Роль микроРНК

microRNAs: the art of silencing in the ear Anya Rudnicki, Karen B. Avraham EMBO Molecular Medicine Volume 4, Issue 9, pages 849–859, September 2012
MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that regulate gene expression through the RNA interference (RNAi) pathway and by inhibition of mRNA translation. miRNAs first made their appearance in the auditory and vestibular systems in 2005, with the discovery of a triad of hair cell-specific miRNAs later found to be involved in both human and mouse deafness. Since then, miRNAs have been implicated in other medical conditions related to these systems, such as cholesteatomas, vestibular schwannomas and otitis media. Due to the limitations in studying miRNAs and their targets derived from human inner ears, animal models are vital in this field of research. Therefore their role in inner ear development and function has been demonstrated by studies in zebrafish and mice. Transcriptomic and proteomic approaches have been undertaken to identify miRNAs and their targets. Finally, it has been suggested that miRNAs may be used in the future in regeneration of inner ear hair cells and ultimately play a role in therapeutics. Рисунки и таблица в оригинале статьи	Намеки на значительную регуляторную силу микроРНК (miRNAs) появились в начале 1989 (Ambros, 1989) и miRNAs, как мы знаем их сегодня, впервые были описаны в 2001 (Lagos-Quintana et al, 2001; Lau et al, 2001; Lee & Ambros, 2001), они не появлялись на сцене во внутреннм ухе вплоть до 2005, когда экспрессия miRNA была выявлена в системе латеральной линии и сенсорных органах рыбок данио (Wienholds et al, 2005) (Table 1). Table 1. Partial llst of ear miRNAs in zebrafish, mice and human tissue and their ear localization miRNA это маленькие в ~23-нуклеотида длиной некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов. У млекопитающих одиночная miRNA может связывать сотни мишеней путем комплементации с seed регионом miRNA в 3' UTR сайте связывания мишеней, тем самым редуцируя экспрессию генов путем супрессии трансляции и дестабилизации мРНК. Примерно треть miRNA генов млекопитающих локализуется внутри интронов белок кодирующих генов. В основном ориентированные в той же самой ориентации с их хозяйской мРНК, они используют тот же самый промотор для транскрипции, хотя некоторые имеют независимый промотор (Guo et al, 2010). Потеря слуха является наиболее распространенным нейросенсорным нарушением у человека. Врожденная глухота затрагивает приблизительно одного из 500 новорожденных (National Institutes of Health, NIDCD, http://www.nidcd.nih.gov/health/statistics/hearing.html). Внутреннее ухо млекопитающих представлено двумя основными органами, улиткой, ответственной за слух, и вестибулярным аппаратом, ответственным за восприятие баланса. Способность воспринимать слух улиткой связана с органом Корти. Этот орган чрезвычайно содержит чувствительный сенсорный эпителий, представленный волосковыми клетками, специализированными сенсорными клетками с богатыми актином выпячиваниями стереоцилий и несенсорными поддерживающими клетками (Frolenkov et al, 2004). miRNAs проявилась во внутреннем ухе в 2006,с описанием miR-9 в качестве потенциального регулятора короткой изоформы COL9A1 (Sivakumaran et al, 2006). Это сопровождалось исследованием miR-96, -182 и -183 кластера, который транскрибируется в виде полицистронного одного транскрипта. Их специфическая экспрессия во внутреннем ухе подчеркивает важность этой триады для внутреннего уха (Weston et al, 2006). С этого момента последовала серия открытий, наиболее неотразимой стала идентификация мутаций ответственных за глухоту в двух обширных испанских семьях. Причинная мутация находится в seed регионе miR-96. Это был первый пример мутации, обнаруженной в miRNA и приводящей к менделирующей болезни (Mencia et al, 2009). miR-96 , как было установлено, вызывает глухоту у ENU-индуцированных мышей, и был установлен механизм возникновения глухоты (Lewis et al, 2009). miRNAs были также описаны при др. связанных с ухом болезнях, таких как роль miR-21 в росте и пролиферации cholesteatoma у человека (Friedland et al, 2009) и в вестибулярных vestibular schwannomas (VS; Cioffi et al, 2010). miRNAs, как было установлено, регулируют процесс продукции и воспаления otitis media (OM) в линиях клеток, происходящих из среднего уха (Song et al, 2011). Используя новые miRNA и техники идентификации мишеней, эта быстра растущая область исследований постоянно обновляется и опубликовано множество данных о экспрессии miRNAs во внутреннем ухе. Expression of miRNAs and implications for function Elucidating miRNA expression in the inner ear Первоначально открытие miRNAs во внутреннем ухе базировалось на их экспрессии (Table 1). Затем был использован ряд методов для выяснения временной и пространственной экспрессии miRNAs. Обычно используются микромассивы для изучения профилей генной экспрессии. Они особенно ценны для выяснения профиля экспрессии малых РНК, включая и miRNAs (Barad et al, 2004; Liu et al, 2004). Эта техника сравнивает профили экспрессии двух образцов, используя гибридизацию каждого образца с олигонуклеотид-синтезированными меченными зондами. Первые miRNAs во внутреннем ухе человека были описаны в результате гибридизации целой улитки в разные моменты времени с коммерческими микромассивами miRNA (Weston et al, 2006). Affymetrix микромассивы были использованы для анализа экспрессии генов между пролиферирующими и не пролиферирующими слуховым эпителием кур (Frucht et al, 2010). Затем были использованы массивы, обогащенные locked nucleic acid (LNA), базируясь на аналоге нуклеиновой кислоты LNA (Petersen & Wengel, 2003) с высоким сродством к РНК (Elkan-Miller et al, 2011). Эта платформа с микромассивом, произведенная Exiqon A/S (Дания), чрезвычайно чувствительна и специфична как к известным, так и частным (proprietary) miRNAs. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) это быстрый и чувствительный метод определения количества зрелых или предшественников miRNAs. Они часто используются после идентификации экспрессии miRNA с помощью микромассивов, чтобы оценить находку и определить аккуратно дифференциальные уровни экспрессии. Такого типа оценка идентифицированных miRNAs в первом скрининге микромассива млекопитающих использовала SYBR Green fluorescence (Weston et al, 2006). Этот метод был использован в дальнейшем для проверки изменений в экспрессии miRNA в клетках предшественниках улитки (Hei et al, 2011). Др. оценки использовали систему TaqMan, которая базируется на праймерах ствола и петли (stem and loop), чтобы превращать РНК в кДНК, увеличивая специфичность и решая проблему сходства членов семейства miRNA, отличающихся только одним нуклеотидом (Chen et al, 2005; Raymond et al, 2005). В недавнем сообщении сравнивали несколько методов профилирования экспрессии для детекции miRNAs в линии раковых клеток, выявлена высокая корреляция между разными техническими методами (Sokilde et al, 2011). In situ гибридизация широко используется, чтобы охарактеризовать профиль пространственной экспрессии miRNAs. Ткань или в форме тотального препарата или в виде замороженных или парафиновых срезов подвергалась гибридизации с LNA™ модифицированным детекционным зондом, меченным молекулой digoxygenin (DIG), и это сопровождалось выявлением с помощью anti-alkaline phosphatase-conjugated (AP) антител (Weston et al, 2006). результатом было пурпурное окрашивание, которое характеризовало miRNA, после реакции с субстратом для щелочной фосфатазы. Наиболее поразительные результаты с использованием этой техники продемонстрировали, что miRNAs обладают чрезвычайно изменчивым временным и пространственным паттерном экспрессии (Elkan-Miller et al, 2011; Friedman et al, 2009; Sacheli et al, 2009). Обусловленное недоступностью ткани внутреннего уха человека и отсутствием соответствующих линий клеток из внутреннего уха, исследования экспрессии miRNAs ограничены животными с экстраполяцией на функции у человека. По этой причине рыбки данио и мыши являются организмами для выбора оценки функции miRNA . Рыбки данио широко используются в качестве мощного инструмента для изучения систем млекопитающих и являются подходящей моделью для изучения болезней человека (Driever & Fishman, 1996). Эти рыбки маленькие и быстро растут, прозрачны и с ними относительно легко манипулировать путем замалчивания генов на эмбриональной стадии. Восприятие слуха и баланса у рыбок данио осуществляется боковой линией и механосенсорными органами (Nicolson, 2005). Экспрессия miRNA во внутреннем ухе рыбок данио впервые продемонстрирована с помощью экспрессии mir-200a и mir-183 в их сенсорном эпителии (Wienholds et al, 2005). Законсервированный кластер miRNA, который включает miR-183, miR-182 и miR-96, , как было установлено, экспрессируется у рыбок данио в волосковых клетках, отических нейронах и др. первичных сенсорных клетках. За этими находками последовало сообщение, что miR-15a-1 обнаружена в органе боковой линии ) и во всём внутреннем ухе, а miR-18a в основном в слуховом пятнышке эллиптического мешочка (utricular macula) и соседних клетках 48 h после оплодотворения (hpf) (Friedman et al, 2009). Поскольку некоторые из этих miRNAs оказывались ограниченными сенсорными органами, роль регуляции miRNA стала важна для этой сложной системы. Мыши рассматриваются наиболее подходящей моделью для изучения механизмов глухоты у млекопитающих (Leibovici et al, 2008). Развитие внутреннего уха мышей активно исследуемая область и многочисленные глухие мутантные мыши служат в качестве моделей глухоты у человека (Frolenkov et al, 2004). Возникший интерес к экспрессии miRNA во внутреннем ухе мышей и её связь с с развитием и созреванием внутреннего уха началось с анализа экспрессии микромассива в ходе некоторых стадий развития, от постнатального дня zero (P0) до 5 недель (Weston et al, 2006). Субнабор miRNAs был затем оценен с помощью Northern blot анализа с использованием образцов из внутреннего уха и др. органов мыши, чтобы оценить, существуют ли тканеспецифичные miRNAs, со специальным интересом ко внутреннему уху. Эти анализы выявили, что законсервированный кластер mir-183, mir-182 и mir-96 обнаруживает экспрессию, ограниченную внутренним ухом мышей по сравнению с головным мозгом, сердцем и экспрессией во всем эмбрионе. In situ гибридизация выявила уникальный паттерн экспрессии mir-182, mir-183 и mir-96 во внутренних и наружных волосковых клетках улитки, волосковых клетках вестибулярных органов и в спиральном и вестибулярном ганглии. Эти три miRNAs, как было установлено, экспрессируются в виде одного и того же паттерна (Weston et al, 2006), транскрибируются в одной и той же ориентации и , как полагают, ко-экспрессируются (Wienholds et al, 2005). Др. характерный паттерн экспрессии обнаруживает miR-124, эта обильно экспрессируемая miRNA в нервной системе (Lagos-Quintana et al, 2002), , как было установлено, экспрессируется в спиральном и вестибулярном ганглиях (Weston et al, 2006). Это было первое сообщение, описывающее специфичные для внутреннего уха млекопитающих miRNAs, и их повсеместный или ограниченный паттерн экспрессии. Чтобы адресовать важный вопрос об эффекте miRNAs в ходе развития, проведено исследование, определяющее паттерн экспрессии кластера mir-183, mir-182 и mir-96 (Sacheli et al, 2009). В этом исследовании, анализ in situ гибридизации осуществлялся в ранние временные точки с miRNAs, обнаруживающими отличительную экспрессию в развитии. Самая ранняя наблюдаемая экспрессия приходилась на день эмбриогенеза 9.5 (E9.5). miR-183 и miR-182, но не miR-96, были обнаружены в отическом пузырьке в раннем эмбриональном внутреннем ухе. Позднее, на ст. E11.5, все три miRNAs обнаруживались в слуховом пузырьке, кохлеа-вестибулярном ганглии и в нервной трубке. Драматические изменения в экспрессии начинались около E14.5, в этот момент времени экспрессия этого кластера ограничивалась вестибулярными волосковыми клетками. Со ст. E17.5 экспрессия обнаруживалась в волосковых клетках, которые становились кохлеарной и вестибулярной системой не обнаруживались поддерживающими клетками. На ст. P0, miR-183, miR-182 и miR-96 строго экспрессировались в волосковых клетках улитки и вестибулярной системы и в спиральном ганглии. На ст. P4 и далее, наблюдался др. крупный сдвиг в экспрессии, т.к. miR-96 более не наблюдалась в улитке или преддверии, но обнаруживалась в spiral limbus и внутренней борозде (inner sulcus). Однако экспрессия miR-183 и miR-182 продолжалась в волосковых клетках, но прекращала свое существование в волосковых клетках, начиная с P11-15 и обнаруживалась только в спиральном крае и внутренней бороздке. В целом эти находки коррелируют с ходом созревания и дифференцировки развивающегося внутреннего уха (Fig 1). Дифференцировка волосковых клеток начинается приблизительно на ст. E14.5, и вплоть до E17-E18, когда сенсорный эпителий обнаруживает волосковые клетки по всей своей длине (Chen et al, 2002). Тот факт, что экспрессия этих miRNAs достигает пика в точке дифференцировки и изменяется от генерального паттерна экспрессии в сенсорном эпителии, ограничивая свою экспрессию волосковыми клетками, указывает на то, что эти miRNAs участвуют в развитии и созревании внутреннего уха новорожденных мышей. Др. исследование с интересом к регуляторным различиям между улиткой и вестибулярной системой касается сканирования микромассива малых РНК в улитке мышей со ст. P0 в улитке и преддверии (Friedman et al, 2009). 24 miRNAs обнаруживали дифференциальную экспрессию в этих двух тканях. Профиль экспрессии набора из 5 miRNAs был оценен с использованием гибридизации in situ. mir-15a, mir-18a, mir-30b, mir-99a и mir-199a были обнаружены в разных самостоятельных регионах улитки и преддверия мыши на ст. P0, включая волосковые и поддерживающие клетки, спиральный ганглий и др. типы клеток. Паттерны дифференциальной экспрессии демонстрируют, что экспрессия miRNA во внутреннем ухе не ограничена одним типом клеток или стадией развития, а их экспрессия распространяется и ассоциирует с изменениями развития, происходящими в ходе времени (Fig 1). miRNAs are involved in formation of the inner ear Как только было установлено, что miRNAs экстенсивно экспрессируются во всем внутреннем ухе, участие Dicer1 в формировании внутреннего уха также стало насущным. Типа III рибонуклеаза Dicer1 важна для процессинга в зрелые miRNAs из их pre-miRNA формы (Bernstein et al, 2001). Мышей, лишенных энзима Dicer1 получали путем нокаута (KO) генов, они погибали во время эмбриогенеза уже на ст. E7.5, возможно из-за неспособности эмбрионов продуцировать функциональные зрелые miRNAs, которые могли бы регулировать процессы развития (Bernstein et al, 2003). Чтобы преодолеть эту раннюю гибель были получены кондиционные нокауты с использованием Cre трансгена (Harfe et al, 2005). Первое исследование, изучающее роль Dicer1 в развитии внутреннего уха, было проведено с использованием Pax2-Cre трансгенных мышей (Soukup et al, 2009). Обусловленная делеция Dicer1 у Pax2-Cre мышей позволяла делетировать Dicer1 во внутреннем ухе, почках и среднем мозге после скрещивания с Dicer1-loxP мышами. Драматическое влияние потери Dicer1 было продемонстрировано у мышей, погибающих на ст. E18.5. Нарушения во внутреннем ухе были значительными. На ст. E17.5 наблюдалось значительное укорочение структур внутреннего уха, а улитка не давала скрученной формы. Scanning electron microscopy (SEM) показало, что волосковые клетки улитки обладают аномальной организацией стереоцилий. Др. кондиционная модель Dicer1 KO использовала Cre экспрессию, стаящую ниже промотора Pou4f3, чтобы попытаться создать жизнеспособных мышей (Dicer-PCKO) (Friedman et al, 2009). Промотор Pou4f3 был избран для Dicer1 условныхl KO модельных мышей, т.к. он экспрессируется в волосковых клетках. Ограниыение экспрессии Cre рекомбиназы в этих клетках приводит к удалению Dicer1-LoxP сайтов из волосковых клеток, приводя к деплеции экспрессии Dicer1 в волосковых клетках. Большинство дефектов в слуховой системе обнаруживалось у взрослых мышей. Dicer-PCKO p38 мыши были глухи, что демонстрировалось по auditory brainstem response (ABR), и они также обнаруживали легкий фенотип вестибулярного кружения. Большинство волосковых клеток улитки имело неправильную форму и не экспрессировало myosin VI, маркера волосковых клеток, а SEM показала, что большинство волосковых клеток или теряло свои стереоцилии или они имели аномальную форму. Эти результаты демонстрируют более выраженные нарушения во внутреннем ухе при прерывании процесса созревания с помощью miRNA. Следующая модель использовала Foxg1-Cre обусловленный нокаут Dicer1 (Kersigo et al, 2011). Эффект на внутреннее ухо был значительным с уменьшением размера внутреннего уха, наблюдаемым на ст. E14.5, в следствие потери образования канала и потери структуры завитой улитки на ст. E18.5. Эти модели показали, что нормальное развитие функционального внутреннего уха строго зависит от нормального созревания miRNA. Нарушение продукции зрелых miRNA вызывает не только структурные дефекты, но и потерю слуховой и вестибулярной функции. Последняя модель, которая была использована для тщательного исследования влияния Dicer1 на развитие внутреннего уха, это Atoh1-Cre условные нокауты Dicer1. Atoh1 экспрессируется во всех волосковых клетках во время эмбриональной стадии, но не ограничивается внутренним ухом. Мыши погибают приблизительно в возрасте 4 недель, обнаруживая атаксию и судороги. miR-183 была полностью истощена в волосковых клетках мутантных мышей, но не в спиральном ганглии. Кроме того, экспрессия miRNAs наблюдалась в др. компонентах внутреннего уха, но не в волосковых клетках, указывая, что эта модель специфически супрессирует экспрессию miRNA в волосковых клетках (Weston et al, 2011). Эти находки подтверждают, что miRNAs являются критическими для развития внутреннего уха и участвуют в формировании, морфогенезе и нейросенсорных процессах, которые создают функциональный орган слуха. Approaches to miRNA target identification Чтобы понять как функционируют miRNAs в клетках, необходимо идентифицировать их мишени. miRNAs дестабилизируют мРНК мишени или ингибируют трансляцию белка, приводя к снижению уровня белка (Guo et al, 2010). Эти мишени могут быть важными клеточными регуляторами и их снижение, даже незначительное может менять судьбу клеток. Предсказание мишени трудная задача с открытия miRNAs; однако алгоритмы обнаружения реальных функциональных мишеней улучшаются. Имеется ряд доступных программ для предсказания пригодных мишеней, включая неограниченные TargetScan и miRanda, большинство из которых работает в слегка отличных алгоритмах, хотя все они базируются на seed спаривании miRNA-распознаваемая мишень. Они выискивают комплементацию miRNA 5' seed региона нуклеотидов (nt) 2-7 к 3'UTR мишени, эволюционно консервативные 7 nt в 3'UTR мишеней, соответствующих miRNA seed региону (Bartel, 2009). Существенным недостатком этих программ компьютерных предсказаний является огромное количество фальшивых позитивных шумов, которые они продуцируют. Напр., хотя пара miRNA-мишень может быть обнаружена с использованием этого метода, но как miRNA , так и мишень не обязательно экспрессируются в исследуемой ткани и поэтом у не будут взаимодействовать in vivo. В таком случае предсказание будет не относящимся к делу. Это заключение подчеркивает важность биологической оценки каждой выявленной компьютером пары miRNA-мишень. Идентификация новых мишеней для miRNAs, экспрессируемых во внутреннем ухе продемонстрирована в немногих исследованиях (Elkan-Miller et al, 2011; Hertzano et al, 2011). Компьютерный анализ с использованием программы miRanda для предсказания мишени был введен, чтобы создать список более чем из 100 предполагаемых мишеней для miR-96 (Lewis et al, 2009). Этот список был аннотирован и 13 потенциальных мишеней были затем исследованы биологически с использованием luciferase метода (Lewis et al, 2009). 5 из тестируемых мишеней были оценены биологически как мишени miR-96: Aqp5, Celsr2, Myrip, Odf2 и Ryk. Используя miR-96 мутантных мышей diminuendo, были использованы разные подходы идентификации мишеней. Микроанализ экспрессии микромассива генов позволил сравнить дифференциально экспрессируемые наборы мРНК от мутантных diminuendo и дикого типа (WT) мышей. После qRT-PCR подтверждения было найдено 5 генов, подавляемых у мутантов: Slc26a5 (prestin), Ocm (oncomodulin), Pitpnm1, Gfi1 и Ptprq. Эти гены, по-видимому, не являются прямыми мишенями для miR-96, указывая, что их подавление является нижестоящим эффектом. Lh/ исследование использовало комбинацию экспериментальных данных и компьютерный анализ для предсказания функциональных мишеней для miRNAs во внутреннем ухе (Elkan-Miller et al, 2011). miRNAs были идентифицированы после применения транскриптомного и протеомного профилирования экспрессии для поиска дифференциально экспрессируемых miRNAs между улитко и преддверием в сенсорном эпителии P2 мышей. Функциональные мишени затем искали, используя FAME (Functional Assignment of miRNA via Enrichment) алгоритм (Ulitsky et al, 2010). FAME определяет количественное увеличение и истощение потенциальных мишеней, найденных с помощью TargetScan, в наборе данных активируемых и подавляемых мРНК и белков. В этом исследовании miR-135b была обнаружена в LNA массиве, активированная в преддверии, тогда как её мишени оказывались обогащенными в массиве данных белков и подавленными в преддверии. Гибридизация In situ подтвердила дифференциальную экспрессию miR-135b в вестибулярных волосковых клетках на ст. P0. Анализ предсказывает, что PSIP1-P75 являются потенциальными мишенями для miR-135b. Psip, PC4- и SF-2 взаимодействующий белок/Ledgf известный активатор транскрипции участвует в регуляции генов, связанных со стрессами, обладает анти-апоптическим эффектом, участвует в сплайсинге мРНК, жизнеспособности клеток и является частью слитого гена при лейкемии (Sutherland et al, 2006). И qRT-PCR и экспрессия белка согласуются с предсказаниями FAME, поскольку PSIP1-P75 подавляются в преддверии по сравнению с улиткой. Наконец, взаимодействие miRNA-мишень было продемонстрировано как с помощью техники замалчивания RNA interference (RNAi), так и методом репортера luciferase. Этот пример иллюстрирует подход по идентификации мишеней, комбинацию как in silico анализа, так и экспериментальных данных, способный предсказывать функционально значимые мишени. Более того, пути с использованием PSIP1-P75 известны и в др. тканях и могут служить путеводной линией для выявления функции этой пары miRNA-мишень во внутреннем ухе (Fig 2). Финальный пример сложного подхода к поиску функциональных мишеней продемонстрирован при целенаправленном поиске регуляторов судеб клеток во внутреннем ухе, включая miRNA мишени и транскрипционные факторы, используя специфичное для типов клеток изучение транскриптома (Hertzano et al, 2011). Жидкостная цитометрия вестибулярных и кохлеарных тканей с использованием CD326, CD34 и CD49f маркеров, сделала возможной разделение эпителиальных (сенсорных и несенсорных), нервных и сосудистых популяций клеток, чтобы идентифицировать дифференциально экспрессируемые транскрипты между этими восмью отличающимися клеточными популяциями. Используя эти данные, семейства miRNA, чьи потенциальные мишени дифференциально экспрессировались в специфических типах клеток, в противоположность направлению экспрессии miRNA, оказались связанными. Предсказание идентифицировало семейство miR-200b с потенциальными мишенями, подавляемыми в сенсорных эпителиальных клетках на ст. P0. Экспрессия miR-200b обнаруживалась с помощью гибридизации in situ во всех сенсорных эпителиальных клетках внутреннего уха. Чтобы идентифицировать др. регуляторные факторы во внутреннем ухе, проводили поиск цис-регуляторных элементов среди экспрессирующихся промоторов сенсорных эпителиальных клеток внутреннего уха. Эта биоинформационная техника выявила транскрипционные факторы ZEB1 и ZEB2 в качестве регуляторов генов, экспрессирующихся в сенсорных клетках внутреннего уха. Ранее было показано, что miR-200b непосредственно воздействует на мишени ZEB1 и ZEB2 (Burk et al, 2008), это связывает регуляторные факторы др. с др. Наконец, испоьзуя подход, специичных для типа клеток, они продемонстрировали заметную неправильную экспрессию генов, подтвердив, что они регулируются с помощью Zeb1 у мутантных мышей с мутацией в Zeb1 транскрипционном факторе. Результаты этих исследований выявили сложную регуляторную сеть miRNAs, мишеней и транскрипционных репрессоров. Clinical implications of inner ear miRNAs Mutations in miRNAs lead to human deafness Важность miRNAs для развития внутреннего уха и их участие в функциональных процессах слуха установлена путем изучения экспрессии и животных моделей. Критическая природа miRNAs для восприятия слуха доказывается открытием, что мутации в гене miR-96 являются причиной несиндромальной потери слуха в двух крупных семьях людей (Mencia et al, 2009). Две мутации в seed регионе miR-96, +13 G>A и +14 C>A, были выявлены в двух неродственных семьях Испании, обнаруживающих аутосомно доминантную прогрессирующую потерю слуха. Эти находки указывают на то, что глухота результат потери сайта распознавания мишени, как результат изменения в miR-96 seed регионе. Идентификация мутаций в гене miR-96 эо первое описание у людей мутаций miRNA, вызывающих менделирующее заболевание. После этого сообщения несколько исследований было сконцентрировано на генах mir-96, mir-182 и mir-183 как источниках мутаций для др. случаев глухоты. Однако, мутаций не было обнаружено в этих генах в семьях американцев и иранцев с аутосомно доминантной и рецессивной несиндромальной потерей слуха (Hildebrand et al, 2010) , указывая, что мутации в этом кластере не являются широко распространенной причиной глухоты. После этого исследования открыты новые мутации, приводящие к потере слуха, в гене miR-96 в итальянской семье (Solda et al, 2012). В отличие от первых мутаций в miR-96 эта мутация (+57 T>C) не расположена в seed регионе. Мутация, как было установлено, нарушает вторичную структуру miR-96 pre-miRNA, изменяя miR-96-3p последовательность и снижая количество копий зрелой miR-96. Тот факт, что мутации в miRNAs могут вызывать потерю слуха, демонстрирует четко важную роль их в функции слуха и помогает определить механизмы. с помощью которых одиночная мутация miRNA может приводить к глухоте. Model systems address mechanisms of the human mutations Параллельно с открытием мутаций miR-96 у человека, мутации в miR-96 обнаружены при N-ethyl-N-nitrosourea (ENU)-индуцированной глухоте мышей (Lewis et al, 2009). Эти мыши названы diminuendo (Dmdo), обнаруживают прогрессирующую аутосомно доминантную потерю слуха, сходную с таковой у людей. Потеря слуха и фенотип нарушения баланса были более тяжелыми у гомозигот, а исследование SEM выявило уродства стереоцилий как у гетерозиготных, так и гомозиготных мышей. Была открыта точковая мутация после хромосомного картирования на хромосоме, 6, в mir-96 seed регионе (+15 A>T), регионе полностью законсервированным между видами. мутация не нарушает образование зрелой miR-96 у мутантов и поэтому поиск механизма сдвинулся на распознавание мишеней. Однако, ни идентифицированные мишени, ни подавляемые гены не были связаны с фенотипом. Очевидно, т.к. одиночная miRNA может регулировать сотни мишеней, то такая мутация в seed регионе сайта связывания мишени, может приводить к каскадному эффекту, вызывая многие вторичные эффекты, которые в конечном итоге и приводят к глухоте. Дальнейший анализ мутантных miR-96 мышей установил, что останавливается созревание волосковых клеток на ст. P0 (Kuhn et al, 2011). Биофизическое развитие волосковых клеток аномально, т.к. во внутренних волосковых клетках отсутствует типичный ток K⁺. Это исследование подтвердило, что that miR-96 необходима для развития и созревания эмбриональных волосковых клеток. В разных модельных системах рыбки данио были использованы для выяснения роли кластера miR-96, miR-182 и miR-183 в развитии внутреннего уха (Li et al, 2010). Кластер избыточно экспрессировали у рыбок данио путем инъекции эмбрионам двунитчатых miRNAs. Эмбрионы с избыточной экспрессией miR-182 и miR-96 обнаруживали уродства тела и продуцировали эктопические волосковые клетки. Нокдаун каждой из miRNAs кластера с использованием morpholino олигонуклеотидов, показало снижение количества волосковых клеток. Избыточная экспрессия miR-182 у эмбрионов с нокдауном miR-96 продемонстрировала эффект частичного восстановления и увеличение количестве волосковых клеток по сравнению с нокдауном. Эти находки подтверждают, что кластер играет роль в формировании и развитии волосковых клеток и что существует определенный эффект перекрывания между этими членами семейства miRNA. Other human disease phenotypes in the ear miRNAs, как было установлено, регулируют и др. связанные с ухом человека клинические признаки. В одном исследовании была установлена регуляторная роль miR-21 ы роте и пролиферации cholesteatoma человека (Friedland et al, 2009; Fig 3). Cholesteatomas обладают доброкачественным ростом, происходят из эпидермиса среднего уха или сосцевидного отростка. Они часто возвращаются и могут приводить к нарушениям височной кости и к нейросенсорной потере слуха, помимо прочих симптомов. Молекулярные механизмы, приводящие к этому росту изучены недостаточно и предполагается, что miRNAs являются потенциальными молекулярными регуляторами в этой патологии. В этом исследовании образцы холе стеатом и нормальной кожи были взяты от пациентов и проанализированы с использованием qRT-PCR, чтобы установить активируемые miRNAs. Среди серии подозреваемых miRNAs, ранее сцепленных с пролиферацией и ростом в др. моделях, miR-21, как было установлено, активируется в образце cholesteatoma по сравнению с нормальной кожей. Регуляторная модель была предложена, базируясь на известных мишенях для miR-21, связана с инфекцией в качестве первого стимула, которая сопровождается факторами, которые активируют транскрипцию miR-21, которая затем супрессирует PTEN и PDCD-4 (известные гены опухолевых супрессоров) и это приводит к росту cholesteatoma. В др. исследовании miR-21 была обнаружена избыточно экспрессируемой в VS нервной ткани по сравнению с нормальной тканью (Cioffi et al, 2010; Fig 3). VS являются доброкачественными опухолями Шванновских клеток вестибулярного нерва. VS может вызывать головокружения, звон в ушах, потерю слуха и др. симптомы. PTEN, известная мишень для miR-21, как полагают, снижает уровни белка, но не уровни мРНК в образцах VS. miR-21 была подвергнута нокдауну в первичной культуре VS с использованием анти-miR-21 олигонуклеотидов,это усиливало клеточную пролиферацию и жизнеспособность. Др. болезнь человека, которая была выявлена при поиске miRNA , это OM (Song et al, 2011; Fig 3). OM это воспаление среднего уха. Это состояние довольно широко распространено у детей и остается нелеченным и может приводить к ухудшению слуха. В исследовании, проведенном на human middle ear epithelial cells (HMEECs) в качестве модели OM, чтобы идентифицировать miRNAs, индуцируемые во время воспаления, в lipopolysaccharide (LPS)-обработанных и необработанных клетках, были сравнены после анализа микромассивов. 5 и 10 miRNAs были найдены как активируемые и подавляемые. соотв. Большинство из предполагаемых мишеней для активируемых miRNAs участвует в реакции острого воспаления, в регуляции развития и клеточного роста, как сообщает DAVID, биоинформационный ресурс, который предоставляет функциональные аннотации генов. Среди подавляемых miRNA мишеней, функциональные мишени были вовлечены в развитие, клеточные коммуникации, эндоцитоз, клеточную дифференцировку, IκB b NFκB каскад, активность комплемента, клеточную адгезию и реакцию врожденного иммунитета. Авт. полагают, что это исследование указывает на участие miRNAs в иммунном ответе и возникновении OM. Эти примеры демонстрируют широкий спектр miRNAs, отвечающих за клинические проявления у людей и болезни уха. Более того, это подчеркивает важность исследований miRNA для лучшего понимания сложных механизмов, ведущих к болезням человека, в частности слухового и вестибулярного органов. Future directions in miRNA research Involvement in regeneration После открытия многочисленных процессов, в которых участвуют miRNAs во внутреннем ухе, стало интересным, участвуют ли miRNAs в регенерации волосковых клеток. У млекопитающих как только слуховые волосковые клетки полностью сформированы, регенерации не происходит после повреждений, особенно в волосковых клеток улитки (Stone & Cotanche, 2007). Тем не менее у птиц, рептилий. амфибий и рыб потерянные волосковые клетки могут замещаться новыми, в результате регенерации из поддерживающих клеток. Этот факт послужил основой для многих исследований, сфокусированных на идентификации биологических процессов, которые ответственны за такую регенерацию, включая и miRNAs. В исследовании, которое изучало роль miRNAs в трансдифференцировке, анализ микромассива miRNA был осуществлен с использованием регенерирующих хрусталиков и волосковых клеток внутреннего уха в тканях, извлечённых из взрослых тритонов. Лабиринт, который включает слуховой и вестибулярный сенсорный эпителий выделяли и культивировали in vitro. Гибель волосковых клеток вызывали aminoglycosides и образцы РНК брались из культивируемой ткани в немногие временные точки, до тех пор, пока набюдалась регенерация, 18 дней спустя после воздействия. Анализ микромассивов выявил, что экспрессия let-7 семейства, в частности let-7a, -7b, -7c, -7d, -7e, -7f и -7g, была снижена как в дифференцирующихся волосковых клетках, так и хрусталиках. Т.к. семейство let-7 , как известно, регулирует терминальную дифференцировку, то их подавление указывает на потенциальную роль в дедифференцировке, т.о., тем самым регулируются мишени, участвующие в регенерации (Tsonis et al, 2007). У млекопитающих хотя слуховые волосковые клетки не регенерируют, вестибулярный сенсорный эпителий обладает ограниченной способностью регенерировать (Kawamoto et al, 2009). Различия в регуляции между улиткой и преддверием были изучены, чтобы определить участвует ли регуляция miRNA в этих различиях в регенеративной способности. При поиске дифференциально экспрессируемых miRNAs между улиткой и преддверием анализ микромассива на ст. P0 проводили в улитке и преддверии мыши (Friedman et al, 2009). 24 miRNAs обнаруживали дифференциальную экспрессию. Несмотря на относительно легкие различия (15-40%), miRNAs, которые обнаруживают наивысшую дифференциальную экспрессию, это let-7a, -7b, miR-220, -423, -190, -204,-24, -195 и miR-125b. Эти результаты показывают, что miRNAs могут быть вовлечены в регуляцию разных характеристик между улиткой и преддверием. В противоположность млекопитающим, волосковые клетки слухового эпителия птиц обладают способностью регенерировать после повреждения (Brignull et al, 2009). При поиске генов, участвующих в регенерации у кур, изучали экспрессию генов, анализируя микромассивы после воздействия forskolin, который вызывает пролиферацию поддерживающих клеток, что сопровождается появлением новых волосковых клеток на basilar papilla кур (Frucht et al, 2010). Подавляемые гены между обработанной и контрольной тканью представляют набор мишеней для miRNAs, которые участвуют в процессе регенерации. Используя эти два набора тканей осуществляли gene set enrichment analysis (GSEA). Идентифицированы немногие miRNAs в анализе GSEA, это miR-181a, miR114, miR-200a и miR-27, подозреваемые в участии в регенерации. miR-181a была изучена далее и была избыточно экспрессирована в эксплантах basilar papilla эмбрионов кур. После инкорпорации BrdU экспланты, трансфицированные miR-181a. обнаруживали высокие уровни пролиферации по сравнению с контролем. Для дополнительного изучения роли miR-181a в пролиферации, basilar papilla обрабатывали forskolin и позднее трансфицировали анти-miR-181a и обрабатывали forskolin снова. Трансфицированные basilar papillae как forskolin, так и anti-miR-181a обнаруживали меньше пролиферирующих клеток по сравнению с теми, которые обрабатывали только forskolin и контролем. Эти результаты указывают на то, что miR-181a может усиливать пролиферацию как в молчащих, так и пролиферирующих basilar papilla эмбрионов кур. Рыбки данио представляют собой др. пример участия miRNAs в регенерации, т.к. избыточная экспрессия miR-182 и miR-96 приводила к продукции эктопических волосковых клеток (Li et al, 2010). Эти исследования привели к идее, что miRNAs могут иметь многообещающий терапевтический эффект, т.к. miRNAs участвуют как активный агент, способствующий регенерации и как регуляторный медиатор, помогающий открыть нижестоящие мишени и транскрипционные факторы, участвующие в регенерации. Deep sequencing to identify new miRNAs Новые разработанные техники наделяют их удивительными возможностями открытия новых miRNAs. Следующая генерация секвенирования или massively parallel sequencing (MPS), молекул ДНК и РНК обладает измененной скоростью и широтой доступного секвенирования. MPS было использовано для идентификации некодирующих РНК, включая и miRNAs (Berezikov et al, 2006; Mardis, 2008). Глубокое секвенирование делает возможным открытие новых miRNAs поскольку их уникальная структура и т.д. могут служить в качестве количественного инструмента для прямого измерения количеств miRNA. Пока только одно исследование использовало эту технологию в области внутреннего уха для выявления изменений в экспрессии miRNA в слуховой части переднего мозга у zebra зяблика, после того как его понуждали к пению (Gunaratne et al, 2011). Глубокое секвенирование, проведенное на РНК, происходящей из слуховой части переднего мозга выявило 34 новые miRNAs, специфичные для генома zebra зяблика. Этот пример демонстрирует, что экспрессия miRNA может меняться в зависимости от поведения и нейрональной реакции и может быть выявлено при глубоком секвенировании. Следует ожидать. что использование этой технологии секвенирования для идентификации новых miRNAs в разных тканях во время онтогенетических изменений или экспрессии при болезни, будет использовано более широко. Conclusions miRNA involvement in the development and maturation of the inner ear and the auditory mechanism has been demonstrated numerous times. The most relevant to inner ear disease is the mutations in the seed region of miR-96, causing deafness in both humans and mice. This remarkable finding initiated a new paradigm in the deafness gene hunt. This was the first time that a single mutation in a miRNA was found to lead to deafness. The implication that a single mutation in a miRNA can lead to deafness is not trivial, since it is not a direct result of the mutation, but rather, a result of many small cumulative events, caused by both the loss of inhibition on the miR-96 targets, and gain of function of the targets now recognized by the new mutated seed region. This complex disease-causing mechanism had led us to believe that there is much more to miRNA involvement in disease than previously known. As new deep sequencing technologies are becoming more readily available, the miRNA field will rapidly grow and expand, identifying new miRNAs regulating important inner ear functions. Many diseases may be demonstrated to be affected by miRNA mutations, opening a vast potential for a future role for miRNAs as therapeutic agents. Deafness A common neurosensory disorder that leads to partial or complete hearing loss. microRNA (miRNA) A ~23-nucleotide long RNA that is not translated into protein and regulates gene expression by binding to the 3'UTR of a target mRNA. Cochlea The auditory portion of the inner ear labyrinth responsible for hearing. Vestibule A portion of the inner ear labyrinth responsible for balance. Hair cells Sensory receptor cells located in the cochlea and vestibule organs. Zebrafish The species Danio rerio, a tropical freshwater fish used as a vertebrate model organism. Cholesteatoma A benign keratinizing squamous epithelium growth in the middle ear. Vestibular schwannomas A benign vestibular nerve Schwann cell tumour. Otitis media An inflammation of the middle ear, mainly affecting children. Transcriptome The expression profile of messenger RNAs. Proteomics The large-scale study of proteins. Regeneration A process of renewal of dead or lost cells. Pending issues Lack of human RNA tissue from the inner ear: Unlike miRNA research in the cancer field, where much of the work is focused on tissues and tumours derived from human patients, research in the deafness field does not base itself on human tissue. RNA from humans is almost impossible to obtain. Despite the genetic resemblance between humans and mice, miRNA targets may be different between the two, providing a difficult basis for development of therapeutics for human deafness. This aspect must be reconciled with when making extrapolations from miRNA experiments using RNA derived from mice. Regeneration: Regeneration of damaged hair cells does not occur in the mammalian cochlea. miRNA involvement in hair cell regeneration in reptiles and birds must be further studied, with the hope of identifying factors that promote regeneration in mammals. Treatment: Treatment by gene therapy for diseases caused by miRNA mutations is still the ‘holy grail’ of miRNA disease research. A study of the pathogenesis caused by a mutation in a single miRNA, such as miR-96, is a promising candidate for gene therapy studies. Finding methods to reduce or induce miRNA expression in the inner ear, for fine-tuning of target expression to influence factors involved in hearing loss, is an ongoing goal in the field.

Намеки на значительную регуляторную силу микроРНК (miRNAs) появились в начале 1989 (Ambros, 1989) и miRNAs, как мы знаем их сегодня, впервые были описаны в 2001 (Lagos-Quintana et al, 2001; Lau et al, 2001; Lee & Ambros, 2001), они не появлялись на сцене во внутреннм ухе вплоть до 2005, когда экспрессия miRNA была выявлена в системе латеральной линии и сенсорных органах рыбок данио (Wienholds et al, 2005) (Table 1).

Table 1. Partial llst of ear miRNAs in zebrafish, mice and human tissue and their ear localization

miRNA это маленькие в ~23-нуклеотида длиной некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию генов. У млекопитающих одиночная miRNA может связывать сотни мишеней путем комплементации с seed регионом miRNA в 3' UTR сайте связывания мишеней, тем самым редуцируя экспрессию генов путем супрессии трансляции и дестабилизации мРНК. Примерно треть miRNA генов млекопитающих локализуется внутри интронов белок кодирующих генов. В основном ориентированные в той же самой ориентации с их хозяйской мРНК, они используют тот же самый промотор для транскрипции, хотя некоторые имеют независимый промотор (Guo et al, 2010).

Потеря слуха является наиболее распространенным нейросенсорным нарушением у человека. Врожденная глухота затрагивает приблизительно одного из 500 новорожденных (National Institutes of Health, NIDCD, http://www.nidcd.nih.gov/health/statistics/hearing.html). Внутреннее ухо млекопитающих представлено двумя основными органами, улиткой, ответственной за слух, и вестибулярным аппаратом, ответственным за восприятие баланса. Способность воспринимать слух улиткой связана с органом Корти. Этот орган чрезвычайно содержит чувствительный сенсорный эпителий, представленный волосковыми клетками, специализированными сенсорными клетками с богатыми актином выпячиваниями стереоцилий и несенсорными поддерживающими клетками (Frolenkov et al, 2004). miRNAs проявилась во внутреннем ухе в 2006,с описанием miR-9 в качестве потенциального регулятора короткой изоформы COL9A1 (Sivakumaran et al, 2006). Это сопровождалось исследованием miR-96, -182 и -183 кластера, который транскрибируется в виде полицистронного одного транскрипта. Их специфическая экспрессия во внутреннем ухе подчеркивает важность этой триады для внутреннего уха (Weston et al, 2006). С этого момента последовала серия открытий, наиболее неотразимой стала идентификация мутаций ответственных за глухоту в двух обширных испанских семьях. Причинная мутация находится в seed регионе miR-96. Это был первый пример мутации, обнаруженной в miRNA и приводящей к менделирующей болезни (Mencia et al, 2009). miR-96 , как было установлено, вызывает глухоту у ENU-индуцированных мышей, и был установлен механизм возникновения глухоты (Lewis et al, 2009). miRNAs были также описаны при др. связанных с ухом болезнях, таких как роль miR-21 в росте и пролиферации cholesteatoma у человека (Friedland et al, 2009) и в вестибулярных vestibular schwannomas (VS; Cioffi et al, 2010). miRNAs, как было установлено, регулируют процесс продукции и воспаления otitis media (OM) в линиях клеток, происходящих из среднего уха (Song et al, 2011). Используя новые miRNA и техники идентификации мишеней, эта быстра растущая область исследований постоянно обновляется и опубликовано множество данных о экспрессии miRNAs во внутреннем ухе.

Expression of miRNAs and implications for function

Elucidating miRNA expression in the inner ear

Первоначально открытие miRNAs во внутреннем ухе базировалось на их экспрессии (Table 1). Затем был использован ряд методов для выяснения временной и пространственной экспрессии miRNAs. Обычно используются микромассивы для изучения профилей генной экспрессии. Они особенно ценны для выяснения профиля экспрессии малых РНК, включая и miRNAs (Barad et al, 2004; Liu et al, 2004). Эта техника сравнивает профили экспрессии двух образцов, используя гибридизацию каждого образца с олигонуклеотид-синтезированными меченными зондами. Первые miRNAs во внутреннем ухе человека были описаны в результате гибридизации целой улитки в разные моменты времени с коммерческими микромассивами miRNA (Weston et al, 2006). Affymetrix микромассивы были использованы для анализа экспрессии генов между пролиферирующими и не пролиферирующими слуховым эпителием кур (Frucht et al, 2010). Затем были использованы массивы, обогащенные locked nucleic acid (LNA), базируясь на аналоге нуклеиновой кислоты LNA (Petersen & Wengel, 2003) с высоким сродством к РНК (Elkan-Miller et al, 2011). Эта платформа с микромассивом, произведенная Exiqon A/S (Дания), чрезвычайно чувствительна и специфична как к известным, так и частным (proprietary) miRNAs.

Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) это быстрый и чувствительный метод определения количества зрелых или предшественников miRNAs. Они часто используются после идентификации экспрессии miRNA с помощью микромассивов, чтобы оценить находку и определить аккуратно дифференциальные уровни экспрессии. Такого типа оценка идентифицированных miRNAs в первом скрининге микромассива млекопитающих использовала SYBR Green fluorescence (Weston et al, 2006). Этот метод был использован в дальнейшем для проверки изменений в экспрессии miRNA в клетках предшественниках улитки (Hei et al, 2011). Др. оценки использовали систему TaqMan, которая базируется на праймерах ствола и петли (stem and loop), чтобы превращать РНК в кДНК, увеличивая специфичность и решая проблему сходства членов семейства miRNA, отличающихся только одним нуклеотидом (Chen et al, 2005; Raymond et al, 2005). В недавнем сообщении сравнивали несколько методов профилирования экспрессии для детекции miRNAs в линии раковых клеток, выявлена высокая корреляция между разными техническими методами (Sokilde et al, 2011).

In situ гибридизация широко используется, чтобы охарактеризовать профиль пространственной экспрессии miRNAs. Ткань или в форме тотального препарата или в виде замороженных или парафиновых срезов подвергалась гибридизации с LNA™ модифицированным детекционным зондом, меченным молекулой digoxygenin (DIG), и это сопровождалось выявлением с помощью anti-alkaline phosphatase-conjugated (AP) антител (Weston et al, 2006). результатом было пурпурное окрашивание, которое характеризовало miRNA, после реакции с субстратом для щелочной фосфатазы. Наиболее поразительные результаты с использованием этой техники продемонстрировали, что miRNAs обладают чрезвычайно изменчивым временным и пространственным паттерном экспрессии (Elkan-Miller et al, 2011; Friedman et al, 2009; Sacheli et al, 2009).

Обусловленное недоступностью ткани внутреннего уха человека и отсутствием соответствующих линий клеток из внутреннего уха, исследования экспрессии miRNAs ограничены животными с экстраполяцией на функции у человека. По этой причине рыбки данио и мыши являются организмами для выбора оценки функции miRNA . Рыбки данио широко используются в качестве мощного инструмента для изучения систем млекопитающих и являются подходящей моделью для изучения болезней человека (Driever & Fishman, 1996). Эти рыбки маленькие и быстро растут, прозрачны и с ними относительно легко манипулировать путем замалчивания генов на эмбриональной стадии. Восприятие слуха и баланса у рыбок данио осуществляется боковой линией и механосенсорными органами (Nicolson, 2005). Экспрессия miRNA во внутреннем ухе рыбок данио впервые продемонстрирована с помощью экспрессии mir-200a и mir-183 в их сенсорном эпителии (Wienholds et al, 2005). Законсервированный кластер miRNA, который включает miR-183, miR-182 и miR-96, , как было установлено, экспрессируется у рыбок данио в волосковых клетках, отических нейронах и др. первичных сенсорных клетках. За этими находками последовало сообщение, что miR-15a-1 обнаружена в органе боковой линии ) и во всём внутреннем ухе, а miR-18a в основном в слуховом пятнышке эллиптического мешочка (utricular macula) и соседних клетках 48 h после оплодотворения (hpf) (Friedman et al, 2009). Поскольку некоторые из этих miRNAs оказывались ограниченными сенсорными органами, роль регуляции miRNA стала важна для этой сложной системы.

Мыши рассматриваются наиболее подходящей моделью для изучения механизмов глухоты у млекопитающих (Leibovici et al, 2008). Развитие внутреннего уха мышей активно исследуемая область и многочисленные глухие мутантные мыши служат в качестве моделей глухоты у человека (Frolenkov et al, 2004). Возникший интерес к экспрессии miRNA во внутреннем ухе мышей и её связь с с развитием и созреванием внутреннего уха началось с анализа экспрессии микромассива в ходе некоторых стадий развития, от постнатального дня zero (P0) до 5 недель (Weston et al, 2006). Субнабор miRNAs был затем оценен с помощью Northern blot анализа с использованием образцов из внутреннего уха и др. органов мыши, чтобы оценить, существуют ли тканеспецифичные miRNAs, со специальным интересом ко внутреннему уху. Эти анализы выявили, что законсервированный кластер mir-183, mir-182 и mir-96 обнаруживает экспрессию, ограниченную внутренним ухом мышей по сравнению с головным мозгом, сердцем и экспрессией во всем эмбрионе. In situ гибридизация выявила уникальный паттерн экспрессии mir-182, mir-183 и mir-96 во внутренних и наружных волосковых клетках улитки, волосковых клетках вестибулярных органов и в спиральном и вестибулярном ганглии. Эти три miRNAs, как было установлено, экспрессируются в виде одного и того же паттерна (Weston et al, 2006), транскрибируются в одной и той же ориентации и , как полагают, ко-экспрессируются (Wienholds et al, 2005). Др. характерный паттерн экспрессии обнаруживает miR-124, эта обильно экспрессируемая miRNA в нервной системе (Lagos-Quintana et al, 2002), , как было установлено, экспрессируется в спиральном и вестибулярном ганглиях (Weston et al, 2006). Это было первое сообщение, описывающее специфичные для внутреннего уха млекопитающих miRNAs, и их повсеместный или ограниченный паттерн экспрессии.

Чтобы адресовать важный вопрос об эффекте miRNAs в ходе развития, проведено исследование, определяющее паттерн экспрессии кластера mir-183, mir-182 и mir-96 (Sacheli et al, 2009). В этом исследовании, анализ in situ гибридизации осуществлялся в ранние временные точки с miRNAs, обнаруживающими отличительную экспрессию в развитии. Самая ранняя наблюдаемая экспрессия приходилась на день эмбриогенеза 9.5 (E9.5). miR-183 и miR-182, но не miR-96, были обнаружены в отическом пузырьке в раннем эмбриональном внутреннем ухе. Позднее, на ст. E11.5, все три miRNAs обнаруживались в слуховом пузырьке, кохлеа-вестибулярном ганглии и в нервной трубке. Драматические изменения в экспрессии начинались около E14.5, в этот момент времени экспрессия этого кластера ограничивалась вестибулярными волосковыми клетками. Со ст. E17.5 экспрессия обнаруживалась в волосковых клетках, которые становились кохлеарной и вестибулярной системой не обнаруживались поддерживающими клетками. На ст. P0, miR-183, miR-182 и miR-96 строго экспрессировались в волосковых клетках улитки и вестибулярной системы и в спиральном ганглии. На ст. P4 и далее, наблюдался др. крупный сдвиг в экспрессии, т.к. miR-96 более не наблюдалась в улитке или преддверии, но обнаруживалась в spiral limbus и внутренней борозде (inner sulcus). Однако экспрессия miR-183 и miR-182 продолжалась в волосковых клетках, но прекращала свое существование в волосковых клетках, начиная с P11-15 и обнаруживалась только в спиральном крае и внутренней бороздке. В целом эти находки коррелируют с ходом созревания и дифференцировки развивающегося внутреннего уха (Fig 1). Дифференцировка волосковых клеток начинается приблизительно на ст. E14.5, и вплоть до E17-E18, когда сенсорный эпителий обнаруживает волосковые клетки по всей своей длине (Chen et al, 2002). Тот факт, что экспрессия этих miRNAs достигает пика в точке дифференцировки и изменяется от генерального паттерна экспрессии в сенсорном эпителии, ограничивая свою экспрессию волосковыми клетками, указывает на то, что эти miRNAs участвуют в развитии и созревании внутреннего уха новорожденных мышей.

Др. исследование с интересом к регуляторным различиям между улиткой и вестибулярной системой касается сканирования микромассива малых РНК в улитке мышей со ст. P0 в улитке и преддверии (Friedman et al, 2009). 24 miRNAs обнаруживали дифференциальную экспрессию в этих двух тканях. Профиль экспрессии набора из 5 miRNAs был оценен с использованием гибридизации in situ. mir-15a, mir-18a, mir-30b, mir-99a и mir-199a были обнаружены в разных самостоятельных регионах улитки и преддверия мыши на ст. P0, включая волосковые и поддерживающие клетки, спиральный ганглий и др. типы клеток. Паттерны дифференциальной экспрессии демонстрируют, что экспрессия miRNA во внутреннем ухе не ограничена одним типом клеток или стадией развития, а их экспрессия распространяется и ассоциирует с изменениями развития, происходящими в ходе времени (Fig 1).

miRNAs are involved in formation of the inner ear

Как только было установлено, что miRNAs экстенсивно экспрессируются во всем внутреннем ухе, участие Dicer1 в формировании внутреннего уха также стало насущным. Типа III рибонуклеаза Dicer1 важна для процессинга в зрелые miRNAs из их pre-miRNA формы (Bernstein et al, 2001). Мышей, лишенных энзима Dicer1 получали путем нокаута (KO) генов, они погибали во время эмбриогенеза уже на ст. E7.5, возможно из-за неспособности эмбрионов продуцировать функциональные зрелые miRNAs, которые могли бы регулировать процессы развития (Bernstein et al, 2003).

Чтобы преодолеть эту раннюю гибель были получены кондиционные нокауты с использованием Cre трансгена (Harfe et al, 2005). Первое исследование, изучающее роль Dicer1 в развитии внутреннего уха, было проведено с использованием Pax2-Cre трансгенных мышей (Soukup et al, 2009). Обусловленная делеция Dicer1 у Pax2-Cre мышей позволяла делетировать Dicer1 во внутреннем ухе, почках и среднем мозге после скрещивания с Dicer1-loxP мышами. Драматическое влияние потери Dicer1 было продемонстрировано у мышей, погибающих на ст. E18.5. Нарушения во внутреннем ухе были значительными. На ст. E17.5 наблюдалось значительное укорочение структур внутреннего уха, а улитка не давала скрученной формы. Scanning electron microscopy (SEM) показало, что волосковые клетки улитки обладают аномальной организацией стереоцилий. Др. кондиционная модель Dicer1 KO использовала Cre экспрессию, стаящую ниже промотора Pou4f3, чтобы попытаться создать жизнеспособных мышей (Dicer-PCKO) (Friedman et al, 2009). Промотор Pou4f3 был избран для Dicer1 условныхl KO модельных мышей, т.к. он экспрессируется в волосковых клетках. Ограниыение экспрессии Cre рекомбиназы в этих клетках приводит к удалению Dicer1-LoxP сайтов из волосковых клеток, приводя к деплеции экспрессии Dicer1 в волосковых клетках. Большинство дефектов в слуховой системе обнаруживалось у взрослых мышей. Dicer-PCKO p38 мыши были глухи, что демонстрировалось по auditory brainstem response (ABR), и они также обнаруживали легкий фенотип вестибулярного кружения. Большинство волосковых клеток улитки имело неправильную форму и не экспрессировало myosin VI, маркера волосковых клеток, а SEM показала, что большинство волосковых клеток или теряло свои стереоцилии или они имели аномальную форму. Эти результаты демонстрируют более выраженные нарушения во внутреннем ухе при прерывании процесса созревания с помощью miRNA. Следующая модель использовала Foxg1-Cre обусловленный нокаут Dicer1 (Kersigo et al, 2011). Эффект на внутреннее ухо был значительным с уменьшением размера внутреннего уха, наблюдаемым на ст. E14.5, в следствие потери образования канала и потери структуры завитой улитки на ст. E18.5. Эти модели показали, что нормальное развитие функционального внутреннего уха строго зависит от нормального созревания miRNA. Нарушение продукции зрелых miRNA вызывает не только структурные дефекты, но и потерю слуховой и вестибулярной функции.

Последняя модель, которая была использована для тщательного исследования влияния Dicer1 на развитие внутреннего уха, это Atoh1-Cre условные нокауты Dicer1. Atoh1 экспрессируется во всех волосковых клетках во время эмбриональной стадии, но не ограничивается внутренним ухом. Мыши погибают приблизительно в возрасте 4 недель, обнаруживая атаксию и судороги. miR-183 была полностью истощена в волосковых клетках мутантных мышей, но не в спиральном ганглии. Кроме того, экспрессия miRNAs наблюдалась в др. компонентах внутреннего уха, но не в волосковых клетках, указывая, что эта модель специфически супрессирует экспрессию miRNA в волосковых клетках (Weston et al, 2011). Эти находки подтверждают, что miRNAs являются критическими для развития внутреннего уха и участвуют в формировании, морфогенезе и нейросенсорных процессах, которые создают функциональный орган слуха.

Approaches to miRNA target identification

Чтобы понять как функционируют miRNAs в клетках, необходимо идентифицировать их мишени. miRNAs дестабилизируют мРНК мишени или ингибируют трансляцию белка, приводя к снижению уровня белка (Guo et al, 2010). Эти мишени могут быть важными клеточными регуляторами и их снижение, даже незначительное может менять судьбу клеток. Предсказание мишени трудная задача с открытия miRNAs; однако алгоритмы обнаружения реальных функциональных мишеней улучшаются. Имеется ряд доступных программ для предсказания пригодных мишеней, включая неограниченные TargetScan и miRanda, большинство из которых работает в слегка отличных алгоритмах, хотя все они базируются на seed спаривании miRNA-распознаваемая мишень. Они выискивают комплементацию miRNA 5' seed региона нуклеотидов (nt) 2-7 к 3'UTR мишени, эволюционно консервативные 7 nt в 3'UTR мишеней, соответствующих miRNA seed региону (Bartel, 2009). Существенным недостатком этих программ компьютерных предсказаний является огромное количество фальшивых позитивных шумов, которые они продуцируют. Напр., хотя пара miRNA-мишень может быть обнаружена с использованием этого метода, но как miRNA , так и мишень не обязательно экспрессируются в исследуемой ткани и поэтом у не будут взаимодействовать in vivo. В таком случае предсказание будет не относящимся к делу. Это заключение подчеркивает важность биологической оценки каждой выявленной компьютером пары miRNA-мишень. Идентификация новых мишеней для miRNAs, экспрессируемых во внутреннем ухе продемонстрирована в немногих исследованиях (Elkan-Miller et al, 2011; Hertzano et al, 2011).

Компьютерный анализ с использованием программы miRanda для предсказания мишени был введен, чтобы создать список более чем из 100 предполагаемых мишеней для miR-96 (Lewis et al, 2009). Этот список был аннотирован и 13 потенциальных мишеней были затем исследованы биологически с использованием luciferase метода (Lewis et al, 2009). 5 из тестируемых мишеней были оценены биологически как мишени miR-96: Aqp5, Celsr2, Myrip, Odf2 и Ryk. Используя miR-96 мутантных мышей diminuendo, были использованы разные подходы идентификации мишеней. Микроанализ экспрессии микромассива генов позволил сравнить дифференциально экспрессируемые наборы мРНК от мутантных diminuendo и дикого типа (WT) мышей. После qRT-PCR подтверждения было найдено 5 генов, подавляемых у мутантов: Slc26a5 (prestin), Ocm (oncomodulin), Pitpnm1, Gfi1 и Ptprq. Эти гены, по-видимому, не являются прямыми мишенями для miR-96, указывая, что их подавление является нижестоящим эффектом.

Lh/ исследование использовало комбинацию экспериментальных данных и компьютерный анализ для предсказания функциональных мишеней для miRNAs во внутреннем ухе (Elkan-Miller et al, 2011). miRNAs были идентифицированы после применения транскриптомного и протеомного профилирования экспрессии для поиска дифференциально экспрессируемых miRNAs между улитко и преддверием в сенсорном эпителии P2 мышей. Функциональные мишени затем искали, используя FAME (Functional Assignment of miRNA via Enrichment) алгоритм (Ulitsky et al, 2010). FAME определяет количественное увеличение и истощение потенциальных мишеней, найденных с помощью TargetScan, в наборе данных активируемых и подавляемых мРНК и белков. В этом исследовании miR-135b была обнаружена в LNA массиве, активированная в преддверии, тогда как её мишени оказывались обогащенными в массиве данных белков и подавленными в преддверии. Гибридизация In situ подтвердила дифференциальную экспрессию miR-135b в вестибулярных волосковых клетках на ст. P0. Анализ предсказывает, что PSIP1-P75 являются потенциальными мишенями для miR-135b. Psip, PC4- и SF-2 взаимодействующий белок/Ledgf известный активатор транскрипции участвует в регуляции генов, связанных со стрессами, обладает анти-апоптическим эффектом, участвует в сплайсинге мРНК, жизнеспособности клеток и является частью слитого гена при лейкемии (Sutherland et al, 2006). И qRT-PCR и экспрессия белка согласуются с предсказаниями FAME, поскольку PSIP1-P75 подавляются в преддверии по сравнению с улиткой. Наконец, взаимодействие miRNA-мишень было продемонстрировано как с помощью техники замалчивания RNA interference (RNAi), так и методом репортера luciferase. Этот пример иллюстрирует подход по идентификации мишеней, комбинацию как in silico анализа, так и экспериментальных данных, способный предсказывать функционально значимые мишени. Более того, пути с использованием PSIP1-P75 известны и в др. тканях и могут служить путеводной линией для выявления функции этой пары miRNA-мишень во внутреннем ухе (Fig 2).

Финальный пример сложного подхода к поиску функциональных мишеней продемонстрирован при целенаправленном поиске регуляторов судеб клеток во внутреннем ухе, включая miRNA мишени и транскрипционные факторы, используя специфичное для типов клеток изучение транскриптома (Hertzano et al, 2011). Жидкостная цитометрия вестибулярных и кохлеарных тканей с использованием CD326, CD34 и CD49f маркеров, сделала возможной разделение эпителиальных (сенсорных и несенсорных), нервных и сосудистых популяций клеток, чтобы идентифицировать дифференциально экспрессируемые транскрипты между этими восмью отличающимися клеточными популяциями. Используя эти данные, семейства miRNA, чьи потенциальные мишени дифференциально экспрессировались в специфических типах клеток, в противоположность направлению экспрессии miRNA, оказались связанными. Предсказание идентифицировало семейство miR-200b с потенциальными мишенями, подавляемыми в сенсорных эпителиальных клетках на ст. P0. Экспрессия miR-200b обнаруживалась с помощью гибридизации in situ во всех сенсорных эпителиальных клетках внутреннего уха. Чтобы идентифицировать др. регуляторные факторы во внутреннем ухе, проводили поиск цис-регуляторных элементов среди экспрессирующихся промоторов сенсорных эпителиальных клеток внутреннего уха. Эта биоинформационная техника выявила транскрипционные факторы ZEB1 и ZEB2 в качестве регуляторов генов, экспрессирующихся в сенсорных клетках внутреннего уха. Ранее было показано, что miR-200b непосредственно воздействует на мишени ZEB1 и ZEB2 (Burk et al, 2008), это связывает регуляторные факторы др. с др. Наконец, испоьзуя подход, специичных для типа клеток, они продемонстрировали заметную неправильную экспрессию генов, подтвердив, что они регулируются с помощью Zeb1 у мутантных мышей с мутацией в Zeb1 транскрипционном факторе. Результаты этих исследований выявили сложную регуляторную сеть miRNAs, мишеней и транскрипционных репрессоров.

Clinical implications of inner ear miRNAs

Mutations in miRNAs lead to human deafness

Важность miRNAs для развития внутреннего уха и их участие в функциональных процессах слуха установлена путем изучения экспрессии и животных моделей. Критическая природа miRNAs для восприятия слуха доказывается открытием, что мутации в гене miR-96 являются причиной несиндромальной потери слуха в двух крупных семьях людей (Mencia et al, 2009). Две мутации в seed регионе miR-96, +13 G>A и +14 C>A, были выявлены в двух неродственных семьях Испании, обнаруживающих аутосомно доминантную прогрессирующую потерю слуха. Эти находки указывают на то, что глухота результат потери сайта распознавания мишени, как результат изменения в miR-96 seed регионе. Идентификация мутаций в гене miR-96 эо первое описание у людей мутаций miRNA, вызывающих менделирующее заболевание. После этого сообщения несколько исследований было сконцентрировано на генах mir-96, mir-182 и mir-183 как источниках мутаций для др. случаев глухоты. Однако, мутаций не было обнаружено в этих генах в семьях американцев и иранцев с аутосомно доминантной и рецессивной несиндромальной потерей слуха (Hildebrand et al, 2010) , указывая, что мутации в этом кластере не являются широко распространенной причиной глухоты. После этого исследования открыты новые мутации, приводящие к потере слуха, в гене miR-96 в итальянской семье (Solda et al, 2012). В отличие от первых мутаций в miR-96 эта мутация (+57 T>C) не расположена в seed регионе. Мутация, как было установлено, нарушает вторичную структуру miR-96 pre-miRNA, изменяя miR-96-3p последовательность и снижая количество копий зрелой miR-96. Тот факт, что мутации в miRNAs могут вызывать потерю слуха, демонстрирует четко важную роль их в функции слуха и помогает определить механизмы. с помощью которых одиночная мутация miRNA может приводить к глухоте.

Model systems address mechanisms of the human mutations

Параллельно с открытием мутаций miR-96 у человека, мутации в miR-96 обнаружены при N-ethyl-N-nitrosourea (ENU)-индуцированной глухоте мышей (Lewis et al, 2009). Эти мыши названы diminuendo (Dmdo), обнаруживают прогрессирующую аутосомно доминантную потерю слуха, сходную с таковой у людей. Потеря слуха и фенотип нарушения баланса были более тяжелыми у гомозигот, а исследование SEM выявило уродства стереоцилий как у гетерозиготных, так и гомозиготных мышей. Была открыта точковая мутация после хромосомного картирования на хромосоме, 6, в mir-96 seed регионе (+15 A>T), регионе полностью законсервированным между видами. мутация не нарушает образование зрелой miR-96 у мутантов и поэтому поиск механизма сдвинулся на распознавание мишеней. Однако, ни идентифицированные мишени, ни подавляемые гены не были связаны с фенотипом. Очевидно, т.к. одиночная miRNA может регулировать сотни мишеней, то такая мутация в seed регионе сайта связывания мишени, может приводить к каскадному эффекту, вызывая многие вторичные эффекты, которые в конечном итоге и приводят к глухоте. Дальнейший анализ мутантных miR-96 мышей установил, что останавливается созревание волосковых клеток на ст. P0 (Kuhn et al, 2011). Биофизическое развитие волосковых клеток аномально, т.к. во внутренних волосковых клетках отсутствует типичный ток K⁺. Это исследование подтвердило, что that miR-96 необходима для развития и созревания эмбриональных волосковых клеток.

В разных модельных системах рыбки данио были использованы для выяснения роли кластера miR-96, miR-182 и miR-183 в развитии внутреннего уха (Li et al, 2010). Кластер избыточно экспрессировали у рыбок данио путем инъекции эмбрионам двунитчатых miRNAs. Эмбрионы с избыточной экспрессией miR-182 и miR-96 обнаруживали уродства тела и продуцировали эктопические волосковые клетки. Нокдаун каждой из miRNAs кластера с использованием morpholino олигонуклеотидов, показало снижение количества волосковых клеток. Избыточная экспрессия miR-182 у эмбрионов с нокдауном miR-96 продемонстрировала эффект частичного восстановления и увеличение количестве волосковых клеток по сравнению с нокдауном. Эти находки подтверждают, что кластер играет роль в формировании и развитии волосковых клеток и что существует определенный эффект перекрывания между этими членами семейства miRNA.

Other human disease phenotypes in the ear

miRNAs, как было установлено, регулируют и др. связанные с ухом человека клинические признаки. В одном исследовании была установлена регуляторная роль miR-21 ы роте и пролиферации cholesteatoma человека (Friedland et al, 2009; Fig 3). Cholesteatomas обладают доброкачественным ростом, происходят из эпидермиса среднего уха или сосцевидного отростка. Они часто возвращаются и могут приводить к нарушениям височной кости и к нейросенсорной потере слуха, помимо прочих симптомов. Молекулярные механизмы, приводящие к этому росту изучены недостаточно и предполагается, что miRNAs являются потенциальными молекулярными регуляторами в этой патологии. В этом исследовании образцы холе стеатом и нормальной кожи были взяты от пациентов и проанализированы с использованием qRT-PCR, чтобы установить активируемые miRNAs. Среди серии подозреваемых miRNAs, ранее сцепленных с пролиферацией и ростом в др. моделях, miR-21, как было установлено, активируется в образце cholesteatoma по сравнению с нормальной кожей. Регуляторная модель была предложена, базируясь на известных мишенях для miR-21, связана с инфекцией в качестве первого стимула, которая сопровождается факторами, которые активируют транскрипцию miR-21, которая затем супрессирует PTEN и PDCD-4 (известные гены опухолевых супрессоров) и это приводит к росту cholesteatoma.

В др. исследовании miR-21 была обнаружена избыточно экспрессируемой в VS нервной ткани по сравнению с нормальной тканью (Cioffi et al, 2010; Fig 3). VS являются доброкачественными опухолями Шванновских клеток вестибулярного нерва. VS может вызывать головокружения, звон в ушах, потерю слуха и др. симптомы. PTEN, известная мишень для miR-21, как полагают, снижает уровни белка, но не уровни мРНК в образцах VS. miR-21 была подвергнута нокдауну в первичной культуре VS с использованием анти-miR-21 олигонуклеотидов,это усиливало клеточную пролиферацию и жизнеспособность.

Др. болезнь человека, которая была выявлена при поиске miRNA , это OM (Song et al, 2011; Fig 3). OM это воспаление среднего уха. Это состояние довольно широко распространено у детей и остается нелеченным и может приводить к ухудшению слуха. В исследовании, проведенном на human middle ear epithelial cells (HMEECs) в качестве модели OM, чтобы идентифицировать miRNAs, индуцируемые во время воспаления, в lipopolysaccharide (LPS)-обработанных и необработанных клетках, были сравнены после анализа микромассивов. 5 и 10 miRNAs были найдены как активируемые и подавляемые. соотв. Большинство из предполагаемых мишеней для активируемых miRNAs участвует в реакции острого воспаления, в регуляции развития и клеточного роста, как сообщает DAVID, биоинформационный ресурс, который предоставляет функциональные аннотации генов. Среди подавляемых miRNA мишеней, функциональные мишени были вовлечены в развитие, клеточные коммуникации, эндоцитоз, клеточную дифференцировку, IκB b NFκB каскад, активность комплемента, клеточную адгезию и реакцию врожденного иммунитета. Авт. полагают, что это исследование указывает на участие miRNAs в иммунном ответе и возникновении OM.

Эти примеры демонстрируют широкий спектр miRNAs, отвечающих за клинические проявления у людей и болезни уха. Более того, это подчеркивает важность исследований miRNA для лучшего понимания сложных механизмов, ведущих к болезням человека, в частности слухового и вестибулярного органов.

Future directions in miRNA research

Involvement in regeneration

После открытия многочисленных процессов, в которых участвуют miRNAs во внутреннем ухе, стало интересным, участвуют ли miRNAs в регенерации волосковых клеток. У млекопитающих как только слуховые волосковые клетки полностью сформированы, регенерации не происходит после повреждений, особенно в волосковых клеток улитки (Stone & Cotanche, 2007). Тем не менее у птиц, рептилий. амфибий и рыб потерянные волосковые клетки могут замещаться новыми, в результате регенерации из поддерживающих клеток. Этот факт послужил основой для многих исследований, сфокусированных на идентификации биологических процессов, которые ответственны за такую регенерацию, включая и miRNAs. В исследовании, которое изучало роль miRNAs в трансдифференцировке, анализ микромассива miRNA был осуществлен с использованием регенерирующих хрусталиков и волосковых клеток внутреннего уха в тканях, извлечённых из взрослых тритонов. Лабиринт, который включает слуховой и вестибулярный сенсорный эпителий выделяли и культивировали in vitro. Гибель волосковых клеток вызывали aminoglycosides и образцы РНК брались из культивируемой ткани в немногие временные точки, до тех пор, пока набюдалась регенерация, 18 дней спустя после воздействия. Анализ микромассивов выявил, что экспрессия let-7 семейства, в частности let-7a, -7b, -7c, -7d, -7e, -7f и -7g, была снижена как в дифференцирующихся волосковых клетках, так и хрусталиках. Т.к. семейство let-7 , как известно, регулирует терминальную дифференцировку, то их подавление указывает на потенциальную роль в дедифференцировке, т.о., тем самым регулируются мишени, участвующие в регенерации (Tsonis et al, 2007).

У млекопитающих хотя слуховые волосковые клетки не регенерируют, вестибулярный сенсорный эпителий обладает ограниченной способностью регенерировать (Kawamoto et al, 2009). Различия в регуляции между улиткой и преддверием были изучены, чтобы определить участвует ли регуляция miRNA в этих различиях в регенеративной способности. При поиске дифференциально экспрессируемых miRNAs между улиткой и преддверием анализ микромассива на ст. P0 проводили в улитке и преддверии мыши (Friedman et al, 2009). 24 miRNAs обнаруживали дифференциальную экспрессию. Несмотря на относительно легкие различия (15-40%), miRNAs, которые обнаруживают наивысшую дифференциальную экспрессию, это let-7a, -7b, miR-220, -423, -190, -204,-24, -195 и miR-125b. Эти результаты показывают, что miRNAs могут быть вовлечены в регуляцию разных характеристик между улиткой и преддверием.

В противоположность млекопитающим, волосковые клетки слухового эпителия птиц обладают способностью регенерировать после повреждения (Brignull et al, 2009). При поиске генов, участвующих в регенерации у кур, изучали экспрессию генов, анализируя микромассивы после воздействия forskolin, который вызывает пролиферацию поддерживающих клеток, что сопровождается появлением новых волосковых клеток на basilar papilla кур (Frucht et al, 2010). Подавляемые гены между обработанной и контрольной тканью представляют набор мишеней для miRNAs, которые участвуют в процессе регенерации. Используя эти два набора тканей осуществляли gene set enrichment analysis (GSEA). Идентифицированы немногие miRNAs в анализе GSEA, это miR-181a, miR114, miR-200a и miR-27, подозреваемые в участии в регенерации. miR-181a была изучена далее и была избыточно экспрессирована в эксплантах basilar papilla эмбрионов кур. После инкорпорации BrdU экспланты, трансфицированные miR-181a. обнаруживали высокие уровни пролиферации по сравнению с контролем. Для дополнительного изучения роли miR-181a в пролиферации, basilar papilla обрабатывали forskolin и позднее трансфицировали анти-miR-181a и обрабатывали forskolin снова. Трансфицированные basilar papillae как forskolin, так и anti-miR-181a обнаруживали меньше пролиферирующих клеток по сравнению с теми, которые обрабатывали только forskolin и контролем. Эти результаты указывают на то, что miR-181a может усиливать пролиферацию как в молчащих, так и пролиферирующих basilar papilla эмбрионов кур. Рыбки данио представляют собой др. пример участия miRNAs в регенерации, т.к. избыточная экспрессия miR-182 и miR-96 приводила к продукции эктопических волосковых клеток (Li et al, 2010). Эти исследования привели к идее, что miRNAs могут иметь многообещающий терапевтический эффект, т.к. miRNAs участвуют как активный агент, способствующий регенерации и как регуляторный медиатор, помогающий открыть нижестоящие мишени и транскрипционные факторы, участвующие в регенерации.

Deep sequencing to identify new miRNAs

Новые разработанные техники наделяют их удивительными возможностями открытия новых miRNAs. Следующая генерация секвенирования или massively parallel sequencing (MPS), молекул ДНК и РНК обладает измененной скоростью и широтой доступного секвенирования. MPS было использовано для идентификации некодирующих РНК, включая и miRNAs (Berezikov et al, 2006; Mardis, 2008). Глубокое секвенирование делает возможным открытие новых miRNAs поскольку их уникальная структура и т.д. могут служить в качестве количественного инструмента для прямого измерения количеств miRNA.

Пока только одно исследование использовало эту технологию в области внутреннего уха для выявления изменений в экспрессии miRNA в слуховой части переднего мозга у zebra зяблика, после того как его понуждали к пению (Gunaratne et al, 2011). Глубокое секвенирование, проведенное на РНК, происходящей из слуховой части переднего мозга выявило 34 новые miRNAs, специфичные для генома zebra зяблика. Этот пример демонстрирует, что экспрессия miRNA может меняться в зависимости от поведения и нейрональной реакции и может быть выявлено при глубоком секвенировании. Следует ожидать. что использование этой технологии секвенирования для идентификации новых miRNAs в разных тканях во время онтогенетических изменений или экспрессии при болезни, будет использовано более широко.

Conclusions

miRNA involvement in the development and maturation of the inner ear and the auditory mechanism has been demonstrated numerous times. The most relevant to inner ear disease is the mutations in the seed region of miR-96, causing deafness in both humans and mice. This remarkable finding initiated a new paradigm in the deafness gene hunt. This was the first time that a single mutation in a miRNA was found to lead to deafness. The implication that a single mutation in a miRNA can lead to deafness is not trivial, since it is not a direct result of the mutation, but rather, a result of many small cumulative events, caused by both the loss of inhibition on the miR-96 targets, and gain of function of the targets now recognized by the new mutated seed region. This complex disease-causing mechanism had led us to believe that there is much more to miRNA involvement in disease than previously known. As new deep sequencing technologies are becoming more readily available, the miRNA field will rapidly grow and expand, identifying new miRNAs regulating important inner ear functions. Many diseases may be demonstrated to be affected by miRNA mutations, opening a vast potential for a future role for miRNAs as therapeutic agents.

Deafness
A common neurosensory disorder that leads to partial or complete hearing loss.

microRNA (miRNA)
A ~23-nucleotide long RNA that is not translated into protein and regulates gene expression by binding to the 3'UTR of a target mRNA.

Cochlea
The auditory portion of the inner ear labyrinth responsible for hearing.

Vestibule
A portion of the inner ear labyrinth responsible for balance.

Hair cells
Sensory receptor cells located in the cochlea and vestibule organs.

Zebrafish
The species Danio rerio, a tropical freshwater fish used as a vertebrate model organism.

Cholesteatoma
A benign keratinizing squamous epithelium growth in the middle ear.

Vestibular schwannomas
A benign vestibular nerve Schwann cell tumour.

Otitis media
An inflammation of the middle ear, mainly affecting children.

Transcriptome
The expression profile of messenger RNAs.

Proteomics
The large-scale study of proteins.

Regeneration
A process of renewal of dead or lost cells.

Pending issues
Lack of human RNA tissue from the inner ear: Unlike miRNA research in the cancer field, where much of the work is focused on tissues and tumours derived from human patients, research in the deafness field does not base itself on human tissue. RNA from humans is almost impossible to obtain. Despite the genetic resemblance between humans and mice, miRNA targets may be different between the two, providing a difficult basis for development of therapeutics for human deafness. This aspect must be reconciled with when making extrapolations from miRNA experiments using RNA derived from mice.

Regeneration: Regeneration of damaged hair cells does not occur in the mammalian cochlea. miRNA involvement in hair cell regeneration in reptiles and birds must be further studied, with the hope of identifying factors that promote regeneration in mammals.

Treatment: Treatment by gene therapy for diseases caused by miRNA mutations is still the ‘holy grail’ of miRNA disease research. A study of the pathogenesis caused by a mutation in a single miRNA, such as miR-96, is a promising candidate for gene therapy studies. Finding methods to reduce or induce miRNA expression in the inner ear, for fine-tuning of target expression to influence factors involved in hearing loss, is an ongoing goal in the field.

microRNAs: the art of silencing in the earAnya Rudnicki, Karen B. Avraham EMBO Molecular Medicine Volume 4, Issue 9, pages 849–859, September 2012

microRNAs: the art of silencing in the ear
Anya Rudnicki, Karen B. Avraham
EMBO Molecular Medicine Volume 4, Issue 9, pages 849–859, September 2012