Heparan sulfate (HS) является многосторонним и важным компонентом клеточной поверхности и matrix-associated proteoglycans (HSPGs) (Bernfield et al., 1999). Благодаря своей специфической химии и высокому негативному заряду цепочки HS могут соединяться сразными белками, включая ростовые факторы, сигнальные белки, интегральные мембранные рецепторы, хемокины и внеклеточные матриксные белки (Hacker et al., 2005; Bishop et al., 2007). Исследования показали, что. в частности, HS цепочки вносят вклад в протегликаны с ключевой способностью регулировать распределение и доступность ростовых и сигнальных белков и соотв. их взаимодействиями, функцией и биоактивностью на клетки мишени (Bernfield et al., 1999; Lin,2004; Umulis et al., 2009). Поскольку многие из этих белков, включая членов семейств hedgehog, bone morphogenetic protein (BMP), fibroblast growth factor (FGF) и Wnt, экспрессируются в ростовой пластинке (Kronenberg, 2003), ясно, что HS влияют на многие важные процессы скелетогенеза и скелетного роста и морфогенеза. Мыши, дефицитные по Ext1, важному энзиму полимеризации HS, обнаруживают измененные паттерны диффузии Indian hedgehog (Ihh), увеличение диапазона передачи сигналов и приводят к достоверным изменениям в морфологии ростовой пластинки (Koziel et al., 2004; Hilton et al., 2005). N-sulfotransferase 1 (Ndst1) др. критический энзим сборки HS, определяет паттерны тканеспецифичной sulfation путем замещения ацетильных групп на sulfate модификации. Потеря Ndst1 также вызывает тяжелые изменения в распределении Hedgehog и функции ростовой пластинки (Yasuda et al., 2010). Важность цепочек HS и HSPGs в скелетогенезе подтверждается тем фактом, что имеются несколько скелетных и черепно-лицевых фенотипов, связанных с генетическими мутациями в HS-синтезирующих и модифицирующих энзимах и в экспрессии HSPG (Bishop et al., 2007). В случае hereditary multiple exostoses (HME), аутосомно-доминантного нарушения у детей,ри которых разрастания хрящей. наз. экзостозами, формируются рядом с ростовой пластинкой скелетных элементов, таких как длинные кости, ребра и таз и выпячиваются в соседнюю надхрящницу и соседние ткани (Porter and Simpson, 1999; Hecht et al., 2005). В свою очередь экзостозы могут вызывать деформации скелета, хронические боли и остеоартриты с ранним началом, помимо др. разнообразных патологических событий (Dormans, 2005; Jones, 2011). HME, также наз. множественной остеохондрома (MO) или multiple hereditary exostoses (MHE), встречаются 1 на 50,000 детей и имеют 100% пенетрантность. Большинство случаев HME вызывается мутациями потери функции в EXT1 и EXT2, которые кодируют Golgi-associated glycosyltransferases. После того как некоторые др. энзимы создают сцепление tetrasaccharide с остатком серина стержневого белка, Ext1 и Ext2 коллективно оказываются ответственными за полимеризацию HS цепей (Esko and Selleck, 2002). Количество и тип EXT мутаций многочисленны и приводят к разной степени дефицита HS (Jennes et al., 2009). Пока не совсем понятно, ведет ли и как дефицит HS к образованию экзостозов, может ли он объяснить все разнообразные симптомы и осложнения синдрома и может ли он использоваться для терапии. Несколько недавних исследований сообщили попытках расшифровки возможных ролей дефицита HS на образование экзостозов и патогенез HME в целом, и предоставили также намеки на генез др. осложнений болезни.

HME Pathology and Population Studies

HME характеризуется преимущественно ортопедическими проявлениями. Экзостозы наиболее характерный признак синдрома и представлен похожими на ростовую пластинку хрящевые шапочки, покрывающие основания костей (Fig. 1) (Jones, 2011). Из-за их локализации, размера, количества и взаимодействий, экзостозы могут вызывать: сдавления нервов, кровеносных сосудов и сухожилий с последующими болями и нарушениями подвижности; деформации и задлержки роста скелета вмешиваются в нормальную функцию ростовых пластинок; и ведут к остеоартритам с ранним началом (Fig. 2A,B). Пациенты с HME часто обнаруживают уменьшенный рост изгибание и укорочение элементов предплечья, изменения угла наклона (angulations) коленей и пальцев и неравенство длины конечностей. Предыдущие гипотезы предполагали, что экзостозы растут вдоль костей предплечья, изменяя их форму и внося "steal phenomenon", который вызывает укорочение костей. Однако, недавние эксперименты не обнаружили изменений общего объема кости и не выявили корреляций между укорочением предплечья и присутствием остеохондромы. Эта работа показала, что потеря HS может быть важной для управления соотношением между периферическим и продольным ростом (Jones et al.,2013). экзостозыц могут также иногда появляться в черепно-лицевых элементах, таких как нижняя челюсть (Ruiz and Lara, 2012). Хронические боли и ограничения активности являются наиболее распространенными следствиями болезни. Недавние исследования с Нидерландах выявили достоверно более низкий результат физического функционирования и роли ограничений, социального функионирования, жизнеспособности, боли и в целом ощущении здоровья у пациентов с HME по сравнению с тремя отдельными контрольными группами (Goud et al., 2012). К сожалению, из-за этих симптомов и трудности прогресса, пациенты д. подвергаться хирургическому вмешательству, при этом 70% пациентов подвергается операциям когда они достигают 18 летнего возраста. У детей, хирургическое вмешатесльство может быть опасным,. может вызывать необратимые повреждения соседней ростовой пластинки. Хотя новые экзостозы не появляются после половой зрелости, когда ростовая пластинка закрывается, существующие экзостозы могут продожать рост и вызывать дальнецшие боли и осложнения, приводя к хирургическим вмешательствам у 67% взрослых (Goud et al., 2012). Figure 1. Figure 2.

Одним из потенциально серьёзных осложнений HME является трансформация доброкачественных экзостозов в злокачественные хонрдросаркомы, приблизительно у 2- 5% пациентов (Fig. 2C,D). Для пациентов, чьи экзостозы подвергаются злокачественно дегенерации, средний возраст постановки диагноза 35 лет, т.е. моложе, чем для пациентов сHME в целом (Bjornsson et al., 1998). Др. серьезным осложнением HME является образование экзостозов на поверхности позвонков, которые сдавливают спинной мозг или корешки нервов (Fig. 2E,F). Сдавление спинного мозга, обусловленное экзостозами проявляется как двигательный и сенсорный дефицит, включая нарушения походки, слабость или онемения, увеличение рефлекторных реакций и спастичность, и несдержанность (Bari et al., 2012; Zaijun et al., 2013). Экзостозы позвонков могут также воздействовать на пищевод, нарушая нормальное глотание (Perrone, 1967).Кроме того, экзостозы на поверхности позвонков и ребер могут влиять на функцию легких и обычно приводящие к немеделенному хирургическому вмешательству (Assefa et al., 2011).

Интересно, что хотя продукция HS у HME пациентов слегка снижена во всех тканях, но единственным настоящим проявлением и диагностическим фенотипом являются сами экзостозы. Однако, как указывадось выше, пациенты HME могут страдать от различных менее очевидных проблем, которые могут включать задержку в заживлении ран, нестабильность обучения, проблемы с зубами и др. (Hosalkar et al., 2007; Wiweger et al., 2012). Такая клиническая и биохимическая сложность, хотя всё ещё недостаточно изучена и ясна, но определенно связана с тем фактом. что HSPGs регулируют многочисленные, если не большинство, физиологических процессов в растущем и взрослом организме. Т.о., общий недостаток HS может и должен иметь широкие и распространенные последствия, тяжесть которых д. отражать специфическую важность и роли, которые HS и HSPG играют в разных тканях и органах, в разных биологических контекстах и процессах (Bishop et al., 2007).

HS Synthesis and HME Genetics

HS составляет часть гликозаминогликанов, тех что на клеточной поверхности и матричных протеогликанов, таких как syndecans, glypicans и perlecan (Bernfield et al., 1999). Цепочки HS состоят из повторяющихся остатков D-glucuronic acid (GlcA) and N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), которые собираются в линейные полисахариды с помощью биосирнтетического процесса, включая инициацию, элонгацию и ступени модификаций. Синтез начинается в эндоплазматическом ретикулуме путем добавления xylose к остатку серина в протеогликановом стержневом белке с помощью xylosyltransferase. Компановка тетрасахарида завергается в аппарате Гольджи путем добавления двух остатков галактозы и глюкуроновой кислоты, с помощью galactyltransferases I и II and glucuronosyltransferase I, соотв. Элонгация HS затем осуществляется ступенчатообразно с помощью ассоциированных с Гольджи гетеродимерных комплексов из EXT1 и EXT2, которые повсеместно экспрессируют типа-II трансмембранные гликопротеины (Esko and Selleck, 2002). Оба белка и экспрессия обоих аллелей необходимы для продукции и поддержания нормальных фмзиологических уровней и гомеостаза HS. Во время сборки синтезируемые цепочки подвергаются значительным модификациям, которые включают N-деацетилирование и N-сульфатирование, эпимеризацию и O-сульфатирование, требующие нескольких ферментативных реакций и осуществляютх ряд структурных изменений HS отличающихся между и внутри тканей, которые обеспечивают структурную и белок-связывающую специфичность (Bulow and Hobert, 2006).

EXT1 и EXT2, первоначально рассматривались как гены опухолевых супрессоров, они являются частью семейства EXT белков, которые также включают EXTL (exostosin-like) членов. Последние белки участвуют также в синтезе HS, включая добавление первого углеводного остатка к тетрасахаридному сцеплению (Kitagawa et al., 1999; Kim et al., 2001; Busse et al., 2007; Okada et al., 2010). Мутации или в EXT1 или в EXT2 ответственны за ~ 90% случаев HME, при этом большинство (~65%) связано с EXT1, белком предположительно обладающим ферментативной активностью в комплексе EXT1/EXT2 (EXT2 играет структурню роль и может также облаать функцией шаперона) (McCormick et al., 1998). Кстати, более 650 уникальных мутаций было установлено в этих двух генах, большинство из которых были бессмысленными, сдвига рамки считывания или мутациями сплайс-сайтов (Jennes et al., 2009; Ciaverella et al., 2012). Эти инактивирующие мутации приводят к преждевременному окончанию EXT белков, вызывая преждевременную деградацию и почти полную потерю функции (Wuyts and Van Hul, 2000). Совсем недавно на семье пациентов с негативными EXT1 или EXT2 мутациями было показано присутсвие интронных перестроек внутри первого интрона EXT1, подтверждая возможный механизм возникновения HME, который не был выявлен с помощью обычной диагностической техники (Waaijer et al., 2013).

Несколько исследований было проведено с целью выявления взаимоотношений между генотипом и фенотипом, но не были подтвержены пока подобные взаимоотношения. Интересно, что имеется широкий спектр вариабельности в проявлении болезни в семьях и между индивидами с одной и той же мутацией, это указывает на доплнительные генетические, гормональные или средовые влияния на спецификацию и тяжесть фенотипа. Однако некоторые общие корреляции были установлены в некотоых популяционных исследованиях HME. Связанные с её ферментативной функцией EXT1 мутации коррелирую с более тяжелыми проявлениями болезни (Francannet et al., 2001; Porter et al., 2004). Кроме того, мужчины обычно обнаруживают более тяжеые клинические проявления, которые, как полагают, вызываются более поздним закрытием ростовой пластинки, что дает больше времени для образования экзостозов. Соотв., пациенты с большим количество экзостозов (боле 20) обычно имеют большую функциональную недееспособность и деформации (Alvarez et al., 2006; Pedrini et al.,2011).

Animal Models of HME

Образование скелнетных элементов черепа, уловища и конечностей начинается с формирования экто-мезенхимных и мезенхимных клеточных конденсайций в определенное время и месте. Некоторые конденсаты, расположенрные в регионе черпа подвергаются внутримембранозной оссификации и продуцируют скелетные элементы, такие как свод черепа и челюсти. Оставшиеся и более многочисленные конденсации подвергаются эндохондральной оссификации, во время которой сконденсированные мезенхимные клетки дифференцируются в хондроциты и оказываются организованными в ростовые пластинки, тесно окруженные перихондральными тканями. хондроциты ростовой пластинки пролиферируют, подвергаются гипертрофии и замещаются эндохондральной костью и костным мозгом, тем самым поддерживается рост скелета вплоть до конца половго созревания и продуцируются определенные скелетные элементы по всему телу, которые включают ребра, позвонки и длинные кости (Kronenberg, 2003). Как подчеркивалось выше, хондроциты ростовой пластинки экспрессируют HSPGs как клеточной поврехности, так и ассоциированные с матриксом, включая syndecan-3, glypicans-5 и perlecan, которые необходимы для функции, включая регуляцию распределения ростовых факторов и действи и взаимоотношения ростовой пластинки с окружающими тканями и особено важно с надхрящницей (Arikawa-Hirasawa et al., 1999; Viviano et al., 2005; Habuchi et al., 2007; Yasuda et al.,2010). Экзостозы обнаруживают интригующую организацию, сходную с ростовой пластинкой, в которой их основная ось элонгации находится приблизительно под углом в 90° по сравнению с соседней нативной ростовой пластинкой. Понимание роли HS и HSPGs в ростовой пластинке поэтому является важным для выяснения процессов формирования экзостозов и последующего их роста, но никогда внутрь ростовой пластинки, а выпячиваются в нажхрящницу и окружающие ткани.

Некторые модели на рыбках данио были оценены в отношении изменений HSPGs и их эффектов на развитие хряща. HS цепочки и наблюдаемый тяжелый хрящевой фенотип с дезорганизованными клетками, которые неспособны уплощаться и интеркалировать в стеки (stacks) и теряют экспрессию collagen type X. Однако эти клетки способны экспрессируровать маркеры как ранних хондроцитов, так и надхрящницы, указывая тем самым, что они способны формировать компоненты экзостозов. Интересно, что мутанты pinscher (pic/slc35b2) обладают даже более тяжелым фенотипом с утолщениями надхрящницы и снижением отложения матрикса. Pic мутанты неспособны транспортировать доноры сульфата в Гольджи и продуцируют лишеные сульфата GAGs (включая keratan sulfate и chondroitin sulfate). Это демонстрирует необходимость цепочек GAG для поддержания собственно фенотипа и морфологии хондроцитов и клеток надхрящницы (Wiweger et al., 2011). Трансплантационые эксперименты показали, что большинство dak мутантных клеток может быть восстановлено с помощью окружающих клеток дикого типа, возвращая собственно уплощенный и интркалируемый фенотип. Однако, эти клетки изредка растут из краев развивающегося хряща, ориентируясь перпендикулярно по отношению клеток дикого типа; этот рост воспроизводит развивающиеся экзостозы у людей, которые постоянно образуются по бокам ростовой пластинки, распространяясь в надхроящницу. Эта модель подтверждает, что расположение мутантных клеток внутри хрящевых элементов может диктовать их чувствительность к изменениям в распределении факторов роста или способность контактировать с соедними клетками дикого типа (Clement et al., 2008).

В течение последней декады были разработаны некоторые модели HME на млекопитающих, чтобы понять патогенез экзостозов и роль HS в нормальном развитии скелета млекопитающих (Table 1). Ext1-нулевые мыши являются эмбриональными леталями на E8.5 день эмбриогенеза, указывая на существенное значение HSPGs для поддержания и регуляции критических стадий развития (Lin et al.,2000). В самом деле, со ст. E10.5, экспрессия Ext1 становится довольно заметной в развивающихся зачатках конечностей (Stickens et al., 2000). Интересно, что мыши гетерозиготные по нулевому аллелю Ext1, первоначально созданные как модель HME, как было установлено, ведут себя в основном нормально и лишены основных скелетных фенотипических отклонений (Hilton et al., 2005). Однако после более тщательной проверки их ростовых пластинок выявлены едва заметные изменения, включая увеличение экспрессии collagen type II, снижение экспрессии collagen type 10a1, и усиление включения BrdU в пролиферативную зону, всё это в целом подтверждает изменение пролиферации хондроцитов и паттерна созревания. Поскольку общая длина костей конечностей у взрослых мутантных мышей была сходна с таковой у мышей дикого типа, то было предположено, описанные выше эффекты дефицита Ext1 и HS должны компенсироваться со временем (Hilton et al., 2005). Мыши, лишенные Ext2, были также эмбриональными леталями и эмбрионы действительно были неспособны подвергатьтся гаструляции, как и в случае разрушения нескольких сигнальных путей, критических для развития мезодермы и формирования внеэмбрональных структур (Stickens et al., 2005). Гетерозиготные нулевые Ext2^+/- мыши обнаруживают нарушения в ростовой пластинке, сходные с теми, что и у их аналогов Ext1+^/-, с дезорганизацией пролиферативной зоны и изменениями доменов экспрессии Ihh. Существенный интерес представляет тот факт, что небольшой процент Ext2^+/- мышей формирует небольшие похожие на экзостозы выросты вдоль ребер вблизи костно-хрящевого соединения, подтверждая идею, что частичная потеря функции Ext и продукции HS может быть достаточной для формирования экзостозов (Stickens et al., 2005).

Table 1. Summary of Current Models of EXT Deficiency in Mice

Интересно, что уровни HS, наблюдаемые после хирургического исправления хрящевых экзостозов у людей были обнаружены очень низкие и явно ниже, чем 50% уровни, по-видимому, вызываемые одиночными гетерозиготными EXT мутациями (Hecht et al., 2005). Потерей гетерозигогтности можно объяснить столь низкие уровни HS, но LOH в действительности выявлен лишь в немногих случаях (Bovee et al., 1999), хотя это может быть заниженным из-за смешанной природы клеток внутри экзостозов (Jones, 2011). Т.о., возможно, что вторичные мутации в др. HS-родственных генах, действие деградирующих HS энзимов, таких как heparanase (Trebicz-Geffen et al., 2008), или др. механизмов могут играть роль в дальнейшем снижении уровней HS. Чтобы протестировать эту идею, мы создали и проанализировали двойных нгетерозиготных Ext1^+/-;Ext2^+/- мышей (double hets) (Zak et al., 2011). Поскольку полный набор Ext белков, необходимых для нормальных уровней синтеза HS, предсказывает, что эти компаундные мыши должны иметь достоверное снижение уровней HS (~ 25%) по сравнению с одиночными мутантными гетерозиготами (~ 50%) и диким типом (100%). В самом деле, мы обнаружили, что добавление к развивающимся подобным экзостозам выростам на ребраз у одиночных Ext2^+/- гетерозиготных мышей, почти половина компаундных Ext1^+/--; Ext2^+/- мутантов имела стереотипические экзостозы рядом с ростовыми пластинками длинных костей. Экзостозы обнаруживали расположение зоны хондроцитов подобное ростовой пластинке с типичными паттернами экспрессии маркеров зоны, таких как Sox9, collagen type II, Indian hedgehog (Ihh) и collagen type X. Уровни HS в ростовых пластинках и экзостозах таких мышей были достоверно снижены по сравнению с таковыми для сибсов дикого типа, как показывает иммуноокрашивание, HS цепочки, которые были продуцированы хондроцитами культивируемых компаундных мутантов были короче тех, что продуцировались хондроцитами дикого типа. Мы также получили доказательства реакции хондроцитов на факторы роста, важные для нормального развития скелета (Zak et al., 2011). Эти фенотипы строго подтверждают идею, что существенная, но не оязательно полная, потеря экспрессии Ext и продукции HS достаточна для образования мноржественных стереотипических экзостозов. Т.о., очевидно, что инициация экзостозов и частота обратно связаны с общим уровнем экспрессии Ext, а функция и увеличение почти линейны у WT в противоположность одиночным гетерозиготам и двойным гетерозиготам. Эти находки могут объяснить широкие пределы тяжести фенотипов, наблюдаемых у HME пациентов, у кот. функция белка EXT и продукция HS могут варьировать в зависимости от природы EXT мутаций и др. сопутствующих генетических модификаций.

Др. мышиные модели HME предоставили дополнительную информацию о патогенезе экзостозов и роли HS в нормальном развитии ростовой пластинки. Гипоморфная, gene-trapped Ext1^Gt/Gt линия мышей, экспрессирующая укороченную форму Ext1 обнаруживает укороченные скелетные элементы и слитые позвонки на ст. E15.5 (Koziel et al., 2004). Эти изменения сопровождались усилением распределения и передачи сигналов Ihh внутри ростовой пластинки и задержку гипертрофической дифференцировки, подкрепляя идею, что экспрессия Ext и продукция HS необходимы для регуляции действия и распределения сигнальных белков внутри ростовой пластинки. Постнатальная, химерная и условная инактивация Ext1 в хондроцитах ростовой пластинки мышей, как было установлено, ведет к образованию многочисленных экзостозов по всему добавочному скелету, демонстрируя, что полная потеря Ext ведет к формированию агрессивных экзостозов (Jones et al., 2010). Кондиционная делеция Ext1 из мезенхимы конечностей с использованием Prx1-Cre трансгенных мышей вызывает тяжелые дефекты скелета конечностией, включая слияние суставов и варьирующие количества развивающихся пальцев. Эти эффекты были, по крайней мере, частично приписаны более широкому и нефизиологическому распределению BMPs и активности передачи сигналов BMP к мишеням (Matsumoto et al., 2010).

HS and Signaling Proteins

Приведенные выше исследования четко показывают, что HS и HSPGs являются критическими для детерминации и контроля распределения сигнальных белков, границ их действия и эффектов, оказываемых на их мишени. Они объясняют также, что дефицит HS может иметь выраженное влияние на эти механизмы и может непосредственно вносить вклад в патологические изменения. Взаимодействия между ростовыми факторами и HS были тщательно исследованы во многих органных системах, типах клеток и in vivo сценариях. Одной из главной общей информацией, полученной в этих работах является то, что эти взаимодействия и взаимоотношения контекстуально зависят и могут специфически варьировать в зависимости от стадии развития ткани или органа, типа участвующих клеток, присутствия др. системных и локальных факторов и т.д. (Rider and Mulloy, 2010). Одним из хорошо охарактеризованных взаимодействий HS является взаимодействие с одним из членов семейства fibroblast growth factor (FGF). В этом отношении, HS наиболее часто необходим для эффективной сигнальной трансдукции, т.к. он действует как ко-рецептор FGF (Hacker et al., 2005). На ранней стадии Ext2 нулевые эмбрионы фактически не отвечают на передачу сигналов FGF, тем самым объясняется их ранний эмбриональный летальный фенотип (Shimokawa et al., 2011). Фибробласты, полученные от Ext1^Gt/Gt мышей. обнаруживают пониженные количества HS на клеточной поверхности, как и ожидалось, и, кроме того, обнаруживают снижение передачи сигналов в ответ на FGF2 и последующее снижение пролиферации после стимуляции факторами роста (Osterholm et al.,2009).

Передача сигналов Hedgehog является др. важным регулятором развития осевого скелета и скелета конечностей. Поскольку первичные реснички в основном ответственны за этот путь передачи сигналов, то имеются существенные доказательства, что они также важны для развития скелета (Huangfu and Anderson, 2005). Кондиционная делеция компонента первичных ресничек Kif3a в хондроцитах ведет как аномалиям скелета коненостей, так и черепа, включая похожие на экзостозы хрящевые массы, формирующиеся возле ростовой пластинки. Мы показали, что неожиданно, мутантные Kif3a-нулевые ростовые пластинки обнаруживают резкое снижение экспрессии HSPG (и в особенности syndecan-3 и perlecan) и соответственно более широкое распределени Ihh внутри ростовой пластинки и вдоль всей соседней надхрящницы. Это было связано с непосредственно вызывалось эктопической передачей сигналов hedgehog вдоль всей надхрящницы, эктопическим хондрогенезом и затем локальным образованием подобных экзостозам хрящевых масс, подтверждая роль hedgehog белков и дефектных связанных с Kif3a механизмов в формировании экзостозов также (Koyama et al., 2007). Первичне реснички были также, по крайней мере, частично ответственны за организацию хондроцитов в их столбчатые структуры, специфичные для ростовой пластинки. Доказание роли первичных ресничек в HME, это полярность, которая, как было установлено, теряется в клетках остеохондром человека, указывая на значительные изменения в клеточной адгезии и подвижности и в связанных с ними клетка-матрикс и межклеточными механизмами коммуникаций (de Andrea et al., 2010).

BMPs, подсемейство из сверхсемейства TGFβ секретируемых белков, также регулирует некоторые стадии развития скелета. Истощение HS с поверхности C2C12 клеток увеличивает биоактивность BMP2 в то же время ингибирует его интернализацию (Jiao et al., 2007). разрушение цепочек HS с помощью экзогенной heparinase также усиливает передачу сигналов pSmad1/5/8 в мезенхимных стволовых клетках человека (Manton et al., 2007). Некоторые члены как BMP так и FGF семейств экспрессируются в ростовой пластинке и/или надхрящнице и, как было установлено, участвуют в диалоговых петлях, регулирующих экспрессию Ihh и PTHrP и всю активность ростовой пластинки (Zou et al., 1997; Pathi et al., 1999). Эктопическая экспрессия Ihh вызывает изменения в экспрессии прохондрогенных BMPs, также как и анти-хондрогенных антагонистов Noggin и Chordin, изменяя дифференцировку клеток в ростовой пластинке, а также в соседне надхрящнице (Pathi et al., 1999).

Во время мезенхимных конденсаций в раннем скелетном развитии, Wnt лиганды индуцируют накопление β-catenin в цитоплазме. В свою очередь, β-catenin транслоцируется в ядро и соединяется с транскрипционными факторами, контролирующими транскрипцию нижестоящих генов, чтобы детерминировать остеогенный клон. Устранение β-catenin инициирует формирование хряща, тогда как трансгенная избыточная экспрессия передачи сигналов Wnt способствует дифференцировке остеобластов (Day et al., 2005). Wnt лиганды также соединяются тесно с HSPGs на клеточной поверхности, которые действуют, чтобы поддерживать растворимость гидрофобного Wnt и стабилизировать его активность (Fuerer et al., 2010; Kikuchi et al.,2011). Сигнальный путь Wnt/β-catenin также играет важную роль в поддержании хряща и функции ростовой пластинки (Yuasa et al., 2009). Интересно, что постнатальное устранение β-catenin в хряще вызывает образование похожих не экзостозы масс хряща из ростовой пластинки, а также в недкостнице. Кроме того, хрящевая ткань, полученная из остеохондром у HME пациентов обнаруживает мало или не обнаруживает β-catenin позитивных клеток, потенциально удлиняя продолжительность жизни экзостозов из хондроцитов (Cantley et al., 2013). Итак, получены четкие доказательства важной роли, что HS-зависимые механизмы контролируют и координируют различные функции и процессы внутри ростовой пластинки, поскольку они связаны с функционированием и действием сигнальных белков и факторов (Minina et al., 2002).

Signaling Proteins and Exostosis Initiation

Приведенные выше исследования немекают на возможность, что снижение экспрессии Ext и уровней HS и последующее увеличение распределения и действия сигнальных белков инициирует эктопический хондрогенез и образование экзостозов. Чтобы проверить эту возможность непосредственно, мы недавно осуществили исследование in vitro? в котором мы изолировали мезенхимные клетки конечности эмбриона мыши и выращивали их в хондрогенных условиях в культуре микромассивов (Huegel et al., 2013). Культуры поддерживались в отсутствии или в присутствии Surfen, малой молекулы heparan sulfate антагониста (Schuksz et al., 2008). В самом деле, воздействие Surfen вызывало дозово-зависимое увеличение в количестве Alcian blue-позитивных хрящевых узелков (Fig. 3A-C). Интересно, что узелки в культурах, обработанных Surfen, теряли свою типичную округлую, индивидуальную морфологию и сливались др. с др., демонстрируя, что узелки неспособны сохранять свою границу и окружающий их периметр обычно занимается плоскими клетками, похожими на клетки надхрящницы (Ahrens et al., 1979). РНК, выделенные из культуры микромассивов, стали предметом qPCR. Обработка Surfen четко вызывала достоверное увеличение в экспрессии характерных хондрогенных генов, включая aggrecan, collagen type II, Runx2 и Sox9, подтверждая. что потеря функции HS стимулирует хондрогеннуд дифференцировку клеток предшественников (Fig. 3D). Тот же самый эффект наблюдался, когда Ext1^fl/fl клетки зачатка конечности в культуре микромассива обрабатывали Cre-экспрессирующими аденовирусами, редуцируя тем самым экспрессию Ext и продукцию HS; эти эффекты и реакции устранялись и уменьшались добавлением BMP антогониста Noggin (not shown) (see Paine-Saunders et al., 2002). Figure 3.

Как обсуждалось ранее, HS обеспечивает взаимодействие хондрогенных факторов с клетками мишенями, ограничивая их доступность, распределение и действие (Bernfield et al., 1992; Lin, 2004). Поэтому мы полагаем. что Surfen д. стимулировать хондрогенез путем увеличения доступности и действия сигнальных белков. Мы выбрали передачу сигналов BMP, поскольку она обладает строгой прохондрогенной активностью (Weston et al., 2000). В самом деле, передача сигналов BMP, как показано с помощью уровней фосфорилирования pSmad1/5/8, существенно увеличивается при воздействии Surfen на культуры микромасс из мезенхимы конечностей и этому увеличению предшествует увеличение в образовании хрящевых узелков. Такие реакции устранялись добавлением BMP антагониста Noggin. Проверка репортерных плазмид подтвердила. что клетки, обработанные Surfen, более чувствительны к эндогенному и экзогенному BMP2 (Huegel et al., 2013). Чтобы подтвердить данное наблюдение in vivo мы условно делетировали Ext1 в надкостнице, фланкирующей верхние части ростовой пластинки у Ext1^fl/fl;Gdf5Cre мвшиных эмбрионов. Мы установили, что большинство мутантных перихондриальных клеток становится позитивными вотношении передачи сигналов pSmad1/5/8 в ядро, тогда как большинство клеток в контроле были негативными. Экспланты конечностей, обработанные Surfen, обнаруживали сходные изменения в передаче сигналов (Fig. 4C,D). Эта эктопическая передача сигналов BMP сопровождалась формированием эктопического хряща внутри надхрящницы (Fig. 4A,B). Итак. эти исследования потведили, что Ext1 и HS являются критическими регуляторами фенотипа надхрящницы, позволяющй ей действовать как противо-хондрогенная граница вокруг ростовой пластинки, и они также важны для сдерживания и удержания роста хряща. В условиях дефицита Ext1 и HS, передача сигналов BMP будет усиливать и неправильно регулировать, приводя к аномальному поведению и росту хондроцитов и усилению хондрогенной реакции надхрящницы. Figure 4.

Other Modifiers of HS

Др. интересным аспектом биологии HS цепочек и HSPGs является то, что цепочки могут быть модифицированы внеклеточно путем действия энзимов, таких как heparanase (HPSE) и sulfatases (Ai et al., 2007; Fux et al., 2009). В самом деле, повышенная экспрессия HPSE была описана в ткани экзостозов (Trebicz-Geffen et al., 2008; Yang et al., 2010). Ответственная за расщепление HS цепочек на малые фрагменты, endoglucuronidase HPSE обладает активностью, способствующей пролиферации, и участвует в ряде раковых опухолей, ассистируя структурному ремоделированию внеклеточного матрикса во время инвазии клеток и высвобождая ростовые факторы (Ilan et al., 2006). Эта инвазивная характеристика также видна и при развитии зубов, когда зубные фолликулярные клетки проникают через оболочку эпителиального корешка, чтобы дифференцироваться в цементобласты, это координируется с помощью активации экспрессии HPSE (Hirata and Nakamura, 2006). Кроме того, повышенные уровни HPSE присутствуют в костно-хрящевых соединениях развивающихся костей, подтверждая, что HPSE играет роль в поздней дифференцировкке хондроцитов во время эндохондральной оссификации (Brown et al., 2008). Это также подтверждает, что регулируемая деградация цепочек HS д. способствовать фактору высвобождения и передачи сигналов во время др. ключевых моментов процесса формирования кости.

Сульфатазы модифицируют внеклеточные HS цепочки с помощью избирательного расщепления 6-O-sulfate групп, изменяя структурный паттерн и гетерогенность и ударное взаимодействие с сигнальными молекулами (Ai et al., 2007). Идея, что паттерн сульфатации HS может быть изменчив после синтеза, предоставляет др. уровень регуляции, специфичной для клеток или тканей, функции HSPG. Во время эмбриогенеза Xenopus экспрессия энзима Sulf1 высоко регулируется и действует негативно на передачу сигналов BMP и FGF, делая возможным образование градиентов морфогенов, жизне6нно важных для формирования паттерна оси, сомитогенеза и др. ключевых онтогенетических процессов (Freeman et al., 2008). Недавно, суставной хрящ Sulf1^-/- мышей, как было установлено, обладает спонтанным остеоартритическим фенотипом со снижением BMP и усилением передачи сигналов FGF (Otsuki et al., 2010). Показано. что экспрессия Sulf также необходима для поддержания гомеостаза суставного хряща путем регуляции передачи сигналов между хондроцитами.

Concluding Remarks and Future Directions

The above studies have provided major new insights into the interplays amongst HS biology, growth plate function and exostosis formation as well as the complexities and subtleties of these mechanisms. It appears plausible and likely therefore that exostosis formation is the ultimate outcome of changes in HS-dependent signaling pathways, including BMP and Ihh pathways, converging to create pro-chondrogenic responses and proliferative environments along the border of growth plates. Exostosis formation would thus result from increased distribution of these factors, increased responsiveness of the cells to these factors, and reduced capacity of growth plate cartilage and/or perichondrium to remain distinct and phenotypically stable. Other aspects of exostosis biology remain to be clarified. For instance, exostoses have been shown to often consist of a mix of HS-expressing and HS-null cells (Jones, 2011), suggesting that the cell population within each exostosis may be varied and phenotypically diverse and may have varying developmental origins. With regard to the latter, different hypotheses have been put forward over the years regarding the origin of exostosis forming cells. One hypothesis is that the cells represent borderline growth plate chondrocytes that would misbehave as a result of Ext/HS deficiency and lack of Ext tumor suppressor function, thus behaving as benign tumor cells and solely responsible for exostosis formation (Fig. 5A). A second hypothesis is that the cells would originate in perichondrium and would be progenitors in nature (Fig. 5B). The cells would lose their fibrogenic/progenitor phenotype and become reassigned to the chondrogenic lineage, and would undergo de novo chondrogenesis and give rise to the exostoses. The third possibility is that the cells would originate in the groove of Ranvier, a specialized region of perichondrium near the epiphysis which is rich in progenitor cells and may contain a specialized stem cell niche (Fig. 5C). Data in favor of, and against, these various hypotheses exist in the literature, thus requiring further work and more refined tools to be clarified and defined in a conclusive manner. As pointed out above, it may be that these hypotheses are not mutually exclusive and that exostosis formation could co-involve growth plate and perichondrial/groove cells. Their common denominators would be: enhanced responsiveness to growth factors; greater availability of those factors to act; increased enzymatic degradation of existing HS chains by heparanase; and inclusion of a mixed cell population (Fig. 5D). Based on our studies, we believe the contribution of perichondrial/groove cells may be preponderant. Figure 5.

Schematic summarizes current hypotheses regarding the origin of exostosis-forming cells. A-C: Those cells are currently thought to be: growth plate chondrocytes themselves (A, blue); perichondrial cells (B, red); or cells originating in the groove of Ranvier (C, purple). Data in favor and against each of these theses have been reported in recent years. Our own work indicates that perichondrium, including the groove of Ranvier, could represent a source of these cells. It is also possible that the exostosis-founding cells could reside in growth plate or perichondrium at the onset of exostosis formation, and would subsequently recruit cells from surrounding sites to sustain and boost the outgrowth process. D: Thus, exostosis formation could involve more than one source of cells. Other factors may also play a role in initiation and growth of ectopic cartilage, including increased range and responsiveness of growth factor signaling as well as up-regulated heparanase.

An equally critical issue to be addressed in the future is whether and how exostosis formation could be prevented or even reversed therapeutically. As discussed above, symptomatic exostoses are removed surgically at present, but surgery is dangerous, can have complications and cannot be used to remove each exostosis because the number of exostoses is usually very high in each patient. Hence, biological solutions are needed to aid surgery. Given that the exostoses likely represent a de novo chondrogenic process involving growth plate chondrocytes, perichondrial cells, or both, it is plausible to assume that anti-chondrogenic tools could be effective to block exostosis formation. Powerful anti-chondrogenic mechanisms include the retinoid pathway, Wnt signaling, and BMP antagonists such as Noggin and Gremlin. We have recently used acute activation of retinoid signaling by means of nuclear retinoic acid receptor-selective synthetic agonists to prevent and block heterotopic ossification, an ectopic endochondral processes triggered by trauma or gain-of-function activin receptor 1a mutations (Shimono et al., 2011). It is conceivable that such therapy may work in HME as well, and we will be testing this thesis in one of our HME mouse models in the near future. Another possibility is that microRNAs could be used to treat HME as it is being currently tested in other cancer fields. A recent study has shown that the miR transcriptome in human exostosis tissue differs from that of normal human cartilage pointing to multiple putative therapeutic targets (Zuntini et al., 2010). Last but not least, the identification of Surfen as an HS antagonist shows that HS can be affected and modulated by pharmacological means. Thus, it is possible that HS agonists could be identified and would increase HS bioactivity, reduce turnover or increase EXT expression. Whatever their mechanisms of action, the drugs would then be tested for ability to increase or restore HS function/levels in HME mouse models and eventually patients, reduce exostosis formation, and ameliorate other symptoms. Our genetic studies show that exostosis formation does not require a complete loss of Ext function to occur. It may be that pharmacological prevention of exostosis formation may require a significant, but not a major and complete, increase in HS function and levels as well.

Heparan sulfate in skeletal development, growth, and pathology: The case of hereditary multiple exostoses Julianne Huegel, Federica Sgariglia, Motomi Enomoto-Iwamoto, Eiki Koyama, John P. Dormans, Maurizio Pacifici Developmental Dynamics 242:1021-1032, 2013. © 2013 Wiley Periodicals, Inc.

Heparan sulfate in skeletal development, growth, and pathology: The case of hereditary multiple exostoses
Julianne Huegel, Federica Sgariglia, Motomi Enomoto-Iwamoto, Eiki Koyama, John P. Dormans, Maurizio Pacifici
Developmental Dynamics 242:1021-1032, 2013. © 2013 Wiley Periodicals, Inc.