Мы установили, что ни одна из идентифицированных мутаций Nek8 у NPHP пациентов и ни одна эквивалентная мутация, обнаруженная у мышей jck, моделирующих ювенильную кистозную болезнь почек, не нарушает активности энзима. Однако, киназная активность необходима для правильной локализации белка на центросоме делящихся клеток и в проксимальном регионе ресничек покоящихся клеток. С др. стороны, локализация обеспечивается с помощью некаталитического RCC1 домена и поэтому мы предположили, что аутофосфорилирование внутри этого домена может быть необходимо для выявления места доставки центросомы. Мы также установили, что выход из клеточного цикла и инициация цилиогенеза сопровождаются, прежде всего, активацией, и затем деградацией белка Nek8, поэтому активация может быть необходима для аутофосфорилирования внутри каталитического домена киназы. Эти исследования предоставляют важную новую информацию о том, что регулирует, как активность, так и локализацию этого белка цилиопатической болезни (Table 1). Table 1. Activity and subcellular localization of kinase domain and disease-associated mutants of Nek8

Мы впервые установили, что мутации не только ключевого каталитического сайта, остатков (K33R и D128A), но и также сайта на петле активации, который часто становится предметом фосфорилирования в протеин киназах, T162A в случае Nek8, полностью устраняют киназную активность Nek8. Напротив, T162E phosphomimetic мутация ведет к эквивалентной, возможно даже повышенной, активности Nek8 по сравнению с белком дикого типа. Поэтому мы пришли к заключению, что Nek8 почти полностью регулируется позитивным способом благодаря фосфорилированию по этому сайту. Во-вторых, мы установили, что изолированный киназный домен остается активным, как и в белке полной длины, это говорит о том, что в отличие от родственного Nek9 белка (31), или RCC1-подобный домен не действует в качестве ауто-ингибирующего региона, или аутоингибирование полностью высвобождается, когда белок экспрессируется в делящихся HEK 293 клетках. В-третьих, мы установили, что киназа полной длины способна фосфорилировать изолированный RCC1-подобный домен, открывая возможность того, что эта киназа подвергается аутофосфорилированию внутри этого региона. Если мы посмотрим на локализацию этого мутантного и укороченного белков, то мы обнаружим, что локализация на центросомах и ресничках коррелирует в точности с активностью белков полной длины (активные белки локализуются корректно, а инактивированные белки неспособны локализоваться). Интересно, что хотя изолированный RCC1-подобный некаталитический домен локализуется корректно, а изолированный киназный домен нет. Итак. мы предлагаем модель. согласно которой RCC1-подобный домен содержит последовательность для направления на центросому и в ресничку, но что киназная активность также необходима для аутофосфорилирования внутри RCC1 домена, что потенциально вызывает конформационное изменение, которое выявляет сайт для доставки центросомы в белке полной длины (Fig. 8A). Тот факт, что локализация Nek8 в проксимальном регионе реснички зависит от белка Inv/NPHP2, который также регулирует локализацию NPHP3 в том же самом компартменте (26), означает, что было бы дельно протестировать, может ли регион для доставки на центросому формировать комплекс с одним или обоими этими белками.

NPHP является рецессивной болезнью и поэтому д. быть результатом потери функции обоих аллелей гена NPHP. Мутация H425Y идентифицирована в гомозиготном состоянии и мы предположили, что потеря правильной субклеточной доставки и ведет к болезни. Потеря локализации в мутантной ресничке и центросомах согласуется с результатами, полученными Otto et al. (25). Однако мы также наблюдали потерю этого мутанта из ядра, но остается неясным является ли ключевой дефект результатом потери локализации на центросомах и в ресничке или скорее в ядре. Nek8 не содержит обычной NLS, указывая тем самым, что ядерное накопление является результатом или скрытой NLS или взаимодействия с партнером, который подвергается доставке в ядро. В терминах доставки в ресничку, поскольку Nek8 не содержит FR мотива ли кислых кластеров, которые могут связывать PACS-1 (33,34), он содержит два VxPx мотива, которые поставляют PC-2 и др. белки ресничек в эту структуру (35-38). Хотя они расположены внутри RCC1 домена, конструкция, использованная здесь, позволила обнаружить их на самом N-конце этого региона непосредственно после киназного домена и неясно, как они могут быть затронуты мутацией H425Y. Более того, эти мотивы не достаточно хорошо законсервированы (Supplementary Material, Fig. S7). Остается непонятным функциональны они или нет.

Интригует, что неправильная локализация все трех субклеточных сайтов наблюдается не только у H425Y мутанта, но и также при jck эквивалентной G442V мутации, которая расположена внутри того же самого RCC1 повтора. Можно представить, что доставка на центросому и в ресничку регулируется взаимодействием с одним специфическим белком партнером, но может ли это также направлять белок в ядро? Эта возможность подкрепляется доказательствами, что факторы ядерного транспорта Ran и importin-β2 играют роль в доставке в ресничку микротубулярного моторного белка KIF17 посредством мотива, который может действовать или как последовательность локализации в ядре или в ресничке (39). То, что мутация H425Y не ведет непосредственно к крупному нарушению упаковки белка подтверждается тем фактом, что он сохраняет полностью киназную активность и активируется и деградирует после сывороточного голодания сходным образом с белком дикого типа. С др. стороны, наши данные указывают на то, что эти последние активности регулируются с помощью киназного домена, так что остается возможность, что эта мутация вызывает существенные нарушения предполагаемой β-propeller структуры RCC1 домена. Структурное моделирование Nek8 RCC1-подобного домена показало, что H425 расположена внутри консервативного домена, который обычно обнаруживается в петле между третьей и четвертой β-strands RCC1-подобного propeller листка (blades) (Fig. 8B). Конформация, принимаемая этим мотивом установлена в третьем β-propeller E3 ubiquitin лигазы HERC2, в которой этот мотив повторен дважды. Эта структура указывает на то, что консервативная гистидиновая побочная цепь формирует внутримолекулярный H-мостик с боковой цепью из консервативных Ser или Thr остатка, также присутствующего в этом мотиве (Fig. 8C). Следовательно, мутация в этом остатке тирозина, скорее всего, нарушает локальную структуру. Более того, мутации H425 и G442 лежат внутри поверхностного региона белка, который сильно консервативен среди позвоночных (Fig. 8D, Supplementary Material, Fig. S7 and Movie S1).

Наше исследование выявило два ключевых механизма регуляции Nek8, что сопровождается вступлением в покойное состояние и индукцией цилиогенеза. Во-первых, Nek8 киназа активируется. Это коррелирует с переключением вверх, которое наблюдается только с киназным доменом и которое отсутствует у T162A мутантов. Более того, T162E мутант является столь же активным в делящихся клетках, как и белок дикого типа после сывороточного голодания. Поэтому мы предположили, что увеличение киназной активности Nek8 является результатом фосфорилирования активационной петли, особенно по T162. Однако является ли это результатом аутофосфорилирования или вышестоящей киназы, предстоит ещё определить. Во-вторых, белок Nek8 подвергается деградации зависимым от протеосом методом. Было показано с помощью рекомбинантного GFP-Nek8, но не GFP самого по себе, а также с помощью эндогенного Nek8 белка. Интересно, что деградация, по-видимому, обеспечивается посредством каталитического домена, т.к. только киназный домен деградирует после сывороточного голодания, но она не зависит от активности всей полной длины киназного домена, а ассоциированные с болезнью мутанты оказывались деградированными. В настоящее время причина активации и деградации Nek8 полностью неизвестна. Однако можно предположить, что активность Nek8 может быть необходима для инициации некоторого аспекта программы цилиогенеза, тогда как его деградация может быть необходима для предупреждения инициации подобного процесса.

Предыдущие исследования сообщили, что ни siRNA-обусловленная деплеция, ни избыточная экспрессия Nek8 не влияет на цилиогенез (18,25,30). Понимание. почему мутации Nek8 д. приводить к болезни кистоза почек остается загадкой. Одной из возможностей является, что неправильная локализация нарушает функцию шлюзования белковых комплексов, включая некоторые NPHP белки, которые располагаются вокруг переходной зоны (28,29). Это может приводить к дисбалансу в локализации белков реснички, которые контролируют ключевые сигнальные пути, такие как те, что обеспечиваются с помощью Hedgehog и Wnt лигандов (2,40,41). Сходным образом,он может нарушить передачу сигналов посредством polycystins, PC-1 и PC-2, которые мутантны при ADPKD. В сомом деле, Nek8, как было установлено, взаимодействует с PC-2 белком, тогда как экспрессия и локализация, PC-1 и PC-2 нарушены в почечных клетках jck мышей (23,24). Кроме того, мыши, которые несут гетерозиготные мутации как в Pkd1 гене, который кодирует PC-1, так и Nek8 гене, также дают более агрессивную форму кистозной болезни почек, чем наблюдается у гетерозигот только по Pkd1 (42). Интересно, что Nek1 также участвует в регуляции экспрессии PC-2, в этом случае посредством фосфорилирования E3 ubiquitin ligase адаптора, который обычно направляет PC-2 на деградацию (43).

Наконец, наши данные по мутанту A197P ставят некоторые интересные вопросы. Эта мутация находится внутри каталитического домена и была идентифицирована как потенциальная driver мутация при раке поджелудочной железы (32), тогда как избыточная экспрессия Nek8, как было установлено, наблюдается при опухолях груди (44). Поскольку мы не нашли драматических изменений в киназной активности данного мутанта, его способность локализоваться в центросоме, ресничек и ядре полностью отсутствовала. Это может в принципе устранять транскрипционную программу, которая диктует, должны ли клетки вступать в состояние покоя или продолжать клеточный цикл. В самом деле, дефекты в передаче сигналов от реснички в ядро были выявлены при развитии опухолей (45,46). Напротив, Nek8 может играть роль в центросомах во время митотических клеточных делений и следует помнить, что развитие почечных кист отражает потерю контроля над ходом клеточного цикла и возможно над ориентацией митотического веретена (47-50). Недавно было установлено, что клетки от ARPKD пациентов, которые имели мутации в белке fibrocystin/polyductin, обнаруживают амплификацию центросом и дефекты митотического веретена (51). Хотя в одном исследовании Nek8 не обнаружена на центросомах делящихся клеток (18), мы и др. четко наблюдали Nek8 на центросомах в течение всего клеточного цикла, а избыточная экспрессия Nek8 была описана как управляющая образованием множественных ядер, указывая на нарушение клеточных делений (22,30). Возможно кроме того, что определенные др. Neks, включая Nek1 (52), Nek8 участвуют в реакции на повреждения ДНК и могут являться причиной их ядерной локализации. необходимо понять, как Nek8 может координировать цилиогенез с циклом митотических клеточных делений.