Полное экзомное секвенирование (WES) выявило патогенетические мутации нескольких ранее неохарактеризованных генов для редких болезней. Такое открытие генов было нацелено на постнатальные фенотипы, такие как известные синдромы, менделирующие болезни или умственная отсталость [1-3]. Меньшее внимание, однако было уделено использованию WES для обнаружения генов при нарушениях у плодов, которые приводят к гибели in utero, поскольку они обычно возникают спорадически и не распознаются как менделирующие заболевания. Кроме того, пренатальные клинические данные часто неточны. Даже если доступны данные аутопсии, ассоциация фенотипов плодных множественных врожденных аномалий (MCA) со специфическим клиническим диагнозом, который часто только описан у детей или позднее, затруднена. Всё это ограничивает распознавание плодных MCA синдромов и ухудшает интрпретацию данных по всему экзому [4].
Недавно гены, участвующие в функции ресничек, как было установлено, вызывают Mohr-Majewski (MIM 258860), hydrolethalus (MIM 236680) и acrocallosal (MIM 200990) синдромы в семьях с рецессивным наследованием, подтверждая главную роль таких мутаций в аномальном развитии плодов [9, 10]. Цилиопатии это группа клинически и генетически разнородных нарушений, обладающих общим клиническим признаком и которые могут затрагивать почти каждый крупный орган или ткань, отражая важность первичных ресничек в развитии. Действительно все типы клеток позвоночных образуют первичные реснички, екоторые возникают из модифицированных центросом, органелл, которые образуют полюса веретена во время митозов. Первичные реснички могут ощущать широкий спектр внеклеточных сигналов и передавать сигналы, связанные с пролиферацией, полярностью, ростом , дифференцировкой или с тканевым поддержанием внутрь клеток. Реснички являются сложными сенсорными органеллами, участвующими в контроле разнообразных клеточных сигнальных путей [11]. Т.к. структурной основой ресничек является кольцо из 9 микротрубочек, то реснички рассмативаются как специализированные выпячивания цитоскелета и появляются доказательства, что белки ресничек являются ключевыми игроками в др. клеточных процессах, использующих цитоскелет и координирующих цилиогенез и прогресс клеточного цикла посредством молекулярной сети [12-15].
Мы использовали WES в семьях с повторяющимся плодным паттерном MCA, который мы рассматривали как летальный из-за определенных уродств головного мозга и почек. Мы полагали, что клинические проявления результат цилиопатий. Мы идентифицировали новые аутосомно рецессивные мутации, которые вызывают летальные состояния. Мы показали, что у мышей аутосномно рецессивные мутации в тех же самых генах, также как и нокаут генов воспроизводят фенотипические отклонения у человека.
Discussion
Мы описали летальный плодный фенотип ресничек, ассоцированный с биаллельными инактивирующими мутациями KIF14, члена сверхсемейства кинезинов. Кинезины являются зависимыми от микротрубочек молекулярными моторами, которые играют важные роли в делении и внутриклеточном транспорте органелл в клетках [22], и , как известно, являются критическим для цилиогенеза и внутрижгутикового транспорта [23]. Carleton et al. [24] показали, что внутренний моторный домен KIF14 содержит зависимую от микротрубочек АТФазную активность и что экспрессия KIF14 зависит от клеточного цикла. Замалчивающие KIF14 клетки демонстрируют снижение концентрации KIF14 в midbody в клетках на поздней ст. митоза и неспособны завершать цитокинез, это приводит к образованию у дву- и многоядерных клеток. Был сделан вывод, что истощение KIF14 нарушает ход клеточного цикла и вызывает неспособность цитокинеза [24]. Повторная проверка гистологических срезов головного мозга и почек затронутых плодов неожиданно выявила высокое количество двуядерных клеток по сравнению с контролем (Fig. 3).
KIF14 законсервиирован у макак резус, собак, мышей, крыс, кур, рыбок данио, плодлвых мух и комаров (NCBI Gene, www.ncbi.nlm.nih.gov/gene). KIF14 принадлежит семейству Unc104/KIF1, быстрых антероградных мономерных моторов с типа NH2-терминальным моторным доменом (N-type белки)[25]. Мышиный гомолог Unc104, Kif1A, специфически экспрессируется в нейронах и обогащен в аксонах и фокальная гибель клеток нейронов наблюдается в ЦНС нокаутных мышей, оторые в основном погибают в течение дня после рождения [26]. Nebbish, гомолог KIF14 у дрозофилы, участвует в митотических и мейотических клеточных делениях и в регуляции клеточного цикла [27, 28]. Небольшой процент гомозигот, доживших до взрослого состояния имеет ряд морфологических дефектов, включая грубые глаза, отсутствие щетинок и нарушения абдоминальных структур (особенно у самок дрозофилы), демонстрируя фундаментальную необходимость этого гена для ранн76его развития (Flybase, www.flybase.org).
Сравнительно недавно гомозиготная мутация в Kif14 (G/A замена в 3' splice акцепторном сайте Kif14 экзона 5) была идентифицирована у нового спонтанного мышиного мутанта, laggard (lag) [29]. Мыши laggard обнаруживают очень сильное уменьшение размера головного мозга аплоть до 47% по сравнению с их собратьями из того же помёта на постнатальный день 9 (P9), наиболее дараматичное в коре головного мозга и мозжечка и обонятельных луковицах. Кроме того, тяжелое гипомиэлинизирование и дисгенез коры головного мозга и мозжечка, а также гиппокампа происходит в ассоциации с генеральным ограничением роста тела и преждевременной гибелью перед постнатальным днем 21 (Theiler stage 28, соответствующая периоду плодного развития у людей). Морфология др. органов, включая общую морфологию почек, была описана ка кнормальная [29].
И мутации, описанные здесь в семьях, и мутации, наблюдаемые у мышей laggard затрагивают кодоны внутри моторного домена кинезаина (codon 356-709) (Fig. 4). Модель с Kif14 нокаутом подтвердила, что Kif14 является причинным геном для этого фенотипического отклонения у мышей.
Хотя мы не можем идентифицировать почечные аномалии у мышей, как это присутствует у плодов человека, фенотип мышей laggard прекрасно воспроизводит нарушения развития головного мозга человека, уменьшение размера головного мозга, общее снижение роста и ранняя летальность в этих семьях. Детальное фенотипическое сравнение представлено в Table 1.
В соответствии с профилем EST человека (Hs.1304, NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov) KIF14 преимущественно экспрессируется в эмбриональной ткани и также во взрослых почках, печени, мочевом пузыре, лёгких, матке, тимусе и яичниках. Картина нарушений в головном мозге, наблюдаемая у плодов сравнима с данными по экспрессии Atlas of the Developing Human Brain (www.brainspan.org). На 15, 16 и 21 неделе после зачатия экспрессия KIF14 наивысшая в вентрикулярной и субвентрикулярной зоне, обеспечивает развитие головного мозга и мозжечка и в особенности клеток Пуркинье и глубоких ядер головного мозга. KIF14 также обнаруживается в мозолистом теле и медиальном, латеральном и каудальном ганглиолярном возвышении (ganglionic eminence).
Несколько др. членов семейства генов кинезинов участвуют в раннем эмбриональном развитии и формировании ресничек как у людей, так и животных моделей. Аутосомно рецессивные мутации в KIF7, компоненте пути hedgehog, недавно были идентифицированы в качестве причины acrocallosal и плодного hydrolethalus синдрома у человека [10, 30]. Внутрисемейная фенотипическая изменчивость сравнима с изменчивостью, наблюдаемой в наших семьях. Авт. предоставлили экспериментальные доказательства своим предварительным фенотипическим предсказаниям, что эти фентипические отклонения являются результатом нарушений ресничек. Аутосомно доминанные мутации в KIF11 вызывают микроцефалию [31], а мутации в KIF5C и KIF2A вызывают микройефалию и нарушения кортикального развития [32]. Интересно, что гомозиготные нарушения Kif11 у мышей приводят к ранней эмбриональной летальности [33].
Гипогенез и агенез червячка мозжечка, также как глобальные отклонения в развитии мозжечка и кистоз почек являются характерными для хорошо известного Joubert, Joubert-related и MKS синдромов [34, 35]. MKS является летальным перед или сразу же после рождения и все эти состояния обнаруживают клинические признаки, которые перекрываются с клиническими проявлениями в изученных семьях. Сила аллельного эффекта на функцию белка в одиночном локусе давно известных генов коррелирует с тяжестью фенотипического отклонения, нулевые аллели вызывают летальные MKS, тогда как гипоморфные мутации участвуют в возникновении Joubert-/nephronophthisis и Bardet-Biedl фенотипов у детей и взрослых(rev. [36]). Все белки, идентифицированные при Joubert/MKS синдромных мутациях располагаются в базальных тельцах или аксонеме реснички и некоторые из них участвуют в модуляции путей передачи сигналов hedgehog, wingless и планарной клеточной полярности [37-39].
Lin et al. [19] продемонстрировали участие кинезинов в потере первичных ресничек и появлении почечных кист при специфичном для почек нокауте Kif3a у трансгеннх мышей. Гомозиготные Kif3a нокаутные мыши являются эмбриональными леталями [40, 41]. Гены семейства кинезинов также оказывают регуляторный эффект на передачу сигналов wingless [15]. Гипоплазия матки и влагалища или аплазия, которые возникают у поврежденных плодов, опи ъсанных здесь, были описаны и ранее при нарушениях образования ресничек [42, 43]. Члены hedgehog (HH), homeobox (HOX) и the wingless (WNT) семейств генов, которые все являются частью сигнальной сети ресничек, играют критическую роль а развитии репродуктивного тракта [44, 45].
Ряд дальнейших клеточных и животных модельных экспериментов свяжет KIF14 и его непосредственных функциональных партнеров с регуляцией клеточного цикла, сетью и передачей сигналов в ресничках (Fig. S2), а также с фенотипическими отклонениями при цилиопатиях [46-51]. Интересно, что KIF14 совместно очищается в комплексе с PRC1 белком (MIM *603484), который регулирует цитогенез, локализует базальные тельца в эпителиальных клетках с ресничками и контролирует функцию и морфологию ресничек. Данные подтвеждают, что неожиданное количество цитокинетических регуляторных аппаратов может также выполнять важные функции, связанные со ресничками [47].
Мы впервые описали феноипические отклонения у человека, связанные с биаллельными инактивирующими мутациями в KIF14. Летальные аномалии развития головного мозга и почек и недостаток роста у затронутых плодов человека и соотв. мышиные модели строго подтверждают, что эти мутации выступают как причинные для этого ранее не описанного синдрома порока развития. Характер аномалий развития характерен для аномалий ресничек и это предсказывает участие KIF14 в функции первичных ресничек. Эта интерпретация подтверждается предыдущими исследованиями клеток и модельных организмов по партнерам, взаимодействующими с KIF14. Цилиарные отростки, структуры и сигнальные пути строго взаимосвязаны и KIF14, по-видимому, является дальнейшим примером, возникающей связи между регуляцией клеточного цикла, цитокинезом и первичной ресничкой. Точную роль KIF14, однако, необходимо определить, чтобы объяснить цепочку вредных событий на ранних стадиях развития, вызываемых специфическими мутациями, нами идентифицированными. KIF14 может рассматриваться как ген кандидат, обеспечивающий жизнеспособный аллельный фенотип ресничек, а также микроцефалию в присутствии гипоморфных аллелей.
В клинической практике этиология многих плодных нарушений остается неизвестной после стандартного кариотипирования или тестирования хромосомных микромассивов и как следствие генетическое консультирование в отношении риска повторного появления в будущих беременностях часто расплывчато. Идентификация причинных мутаций предоставляет возможость ранней пренатальной инвазивной диагностики при последующих беременностях. Наши находки вносят вклад в мнение, что аутосомно рецессивное наследование может объяснить ряд недиагностируемых летальных плодных нарушений у человека [7, 8, 33]. WES может быть использован в индивидуальных семьях с недиагностированными летальными MCA синдромами для выявления аутосомно рецессивных мутаций при условии, что анализ предварительных данных плодного фенотипа будет скоррелирован с определенными путями развития в эмбриогенезе.
