Самые ранние классификации нейральных опухолей впервые предположили связь между морфологией опухоли и базовыми механизмами нейрального развития [1]. Десятилетиями исследователи выясняли значимые корреляции между гистологией опухоли и исходом для пациента [2]. Эти наблюдения вызвали спекуляции, что аберрантные раковые процессы могут воспроизводить нормальное развитие и только недавно пути исследователей пересеклись. Пересечение базовых нейральных и раковых исследований произошло в результате наблюдений, что опухоли головного мозга могут увеличиваться за счет раковых клеток, которые напоминают нормальные neural stem cells (NSCs) [3–5], а также благодаря находкам, что подгруппы опухолей головного мозга могут возникать из разных популяций NSCs [6,7] и доступность новых технологий для анализа нормальных и злокачественных клеток на шкале генома [8].

Knitting a nervous system

Зрелая ЦНС представлена тремя основными типами клеток: нейронами, астроцитами и олигодендроцитами. Эти клетки возникают из стволовых клеток и клеток предшественников, происходящих из нервной трубки [9]. Морфологически большинство клеток опухолей головного мозга напоминают эти три базовых нейральных типа.

Ранняя зародышевая зона ЦНС включает одиночный слой нейроэпителия, а ‘псевдостартифицированное’ проявление этого нейроэпителия продуцируется процессом, называемым интеркинетическая миграция ядер, при этом ядра нейроэпителиальных клеток подвергаются апикально-базальному ‘подъему’ синхронно с состоянием их клеточного цикла [10]. Эти нейроэпителиальные клетки подвергаются симметричным делениям, чтобы увеличить общее количество доступных клеток предшественников [11].

По ходу нейрогенеза происходит переход нейроэпителиальных клеток в радиальную глию radial glia (RG). Считалось первоначально, что они служат исключительно для поддержки миграции, RG сегодня стаются как принципиальные нейральные стволовые клетки в ЦНС [12]. RG делятся асимметрично во время нейрогенеза, давая одну дочернюю RG клетку, идентичную родительской (само-обновление), а также более ограниченную клетку предшественник, предназначенную давать или нейроны или глию [9]. RG обладают некоторыми ключевыми эпителиальными свойствами, включая слипчивые соединения и полярность (имеют апикальную сторону, обращенную в направлении боковых желудочков и базальную сторону, обращенную в направлении к поверхности мягкой оболочки), но теряют свои апикальные свойства, такие как плотные соединения. RG обладают также свойствами астроглии, включая экспрессию маркеров, ассоциированных с астроцитами, таких как GLAST (glutamate transporter), BLBP (brain-lipid-binding protein) и на ультраструктурном уровне приобретают гранулы гликогена, характерный признак астроцитов [11]. RG держат тела своих клеток в вентрикулярной зоне, по соседству с вентрикулярной системой и также подвергаются интеркинетической ядерной миграции внутри этой области.

Существует несколько др. известных зародышевых типов клеток внутри развивающейся ЦНС, которые имеют особое значение для опухолей головного мозга. Промежуточные предшественники в коре головного мозга происходят из RG и , как полагают, функционируют как механизм умножения, увеличивая общую способность продуцировать нейроны [13]. Промежуточне предшественники отслаиваются от вентрикулярной зоны, при этом тела нейральных стволовых клеток обнаруживаются обычно расположенными в соседней subventricular zone (SVZ). Они обладают ограниченным пролиферативным и дифференционным потенциалом, оказываясь способными только к самообновлению за счет немногих симметричных делений перед терминальным делением, которое продуцирует два дочерних нейрона. Granule neurone precursors (GNPCs) мозжечка продуцируют наиболее многочисленный подтип нейронов головного мозга, мозжечковые гранулярные нейроны. Во время развития мозжечка GNPCs мигрируют из верхней ромбической губы, чтобы сформировать вторую зародышевую зону, известную как external granular layer (EGL), который покрывает поверхность мозжечка [14]. GNPCs продолжают пролиферировать постнатально, позволяя пулу предшественников расширяться для предетерминированного размера, прежде чем начать дифференцировку и мигрировать внутрь, чтобы сформировать внутренний гранулярный слой. Как указывалось выше, GNPCs являются установленными клетками источником Sonic Hedgehog (SHH)-подгруппы медуллобластомы [15–17]. Напротив, нейральные предшественники, происходящие из нижнего ромба, которые мигрируют из дорсальной части ствола головного мозга, чтобы заселить ядра вентральной части ствола мозга, где, как было установлено, они генерируют Wingless (WNT)-подгруппу медуллобластомы [7,18].

Location matters

Хотя в ЦНС может быть распознана базовая иерархия NSCs, RG, детерминированных предшественников и дифференцированных клеток, эти популяции клеток обладают существенным региональным разнообразием. Этого можно ожидать, принимая во внимание значительное разнообразие зрелых тканей, которые существуют в разных частях нервной системы; однако лишь недавно были открыты некоторые клеточные механизмы, которые лежат в основе этих различий. Напр., NSCs в разных частях ЦНС обнаруживают существенную изменчивость в своих транскриптомах. потенциале и чувствительности к ростовым факторам [6,19]. Эти различия частично достигаются с помощью ряда клеточно автономных и неавтономных механизмов, включая эпигенетическую регуляцию и внешние сигналы, такие как факторы роста, морфогены и цитокины [20]. Эти регуляторные процессы многоуровневые на вершине базовая структура из иерархии стволовых клеток и клеток предшественников создает громадный объем для контроля за принятием решений о судьбах клеток, тем самым объясняя ряд биологических исходов, возможных из относительно небольшого числа сигнальных путей. Изучение альтераций в опухолях головного мозга в контексте этих нормальных парадигм развития, создает огромные перспективы для всестороннего понимания туморогенеза [8].

Brain tumour real estate

Если нормальная нервная система обладает региональными различиями в потенциале развития. то возможно, что разрушение этих топологически дискретных активностей будет приводить к сайт-специфической, межопухолевой гетерогенности? Этот вопрос стал фокусом наших исследований последних лет.

Чтобы очертить подгруппы эпендимом и их онкогенных двигателей, мы сначала определяли профили ДНК copy number alterations (CNAs) и профили экспрессии мРНК и miRNA в 83 эпендимомах [6]. Этот подход позволил разделить опухоли на 9 подгрупп по локализации в ЦНС. Интеграция ДНК и мРНК профилей выявила 17% (n = 107/632) генов внутри оцененных и периодических фокальных ампликонов (в среднем, 150 kb), это предоставляет доказательства CNA-управляемой экспрессии, указывая на них как на кандидатов онкогенов, тогда как 18% (n = 130/728) генов внутри рассмотренных и повторяющихся фокальных делеций (менее 200 kb) обнаруживает CNA-управляемую пониженную экспрессию, сравнимую с той, что вызывается tumour suppressor genes (TSGs). Поскольку эти кандидаты включают небольшое количество известных онкогенов и TSGs, напр., NOTCH1 и INK4A/ARF, многие не были отмечены участием в канцерогенезе, и включают известные регуляторы обновления и детерминации судеб нейральных стволовых клеток, напр., THAP11 [21], PSPH [22], EPHB2 [23], RAB3A [24,25] и NOTCH1 [26]. Специфичное для подгрупп обогащение некоторых CNAs, напр., амплификация EPHB2 и делеция INK4A/ARF в церебральных эпендимомах, подтверждает мнение, что эти отклонения управляют нгенезом специфических подгрупп опухолей.

Чтобы протестировать, могут ли эмбриональные клетки RG и взрослые NSCs быть клеточным источником эпендимомa [27], мы выделяли NSCs [помощью Green Fluorescence Protein (GFP) метки] из головного мозга, заднего мозга и спинного мозга на эмбриорнальный день (E) 14.5 и у взрослых Blbp–eGFP трансгенных мышей [28,29]. Иммунофенотипирование, методы самообновления и профили экспрессии мРНК позволили выделить 177 отдельных культур NSC в соответствии с местоположением, стадией развития и статусом Ink4a/Arf (нулевой или дикого типа; выбран из-за его частого делетирования в опухолях головного мозга) [6]. Чтобы установить, какие из этих вариантов NSC могут давать подгруппы эпендимом, мы разработали новаторский алгоритм, названный agreement of differential expression (AGDEX), чтобы выявлять сходства транскриптомов между тканями от разных видов [30]. AGDEX подогнан к эпендимомам головного мозга человека с эмбриональными Ink4a/Arf-/- NSCs головного мозга и к эпидимомам спинного мозга со взрослыми спинномозговыми NSCs (n = 14 261 ортологов, permuted P менее 0.05), он подтвердил, что NSCs являются клетками источниками для соотв. опухолей (Figure 1). Наконец, мы тестировали будет ли AGDEX предсказывать, что эмбриональные cerebral Ink4a/Arf^-/-NSCs (cNSC) головного мозга является специфическим источником эпендимом головного мозга путем введения в эти клетки ретровируса EPHB2-red fluorescence protein (EPHB2RFP) , поскольку EPHB2 избирательно амплифицируется в этих опухолях [6]. Болшинство мышей (n = 18/26; 70%) , которым имплантированы эти клетки, давали классические эпендимомы (названные mEPEPHB2). Это контрастирует с отсутствием опухолей в контроле (n = 120) или с др. типами NSC с введенным EPHB2RFP (n = 94) [6]. AGDEX анализ подтвердил высоко достоверное и избирательное соответствие между транскриптомом mEPEPHB2 и только одной из 9 подгрупп эпендимом человека (церебральный подтип-D). Т.о., целенаправленные мутации в специфической популяции NSC предоставляют средство для разработки аккуратных мышинных моделей подгрупп эпендимом.

Figure 1. Brain tumour subgroups have distinct developmental origins. Cartoon depicting the potential cells-of-origin recently described for supratentorial (ST), posterior fossa (PF) and spinal (SP) ependymoma. Gross regional distribution of originating cells is shown in A. B and C show details of combinations of cells and mutations that generate subgroups of ependymoma and medulloblastoma. LRLP, lower rhombic lip progenitor. Other abbreviations are as in the text.

Параллельные исследования позволили нам сделать сходные наблюдения на медуллобластомах (Figure 1). И снова, гетерогенность опухолей, наблюдаемая на транскрипционном уровне подразделяет мудуллобластомы на самостоятельные подгруппы [31]. Перекрестный анализ выявил тесное сходство между транскриптомами этих погрупп опухолей и их предшественниками в разных регионах развивающегося мозжечка и заднего мозга [7], подтвердив гипотезу, что подобно эпендимомам подгруппы медуллобластом возникают из разных клеточных популяций. В самом деле, данные нашей группы и др. показали, что SHH, WNT и подгруппа-3 медуллобластом возникают соотв. из детерминированных GNPCs [16,17], предшественнриков нижней ромбической губы [7] и ещё неидентифицированной популяции предшественников мозжечка [16,32,33]. Важно, что эти исследования, также как и недавнее элегантное отслеживание глиом yfмышиных моделях [34], показали, что NSCs могут приобретать мутации, которые могут не трансформировать клетки вплоть до поздней стадии в этом клоне. Т.о., детальное понимание иерархии нормального развития необходимо, если мы хотим выяснить источники всех типов опухолей головного мозга.

Итак. эти находки указывают, что определенные подгруппы опухолей голоного мозга скорее всего инициируются в регионально и онтогенетически дискретных иерархиях нейронов, поскольку клетки пытаются преодолеть препятствие при переходе от мультипотентности к терминальной дифференцировке. Подобно своим родителям NSCs, аберрантные дочерние клетки из опухоли головного мозга могут оказаываться компартментализованными и испытывать влияние со стороны специфических локальных сигналных путей, которые без соотв. контроля впадают в непринужденную пролиферацию. Можно предположить, что эти злокачественные стволовые клетки, отлавливаемые на ранних стадиях развития, неспособны созревать за границы своего текущего состояния, тогда как они приобретают опасный потенциал роста. i

Мы уделим немного времени в этом обзоре обсуждению раковых стволовых клеток cancer stem cells (CSCs), похожим на стволовые раковым клеткам, которые способны к аберрантному самообновлению и болезненному распространению и обитают в околососудистых нишах, сходных с теми, в которые оккупируют NSCs в нормальном головном мозге [3,5,35]. Эти CSCs стали фокусом интенсивных исследований и споров [36,37]. Однако, необходимо отметить (i) что существование CSCs внутри опухолей не означает, что опухоли происходят из стволовых клеток; и (ii) что отсутствие CSCs непременно указывает на возникновение не из стволовых клеток. Единственно тщательная характеристика нормальных и злокачественных иерархий в целых животных моделях скорее всего предоставит четкую информацию о связи между нормальными стволовыми клетками и их злокачественными аналогами.

The promise of better therapies

Усовершенстования в хирургическом, радиационном и химиотеерапевтическом удалени опухолей привели к существенному уменьшению смертности детей с опухолями головного мозга к сердеине 1990s; но затем прогресс в основном остановился [38]. Почему? Одной из беспорных причин является наша неспособность ставить гистологические диагнозы опухолей головного мозга, напр., медуллобластом, как несколько самостоятельных сущностей или подгрупп. Поскольку опыт по патологии и биологии говорит нам, что один диагноз опухоли может включать разные заболевания, наш клинический опыт ещё только приближается к этому мнению. Но как может быть наш опыт принят без способа открытия и применения специфичной для субгрупп терапии? Базирующиеся на развитии аккуратные мышиные модели опухолей головного мозга могут предоставить мощные средства для преодоления этого тупика.

Наша первая мышиная модель эпендимомы в точности воспроизводит гистологию и транскриптом одной формы эпендимом головного мозга человека (подгруппа D), что делает ей привлекательным инструментом для разработки лечения для этой специфической группы пациентов, а также для понимания сигнальных путей, важных для поддержания болезни [6]. Далее, т.к. наши модели генерируются из специфических типов NSCs, мы также способны тестировать, является ли предлагаемая терапия токсичной для тесно связанных нормальных типов клеток. Используя эту модель, мы недавно описали интегрированный, мультиплатформенный in vitro и in vivo высокопроизводительный скрининг high-throughput screen (HTS) эффективности лекарств. Этот комплексный подход идентифицировал несколько новых терапевтических кандидатов для клинической разработки, включая опухолевые селективные агенты, а также предоставил новую информацию о биологии эпендимом. Благодаря комбинации ингибирования роста и kinome-wide метода связывания, наше исследование также продемонстрировало, что ингибиторы сигнального пути рецептора Insulin Growth Factor и цикла центросом, напр., ингибиторы PLK1, являются очень мощными против подгруппы-D эпендимом. Эти киназы ранее не были замечены, как участвующие в биологии эпендимом.

Помимо идентификации киназ, важных для поддержания эпендимом, наше исследование подчеркивает значение HTS для разумного перепрофилирования существующих противоопухолевых лекарств. repurposing existing anti-cancer drugs. HTS скрининг идентифицировал 5-Fluorouracil (5-FU) и два близкородственных соединения как высоко избирательные и мощные ингибиторы эпендимом подгруппы-D. Более того, этот потенциал и избирательность были подтверждены in vivo. 5-FU никогда не тестировался формально у пациентов с эпендимомами и сегодня проходит Фазу 1 лечения в виде bolus вливаний в St. Jude Children's Research Hospital у детей с такой опухолью.

Сегодня мы используем ту же самую методологию для осуществления HTS скрининга специфичных для подгруп моделей медуллобластом, эпендимом и карцином хороидного сплетения. Эта батарея моделей д. позволить нам завершить многочисленные одиночные и множественные лекарственные преклинические испытания, которые позволят перейти к клиническим испытаниям. Преклинические стратегии внушают надежду на идентификацию и приоритизацю терапии для рациональных клинических испытаний на пациентах со специфическим подтипом рака.

Developmental origins of neural tumours: old idea, new approachesT. N. Phoenix, D. S. Currle, G. Robinson, R. J. Gilbertson Neuropathology and Applied Neurobiology Special Issue: Molecular pathways to neural tumors in mouse and man Volume 38, Issue 3, pages 222–227, June 2012

Developmental origins of neural tumours: old idea, new approaches
T. N. Phoenix, D. S. Currle, G. Robinson, R. J. Gilbertson
Neuropathology and Applied Neurobiology Special Issue: Molecular pathways to neural tumors in mouse and man Volume 38, Issue 3, pages 222–227, June 2012