C момента клонирования и выделения в конце 1980s, хемокины стали критическими игроками в управлении перемещениями и активностью лейкоцитов во время иммунного надзора и болезней (Charo & Ransohoff, 2006; Richmond, 2011). Спустя два десятилетия новые аспекты системы хемокинов продолжают выявляться, их избыточность и многосторонность всё ещё до конца не поняты. Первоначально идентифицированные как небольшие хемоаттрактантные цитокины, которые могут стимулировать направленную миграцию нейтрофилов или моноцитов, их известные функции сегодня затрагивают обширные пространства, такие как ангиогенез, эмбриональное развитие и клеточный гомеостаз (Keeley et al, 2011; Raman et al, 2011), а их роль в патогенезе большинства воспалительных и аутоиммунных болезней неоспорима. Одним из примеров является атеросклероз, распространенное хроническое заболевание, которое характеризуется формированием богатых липидами повреждений, называемых бляшками, в стенках крупных артерий. Эти бляшки развиваются первоначально в результате дисфункции эндотелия, напр., в местах нерегулярного кровотока, это приводит к увеличению потребления и субэндотелиальному накоплению богатых холестеролом плазменных липопротеинов, а именно low-density lipoprotein (LDL; Simionescu, 2009). Внутри сосудистой стенки кристаллизация холестерола и (оксидативные) модификации LDL ведут к активирующим клетки про-воспалительным видам (Duewell et al, 2010; Navab et al, 2004) и неконтролируемому фагоцитозу модифицированных LDL (oxLDL) частиц с помощью макрофагов, приводящему к фобразованию вспененных (foam) клеток, которые секретируют различные факторы, которые способствуют воспалению. Это заставляет эндотелиальные клетки экспрессировать адгезивные молекулы, такие как P-selectin или vascular cell adhesion molecule-1, способствующие непрерывному рекрутированию и притоку лейкоцитов, это ведет к углублению первоначальных сосудистых повреждений до полностью сформированных атеросклеротических бляшек. Хотя в клинической практике осложнения атеросклероза контролируются с помощью фармакологических и хирургических вмешательств, настоящее нацеленное на причину лечение этого хронического заболевания всё ещё отсутствует. Участвуя в трафике лейкоцитов многие хемокины направляют лейкоциты в места сосудистого воспаления и могут таким образом представлять собой привлекательные модели для лекарственной терапии.

Chemokine structure and mechanisms of action

В качестве небольших, компактных и стабильных белков хемокины хорошо структурно озарактеризованы. Они могут быть экспрессированы и очищены из Escherichia coli (E. coli) с высоким выходом, это открывает возможность для метаболического мечения стабильными изотопами 15N и 13C для исследований с помощью nuclear magnetic resonance (NMR). Растворенная и кристаллическая структура хемокинов получена в начале 1990s, выявлены характерные структурные сходства между всеми членами семейства (Clore & Gronenborn, 1995). Мономерная структура хемокинов подчеркивается 'хемокиновой складкой', которая состоит из плохо распознаваемого беспорядочного amino (N)-конца, сопровождаемого тремя антипараллельными beta-нитями, организованными в beta-листок и стабилизированными с помощью carboxy-терминальной alpha-спирали. Пространственное расположение двух консервативных остатков цистеина на N-конце предопределяет номенклатуру и классификацию членов семейства хемокинов; в C-, CC-, CXC- и CX3C-хемокины. Это пространственное расположение цистеинов, по-видимому, предопределяет четвертичную структуру. В то время как мономерные структуры хемокинов все сходны, CC- и CXC-хемокины существенно различаются по своей димерной структуре. Хемокиновые мономеры CXC-типа ассоциируют, чтобы сформировать глобулярные димеры путем вытягивания своих трех антипараллельных beta-нитей к центральному 6-нитчатому beta-листку, тогда как CC-типа хемокиновые димеры скорее образуются за счет спаривания N-концов и имеют удлиненную форму. Некоторые хемокины обнаруживают склонность формировать мультимеры высокго порядка. Напр., недавнее исследование выявило, что CC-хемокины macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α and -β и CCL3 и CCL4, соотв), способны формировать удлиненные спиральные полимеры с молю весом до 3000 kDa, что соответствует не менее, чем 50 MIP-1 мономерам (Ren et al, 2010). Эта полимеризация MIP-1, как было установлено, действует на его in vivo функции рекрутирования клеток в том смысле, что MIP-1 мутанты со сниженной полимеризацией менее эффективны на мышиной модели рекрутирования перитонеальных клеток. Это может быть объяснено наблюдением, что MIP-1 полимер более устойчив к протеолитической деградации, напр., с помощью инсулин деградирующего энзима. Соответственно, образование более крупных устойчивых к протезе полимеров облегчает постепенное высвобождение MIP-1 мономеров на более длинные расстояния и может составлять новую возможность для хемокинов, чтобы эффективно способствовать хемотаксису. Хотя сегодня неизвестно, могут ли др. хемокины формировать такие крупные полимеры, важность олигомеризации более высокого порядка для их функции in vivo хорошо известна (Campanella et al, 2006; Proudfoot et al, 2003).

Существует, по-видимому, функциональная связь между олигомеризацией хемокинов и из взаимодействия с glycosaminoglycans (GAGs), т.к. альтерации, которые влияют на олигомеризацию хемокинов, часто также затрагивают их соединение с GAGs. Фактически, хемокины, как было установлено, олигомеризуются на GAGs после соединения (Hoogewerf et al, 1997), приводя к высоким локальным концентрациям и образованию двумерных 'haptotactic градиентов', позволяя проходящим лейкоцитам 'ощутить' хемотактические сигналы, представленные на эндотелиальной поверхности (Rot & von Andrian, 2004). Подтверждение этой концепции in vivo было получено в недавнем исследовании на трансгенных мышах с индуцибельным эндотелиальным дефицитом GAG heparan sulphate (Bao et al, 2010). В этом случае мыши, дефицитные по эндотелиальному heparan sulphate, обнаруживали достоверное снижение миграции лимфоцитов и дендритных клеток (DCs) в лифатические узлы, в основном из-за сниженной представленности хемокинов CCL19 и CCL21 на наружных эндотелиальных венулах. Помимо презентации, GAGs также участвуют в транспорте хемокинов с базо-латеральной на апикальную сторону клетки (Wang et al, 2005), обеспечивая дополнительную роль duffy antigen receptor for chemokines (DARC; Pruenster et al, 2009). Регионы в первичной структуре хемокинов, которые ответственны за соединение с GAGs хорошо известны и в основном используют кластеры основных позитивно заряженных аминокислот, которые подвергаются электростатическим взаимодействиям с негативно заряженными углеводами и сульфатными половинками в GAGs (Salanga & Handel, 2011). Модификация этих основных остатков серьезно редуцирует функцию рекрутирования клеток хемокинами in vivo (Proudfoot et al, 2003). С др. стороны, внесение или присутствие дополнительных основных остатков или доменов ведет к сильному увеличению сродства к GAGs, это наблюдается на примере преобразованного противовоспалительного варианта monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1/CCL2; Piccinini et al, 2010) или сплайс-варианта stromal cell-derived factor-1 (SDF-1/CXCL12; Laguri et al, 2007).

При физиологических условиях хемокины могут подвергаться крупным разнообразным посттрансляционным модификациям, многие из которых влияют на функцию хемокинов. Наиболее охарактеризованный пример это протеолитическое расщепление с помощью serine- и metalloproteases, но glycosylation и недавно описанное citrullination аргинновых остатков в хемокинах, также оказывают заметные эффекты на связывание рецепторов и передачу сигналов (Mortier et al, 2011).

Передача сигналов хемокинов начинается с соединения и активации G protein-coupled seven-transmembrane рецепторов (Fig 1). Их классификация базируется на их специфичности к членами семейства хемокинов, напр., CC-chemokine receptors (CCR) преимущественно соединяются с CC-хемокинами, а CXCR аналогично соединяются с CXC-хемокинами. Активация хемокиновых рецепторов осуществляется в два приёма, при этом глобулярная часть хемокинового лиганда соединяется с внеклеточными петлями рецептора, а гибкий хемокиновый N-конец постепенно проникает в определенный карман между трансмембранными спиралями (Monteclaro & Charo, 1996). Интересным свойством хемокиновых рецепторов является их способность формировать гомо- и гетеродимеры, хотя функциональные значения такого взаимодействия разнообразны (Kramp et al, 2011). Напр., концентрация CCR5 и CXCR4 наблюдается в иммунологических синапсах между B и T клетками, а стимуляция реакций T клеток базируется на присутствии обоих рецепторов, которые обнаруживаются в комплексе на T-клеточных мембранах (Contento et al, 2008). Однако в сходном исследовании наблюдался негативный кооперативный эффект связывания между лигандами для CXCR4, CCR2 and CCR5 (Sohy et al, 2009). Сродство CXCR4 к его лиганду CXCL12 существенно снижалось в присутствии лиганда CCR2 или CCR5 как в трансфицированных клетках, так и в нативных CD4⁺ T лимфоцитах. В мышиной модели воздушного кармана рекрутирования лейкоцитов добавление CCR5 антагониста TAK779 сильно снижало миграцию лейкоцитов в направлении CXCL12 (Sohy et al, 2009). Хотя эти исследования показывают, что хемокиновые рецепторы с готовностью образуют гетеродимеры на клеточной поверхности, функциональное значение такого взаимодействия может варьировать в зависимости от физиологического контекста.

Figure 1. Schematic representation of novel chemokine players in atherosclerosis and their mechanism of action towards their target cells.

Neutrophils and Ly6Chi monocytes emigrate from the bone marrow through action of chemokines CXCL12 or CCL2/-20, respectively, and are recruited to atherosclerotic plaques by chemokines (e.g. CXCL1 or CX3CL1) presented on endothelial cells of the inflamed vessel wall. Inside the plaque, the CX3CL1-CX3CR1 axis promotes Ly6Chi monocyte survival. Dendritic cells expressing CCL17 may control the expansion of Treg in plaques and lymph nodes. Migration to and from lymphoid organs, as well as T cell priming are mediated by signalling between CCL19/-21 and CCR7 on T cells and dendritic cells.

В исследованиях с клетками, экспрессирующими хемокиновые рецепторы, обнаруживаются множественные хемокины связанные с множественными хемокиновыми рецепторами и наоборот; наблюдения, которые подсказывают концептуальное введение 'избыточности' в области биологии хемокинов (Lukacs et al, 1999; Mantovani, 1999). Однако т.к. подобного типа эксперименты не учитывают пространственный и временной паттерны экспрессии хемокинов и хемокиновых рецепторов в нормальной физиологии, то действительная избыточность в этой системе in vivo, по-видимому, преувеличена (Koenen & Weber, 2010; Schall & Proudfoot, 2011). Поскольку большинство субнаборов лейкоцитов характеризуется комбинацией хемокиновых рецепторов, можно себе представить, что в данном (пато-)физиологическом контексте генерируется определенная палитра хемокинов и присутствует на эндотелиальной поверхности стенок сосудов с помощью специфического репертуара GAGs. Эта палитра хемокинов способна привлекать субтипы лейкоцитов с соотв. комбинацией хемокиновых рецепторов, делая тем самым возможным 'tailor-made' иммунный ответ. Т.о., семейство хемокинов скорее может восприниматься как обширная и многогранная система для передачи информации.

Established and novel chemokine players in atherosclerosis

Принимая во внимание функцию хемокинов, их участие в болезнях воспаления сосудов вполне возможно и роль многих хемокинов была исследована в контексте атеросклероза. Пионерское исследование обратило основное внимание на идентификацию ключевых хемокинов, способствующих атеросклеротической болезни (Boisvert et al, 1998; Boring et al, 1998; Lesnik et al, 2003). Последующие исследования имели целью установление связи между действиями хемокинов и вовлечением индивидуальных типов лейкоцитов (Boisvert et al, 2006; Heller et al, 2006; Veillard et al, 2005), тогда как др. работы стремились к выяснению функции и динамики субнаборов лейкоцитов, характеризуя профили используемых ими хемокинов и рецепторов (Luchtefeld et al, 2010; Tacke et al, 2007; Weber et al, 2011). Хемокины и хемокиновые рецепторы, которые классически играют роль в атеросклерозе, это, напр., CXCR3 и его лиганды, которые активны на эффекторных T клетках, CCR2 и CX3CR1 и соотв. им лиганды CCL2 и CX3CL1, которые привлекают моноциты, CCR5 со своим лигандом CCL5, которые участвует в рекрутировании как T клеток, так и моноцитов. Роль этих хемокинов в атеросклеротической болезни активно обсуждается (Zernecke & Weber, 2010). Недавнее исследование, однако, приподнесло неожиданно новых игроков из системы хемокинов в атеросклероз. Помимо уже известных игроков были найдены такие, которые действуют на типы клеток, до сих пор не рассматриваемых в отношении их вклада в атерогенез, или которые осуществляют ранее неизвестные функции. Идентифицированы оси хемокин-рецептор, которые специфически действуют на специфические субнаборы.

Использование хемокиновых рецепторов интенсивно исследовалось в отношении субнаборов моноцитов. У мышей идентифицированы две главные субпопуляции: классические или 'воспалительные' моноциты, характеризующиеся высокой экспрессией поверхностных маркеров Ly6C (также наз. Gr1) и L-selectin (CD62L), высокой экспрессией CCR2 и промежуточной экспрессией CX3CR1, и не классические или 'резидентные' моноциты, которые экспрессируют Ly6Clow, CCR2-, CX3CR1hi и CD62L- (Gautier et al, 2009; Tacke et al, 2007). При кормлении мышей, дефицитных по apolipoprotein E (Apoe-/-) диетой с высоким содержанием жира, количество циркулирующих классических Ly6Chi моноцитов значительно увеличивается (Swirski et al, 2007). Эти клетки преимущественно инфильтрируют атеросклеротические повреждения и дифференцируются в макрофаги, указывая тем самым, что классический субнабор доминирует в развитии атеросклероза. Классические Ly6Chi моноциты, по-видимому, утилизируют CX3CR1 и CCR2 в качестве основных рецепторов, чтобы проникать в атеросклеротические повреждения, тогда как не классические Ly6Clow моноциты в основном зависят от CCR5, чтобы проникнуть в бляшки, несмотря на высокую экспрессию CX3CR1 (Tacke et al, 2007). Интересно, что ось CX3CL1-CX3CR1, как было установлено, обеспечивает сигналы, подобные ростовым факторам, в Ly6Clow моноцитах скорее, чем сигналы рекрутирования клеток (Landsman et al, 2009). В отсутствие CX3CR1, уровни моноцитов Ly6Clow существенно снижены. Это может быть объяснено повышенной клеточной гибелью из-за отсутствия связывания CX3CL1 с CX3CR1, что служит в качестве специфического сигнала выживания для этого субнабора. Перенос CX3CR1-дефицитного костного мозга в Apoe^-/- мышей ведет к уменьшению атеросклероза по сравнению с мышами, которым трансплантировали CX3CR1-содержащий костный мозг. Это снижение атеросклероза характеризовалось заметным увеличением апоптических клеток в бляшках химерных CX3CR1^-/-Apoe^-/- мышей, которое можно нейтрализовать с помощью избыточной экспрессии Bcl-2, молекула которая предупреждает клеточную гибель в CX3CR1-дефицитных моноцитах. Т.о., может быть сделан вывод, выживание клеток, обеспечиваемое с помощью CX3CR1, составляет его про-атерогенный потенциал скорее, чем потенциал рекрутирования клеток (Landsman et al, 2009).

Сходным образом, функции CCR2 не ограничиваются рекрутированием клеток. Помимо обеспечения инфильтрации классических моноцитов в бляшки, CCR2 специфически контролирует выход Ly6Chi моноцитов из костного мозга во время бактериальной инфекции (Serbina & Pamer, 2006) или гиперлипидемии (Tsou et al, 2007). Т.о., субнабор классических моноцитов сохраняется в костном мозге CCR2-/- мышей и возникающее в результате низкое количество кровяных клеток может также вносить вклад в уменьшение атеросклероза, что ассоциирует с дефицитом CCR2 (Boring et al, 1998). В дополнение к CCR2, недавнее исследование идентифицировало CCR6 и его лиганд CCL20 в качестве подходящих медиаторов трафика Ly6Chi моноцитов (Wan et al, 2011). Дефицит CCR6 специфически снижает количество Ly6Chi моноцитов у Apoe^-/- мышей во время питания диетой с высоким содержание жира, а внутривенные инъекции CCL20 вызывают моноцитоз крови, демонстрируя, что CCR6 участвует в регуляции высвобождения субнабора Ly6Chi из костного мозга. Подобно CCL2, CCL20 вызывает хемотаксис моноцитов, который зависит от CCR6, т.к. CCR6^-/- моноциты были нечувствительны (Wan et al, 2011).

Помимо моноцитов и макрофагов, T лимфоциты участвуют в развитии атеросклеротических повреждений и существуют во многих отличающихся субтипах, которые могут выполнять про-атерогенные и анти-атерогенные функции (Weber et al, 2008). Напр., некоторые исследования подчеркнули важность CXCR3 для рекрутирования CD4⁺ эффекторных T клеток (напр., T helper 1 клеток) в атеросклеротические повреждения, а блокада или делеция CXCR3 или его лиганда CXCL10 уменьшает образование бляшек у мышей (Heller et al, 2006; van Wanrooij et al, 2008; Veillard et al, 2005). Однако нокдаун CXCR3-CXCL10 оси не только снижает количества про-атерогенных CD4⁺ T клеток в повреждениях, но и также увеличивает присутствие CD4⁺ FoxP3⁺ CD25⁺ регуляторных T клеток (Treg), которые как полагают, играют важную роль в атеросклеротической болезни (Ait-Oufella et al, 2006; Mor et al, 2007). Т.о., CXCR3 может представлять собой переключатель между иммунными реакциями про-воспалительных эффекторных T клеток и противовоспалительных Treg. Особенно мощный субнабор эффекторных Т клеток несет CXCR6, рецептор для трансмембранного хемокина CXCL16, который обладает как хемокиновой, так и oxLDL-очищающей активностью (Ludwig & Weber, 2007). Эти CXCR6⁺ T клетки, как было установлено, экспрессируют высокие количества interferon-γ (IFN-γ ) после активации (Calabresi et al, 2002), который является важным цитокином в атерогенезе. Генетическая делеция CXCR6 сильно ослабляет образование атеросклеротических повреждений у Apoe^-/- мышей, благодаря сильному уменьшению CXCR6⁺ T клеток в аорте и вторично в лимфоидных органах CXCR6^-/- мышей (Galkina et al, 2007). Продукция IFN-γ в CXCR6^-/- аорте снижается соответственно, это ведет к снижению накопления макрофагов и тем самым дает объяснение снижению образования бляшек (Galkina et al, 2007). Известно, что в то время как CXCL16 усиливает свою активность в условиях, способствующих атерогенезу (Postea et al, 2008), генетическая делеция CXCL16 у гиперлипидемичных мышей увеличивает образование атеросклеротических бляшек (Aslanian & Charo, 2006). Это объясняется потерей oxLDL-очищающей функции CXCL16, это может оказывать более сильное влияние, чем функция хемокинов в атерогенезе.

Помимо роли субнаборов одиночных моноядерных клеток, недавние исследования сфокусировались на взаимодействии между антиген-презентирующими DC и T клетками в контексте атеросклероза и не явилось неожиданностью, что хемокины оказались вовлечены в качестве важных модуляторов (Luchtefeld et al, 2010; Weber et al, 2011). Напр., ослабление образования атеросклеротических бляшек наблюдалось у гиперлипидемичных мышей с генетической делецией CCR7 (Luchtefeld et al, 2010), хемокинового рецептора, который важен для трафика T клеток и DC в и из лимфатических органов (Forster et al, 2008). Это уменьшение образования бляшек ассоциировало с повышенными количествами T клеток и клеток, экспрессирующих DC маркер CD11c в корне аорты у CCR7-дефицитных мышей. Повышенные количества CCR7^-/- T клеток в атеросклеротических повреждениях объясняется повышенным удержанием этих клеток в бляшках, поскольку передача сигналов CCR7 служит, чтобы наводить клетки на дистальные лимфатические узлы. Интересно, что миграция CCR7^-/- T клеток в аорту также значительно нарушена по сравнению с T клетками дикого типа, подтверждая, что CCR7 лиганды могут быть ответственны за наведение T клеток к месту воспаления. Нарушенная миграция CCR7-дефицитных T клеток происходит параллельно со снижением наведения DC на вторичные лимфоидные органы, приводя в результате к редукции индукции (priming) T клеток с помощью нагруженных антигеном DC. В контексте атеросклероза, oxLDL рассматривается как основной антиген, который индуцирует локальные и системные иммунные реакции (Hansson & Hermansson, 2011). В ключевом эксперименте, CCR7-дефицитные или дикого типа T клетки инкубировали с oxLDL-pulsed DC и затем инъецировали в гиперлипидемичных CCR7^-/-мышей. В отличие от CCR7-дефицитных T клеток, дикого типа T клетки, побуждаемые (primed) с помощью oxLDL-pulsed DC, могут устранять снижение образования атеросклеротических повреждений у CCR7^-/- мышей. Это указывает на то, что как нарушенное T cell priming во вторичных лимфоидных органах, так и дефектная миграция CCR7-дефицитных T клеток ответственны за уменьшение атеросклероза у CCR7^-/- мышей (Luchtefeld et al, 2010). Находки в этом исследовании могут конфликтовать с находками предыдущих работ, которые подтвердили роль CCR7 в модели быстрой регрессии бляшек,там, где сегменты аорты, содержащие бляшки от hyperlipidemic Apoe^-/- мышей, были трансплантированы мышам дикого типа с нормальным уровнем липидов в крови (Trogan et al, 2006). Анализ генной экспрессии регрессирующих бляшек выявил усиление активности CCR7 мРНК , а регрессия бляшек ингибировалась блокированием антител простив CCR7 лигандов CCL19 и CCL21, демонстрируя, что CCR7-управляемый отток моноядерных клеток из бляшек может быть ответственным за регрессию бляшек в этой модели. Это может быть способ, с помощью которого CCR7 осуществляет защиту от атеросклероза скорее, чем про-атерогенное действие. Однако, в недавнем исследовании, представившим новую мышиную модель генной терапии, вызывающей регрессию бляшек, не отмечено участия CCR7 в регрессии бляшек (Potteaux et al, 2011). Вместо этого было предположено, что ослабление притока одноядерных клеток после вирусного переноста Apoe-гена является механизмом, лежащим в основе регрессии бляшек скорее, чем (CCR7-управляемый) отток воспалительных клеток из бляшек.

Одним из аспектов, который, к сожалению, не был принят во внимание в исследованиях, представленных выше, является роль CCR7 функций в Treg, которые также используют CCR7 для возвращения в лимфоидную ткань и подавления иммунной реакции, имеющей отношение к атеросклерозу (Schneider et al, 2007). Недавняя работа идентифицировала функциональную связь между DC и Treg в атеросклерозе, которая контролируется посредством хемокина CCL17 (Weber et al, 2011). У гиперлипидемичных мышей во всем теле или в костном мозге специфический дефицит CCL17 уменьшает образование атеросклеротических повреждений, что сопровождается снижением числа макрофагов и CD3⁺ T клеток в бляшках. В то время как CCL17, как было установлено, участвует в рекрутировании CD4⁺ T клеток в местах воспаления, накопление Treg в лимфатических узлах и аорте CCL17^-/- мышей несмотря на это наблюдалось, которое отсутствовало у CCL17^+/+ контрольных животных. Это накопление может быть объяснено контролем гомеостаза Treg посредством CCL17-экспрессирующего субнабора DC в повреждениях и лимфатических узлах гиперлипидемичных мышей. Совместная инкубация CD4⁺ T клеток с CCL17^-/- DC увеличивало экспансию Treg и это сопровождалось низкими количествами апоптических Treg по сравнению с совместным культивированием с CCL17^+/+ DC, демонстрируя, что CCL17 также служит в качестве супрессрующего сигнала для пролиферации Treg . Эксперименты по восстановлению показали, что инъекции T клеток, инструктированных с помощью CCL17-экспрессирующих DC оказалось достаточном для индукции образования атеросклеротических повреждений у CCL17-дефицитных Apoe^-/- мышей, которые были истощены по CD4⁺ T клеткам. Наконец, мы смогли продемонстрировать, что обработка Apoe-дефицитных мышей с блокированием антител против CCL17 эффективно снижает образование атеросклеротических бляшек, подчеркивая важность CCL17 для поддержания Treg с помощью DC в контексте сосудистого воспаления и идентификации этого хемокина в качестве потенциальной терпевтической мишени для лечения атеросклероза (Weber et al, 2011).

Помимо одноядерных клеток, дополнительные типы кровянфх клеток участвуют в инициации и прогрессировании восудистого воспаления, наиболее заметны нейтрофилы и тромбоциты (Soehnlein & Lindbom, 2010; von Hundelshausen et al, 2009). Гиперхолестеролемия вызывает отток нейтрофилов из костнеого мозга и увеличивает количества циркулирующих в крови нейтрофилов, что ускоряет атеросклероз, особенно на ранних фазах развития болезни (Drechsler et al, 2010; Gomes et al, 2010; Zernecke et al, 2008). Поскольку CXCL12-CXCR4 ось ответственна за удержание нейтрофилов в костном мозге (Martin et al, 2003), CXCL1-CXCR2 и CCR1, -2 и -5, как было установлено, ответственны за мобилизацию и инфильтрацию нейтрофилов в места артериальных воспалений, соотв. (Drechsler et al, 2010). В дополнение к роли рекрутирования моноядерных клеток, CXCR2 и CCR1, -2 и -5 могут таким образом способствовать атеросклерозу путем обеспечения трафика воспалительных нейтрофилов во внось формируемые атеросклеротические бляшки. Поскольку тробоциты могут вносить вклад в инициацию артериального воспаления благодаря экспрессии цитокинов, таких как CD40 лиганд(CD40L) или interleukin-1 и благодаря отложению функционально взаимо-усиливающих хемокинов, таких как CCL5 и CXCL4 на стенке воспаленного сосуда (von Hundelshausen et al, 2005, 2009), они могут кооперироваться с нейтрофилами, чтобы управлять прогрессией ранних атеросклеротических повреждений. Кроме того, CD40L на тромбоцитах важны для прогрессии атеросклероза путем обеспечения в эндотелии и макрофагах экспрессии CCL2 и обеспечения взаимодействий тромбоцит-лейкоцит и тромбоцит-эндотелий (Lievens et al, 2010). Тромбоциты также влияют на функции T лимфоцитов, напр., путем усиления адгезии T клеток с поверхностями, покрытыми коллагеном in vitro и артериальными тромбами in vivo (Hu et al, 2010). В совместных культурах с CD4⁺ T клетками, тромбоциты ингибируют пролиферацию, но способствуют дифференцировке этих клеток в T helper type 1, type 17 и Treg фенотипы, при этом эффект зависит от коммуникаций тромбоцит-лимфоцит посредством прямого межклеточного контакта и передачи сигналов посредством CCL5 и CXCL4 (Gerdes et al, 2011). Т.о., тромбоциты могут модулировать ход болезни воспаления сосудов на многих уровнях. Обзор хемокинов, участвующих в атеросклерозе, представлен в Table 1, а новые механизмы хемокинового контроля прогрессии атеросклеротических бляшек схематически представлены на Fig 1.

Table 1. Established and novel chemokine players, functions and cellular targets in atherosclerosis

Таблица

Traditional chemokine-based therapeutics for treating cardiovascular disease

Участие системы хемокинов в большом количестве воспалительных заболеваний подвигло исследователей как коммерческих, так и не коммерческих организаций исследовать возможность фармакологического вмешательства. Это, по-видимому, исполнимо, поскольку 50% лекарств на рынке нацелено против G protein-coupled рецепторов, которые включают также и хемокиновые рецепторы. Имея определенные карманы для связывания и активации хемокинов, хемокиновые рецепторы прекрасно подходят для разработки низкомолекулярных ингибиторов. Многочисленные низкомолекулярные ингибиторы были разработаны, посредством чего стала возможной прямая и полная блокада. Один из первых, TAK779 (Takeda) был первоначально предназначен стать ингибитором human immunodeficiency virus (HIV) , проникающего в клетки хозяина. TAK779 потенциально блокирует CCR5 у человека и кроме того ингибирует CXCR3 у мышей (Gao et al, 2003). Применение TAK779 у мышей эффективно снижает формирование атеросклеротических повреждений, обусловленное снижением T helper type 1 клеток в повреждениях (van Wanrooij et al, 2005). Эта находка подразумевает, что блокада CCR5 может также снижать риск атеросклероза у HIV-инфицированных индивидов, у которых повышен риск сердечно-сосудистых событий. Однако это исследование, к сожалению, не выявило, обусловлены ли наблюдаемые благоприятные эффекты блокадой CCR5 или CXCR3 или обоих с помощью TAK779. В более поздней работе уменьшение атеросклероза с помощью специфического CXCR3 антагониста NBI-74330 (Amgen) приводило к уменьшении эффекторных T клеток в дренируемых лимфатических узлах и приводило к увеличению количества Treg в лимфатических узлах и бляшках (van Wanrooij et al, 2008). Т.о., благодаря блокаде CXCR3, миграция эффекторных T клеток может быть редуцирована, чтобы помочь Treg, приводя к общему снижению воспалительной реакции. Интересно, что CXCR2 антагонист SB-517785-M (GlaxoSmithKline), как было установлено, редуцирует angiotensin II-индуцированное рекрутирование лейкоцитов в артериолы крыс (Nabah et al, 2007). Благодаря своему потенциалу, ингибировать приток нейтрофилов, это соединение может помочь предотвратить инициальную фазу атерогенеза (Drechsler et al, 2010), подразумевая, что ингибирование CXCR2 может оказаться благоприятным для предупреждения атеросклеротической болезни у пациентов с риском. Хемокин, который исторически стал главным в качестве терапевтической мишени для лечения сердечно сосудистых болезней, это CCL2. У мышей фармакологическая блокада оси CCL2-CCR2 обнаруживает варьирующий успех. Напр., блокирование антител против CCL2 и CCL12 снижает образование бляшек и инфильтрацию воспалительных лейкоцитов у Apoe-/- мышей (Lutgens et al, 2005). Однако не обнаруживается снижения атеросклероза у мышей, обработанных INCB-3344, мощным антагонистом CCR2, хотя этот антагонист редуцирует количество циркулирующих воспалительных Ly6Chi моноцитов (Aiello et al, 2010). Малый молекулярный ингибитор CCR2, CCX140 (ChemoCentryx) недавно завершил фазу 2 клинического испытания для типа 2 diabetes mellitus. Этот антагонист также обнаруживает благоприятный эффект у пациентов с сердечно-сосудистыми болезнями, но соотв. клинические исследования пока недоступны (Charo & Taub, 2011). Поскольку эти результаты в целом указывают, что ингибирование хемокиновых рецепторов в принципе перспективно для предупреждения и лечения сердечно-сосудистых болезней, некоторые предостережения остаются. Поскольку блокада CXCR4 низкомолекулярным антагонистом AMD3465 (AnorMED) снижала образование неоинтимы после артериальных повреждений у мышей (Karshovska et al, 2008), долговременное лечение с помощью AMD3465 увеличивает диетой индуцированный атеросклероз путем мобилизации нейтрофилов из костного мозга и увеличения их рекрутирования в бляшки (Zernecke et al, 2008).

Др. установленный способ достижения ингибирования хемокиновой оси использует блокирование антител. Благодаря своей высокой специфичности и их часто подходящей продолжительности полу-жизни в плазме, антитела в общем являются пригодными агентами для терапевтического вмешательства. Однако необходимо их использование c помощью инъекций, высокая цена их продукции и риск аллергических реакций или возникновения побочных иммунных являются недостатками применения антител, хотя последние могут предупреждаться c помощью усовершенствованных процедур. Несмотря на это, для цитокинов, таких как tumour-necrosis factor (TNF)- α базирующаяся на антителах терапия уже опробована для лечения анти-иммунных болезней уже более 10 лет. Также хемокины и их рецепторы, различные базирующиеся на антителах лекарственные кандидаты проходят клинические испытания, хотя это не привело к прорыву. Напр., усовершенствованные против CXCL8 антитела ABX-IL8 (Abgenix),как было установлено, дали неутешительные результаты при клинических испытаниях для лечения ревматоидного артрита, псориаза и COPD (Wells et al, 2006). Кроме того, усовершенствованные моноклональные антитела ABN-912 (Novartis) и MLN1202 (Millenium), которые направлены против CCL2 и CCR2, соотв., также оказались неактивными при клинической оценке их успешности при ревматоидном артрите (Schall & Proudfoot, 2011). В фазе II клинического испытания, однако, MLN1202 вызывали снижение уровней сывороточного C-реактивного белка у пациентов с риском сердечно-сосудистых заболеваний (Gilbert et al, 2011), подтверждая тем самым, что блокада CCR2 снижает воспаление в этих условиях и может быть добавлена к современному лечению, а именно к терапии статинами. Др. антитела, направленные против системы хемокинов с терапевтическим потенциалом, которые сегодня проходят клинические испытания, это CCR5-специфические HGS004 (HGS Inc.) в качестве анти-HIV агента и CXCR3-специфические MDX-1100 (Bristol-Myers-Squibb) для лечения ревматоидного артрита (Table 2).

Table 2. Chemokine-receptor antagonists with therapeutic potential for cardiovascular disease Таблица

Novel classes of chemokine blockers

В противовес к более обычным подходам в виде низкомолекулярных антагонистов м антител, разработан ряд новых хемокиновых антагонистов. Кроме того, интересны белки, нейтрализующие хемокины с терапевтическим потенциалом, изолированные из паразитов. Использование новых соединений может быть осуществимым, напр.. в случае гетерогенности мишеней для хемокинов или хемокиновых рецепторов, напр., в результате пост-трансляционных модификаций, которые модифицируют сродство мишеней к антителам или низкомолекулярным антагонистам.

Благодаря своей компактной и мощной структуре и относительной легкости продукции c помощью рекомбинантного метода, хемокины сами по себе имеют материал для структурной модификации, который дает мощных антагонистов (Koenen & Weber, 2010). Прототипом для модифицированных хемокинов является N-methionylated вариант CCL5 (Met-RANTES) с антагонистическими свойствами, идентифицируемыми c помощью прозоливости после экспрессии CCL5 у E. coli (Proudfoot et al, 1996). Применение Met-RANTES,как было установлено, вызвает благоприятные эффекты в различных мышиных моделях воспалительных болезней (Ajuebor et al, 2001; Berres et al, 2010; Song et al, 2002), включая атеросклероз и образование неоинтимы после артериальных повреждений (Schober et al, 2002; Veillard et al, 2004). Отметим, что CCL5 может рассматриваться как ключевой детерминант тяжести болезни, поскольку блокада CCL5 антителами или искусственно созданными антагонистами обнаруживает благоприятные результаты у разных мышей с атеросклерозом и у моделей с ишемией и восстановлением кровоснабжения сердца (Braunersreuther et al, 2010, 2008; Montecucco et al, 2011). В целомl, N-терминальные модификации хемокинов ведут к вариантам, которые обладают пониженной активностью и антагонистическим потенциалом, характеристики, которые эксплуатируются в последних исследованиях, в которых разнообразные N-терминальные аминокислоты CCL5 и CX3CL1 из фаговой библиотеки, дают интересных новых антагонистов (Dorgham et al, 2009; Gaertner et al, 2008). Эти новые антогонисты однако не были исследованы на моделях атеросклероза. Аналогичным способом, N-терминальные укороченные мутации CCL2 и CXCL8 эффективно связываются, но неспособны активировать свои рецепторы (Gong & Clark-Lewis, 1995; Moser et al, 1993). Помимо N-конца GAG-связывающий домен и аминокислоты, ответственные за олигомеризацию, являются интересными мишенями loiz мутагенеза и их модификация ттакже дает варианты хемокинов с антагонистическим потенциалом. Напр., мутация proline 8 в alanine в CCL2, которая дает облигатную мономерную форму, которая сохраняет in vitro активность в отношении CCR2действу3ет как антагонист in vivo, возможно за счет смещения эндогенного CCL2 с GAGs на стенку сосуда (Handel et al, 2008). Сходным образом, мутация сайта связывания GAG в CCL5, CCL7 и CXCL12 дает хемокиновые мутанты, которые компетентны к активации рецепторов in vitro , но обладают противовоспалительными доминантно-негативными свойствами у животных, моделирующих воспаление, включая атеросклероз (Ali et al, 2010; Braunersreuther et al, 2008; O'Boyle et al, 2009). Интересно, как мутантные хемокины с редуцированной олигомеризацией или связыванием с GAGs могут , несмотря на это действовать как ингибиторы ао отношению к их дикого типа экземплярам. Для хемокинов, которые формируют олигомеры высшего порядка, такие как CCL5, мутантный CCL5 может спариваться с эндогенным CCL5, чтобы сформировать биологически неактивный гетеромер. Однако для хемокинов, которые по максиму дают димеры, такие как CCL2 и CXCL12, механизм действия их мутантов менее четко определен. Одним из объяснений может быть десенсибилизация родственных им рецепторов c помощью мутантных хемокинов, которые всё ещё могут действовать как частичные агонисты in vivo.

при комбинации модификаций усиливающих функцию и приводящих к потере функции, был создан новый класс хемокиновых блокаторов с повышенным потенциалом соединяться с GAGs, но без соотв. сродства к распознаваемым ими рецепторам, таким как недавно описанный PA508 (Piccinini et al, 2010). Этот новый антагонист хемокинов модифицирует форму CCL2 с искусственно созданным дополнительным сайтом связывания GAG и мутацией остатков, критических для связывания и активации CCR2. Это приводит к сильному увеличению связывания GAGs, пока с пониженным сродством к CCR2. В нашем недавнем исследовании на мышах, применение PA508 снижало образование неоинтимы после артериальных повреждений, обусловленное снижением инфильтрации моноцитов в повреждения (Liehn et al, 2010). В модели миокардиальной ишемии и восстановлении кровообращения PA508 снижал миокардиальные повреждения и улучшал кардиальную функцию путем снижения иммиграции моноцитов и благоприятного изменения композиции рубцов. Т.о., путем конкуренции с эндогенным CCL2, PA508 ослаблял воспалительную реакцию после артериальных и миокардиальных повреждений и оказывался способным снижать приток воспалительных клеток. Сходные результаты были достигнуты с белками, происходящими из вируса pox или герпеса, которые были способны ингибировать связывание хемокинов с GAGs на стенках сосудов (Dai et al, 2010). В модели ремоделирования аллогенных сосудистых трансплантатов у мышей одиночная инъекция вирусного pox M-T7 белка, который ингибировал соединение хемокинов с GAGs, происходило сильное уменьшение образования неоинтимы трансплантата в дикого типа и CCL2^-/- трансплантах, но не у ndst-1^-/- трансплантатов, демонстрируя, что ингибирующие эффекты M-T7 были специфичными для взаимодействий между хемокинами и GAG . Помимо белков, которые модулируют презентацию хемокинов на стенку сосудов, GAGs сами по себе могут удалять хемокины из сосудистых эндотелиальных клеток. Это было обнаружено в исследовании, показавшем, что применение heparin у пациентов ведет к увеличению в плазме концентраций CXCR3-лигандов CXCL9, -10 и -11 (Ranjbaran et al, 2006). Дальнейшие исследования показали, что heparin удаляет эти хемокины с эндотелиальных GAGs, приводя к снижению трансэндотелиальной миграции T клеток in vitro и рекрутированию аллогенных лимфоцитов в мышиной модели трансплантаций артериальных аллотрансплантатов. Выше представленное исследование показало, что вмешательство в связывание хемокинов с GAGs может представлять собой привлекательный подход для лечения сосудистых воспалительных болезней.

Др. белки, связывающие хемокины, из патогенов были клонированы и экспрессированы, и эти молекулы обнаружили мощные противовоспалительные свойства на модельных животных. Напр., в 36 kDa белок, секретируемый яйцами нематод Schistosoma mansoni (секретирующих хемокин-свзывающий белок, CKBP),как было установлено, инактивирует хемокины семейств CC-, CXC- и CX3C и уменьшает рекрутирование лейкоцитов у некоторых мышиных моделей воспаления (Smith et al, 2005). Кроме того, слюна клещей содержит белки, которые ослабляют иммунную реакцию. Среди этих белков недавно открытые Evasins, группа компактных хемокин-инактивирующих белков с высокой избирательностью для членов разных субклассов хемокинов (Deruaz et al, 2008). Evasin-1 и -4 соединяются с CC-хемокинами (напр., CCL3, -4 и -5), тогда как Evasin-3 избирательно соединяется с CXC-хемокинами CXCL1 и CXCL8 (CXCL2 у мышей). 3D структура Evasins-1 и -3 была установлена и у обоих она очень компактная и характеризуется уникальной структурными складками, отличными от др. (напр., вирусных) CKBPs (Deruaz et al, 2008; Dias et al, 2009). В исследованиях по совместной кристаллизации, Evasin-1, как было установлено, формирует 1:1 комплекс с CCL3, в котором гибкий N-конец хемокина охвачен C-концом Evasin-1 (Dias et al, 2009). Возникающая в результате неподвижность CCL3 N-конца c помощью Evasin-1 может быть механизмом, лежащим в основе можного ингибирования хемокинов. Терапевтический потенциал Evasin-3 был изучен на моделях ишемии и восстановления кровообращения в сердце у мышей (Montecucco et al, 2010). При этом единовременное применение Evasin-3 сразу же после начала ишемии было достаточным, чтобы снизить пост-ишемический размер инфаркта по сравнению с контрольными животными. Это уменьшение повреждений кардиальной ткани сопровождалось низкими концентрациями циркулирующего troponin I и снижением инфильтрации нейтрофилов в место повреждения, которые являются первым типом клеток, привлекаемых c помощью CXCL1 и CXCL2. Т.о., эти исследования подтвердили, белки, нейтрализующие хемокины, из патогенов могут обладать потенциалом как противовоспалительных агентов для лечения сердечно-сосудистых болезней.

Наконец, новейшие стратегии по манипулированию системой хемокинов были придуманы, которые вселяют надежды в качестве будущих терапевтических средств. Терапевтическое использование антител, напр., может быть замещено блокаторами высокого сродства, сконструированными на белковом каркасе в будущем (Binz et al, 2005). Такие каркасы могут оказаться более эффективными, чтобы продуцировать и использовать потенциал избыточности в системе хемокинов, они могут быть снабжены сайтами связывания для множественных мишеней. Др. возможность заключается в разрушении проатерогенных гетеромеров происходящих из тромбоцитов хемокинов CCL5 и CXCL4. Поскольку CCL5 и CXCL4 формируют гетеромерные комплексы с повышенным потенциалом привлечения моноцитов в места воспаления (von Hundelshausen et al, 2005), мы полагаем, что избирательная диссоциация этого комплекса может быть интересной для противовоспалительных подходов. Синтетический пептид, наз. MKEY, который разработан для этих причин, вызывал достоверное снижение образования атеросклеротических повреждений у гиперлипидемичных мышей, благодаря снижению накопления повреждающих макрофагов (Koenen et al, 2009). Эффективность этого MKEY пептида нуждается в присутствии как CCL5, так и CXCL4, указывая на специфичность этого антагониста. Более того, в отличие от CCR1/-5 антагониста Met-RANTES, функции иммунной защиты, напр., во время инфекции herpes simplex type-2 сохранялись после лечения c помощью MKEY, указывая, что нормальные иммунные функции остаются неизменными во время нарушения CCL5-CXCL4 гетеромеризации. Сутью данной потенциальной стратегии является изменение гомеостаза иммунных клеток путем ингибирования хемокинов с гомеостатическими функциями. Осуществимость этого подхода недавно было продемонстрирована в нашем исследовании, показавшем, что посредством ингибирования CCL17 за счет блокирования антител у Apoe^-/-мышей, достигается экспансия благоприятных Treg в лимфатических узлах и аорте, это происходит в результате значительного ослабления образования атеросклеротических повреждений (Weber et al, 2011). Т.о., модуляция гомеостаза лимфоцитов c помощью функциональных манипуляций с CCL17 открывает возможности для разработки и использования новых терапевтических средств для лечениях сосудистых атеросклеротических болезней. Антагонисты с благоприятными свойствами для лечения сердечно-сосудистых болезней, представлены в Табл.2.

Concluding remarks

It is undisputed that the chemokine system plays an important role in the pathophysiology of cardiovascular disease. However, although research in this field is extensive, only 2 chemokine receptor antagonists have currently achieved FDA approval: the CCR5 antagonist Maraviroc for the treatment of HIV and the low molecular weight CXCR4 antagonist Plerixafor (AMD3100) for aiding stem cell mobilization. This highlights the still existing challenges in developing suitable compounds directed against the chemokine system in the context of inflammatory disease. A compound may fail due to numerous reasons and most problems that are encountered during the development of a drug are unforeseen and surface particularly during the clinical evaluation in human subjects, emphasizing the differences between animal models and the course of human life. Unexpected adverse drug interactions, lack of efficiency or heterogeneity in a patient population are only a selection of problems that may arise. In addition, some scientists argue that the search for chemokine-based therapeutics is hampered by the redundancy in the chemokine system (Horuk, 2009), while others advocate for a better conceived target selection and the improvement of drug dosage regimens (Schall & Proudfoot, 2011). Even if this results in effective agents that target the chemokine system, potential safety issues with respect to host defense have to be considered. This is emphasized by studies in mice, demonstrating an impaired mobilization of monocytes from the bone marrow in the absence of CCR2 after microbial infection (Serbina & Pamer, 2006) and recent work revealing a narrow therapeutic bandwidth between beneficial and defense-impairing treatment with Met-RANTES in a model of experimental periodontitis (Repeke et al, 2011). Thus, novel and innovative approaches are still needed to tackle the diverse problems that are currently present in the development of chemokine system-based therapeutics. The selective inhibition of chemokine–chemokine and chemokine–GAG interactions, the use of newly identified chemokine-inhibiting proteins from ticks or viruses, or the modulation of lymphocyte homeostasis, for example by the blockade of CCL17 might open fresh perspectives for the therapeutic targeting of the chemokine system in atherosclerosis and other inflammatory diseases. However, these novel approaches each harbour their inherent drawbacks, such as pharmacologic barriers for synthetic peptide-based compounds, specificity issues for chemokine–GAG-based therapeutics or immunologic safety issues for chemokine-binding proteins and compounds blocking homeostatic chemokines. Thus, even though novel innovative approaches are under development, the way towards truly effective therapeutics based on the chemokine system may still remain curved and bumpy. Pending issues It would be of exceptional interest to investigate the spatial and temporal expression patterns of chemokines during the development of inflammatory (atherosclerotic) diseases. This would also allow better target and dosage selection for the design of effective therapeutics. Different agonists that bind to the same chemokine receptor are known to elicit different cellular responses. The mechanisms behind this phenomenon are largely unknown. Novel and specific drug targets can be revealed through the identification of heterophilic chemokine–chemokine or chemokine receptor–receptor interactions. Through the identification of cell types that have previously been underappreciated to play a role in the pathophysiology of atherosclerosis, novel entry points for drug design can be created.

For more information Information about clinical trials: http://clinicaltrials.gov/

Information about chemokine receptor nomenclature: www.iuphar-db.org

Information about the authors: http://www.klinikum.uni-muenchen.de/de/Kliniken_Abteilungen_Institute/Abteilungen_Institute/Inst_f_Prophylaxe_u_Ep_d_Kreislaufkrankheiten/index.html

Chemokines: established and novel targets in atherosclerosisRory R. Koenen, Christian WeberEMBO Molecular Medicine Volume 3, Issue 12, pages 713–725, December 2011

Chemokines: established and novel targets in atherosclerosis
Rory R. Koenen, Christian Weber
EMBO Molecular Medicine Volume 3, Issue 12, pages 713–725, December 2011