Glis3, член Kruppel-like семейства транскрипционных факторов (Kim et al, 2003), высоко экспрессируется в панкреатических beta клетках (Senee et al, 2006; Yang et al, 2009). GLIS3 мутации, как было установлено, вызывают спорадический диабет у новорожденных детей (Senee et al, 2006). Мы и др. описали дефектную дифференцировку клеток островков и летальный диабет новорожденных у Glis3-дефицитных мышей (Kang et al, 2009; Watanabe et al, 2009; Yang et al, 2011). Далее мы показали, что GLIS3 соединяется с Glis3-response elements (Glis3REs) в промоторе Ngn3, активируя Ngn3 непосредственно и синергично с hepatocyte nuclear factor 6 (HNF6) и forkhead box protein A2 (FOXA2), раскрывая жизненно важную роль Glis3 в функционировании beta клеток во время эмбриогенеза (Yang et al, 2011).
В дополнение к своей роли в развитии островков у плодов, получены доказательства, что Glis3 может также участвовать в регуляции функции beta клеток взрослых. Недавно genome-wide association studies (GWAS) в популяциях взрослых идентифицировали GLIS3 в качестве гена кандидата на роль для диабета типа 1 (Barrett et al, 2009), и как гена, который ассоциирует с диабетом типа 2 (Cho et al, 2012; Dupuis et al, 2010; Liu et al, 2011; Rees et al, 2011). Варианты по GLIS3 были ассоциированы с дисфункцией beta клеток в последней группе (Boesgaard et al, 2010). Более того, локус GLIS3 сцеплен с измененным уровнем глюкозы при голодании у здоровых детей и подростков (Barker et al, 2011). Эти популяционные исследования подтвердили, что Glis3 может регулировать функцию beta клеток у подростков и взрослых.
Glis3-/- мыши погибают после рождения (Kang et al, 2009; Watanabe et al, 2009; Yang et al, 2011), это мешает использованию этой модели для изучения роли Glis3 у взрослых животных. Поэтому мы создали две независимые мышиные модели. Во-первых, мы изучали
Glis3-/+ мышей, которые были euglycaemic и росли нормально. Интересно, мы установили, что гаплонедостаточность Glis3 делает взрослых
Glis3-/+ мышей значительно более склонными, чем дикого типа, к развитию диабета, вызываемого high fat diet (HFD) из-за нарушений пролиферации beta клеток и экспансии массы beta клеток в ответ на HFD. Во-вторых, мы получили кондиционных Glis3-инактивируемых мышей путем скрещивания Glis3
fl/fl мышей (Yang et al, 2011) с Pdx1-CreERT
+ (Gannon et al, 2000) мышами. Мы показали, что tamoxifen (TAM)-индуцированная делеция Glis3 у взрослых животных ведет к острому подавлению продукции инсулина, гипергликемии и затем к апоптозу beta клеток и скоротечному диабету. Эти находки составили молекулярную основу, что локус
Glis3 играет ключевую роль в контроле гликемии в популяции взрослых.
RESULTS:
Чтобы исследовать роль Glis3's у взрослых мы генерировали две независимые модели мышей:
Glis3-/+ и Glis3fl/fl/Pdx1CreERT+. У первых развивался HFD-индуцированный диабет из-за нарушений экспансии массы beta клеток. Ccnd2, доминирующий D-type cyclin в панкреатических beta клетках, как было установлено, является критическим для экспансии массы beta клеток после кормления HFD. Получены доказательства, что GLIS3 контролирует пролиферацию beta клеток в ответ на диету с высоким содержанием жира, по крайней мере, частично путем регуляции транскрипции
Ccnd2. Взрослые
Glis3fl/fl/Pdx1CreERT+ мыши были euglycaemic. TAM-обусловленная специфическая инактивация в beta клетках Glis3 взрослых мышей остро подавляла экспрессию гена инсулина, приводя к гипергликемии и в последствие к ускоренному апоптозу beta клеток.
DISCUSSION
В данном исследовании мы изучали функцию Glis3 в панкреатических beta клетках взрослых животных. Glis3-/- мыши погибают после рождения (Kang et al, 2009; Watanabe et al, 2009; Yang et al, 2011), поэтому мы создали две независимые модели взрослых мышей. Наши результаты показали, что Glis3 необходим для компенсаторной экспансии beta клеток в ответ на кормление HFD. Неспособность к увеличению массы beta клеток у HFD-питаемых Glis3-/+ мышей в первую очередь обусловлена снижением величины пролиферации. Репликация панкреатических beta клеток тонко контролируется многими молекулами (Ackermann & Gannon, 2007; Cozar-Castellano et al, 2006; Sachdeva & Stoffers, 2009). Среди них, D-type cyclins, особенно Ccnd2, важны для постнатального роста панкреатических beta клеток (Georgia & Bhushan, 2004; Kushner et al, 2005) и компенсаторной экспансии в ответ на резистентность к инсулину (Georgia et al, 2010). Интересно, что мы установили, что экспрессия мРНК Ccnd2 подавляется в островках Glis3-/+ мышей и мышей, дефицитных специфичному для beta клеток Glis3. Более того, мы предоставили доказательства, что GLIS3 непосредственно соединяется с промотором Ccnd2 мышей и регулирует его транскрипцию. Эти результаты демонстрируют, что Glis3 необходим для пролиферации beta клеток и увеличения массы в ответ на кормление HFD, по крайней мере, частично за счет регуляции транскрипции Ccnd2.
Во-вторых, мы генерировали Glis3fl/fl/Pdx1CreERT+ мышей. Воздействие на этих мышей TAM вызывало специфичную для beta клетко инактивацию Glis3 у взрослых животных, это приводило к скоротечному диабету. Панкреатическая инсулиновая мРНК, содержание иммунореактивного инсулина и уровень инсулина в плазме становились практически необнаружимы у этих тяжело диабетических мышей.
Т.к. гипергликемия per se, как известно, подавляет экспрессию инсулина, а также стимулирует апоптоз beta клеток (Olson et al, 1993; Poitout & Robertson, 2002, 2008; Robertson et al, 2004), поэтому мы использовали две стратегии, чтобы обойти эти эффекты гипергликемии у обработанных TAM Glis3fl/fl/Pdx1CreERT+ мышей. Во-первых, мы использовали инсулиновые pellets, чтобы частично ослабить гипергликемию у TAM-обработанных Glis3fl/fl/Pdx1CreERT+ мышей до менее 300µmg/dl, при этом иммунореактивный инсулин всё ещё оставался сильно редуцированным в островках этих мышей, в то же время величина апоптоза beta клеток всё ещё оставалась достоверно высокой, чем у контрольных мышей. Чтобы обойти смешанный эффект остаточно от легкой до средней гипергликемии у этих мышей, мы затем исследовали TAM-обработанных Glis3fl/fl/Pdx1CreERT+ у мышей спустя 10 дней после применения TAM, когда животные были всё ещё euglycaemic и имели нормальный уровень инсулина в плазме. В этот ранний промежуток времени уровнеь мРНК инсулина и экспрессия иммунореактивного инсулина были уже снижены. Важно, что в отсутствие гипергликемии количество апоптических клеток в панкреатических островках не отличалось между контрольными и TAM-обработанными мышами, это было подтверждено Glis3-нокдауном INS-1 происходящих 832/13 клеток, указывая тем самым, что повышенный апоптоз, который появляется после начала гипергликемии, является следствием glucotoxicity, а не прямым эффектом потери экспрессии Glis3.
Неавно мы показали, что Glis3 является мощным трансактиватором инсулинового промотора (Yang et al, 2009); он физически и функционально взаимодействует с PDX1, MAFA и NEUROD1, чтобы модулировать активность промотора инсулина (Yang et al, 2009). Здесь мы использовали кондиционных Glis3-дефицитных модельных мышей, чтобы продемонстрировать жизненно важную функцию Glis3 в контроле экспрессии гена инсулина во взрослой поджелудочной железе in vivo. Важно отметить, чтобы оценить секрецию инсулина у Glis3-дефицитных мышей, необходимо принять во внимание тот факт, что Glis3 является мощным трансактиватором гена инсулина (Yang et al, 2009) , а de novo биосинтез инсулина и содержание инсулина в островках заметно снижено у Glis3-дефицитных мышей. Поэтому мы нормализовали GSIS к содержанию инсулина в островках, стратегия обычно используемая др. исследователями в этой области (Gu et al, 2010; Preitner et al, 2004), и не выявили достоверных отличий в GSIS из островков дикого типа и из Glis3-дефицитных островков.
В то время как Glis3 стоит выше Ngn3 в поджелудочной железе плодов, а потеря Glis3 во время эмбрионального развития вызывает диабет новорожденных, как следствие дефектной дифференцировки островков, обусловленной Ngn3 (Yang et al, 2011), у взрослых животных Ngn3, по-видимому, играет меньшую или не играет роли в диабетогенных эффектах потери Glis3. Потеря Glis3 непосредственно вызывает сильно сниженную экспрессию инсулина, приводя к гипергликемии, которая затем индуцирует апоптоз beta клеток возможно из-за глюкотоксичности, запуская порочный цикл, который завершается тяжелым скоротечным диабетом.
Итак, наше исследование предоставило молекулярную основу для GLIS3 локусом обусловленной чувствительности к типа 1 (Barrett et al, 2009) и типа 2 диабета (Boesgaard et al, 2010; Dupuis et al, 2010; Liu et al, 2011), оба из которых базируются на дефектах функции beta клеток (в присутствии резистентности к инсулину в случае болезни типа 2). Мы установили, что Glis3 абсолютно необходим для нормальной экспрессии гена инсулина в beta клетках взрослых in vivo. Более того, редуцированная экспрессия Glis3 ведет к нарушению HFD-индуцируемой экспансии beta клеток. Т.о., помимо свой жизненно важной роли в дифференцировке панкреатических островков у плодов (Kang et al, 2009; Watanabe et al, 2009; Yang et al, 2011), Glis3 является также ключевым транскрипционным фактором beta клеток, который важен для нормальной функции beta клеток и поддержания их массы у взрослых.
