Rooij's недавно показала прогрессивное уменьшение у крыс уровней кардиальной miR-208a, используя концентрации от 0.0625 до 4 mg/kg веса тела лишь с минимальным дальнейшим уменьшением miR при более высоких дозах (Montgomery et al, 2011). Т.о., имеются (возможно, зависимые от химических технологий) взаимоотношения доза-эффект, которые необходимо исследовать с большой аккуратностью в будущем в этой области, т.к. сегодня пределы используемых доз модуляторов miRNA большие и существует лишь немного прямых сравнений между ними (see Table 1).

Первоначальные исследования с использованием модулирующих miRNA субстанций, таких как antagomirs были возможны лишь с помощью взаимодействий университетских лаб. фармакологической индустрии и miRNA start-up компаний в 2005/2006, с затратами на инъекцию на мышь в несколько тысяч Евро (personal experience). Сегодня многие группы всё ещё кооперируют с miRNA компаниями и т.о. получают miRNA ингибиторы, свободно обмениваются материалами по договорам и вступают в открытые обсуждения. Однако сегодня также возможны затраты на LNA-based antimiRs, cholesterol-based antagomirs или др. (хотя используемые детальные химические технологии от таких компаний могут отличаться от тех крупных miRNA терапевтических компаний) которые колеблются между 100 и 600 Евро на инъекцию на мышь в зависимости от ожидаемой дозы on the used dose (personal experience). Т.о., как часто наблюдается для успешных соединений в фармакоцептической разработке затраты на miRNA-модулирующие химические технологии были существенно снижены в последнее время (это возможно продолжится) это позволяет большему числу групп исследователей вступать в эту область и мостить дорожку для крупных исследованиях на животных и финальных клинических исследованиях, где большие количества химически преобразованных miRNA будут необходимы.

miRNA modulation by oligonucleotides in zebrafish

Описанные выше поставки химически преобразованных олигонуклеотидов на miRNAs мишени в организмах приводят к лучшему пониманию функции miRNA и потенциальным терапевтическим эффектам. Модельные рыбки данио использованы для тестирования эффектов различных модуляторов miRNA (Table 2). Модуляции miRNAs у рыбок данио или путем подавления с помощью morpholinos или с помощью усиления активности посредством инъекций специфических pre-miRNAs является элегантным подходом для идентификации , важных для сердечно-сосудистой системы.

Table 2. microRNA modulation in zebrafish leading to cardiovascular phenotypes Field of studies Reference miRNA miRNA modulator chemistry Company Dose Time Species Results Zebrafish Bonauer et al (2009) 92a miR mimics Ambion 2?nl of 20?µM stock solution 30-48?hpf Zebrafish Overexpression of miR-92a induced defects in vessel formation Lagendijk et al (2011) 23 Morpholinos, miR mimics Gene Tools 1?nl of 0.5?mmol/L; 200?ng/µl 2 days, 2 days Zebrafish Loss of miR-23 results in endocardial defects Fish et al (2011) 218 Morpholinos Gene Tools/Open Biosystems morpholino 8-12?ng 2 days Zebrafish Loss of miR-218 results in cardiovascular defects and impaired circulation Fiedler et al (2011) 24 miR mimics Ambion 2?nl of 25?µM stock solution 2 days Zebrafish miR-24 overexpression leads to blood accumulation and abnormal intersegmental vessel formation

Инъекции miR-218 morpholinos приводят к сердечному отеку спустя 48 ч после оплодотворения, хотя формирование паттерна крупных сосудов выглядит нормальным (Fish et al, 2011). Наблюдения дисморфии сердца и перикардиального отека, а также отсутствие тяжелых сосудистых дефектов указывает на то, что miR-218 может быть непосредственно необходима для кардиогенеза. В самом деле, авт. показали, что miR-218 и множественные компоненты передачи сигналов Slit/Robo необходимы для образования сердечной трубки у рыбок данио и что эта сеть модулирует ранее недооцененную функцию передачи сигналов Vegf в этом процессе.

Избыточная экспрессия miR-92a ведет к нарушению роста и формирования паттерна сосудов у рыбок данио (Bonauer et al, 2009). Определение количества межсегментных сосудов, которые собственно соединены с аортой или кардинальной веной на вентральной стороне и с дорсальными продольными анастомическими сосудами на дорсальной стороне, выявило достоверное снижение роста сосудов после избыточной экспрессии miR-92a.

Существенный вклад в наше понимание miRNAs, участвующих в образовании клапанов, внесло использование рыбок данио в качестве модели. Dicer нулевые мутанты обнаруживали избыточное образование эндокардиальных подушек, сопровождаемое сильным увеличением кардиального геля (Lagendijk et al, 2011). Это было воспроизведено с помощью молчания miR-23, благодаря использованию инъекций morpholino. In vitro усиление активности miR-23 предупреждает TGF-beta индуцированный эндотелиально-мезенхимный переход. Эти исследования подтвердили доминантную роль miR-23 во время формирования клапанов (see Table 2). Используется ли этот механизм в др. животных моделях и у человека и может ли помочь разработка терапевтических стратегий для воздействия на болезни клапанов, такие как развитие стеноза аортальных клапанов, ещё предстоит установить.

miR-24 также обогащена в кардиальных эндотелиальных клетках, а её избыточная экспрессия приводит к апоптозу эндотелия и нарушению ангиогенеза (Fiedler et al, 2011). Избыточная экспрессия miR-24 у эмбрионов рыбок данио приводит к перикардиальному отёку, а также скоплению крови. Исследования на трансгенных рыбках данио, которые избыточно экспрессируют GFP в сосудистой системе, показали, что избыточная экспрессия miR-24 нарушает образование межсегментных сосудов и приводит к нарушениям кровоснабжения (Fiedler et al, 2011). Morpholino-обусловленное молчание miR-24 мишеней gata2 и pak4 у рыбок данио воспроизводит эффекты избыточной экспрессии miR-24, демонстрируя участие и потенциальную терапевтическую важность этих мишеней в ангиогенезе (Fiedler et al, 2011).

miRNA modulation by oligonucleotides in mice and large animals

Модуляция экспрессии сердечно-сосудистых miRNA достигается с помощью множества различных подходов (see Fig 1 and Table 1). Большинство из этих исследований использует фармакологические вмешательства, такие как антисмысловыми олигонуклеотидами обусловленный нокдаун или miR-mimic, базирующиеся на технике избыточной экспрессии. Хотя механистические детали неясны, многие разные miRNA терапии могут быть использованы для сердечно-сосудистых клеток, включая кардиомиоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и воспалительные клетки. После клеточного потребления таких ингибиторов miRNA их мишенями miRNAs происходит функциональная деактивация, которая также может наблюдаться по усилению активности соотв. miRNA мишеней. Далее суммируются miRNA терапии, нацеленные на разные сердечно-сосудистые заболевания.

miRNA therapeutics targeting cardiac hypertrophy and fibrosis Одним из первых исследований, в котором был использован antagomir, чтобы ингибировать miRNA стало исследование кардиальной гипертрофии Care с сотр. (Care et al, 2007). Эта группа имплантировала мышам подкожно осмотический мини-насос для постоянной доставки базирующегося на холестероле antagomir против miR-133. После 1 мес. введения ЭКГ анализ показал заметное увеличение кардиальной гипертрофии, демонстрируя, что miR-133 mimics могут иметь терапевтическое значение.

Др. группа показала участие miRNAs в кардиальной гипертрофии; miR-199b управляла calcineurin/nuclear factor of activated T cells (NFAT) мишенью, которая увеличивает свою экспрессию во время сердечной недостаточности у мышей и человека, следовательно, является интересной мишенью для терапии (da Costa Martins et al, 2010). В самом деле, ингибирование in vivo miR-199b с помощью специфического внутрибрюшинного введения antagomir нормализовало пониженную активность ядерного NFAT и вызывало ингибирование и даже устранение кардиальной гипертрофии и фиброза у мышиных моделей сердечной недостаточности.

Thioredoxin, который регулирует частично гипертрофию кардиомиоцитов, приводит к повышению экспрессии let-7 семейства, включая miR-98 (Yang et al, 2011). Чтобы оценить функцию miR-98 в сердце in vivo, аденовирусный miR-98 или antimiR-98 были инъецированы в сердце мыши. Ang II-индуцированное повышение гипертрофии, апоптоза кардиомиоцитов и фиброза были ослаблены с помощью Ad-miR-98 и существенно усилены с помощью Ad-antimiR-98. MiR-98 негативно регулирует Ang II-индуцированную кардиальную гипертрофию и и сопутствующие гистопатологические изменения in vivo и поэтому является привлекательной мишенью для лечения кардиального ремоделирования.

Возникновение кардиального фиброза часто связано с кардиальными стрессами, включая патологическую гипертрофию кардиомиоцитов. Кардиальные фибробласты обогащены определенными miRNAs, такими как miR-21 (Liu et al, 2010; Roy et al, 2009; Thum et al, 2011, 2008b), которые регулируют путь передачи сигналов ERK-MAP kinase посредством воздействия на sprouty-1. С помощью этого механизма жизнеспособность фибробластов и секреция фактора роста, по-видимому, регулирует степень интерстициального фиброза и кардиальной гипертрофии. In vivo молчание miR-21 с помощью специфического базирующегося на холестероле antagomir у мышей, моделирующих болезнь, индуцированную повышенным давлением и перегрузками, снижало активность кардиальной ERK-MAP киназы, ингибировало интерстициальный фиброз и ослабляло кардиальную дисфункцию. Кроме того, недавно было показано, что антагонизм miR-21 блокирует эндотелиально-мезенхимный переход в эндотелиальных клеток, обработанных TGF-beta, а также in vivo в модели кардиальной гипертрофии приводит к редукции развития фиброза (Kumarswamy et al, 2011). Поразительно, эффекты ингибирования miR-21 на предупреждение фиброза были оценены в др. органах, часто подверженных патологическому фиброзу во время болезней, таких как легких (Liu et al, 2010) и почек (Zhong et al, 2011). Т.о., ингибирование miR-21 может представлять собой генеральный подход к ингибированию расширенного фиброза органов.

Др. miRNA, влияющая на развитие фиброза это miR-29. Van Rooij et al установили, что члены семейства miR-29 подавляются в области сердца в преддверии инфаркта. Интересно, что семейство miR-29 целенаправленно воздействует на мРНК, которые кодируют белки, участвующие в фиброзе, такие как множественные коллагены, fibrillins и elastin. В самом деле. избыточная экспрессия miR-29 в фибробластах редуцирует экспрессию коллагена (van Rooij et al, 2008). В противоположность подавлению во время старения, усиление активности miR-29, наблюдаемое в аорте мышей, и повышение экспрессии членов семейства miR-29 были ассоциированы с выраженным подавлением многочисленных компонентов ECM в аортах старых мышей и во время образования аневризмы (Boon et al, 2011). В отношении клиники, уровни miR-29b были сильно увеличены при торакальных аневризмах у человека (Boon et al, 2011). Та же самая группа показала, что LNA-модифицированное антисмысловые олигонуклеотидами обусловленное молчание miR-29 ведет к индукции ECM экспрессии и индукции Ang II-индуцированной дилятации аорты у мышей. Это может быть использовано для лечения и/или стабилизации аневризмы.

miRNA therapeutics targeting angiogenesis and vascularization

Группа Dimmeler впервые использовали ингибиторы miRNA для усиления неоваскуляризации после ишемии задних конечностей и инфаркта миокарда (Bonauer et al, 2009). В самом деле, гипоксия и тканевая ишемия ведет к усилению активности нескольких из членов кластера miR-17-92, включая miR-92a, хотя лежащий в основе детальный регуляторный механизм не совсем ясен (Bonauer et al, 2009). Мышам систематически инъецировали базирующийся на холестероле antagomir-92a, вызывающий существенную редукцию некроза пальцев ноги по сравнению с мышами, обработанными контрольным antagomir. Восстановительный кровоток повышается, а также количество капилляров и позитивных к гладкомышечному актину артериол после воздействия antagomir-92a. Чтобы протестировать эффекты инфаркта миокарда, antagomir-92a или контроль внутривенно вводили на 0, 2, 4, 7 и 9 день после закупорки левой коронарной артерии. Воздействие Antagomir-92a улучшало систолическую и диастолическую функцию левого желудочка, снижало размер инфаркта, супрессировало количество апоптических клеток и повышало количество in vivo проницаемых lectin-позитивных сосудов, в частности, в пограничной зоне инфаркта. Обусловлены ли позитивные эффекты только ингибированием miR-92a в эндотелиальных клетках предстоит установить, поскольку существуют дополнительные прямые эффекты на кардиомиоциты и гладкомышечные клетки.

Др. группа установила усиленную экспрессию miR-503 в эндотелиальных клетках, изолированных из ишемических задних конечностей в условиях диабета (Caporali et al, 2011). Они проверяли может ли локальное ингибирование miR-503 улучшать пост-ишемическую репаративную неоваскуляризацию и восстанавливающий кровоток у диабетических мышей с использованием стратегии распада, чтобы снизить доступность miR-503 в мышцах во время ишемии. В самом деле, восстанавливающий пост-ишемический кровоток в ступнях диабетических мышей был нарушен, а локальные инъекции Ad decoy-miR-503 полностью нормализовали восстанавливающий кровоток у диабетических мышей. Кроме того, такая терапия увеличивала плотность капилляров и артериол в ишемических мышцах диабетических мышей. Т.о., манипуляции с miR-503 могут представлять новый молекулярный подход, способствующий репаративному ангиогенезу у диабетических пациентов.

MiR-126 концентрируется в эндотелиальных клетках, а miR-126 нокаутные мыши погибают рано из-за нарушений ангиогенеза (Wang et al, 2008). Чтобы изучить последствия молчания miR-126 на регенерацию сосудов, van Solingen с сотр. инъецировали мышам одиночную дозу antagomir-126 и вызывали у них ишемию левой задней конечности (van Solingen et al, 2009). Количественная оценка плотности капилляров в ишемической задней конечности мышей после нокдауна miR-126 показала, что у них обнаруживается заметная редукция ангиогенной реакции, указываюшая, что miR-126 mimics могут быть важной стратегией по усилению васкуляризации ишемических тканей. Однако необходима дальнейшая экспериментальная оценка.

Ангиогенные события частично контролируются с помощью hypoxia-inducible factor-1? (HIF-1?), который регулируется с помощью miR-519c посредством прямого соединения с нетранслируемой областью HIF-1? 3? (Cha et al, 2010). Antagomir-обусловленное ингибирование miR-519c увеличивает уровни HIF-1? и усиливает ангиогенную активность в опухолях. Это интересно, поскольку блокада miR-519c может представит собой альтернативную стратегию для стимуляции ангиогенеза в ишемических тканях, таких как после инфаркта миокарда, хотя необходима проверка.

В противоположность ишемической ткани существует необходимость в блокаде преувеличенного ангиогенеза при диабетической ретинопатии, которая является ведущей причиной слепоты. В сетчатке диабетических крыс происходит подавление miR-200b, тогда как уровни её мишени VEGF увеличиваются (McArthur et al, 2011). Локальные инъекции в стекловидное тело miR-200b mimics предупреждает индуцированное диабетом увеличение уровней VEGF и предупреждает glucose-индуцированные повышенные проницаемость и ангиогенез. Это может быть интересным в качестве терапевтического подхода у затронутых пациентов с помощью локального и более легкого введения.

miRNA therapeutics targeting cardiovascular cell survival

Кардиомиоциты млекопитающих удерживаются от вступления в клеточный цикл во время раннего постнатального развития, это ограничивает способность взрослого сердца регенерировать после повреждения. Во время раннего постнатального кардиального развития miR-195, которая является членом семейства miR-15, существенно усиливает активность и управляет экспрессией ряда генов клеточного цикла (Porrello et al, 2011). Важно. что нокдаун семейства miR-15 у новорожденных мышей с помощью LNA-модифицированных antimiRNAs был ассоциирован с повышенным количеством митотических кардиомиоцитов и дерепрессией белка клеточного цикла Chek. Усиление активности семейства miR-15 во время неонатального периода может быть важным регуляторным механизмом, управляющим прекращением клеточных циклов кардиомиоцитов и поэтому может быть интересным терапевтическим средством для повторной стимуляции делений кардиомиоцитов для регенерации (Porrello et al, 2011).

Вследствие ischemia/reperfusion (I/R) повреждений у мышей экспрессия miR-320 существенно снижалась в сердце (Ren et al, 2009). Избыточная экспрессия in vitro miR-320 усиливает апоптоз кардиомиоцитов, тогд как нокдаун, по-видимому, оказывает защитный эффект. В самом деле, воздействие in vivo модифицированным холестеролом antagomir-320 предупреждает апоптоз кардиомиоцитов и снижает размер инфаркта по сравнению с применением мутантного antagomir-320 и контрольного раствора.

miRNA therapeutics targeting arrhythmogenesis

miRNAs могут также регулировать ионные каналы, включая L-type ток кальция, и тем самым влияют на продолжительность потенциала действия (Latronico & Condorelli, 2010; Thum et al, 2008a). miR-328 усиливает свою активность в предсердии собак с индуцированной атриальной фибрилляцией и воздействует на L-type кальциевый канал (Lu et al, 2010). Поразительно, но нормализация уровней miR-328 с помощью antagomir полностью измененными условиями и также генетический нокдаун эндогенной miR-328 смягчает эффекты атриальной фибрилляции (Lu et al, 2010). Это указывает на miR-328 как мишень для лечения атриальной фибрилляции путем нормализации уровня miR-328 для преобразования фибрилляции в синусовый ритм и предупреждения возникновения аритмий в клинических условиях.

miRNA therapeutics targeting atherosclerosis

Атеросклероз это патологический мультифакторный процесс, который очень часто начинается с дисфункции эндотелия, а на более поздних стадиях вызывает отложения соединений жирных кислот, холестерола, кальция, продуктов распада и др. субстанций, которые прогрессивно накапливаются в артериях, приводя в конечном итоге к образованию бляшек. Кроме того, часто наблюдается активация гладкомышечных клеток, которые вносят вклад в процессы патологического ремоделирования артерий, напр.. во время образования neointima в поврежденных сосудах. Общая роль miRNAs в процессе атеросклероза и воспаления недавно была рассмотрена в обзоре (Weber et al, 2010). Поэтому лишь коротко суммируют терапевтические стратегии, базирующиеся на miRNA и успешно влияющие на функцию гладкомышечных клеток, образование neointima и липидный метаболизм (Fig 1 and Table 1).

MiR-21, как было установлено, активирует и индуцирует контрактильный фенотип в сосудистых гладкомышечных клетках человека, затрагивая TGF-beta and bone morphogenic proteins (BMPs; Davis et al, 2008). В самом деле, miR-21 антисмысловая стратегия предупреждает повторное сужение (restenosis) путем блокирования пролиферации гладкомышечных клеток в модели balloon-injured каротидной артерии крыс (Ji et al, 2007). MiR-145 и miR-143 концентрируются в гладкомышечных клетках, которые регулируют критические функции этого типа клеток, а miR-143/145-нокаутные мыши обнаруживают снижение числа сократимых гладкомышечных клеток и повышение клеточной пролиферации (Boettger et al, 2009; Cordes et al, 2009; Elia et al, 2009). In vivo, вирусом обусловленное усиление активности miR-143/145 в поврежденных каротидных артериях крыс и в др. моделях сосудистых повреждений у мышей происходит выраженное снижение возникновения повреждений neointima (Cheng et al, 2009; Elia et al, 2009; Xin et al, 2009), демонстрируя общий потенциал этих miRNAs для многих сосудистых болезней, таких как предупреждение restenosis (Table 1). Наконец, miR-221 и miR-222 активируются в сосудистых гладкомышечных клетках поврежденных каротидных артерий (Liu et al, 2009). Те же авт. показали, что in vivo молчание miR-221 и miR-222 ингибирует пролиферацию гладкомышечных клеток и тем самым утолщение neointima после сосудистых повреждений (see Fig 1 and Table 1).

Разбалансированное метаболическое состояние облегчает развитие атеросклероза, недавно отмечено участие miRNAs в регуляции липидного метаболизма [rev. (Fernandez-Hernando et al, 2011)]. Коротко, недавние базирующиеся на miRNA, терапевтические испытания предприняты для воздействия на липидный метаболизм у малых и крупных животных. Несколько разных miRNAs было изучено в отношении их свойств регулировать липидный метаболизм, включая miR-122, miR-370, miR-378/378*, miR-335, miR-125a-5p и miR-33 [rev. (Fernandez-Hernando et al, 2011)]. Я сконцентрируюсь на терапевтических испытаниях с использованием ингибиторов против miR-122 and miR-33.

MiR-122 концентрируется в печени и участвует в регуляции метаболизма холестерина (Krutzfeldt et al, 2005) и инфекции гепатита C (Lanford et al, 2010). В самом деле. группа Stoffel впервые показала, что уровни холестерина в плазме снижены у мышей после воздействия antagomir-122 (Fig 1 and Table 1). MiR-122 модуляция in vitro и in vivo ведут к альтерациям многих генов, участвующих в печеночном метаболизме, синтезе и окислении жирных кислот (Elmen et al, 2008a; Esau et al, 2006; Krutzfeldt et al, 2005).

Др. miRNA я только упомяну из-за её интригующего трансляционного потенциала это miR-33. Интронная miR-33a располагается в sterol regulatory element-binding protein 2 (SREBF-2) человека, она контролирует некоторые гены, участвующие в потреблении и синтеза холестерина (Horie et al, 2010). Важным геном мишенью для miR-33 является транспортер, ответственный за удаление холестерина из клеток, ABCA1 (Marquart et al, 2010; Najafi-Shoushtari et al, 2010). Ингибирование эндогенной miR-33 in vivo увеличивает экспрессию белка ABCA1, приводя к усилению оттока холестерина к apoA1 (Marquart et al, 2010; Najafi-Shoushtari et al, 2010; Rayner et al, 2010). Имеется несколько др. мишеней для miR-33, участвующих в липидном метаболизме, которые были рассмотрены (Fernandez-Hernando et al, 2011) и не являются предметом данного обзора. MiR-33 , кроме того, регулирует уровни high-density lipoprotein (HDL) в in vivo исследованиях с вирусными и LNA-стабилизированными антагонистами miRNA (Marquart et al, 2010; Najafi-Shoushtari et al, 2010; Rayner et al, 2010; Table 1). Это важно, поскольку низкие уровни HDL являются признаком у пациентов с болезнью коронарных артерий. Осуществляется исследование на не человекообразных приматах с терапевтическим замалчиванием miR-33 с помощью 2?F/MOE-модифицированных antagomirs, приводящие к повышению HDL и снижению уровней плазменных very low-density lipoprotein (VLDL) триглицеридов (Rayner et al, 2011). Было бы интересно узнать, будет ли этот многообещающий подход вскоре подготовлен для первых клинических фаз I/II испытаний.

Future developments and concluding remarks

In the next years, we likely will see further breakthroughs in cardiovascular miRNA research. First, large animal data also in the cardiovascular field will probably appear as this is worldwide currently under investigation in several laboratories. This will not only result in more insight into their therapeutic potential in larger species but also lead to important information about pharmacokinetics of such drugs and safety data. Second, we will see first detailed phase I and II data using miRNA therapeutics in non-cardiovascular but also cardiovascular medicine. This may pave the way for large-scale mechanism orientated miRNA-based therapeutic trials in cardiovascular medicine.

MicroRNA therapeutics in cardiovascular medicine Thomas Thum EMBO Molecular Medicine Volume 4, Issue 1, pages 3–14, January 2012

MicroRNA therapeutics in cardiovascular medicine
Thomas Thum
EMBO Molecular Medicine Volume 4, Issue 1, pages 3–14, January 2012