RNA-binding proteins involved in RNA localization and their implications in neuronal diseases  European Journal of Neuroscience Special Issue: EARLY BRAIN REPAIR AND PROTECTION Volume 35, Issue 12, pages 1818–1836, June 2012 | |
|
Very often, developmental abnormalities or subtle disturbances of neuronal function may yield brain diseases even if they become obvious only late in life. It is therefore our intention to highlight fundamental mechanisms of neuronal cell biology with a special emphasis on dendritic mRNA localization including local protein synthesis at the activated synapse. Furthermore, we would like to point out possible links to neuronal or synaptic dysfunction. In particular, we will focus on a series of well-known RNA-binding proteins that are involved in these processes and outline how their dysfunction might yield neurodevelopmental, neurodegenerative or neuropsychiatric disorders. We are convinced that increasing our understanding of RNA biology in general and the mechanisms underlying mRNA transport and subsequent translation at the synapse will ultimately generate important novel RNA-based tools in the near future that will allow us to hopefully treat some of these devastating diseases. Рисунок и талица в оригинале статьи Abbreviations ALS amyotrophic lateral sclerosis Arc activity-regulated cytoskeleton-associated protein ASD autism spectrum disorder CBC cap-binding complex CBP cap-binding protein CHOP CCAAT enhancer-binding homologous protein CLIP cross-linking immunoprecipitation eIF4E eukaryotic initiation factor 4E EJC exon junction complex FMR1 fragile X mental retardation 1 FMRP fragile X mental retardation protein FTD frontotemporal dementia FUS fused in sarcoma FXS fragile X syndrome FXTAS fragile X-associated tremor/ataxia syndrome GFP Green fluorescent protein hnRNP heterogeneous nuclear ribonucleoprotein KH K-homology LTD long-term depression LTP long-term potentiation MAP2 microtubule-associated protein 2 mGluR metabotropic glutamate receptor mRNP mRNA-containing ribonucleoprotein particle mTORC1 mTOR complex 1 mTOR mammalian target of rapamycin NMDAR N-methyl-D-aspartic acid receptor NPM nucleophosmin PSD-95 postsynaptic density protein 95 kDa Pur a Pur alpha RBP RNA-binding protein RGG Arg-Gly-Gly RNP ribonucleoprotein particle RRM RNA recognition motif SG stress granule SMA spinal muscular atrophy SMN survival of motor neuron TDP-43 TAR DNA-binding protein of 43 kDa TLS translocated in liposarcoma TS tuberous sclerosis TSC tuberous sclerosis (complex) UTR untranslated region ZBP1 zipcode-binding protein 1 new pathway of synaptic modulation in the hippocampus |
Basics of dendritic RNA localization Synapse and memory Нейроны, сильно поляризованные клетки с клеточными телами и обширным комплексом выпячиваний - обычно одного аксона и нескольких разветвленных дендритов - представляющих самостоятельные функциональные компартменты. Типичные пирамидальные нейроны гиппокампа могут иметь до 10 000 синапсов, большинство из них расположено в удалении от тела клетки. Эти места контактов представляют собой минимальные единицы хранения нервной системы, где критическая информация, такая как память, хранится на синаптическом уровне (Kandel, 2001). Поскольку некоторая память сохраняется в течение всей нашей жизни (McKenzie & Eichenbaum, 2011), , следовательно, это является принудительным, чтобы независимо изменять молекулярную композицию индивидуальных синапсов (Govindarajan et al., 2006). Сегодня считается, что это , по крайней мере, частично сопровождается асимметричной локализацией мРНК, как во время развития нервных клеток, так и после их созревания, чтобы поддерживать критические клеточные функции (Doyle & Kiebler, 2011). Особенно впечатляющим примером являются постсинаптические стороны синапсов, называемые дендритными шипами (spines), которые являются небольшими колючко-образными выпячиваниями дендритных отростков (Hering & Sheng, 2001; Penzes et al., 2011) и которые могут быть изменены в ответ в ответ на изменения внешних условий. Они не только могут модифицировать свою морфологию, но и могут формировать новые синапсы или элиминировать существующие в ходе ремоделирования соединений с нейронными цепями (circuits) (Kandel, 2001; Penzes et al., 2011). Недавние доказательства с использованием time-lapse видеомикроскопии подтвердили, что не только новые дендритные шипы формируются во время электрической стимуляции (Engert & Bonhoeffer, 1999; Maletic-Savatic et al., 1999), но и также, что существующие дендритные шипы меняют свою морфологию после обучения (reviewed in Segal, 2005). Synaptic translation at the activated synapse Каковы лежащие в основе механизмы, ответственные за морфологические изменения? Временная и пространственная регуляция генной экспрессии рассматривается как существенная в нейронах (Kandel, 2001). Синаптические белки может быть синтезированы в теле клетки и затем локализованы в синапсах (Doyle & Kiebler, 2011). Альтернативно компоненты аппарата трансляции, включая мРНК, обнаруживаются в дендритах, где они транслируются по необходимости (Steward & Levy, 1982; Tiedge & Brosius, 1996; reviewed in Steward & Schuman, 2001). Сегодня активно исследуется, как индивидуальные транскрипты активно транспортируются из тела клетки в (дистальные части) дендриты (Holt & Bullock, 2009; Martin & Ephrussi, 2009; Doyle & Kiebler, 2011). Во время этого процесса мРНК транспортируются, удерживаемые в трансляционно репрессированном состоянии, т.е. они защищены от трансляции до прибытия в необходимое место (reviewed in Dahm & Kiebler, 2005). Только в случае необходимости, напр., во время синаптической пластичности трансляционно репрессированные транскрипты становятся доступны для активно-индуцируемой трансляции в индивидуальных синапсах (Kang & Schuman, 1996; Gkogkas et al., 2010). Эти вновь синтезированные (синаптические) белки затем позволяют определенным синапсам подвергаться реорганизации, внося тем самым вклад в формирование памяти (Kandel, 2001; Segal, 2005; Govindarajan et al., 2006; Bramham & Wells, 2007). Итак, для этих важных процессов, которые происходят внутри данной нервной цепочки, является важным, чтобы экспрессия генов токо регулировалась пространственным и временным способом. mRNA localization - a multi-step process локализация мРНК в дендритах может быть механически подразделена на отдельные ступени (Ainger et al., 1993; Wilhelm & Vale, 1993; Holt & Bullock, 2009; Martin & Ephrussi, 2009; Doyle & Kiebler, 2011). Локализованные транскрипты содержат элементы цис-действующей локализации или зипкоды (zipcodes), преимущественно расположенные в 3'-untranslated region (UTR). Эти элементы локализации распознаются транс-действующими RNA-binding proteins (RBPs) и вместе собираются в способные к транспортировке ribonucleoprotein particles (RNPs). С помощью молекулярных моторов эти трансляционно репрессированные RNPs транспортируются вдоль цитоскелета из микротрубочек в дендриты (Bassell & Warren, 2008). Существует мало экспериментальных доказательств, как локальные транскрипты, в самом деле, закрепляются в своих финальных местах предназначения или напротив, если они постоянно снуют внутри дендритов вблизи синапсов. Как упоминалось выше, что только после индукции синаптической пластичности здесь синтезируются новые синаптические белки (Kelleher et al., 2004; Cajigas et al., 2010). Новые доказательства указывают, что стабильность мРНК также тонко регулируется в синапсах (Richter & Klann, 2009).
Doyle & Kiebler (2011) недавно предложили концепцию 'RNA signature'. Любой данные локализованный транскрипт, который содержит более одного регуляторного элемента, включая элементы локализации, следовательно, обладает своей собственной уникальной 'РНК сигнатурой', которая представляет собой коллекцию всех структурных и регуляторных элементов внутри данной мРНК. Каждый элемент может быть распознан множественными белками RBPs. Более того, растут доказательства, что RBPs могут обладать как внутримолекулярным, так и межмолекулярным кооперативным поведением, когда соединяется с локализованными мРНК (Dienstbier et al., 2009; Mьller et al., 2011). Такая кооперация может означать, что два RBPs (межмолекулярно) или два РНК-связывающих домена внутри одного и того же RBP (внутримолекулярно) действуют совместно, чтобы распознавать высоко структуированную stem-loop РНК с высокой специфичностью (Doyle & Kiebler, 2012). Итак, каждый транскрипт обладает своей собственной специфической 'РНК сигнатурой', которая определяет судьбу транскрипта внутри клетки, напр., локализацию мРНК, локальную трансляцию, снабжение ярлыком синапса (reviewed in Frey & Frey, 2008) или оборот мРНК. The various roles of RNA-binding proteins in mRNA localization RBPs играют важную роль в метаболизме РНК и являются ключевыми регуляторами, контролирующими экспрессию генов в ЦНС (Lukong et al., 2008; Cooper et al., 2009). Часто они осуществляют более одной определенной функции. Напр., во время процесса локализации мРНК в дендритах, они могут осуществлять разные важные роли, напр., сплайсинг РНК и контроль качества в ядре, экспорт из ядра в цитоплазму, сборку RNPs или в ядре или в цитоплазме, локализацию РНК в цитоплазме, трансляционный контроль и, наконец, стабильность/деградацию мРНК (Marchand et al., 2012). Более того, функция данного RBP может быть отличной для разных транскриптов, напр., heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs), Staufen 1/2 или zipcode-binding protein 1 (ZBP1) (reviewed in Kiebler & Bassell, 2006; Holt & Bullock, 2009; Martin & Ephrussi, 2009). Следовательно, концепция 'РНК сигнатуры' приложима не только к РНК сигналам внутри РНК, но и к рекрутированию различных RBPs на данную РНК. В зависимости от того, какого типа RBPs упакованы в RNPs, это может оказывать критическое влияние на многочисленные судьбы данной РНК внутри клетки. Сегодня детальное понимание всех молекулярных взаимодействий одиночного транскрипта отсутствует.
RBPs сами по себе являются важными мишенями для регуляции (Lukong et al., 2008). Одним из хорошо документированных путей является путь посттрансляционных модификаций. Напр., ZBP1 [или insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1 (Igf2BP1)] фосфорилируется с помощью нерецепторной тирозин киназы Src, которая нарушает его РНК-связывающую способность в результате активации трансляции (Hьttelmaier et al., 2005). Пост-трансляционные модификации ключевых RBPs, индуцируемые с помощью специфических сигнальных путей внутри нейронов, делают возможной не только эффективную и специфическую регуляцию транспорта мРНК, но и также трансляционный контроль или контроль стабильности/деградации мРНК в синапсах. Кроме того, известно несколько ко-транскрипционных механизмов, напр., hnRNPs и их роль в сплайснге (Close et al., 2012).
Несколько ключевых RBPs, как было установлено, вносят вклад в сборку RNP, напр. ZBP1, cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1 (CPEB1), fragile X mental retardation protein (FMRP), Staufen1 и Pur alpha (Pur α) (Kanai et al., 2004; Hokkanen et al., 2012). Важно отметить, что такие 'транспортные RNPs' (Kiebler & Bassell, 2006) не только формируют гранулы РНК в клетках эукариот (Anderson & Kedersha, 2006). Др. тип цитоплазматических гранул РНК это преобразующие (processing) тельца. Они, как полагают, являются основными местами разрушения мРНК, а также репрессии трансляции внутри клеток млекопитающих, существуя как в теле клетки, так и в дендритах вблизи синапсов (Cougot et al., 2008; Zeitelhofer et al., 2008). В клетках, которые подвергаются клеточным стрессам, формируются стрессовые гранулы (SGs), чтобы секвестрировать большинство отловленных мРНК и тем самым ингибировать генеральную трансляцию, путем способствования экспрессии мРНК, которые кодируют молекулярные шапероны и энзимы репарации повреждений (Anderson & Kedersha, 2006). Интересно, что некоторые RBPs могут быть компонентами разного типа RNPs, тогда как др. являются уникальными маркерами для единственного класса гранул РНК. Biological functions of spatially regulated transcripts Локализация мРНК служит многим биологическим функциям, таким как становление оси тела, поддержание полярности клеток, миграция клеток, а также детерминация судьбы клеток и компартментализация клеток (reviewed in St Johnston, 2005; Holt & Bullock, 2009; Martin & Ephrussi, 2009). Этот процесс позволяет внеклеточным стимулам интегрироваться и регулировать генную экспрессию во времени и в пространстве в разных типах клеток и организмах, от почкующихся дрожжей до клеток Drosophila, Xenopus, млекопитающих. Наше внимание здесь сфокусировано на локализации мРНК в дендритах и её связи с нервными болезнями. Этот механизм специфически делает возможной локальную экспрессию генов в нервных процессах. Напр., локализация мРНК обнаруживается в конусах роста, позволяя наводить рост нейритов в ответ на внешние сигналы (Holt & Bullock, 2009; Twiss & Fainzilber, 2009). Так, несколько локализованных мРНК были исследованы в деталях, включая β-actin. В недавних исследованиях даже было подсчитано. что несколько сотен транскриптов может быть локализовано в аксонах (Eberwine et al., 2002). Помимо нейронов локализация мРНК обнаружена также в олигодендроцитах (Carson et al., 2008), где транскрипты, кодирующие базовый белок миэлина, локализуются в миэлинизирующихся отростках (Ainger et al., 1993).
Итак, RBPs вносят критический вклад в формирование и поддержание обучения и памяти путем регуляции локального трансляции в синапсах. Было бы интересно доказать, что существуют множественные связи между локализацией дефектных мРНК и нервными болезнями. В частности, функция аберрантных RBP может вызывать различные болезни в нервной системе. RNA-binding proteins and disease in the nervous system Столь же критический вклад в рост аксонов и ранний синаптогенез в развивающемся головном мозге вносят транспорт РНК и локальная трансляция, которые также участвуют в морфогенезе шипов дендритов и даже в синаптической пластичности в зрелой нервной системе. Уже становится ясно, что дефекты этих процессов приводят ко многим разнообразным типам болезней (Lukong et al., 2008; Cooper et al., 2009; Liu-Yesucevitz et al., 2011) , в особенности нарушения процессов ранней репарации нервов, формирования и морфогенеза дендритов, (дегенеративных) болезней двигательных нейронов, различных форм умственной отсталости, аутизма и эпилепсии. Molecular overview Zipcode-binding protein 1 (также известный как VICKZ, в ссылках на найденных членов: Vg1RBP/Vera, IMP1-3, CRD-BP, KOC и ZBP1, IMP1, IGF-II mRNA-binding protein 1 или Igf2BP1) является членом сильно законсервированного семейства RBPs, представленного наиболее изученными транс-действующими факторами (Yisraeli, 2005). ZBP1 является мультидоменовым белком, содержащим два RNA recognition motifs (RRMs) и четырьмя hnRNP K-homology (KH) доменами (Ross et al., 1997). Хотя он может соединяться со многими разными клеточными мишенями (Jonson et al., 2007), ZBP1 лучше известен как регулирующий транскрипты β-actin, первой мРНК, обнаруживающей локализацию внутри фибробластов и нейронов (Shestakova et al., 2001). ZBP1 не только участвует в транспорте мРНК β-actin, но и также в контроле трансляции (Hьttelmaier et al., 2005) (see also the accompanying News & Views by Dahm & Kiebler, 2005). ZBP1-зависимая локализация β-actin в сайтах активной полимеризации актина является, как полагают, критической для многих важных клеточных функций, напр., клеточной миграции, эмбриогенеза, дифференцировки и канцерогенеза (Hьttelmaier et al., 2005; Stцhr et al., 2012).
Высокий уровень экспрессии ZBP1 во время раннего развития мыши подтверждает важность функций в это время развития (Nielsen et al., 1999; Donnelly et al., 2011). Первое подтверждение получено при генетических исследованиях мышей; мыши, лишенные ZBP1 обнаруживают высокую перинатальную смертность, а те, которые выживают карлики. Так, множественные онтогенетические аномалии были описаны у мышей с ловушкой для гена ZBP1-/- (Hansen et al., 2004).
Однако четкая роль ZBP1 в нервной системе всё ещё отсутствует. Многолетние исследования G. Bassell и R. Singer получили информацию о различных функциях ZBP1 в культуре первичных нейронов. У Xenopus laevis нейроны локализуют мРНК как ZBP1, так β-actin в ростовых конусах растущих аксонов и обнаруживают асимметричное распределение после локального добавления brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (Yao et al., 2006). Это указывает на то, что ZBP1-зависимая локализация и трансляция мРНК β-actin важна для направления ростовых конусов, т.е. поворота ростового конуса в ответ на сигналы наведения (reviewed in Lin & Holt, 2008). Во-вторых, в нейронах гиппокампа в культуре и локализация мРНК и локальная трансляция мРНК β-actin важны для синаптического роста посредством филоподий дендритов и регуляции морфологии дендритов (Eom et al., 2003). Та же самая группа также сообщила об зависимом от активности сновании и динамической локализации ZBP1 и β-actin мРНК в дендритах в направлении активных синапсов (Tiruchinapalli et al., 2003). Итак, эти данные строго указывают на важную роль ZBP1 в нейронах. Role of zipcode-binding protein 1 in axon outgrowth and nerve repair Локализация мРНК в субклеточных компартментах нуждается во взаимодействиях мРНК и белков (Donnelly et al., 2011). Для некоторых транскриптов грузов наблюдается чёткое обогащение в нервных отростках (Poon et al., 2006), тогда как др. мРНК, напр., β-actin, не обнаруживают такого чёткого паттерна локализации в дистальных отростках (Donnelly et al., 2011). недавний подход с трансгенными мышами пролил новый свет на возможную функцию локализации мРНК β-actin in vivo. Авт. получили с ограниченной диффузией репортер green fluorescent protein (GFP) и слили его с 3'-UTR мРНК β-actin. Когда он экспрессировался в периферических и центральных частях отростков сенсорных нейронов, то авт. убедительно показали, что β-actin 3'-UTR ответственен за локализацию мРНК в аксонах in vivo (Willis et al., 2011).
В сопутствующем исследовании с использованием этой трансгенной линии та же группа продемонстрировала, что ZBP1 также вносит критический вклад в регенерацию зрелых сенсорных аксонов после повреждения нерва (Donnelly et al., 2011). Итак, эти два исследования предоставили первые доказательства критической роли RBP в транспорте мРНК и для локальной трансляции в выростах аксонов во время регенерации нервов in vivo. Подход, который избрали авт. очень удобен для анализа живых нейронов, что позволяет изучать динамические аспекты локализации мРНК, вместо исключительно оценки snap-shots фиксированных образцов. Они продемонстрировали UTR competition подходе, что трансфицированные вирусами нейроны обладают пониженными уровнями эндогенной мРНК β-actin. Эндогенный и экзогенный β-actin 3'-UTR конкурируют за аппарат локализации, это, по-видимому, первое указание, что ZBP1 является лимитирующим фактором локализации мРНК (Donnelly et al., 2011). В этом контексте интересно отметить, что локальная трансляция также происходит в выростах аксонов (Donnelly et al., 2010).
Ранее подход с использованием антисмысловых олигонуклеотидов, нарушающих зипкодовую последовательность β-actin, устранял локализацию. Нейроны, обладающие аберрантной динамикой ростовых конусов (Shestakova et al., 2001), обнаруживали ингибирование формирования RNP комплексов (Zhang et al., 2001). Donnelly et al. (2011) также обнаружили влияние экспрессии экзогенного β-actin 3'-UTR на морфологию аксонов. Авт. сообщили, что более короткие аксоны имеют пониженное количество ответвлений аксона и более мелкие конусы роста. В подходе с использованием нейронов, происходящих от трансгенных мышей, экспрессирующих β-actin 3'-UTR, получили сходные результаты, с уточнением, что эффект зависит от дозы. Эта работа особенно интересна, т.к. показала необходимость в каком-либо RBP для локализации мРНК и последующего влияния на рост аксонов in vivo.
Относительно регенерации аксонов после повреждений нерва, Donnelly et al. (2011) описали пониженную регенерацию нерва у трансгенных GFP-3'-UTR β-actin нейронов in vivo, как в нейронах ганглиев дорсальных корешков, так и раздавленных периферических нервах. преходящая избыточная экспрессия ZBP1 конструкции устраняет дефицит роста и дает аксоны нормальной длины. Интересно, что мутантные ZBP1 конструкции, лишенные KH доменов, которые ответственны за связывание РНК, или лишенные сайта фосфорилирования тирозина (Y396), который необходим для репрессии трансляции, не ведут к восстановлению (Donnelly et al., 2011). ZBP1 , как было установлено, супрессирует трансляцию своих мРНК грузов. Подобное блокирование трансляции снижается после фосфорилирования по сайту Y396 (Hьttelmaier et al., 2005). Мутанты с повышенной экспрессией ZBP1Y396F ведут к восстановлению транспорта мРНК, тогда как блокирование трансляции не снижается. Это ведет к отсутствию трансляции и , следовательно, к уменьшению длины аксона (в нейронах дикого типа) (Donnelly et al., 2011). Итак, эти данные показывают, что и локализация и локальная трансляция β-actin являются обязательными для поддержания роста аксонов.
Кроме того, Donnelly et al. (2011) исследовали воздействие белка полной длины ZBP1 более детально. ZBP1+/- мыши также обнаруживают пониженный рост аксонов. Снова, избыточная экспрессия ZBP1, но не мутантной ZBP1Y396F конструкции устраняет дефицит роста аксонов. Это ведет к достоверному усилению роста аксонов даже в нейронах мышей и крыс дикого типа. Авт. полагают, что доступность ZBP1 ограничена, напр., в сенсорных нейронах взрослых. Это указывает, что уровни ZBP1 могут ограничивать способность к регенерации в нервной системе взрослых. В ряде экспериментов по разрушению седалищного нерва с использованием ZBP1+/- мышей выявлено снижение регенерации аксонов in vivo. Эти данные указывают, что взрослые нейроны, происходящие от ZBP1+/- мышей, являются гаплонедостаточными, т.е. оставшийся одиночный функциональный аллель неспособен компенсировать уровни дикого типа, необходимые для регенерации аксонов (Donnelly et al., 2011).
Итак, ZBP1 необходим для локализации мРНК и локальной трансляции своего груза мРНК, т.е. β-actin, оба процесса вносят критический вклад в поддержание роста аксонов. Экзогенный β-actin 3'-UTR конкурирует с эндогенной мРНК β-actin, указывая, что ZBP1 является лимитирующим фактором для оптимальной способности роста аксона после повреждения нерва (Donnelly et al., 2011). эти находки открывают новые и многообещающие пути исследований для терапевтических вмешательств (see also Therapy strategies and outlook) после повреждений нервов путем увеличения доступности функционального ZBP1 в аксональном компартменте поврежденных нейронов. Интересно, что никакой прямой связи дефектного ZBP1 с наследственными нервными болезнями, ни ассоциации мутаций по соседству с генетическим локусом ZBP1 на хромосоме 17 не было описано. Но мы ожидаем обнаружения связи аберрантного ZBP1 с некоторыми наследственными нервными нарушениями в будущем. Fused in sarcoma/translocated in liposarcoma, TAR DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), survival of motor neuron and motor neuron diseases (amyotrophic lateral sclerosis, spinal muscular atrophy) Molecular overview of fused in sarcoma/translocated in liposarcoma Fused in sarcoma (FUS) также известен как translocated in liposarcoma (TLS). FUS/TLS обнаружен в слизеподобных (myxoid) и округло-клеточных липосаркомах в качестве онкогенного слитого белка (Iko et al., 2004), он ассоциирует с генной перестройкой, т.е. с геном, кодирующим CCAAT enhancer-binding homologous protein (CHOP). CHOP является транскрипционным фактором семейства CCAAT-enhancer-binding proteins (C/EBP), он сцеплен с арестом роста и может быть индуцирован посредством повреждения ДНК. хромосомная транслокация приводит к слиянию гена TLS с геном CHOP. Нормальный TLS ранее был описан как новый ядерный RBP, сходный с ewing sarcoma breakpoint region 1 (EWS), который являются генным продуктом. часто обнаруживаемым при саркоме Ewing's (Crozat et al., 1993). Идентифицировано несколько РНК-связывающих мотивов в C-терминальной половине FUS/TLS: (i) RRM , фланкированный множественными повторами Arg-Gly-Gly (RGG) , и (ii) предполагаемый домен цинковые пальчики с 4 цистеинами (Morohoshi et al., 1998; Iko et al., 2004).
Как и у дикого типа (не транслоцированные) TLS, FUS/TLS участвуют в модуляции альтернативного сплайсинга (CHOP, см. выше) (Lerga et al., 2001). FUS/TLS, как было установлено, соединяется с однонитчатой ДНК специфичным для последовательности способом (Perrotti et al., 1998) , а структурный гомолог, как было установлено, соединяется с двунитчатой ДНК (Hackl & Luhrmann, 1996). В др. исследовании было предположено, что FUS/TLS является RBP , т.к. он связывает РНК in vivo. Было установлено, что RRM в FUS/TLS не обязателен для его способности связываться с РНК in vivo (Zinszner et al., 1997). Более того, FUS/TLS, как было установлено, in vitro и in vivo распознает РНК специфически, а именно с помощью мотива GGUG. Это исследование установило, что совместное действие трех доменов связывания РНК, RRM и RGG2-3, является обязательным для специфического связывания FUS/TLS РНК (Lerga et al., 2001). Недавнее исследование с использованием фото-активируемой, усиливаемой рибонуклеозидом cross-linking immunoprecipitation (CLIP) разработало более точно идею о связывании с помощью FUS/TLS РНК. Транскрипты мишени часто оказывались связанными со многими белками. Часто поперечно связанные кластеры, содержащие богатую AU stem-loop структуру, часто имеют открытыми U U или U C non-Watson-Crick пары оснований. Кроме того, авт. исследовали предполагаемые различия в поведении связывания дикого типа и мутантного FUS/TLS. Мутации изменяли скорее, чем разрушали связывание спектра мишеней РНК, потенциально это обусловлено измененной субклеточной локализацией. Дикого типа RBP участвует во многих поперечно-связанных кластерах в интронных регионах по сравнению мутантным FUS/TLS (Hoell et al., 2011).
Масс-спектрометрическое исследование выявило, что FUS/TLS является частью крупного hnRNP комплекса (Calvio et al., 1995). Существует более 30 различных hnRNPs (Iko et al., 2004). Члены этого семейства участвуют в экспорте полностью преобразованной мРНК из ядра в цитоплазму и снуют между ядром и цитоплазмой (Pinol-Roma & Dreyfuss, 1992).
Итак, FUS/TLS, по-видимому, является многофункциональным белком, ответственным за разнообразные регуляторные процессы, включая транскрипцию, сплайсинг мРНК, транспорт мРНК из ядра в цитоплазму и инициацию распространения клеток. Однако, несмотря на его физиологическую важность, мало молекулярной информации о FUS/TLS (Iko et al., 2004).
Исследования Fujii et al. (2005) предоставили первую информацию о потенциальной роли FUS/TLS в ЦНС. Авт. продемонстрировали роль FUS/TLS в отношении регуляции морфологии дендритных шипов. У мышей FUS/TLS экспрессируется в нейронах неокортекса и гиппокампа. FUS/TLS обнаруживается в ядре, в дендритах - локализуясь совместно с postsynaptic density protein 95 kDa (PSD-95)-позитивным дендритными шипами - но отсутствует в аксонах. FUS/TLS, слитый с флюоресцентным белком, обеспечивает двунаправленный транспорт в дендритах незрелых нейронов. Зрелые нейроны гиппокампа обнаруживают значительный сдвиг частиц из дендритов в дендритные шипы, указывая на изменения в поведении локализации на разных стадиях развития. Эксперименты с использованием ингибиторов соотв. цитоскелетных филамент показали, что как актиновые филаменты, так и микротрубочки необходимы для транслокации FUS/TLS. Химически индуцированная стимуляция синапсов с использованием dihydroxyphenylglycine выявляет увеличение локализации FUS/TLS в дендритных шипах, обладающих возбуждающими постсинаптическими сайтами. Это указывает на то, что FUS/TLS вносит вклад в локализацию мРНК в дендритных шипах, которая затем транслируется локально. Авт. выявили преимущества модельных нокаутных по metabotropic glutamate receptor (mGluR)5 мышей и установили, что dihydroxyphenylglycine не индуцирует локализацию FUS/TLS в дендритных шипах. Это согласуется с предыдущими экспериментами, показавшими, что транслокация FUS/TLS в дендритные шипы инициируется вследствие mGluR5-обеспечиваемой активации постсинаптических сигнальных каскадов (Fujii et al., 2005).
В интересной серии экспериментов авт. далее исследовали роль FUS/TLS, используя FUS/TLS-дефицитных трансгенных мышей. Дендриты нейронов, происходящие от этих мышей, обнаруживают нерегулярное ветвление. Кроме того, многие длинные и тонкие отростки, напоминающие незрелые аксоны, были описаны, исходящими из тела клетки. Более того, FUS/TLS-дефицитные отростки нейронов обладают множественными дендритами и только одним аксоном, указывая, что полярность нейронов не изменяется в отсутствие FUS/TLS. Однако нейроны. происходящие от FUS/TLS-/- мышей обладают аберрантной морфологией и уменьшенным количеством дендритных шипов. Морфологические отклонения включают тонкие и длинные дендритные шипы, напоминающие филоподии, но не похожие на гриб дендритные шипы, т.е. с тонкими шейками и крупными головками, которые преимущественно обнаруживаются в нейронах дикого типа (Fujii et al., 2005).
Итак. эти данные подтверждают критический вклад FUS/TLS в созревание нейронов, а именно в ветвление дендритов, а также в морфогенез дендритных шипов. Последний особенно интересе, т.к FUS/TLS накапливается - вместе с РНК - в дендритных шипах после mGluR5 активации (Fujii et al., 2005).
Помимо своих физиологических функций FUS/TLS также участвует в нейродегенеративных болезнях. Molecular overview of TDP-43 Белок TAR DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) был первоначально идентифицирован как транскрипционный фактор, участвующий в регуляции экспрессии гена human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) in vitro и in vivo (Ou et al., 1995). Затем TDP-43 был найден связанным с (TG)m(T)n повторами cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) экзона 9 пре-мРНК, это позволило идентифицировать дополнительную его функцию помимо связывания ДНК, как RBP (Buratti et al., 2001). Исследование Buratti & Baralle (2001) подтвердило существование двух полностью функциональных RRMs, обладающих разными характеристиками связывания. TDP-43 эффективно связывает РНК, содержащие минимум 6 (UG) повторов. Два RRMs в TDP-43 обнаруживают строгую гомологию с hnRNP A1, sex lethal (Sx1) или PolyA-binding protein (PABP) и, как полагают, оба вносят вклад в распознавание РНК (Buratti & Baralle, 2001). Недавно в статье с использованием CLIP вместе с high-throughput sequencing (HITS), однако сообщалось, что богатые GU повторы не необходимы и недостаточны для спецификации сайта связывания TDP-43 (Polymenidou et al., 2011). Др. группа, использующая преимущества УФЛ поперечного связывания и иммунопреципитацию, подтвердила связывание TDP-43 с UG и кроме того идентифицировала полипиримидиновые треки в качестве главного сайта связывания этих RBP. Более того, авт. установили, что TDP-43 преимущественно связывается с интронными последовательностями, но также взаимодействует с 3'UTR генов или некодирующими РНК (Xiao et al., 2011).
TDP-43 является преимущественно ядерным белком (Buratti et al., 2001); однако он также обнаруживается в соматодендритном компартменте и в постсинаптических сайтах (Wang et al., 2008). В дендритах TDP-43 ко-локализуется с РНК динамическим способом, в зависимости от синаптической активности. TDP-43 в основном присутствует в дендритах внутри нейрональных РНК гранул, в которых, напр., идентифицированы транскрипты β-actin и CaMKIIa в качестве РНК грузов (Wang et al., 2008). Wang et al. описали также TDP-43 в преобразующих (processing) тельцах, основных сайтах деградации мРНК, а также сайтов хранения транскрипционно репрессированных мРНК (Parker & Sheth, 2007). В этих РНК гранулах TDP-43 может потенциально регулировать трансляцию, т.к. он действует в качестве репрессора трансляции in vitro (Wang et al., 2008) подобно др. хорошо известным RBPs, такими как FMRP (Zalfa et al., 2003).
Итак, TDP-43 вносит вклад в сплайсинг (Buratti et al., 2001), транспорт мРНК и контроль трансляции (Wang et al., 2008). Подобно FUS/TLS, TDP-43 участвует в патогенезе ALS. Fused in sarcoma/translocated in liposarcoma, TDP-43 disease link - amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia Амиотрофный боковой склероз это быстро прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, которое ведет к смерти, в основном затрагивает двигательные нейроны, в частности верхние и нижние двигательные нейроны (see Box 1 - ALS). Мутации FUS/TLS или TDP-43, двух RBPs, играющих ключевые роли в этой болезни, вызывают ALS (Lagier-Tourenne et al., 2010). Hoell et al. (2011) предложили модель, согласно которой ALS-вызывающие мутации в FUS/TLS могут действовать посредством эффекта избыточной функции. Сюда входит повышенное взаимодействие с цитоплазматическими РНК или клеточные стрессы, обусловленные синтезом аберрантных белков и деградацией этих мутантных RBP, мутанты обладают усиленным взаимодействием с эндоплазматическим ретикулумом и генами мишенями, связанными с ubiquitin-proteasome. Потенциальное взаимодействие между FUS/TLS и TDP-43 остается неуловимым. Находки, что мутантный TDP-43 увеличивает свою тенденцию к связыванию с нормальным FUS/TLS указывает на конвергенцию патогенетических путей этих RBPs при ALS (Ling et al., 2010).
Важным шагом в направлении понимания ALS служит наблюдение, это тенденция FUS/TLS (и TDP-43) давать агрегаты в культуре клеток, которая коррелирует с тяжестью клинической болезни (Dormann et al., 2010). ALS и frontotemporal dementia (FTD) две клинически перекрывающиеся болезни. FTD это клинический синдром, который представляет собой патологическое состояние дегенерации лобно-височных долей, обнаруживающее уменьшение передних частей фронтальной и височных долей головного мозга (see Box 2 - FTD). Тот факт, что TDP-43 агрегаты были найдены при ALS и дегенерации лобно-височных долей (с ubiquitin-позитивными включениями) дает важное доказательство, что эти болезни могут использовать сходные сходные молекулярные механизмы (Neumann et al., 2006). Детальная оценка мышиных моделей ALS выявляет сходные болезненные признаки, обнаруживаемые и у людей, такие как зависимая от возраста нейродегенерация или моторная дисфункция вплоть до спастической квадроплегии (Liu-Yesucevitz et al., 2011). Существующие модели ALS, включая мышей, избыточно экспрессирующих дикого типа человеческий TDP-43 (Wils et al., 2010; Xu et al., 2010; for review of other ALS mouse models, see Swarup & Julien, 2011). Эти мыши обнаруживают - сходные с наблюдаемыми у пациентов с ALS и лобно-височной дегенерацией - ядерные и цитоплазматические TDP-43-позитивные агрегаты (Wils et al., 2010). Цитоплазматические скопления также обнаруживаются у пациентов с ALS с имеющимися FUS/TLS мутациями (Kwiatkowski et al., 2009). Белковая агрегация и образование цитоплазматических агрегатов играет ключевую роль в нейродегенеративных (reviewed in Polymenidou & Cleveland, 2011) или прионовых болезнях (reviewed in Aguzzi et al., 2008). Всё ещё остается спорным, является ли агрегация TDP-43 и FUS/TLS молекулярной основой нейродегенерации и является ли этот процесс важным для ALS (Liu-Yesucevitz et al., 2011).
Дикого типа FUS/TLS и TDP-43, как было установлено, ассоциируют с SGs в реакции на стрессы (Colombrita et al., 2009). нервные гранулы, такие как SGs, участвуют в регуляции локальной трансляции в синапсах (for review, see Kiebler & Bassell, 2006). TDP-43 также взаимодействует с факторами аппарата трансляции (Freibaum et al., 2010). Мутации в TDP-43 и FUS/TLS увеличивают образование TDP-43-позитивных SGs. Кроме того, возрастает связывание TDP-43 с др. SG-ассоциированными белками, включая T-cell-restricted intracellular antigen-1 (TIA-1) или FUS/TLS, что также сцеплено с мутациями в TDP-43 (Liu-Yesucevitz et al., 2010). Интересно, что TDP-43 мутанты. которые неспособны связывать РНК, не образуют агрегатов и не являются токсичными. Эти находки подтверждают критический вклад РНК в ALS (Lagier-Tourenne et al., 2010).
Более того, TDP-43 был обнаружен с РНК гранулах в дендритах (Liu-Yesucevitz et al., 2011) , а нейрональная активность потенциально регулирует транспорт TDP-43 в дендритные шипы (Wang et al., 2008). Итак. эти находки подтверждают возможную связь патогенеза ALS с дефектным транспортом мРНК и нарушенным контролем трансляции.
Всё ещё спорно, является ли агрегация RBPs ответственной за развитие нейродегенеративных болезней. Т.к. образование агрегатов и секвестрация RBPs происходит в цитоплазме, то уровни TDP-43 и FUS/TLS белков снижаются в ядрах затронутых клеток. Остается показать, является ли это критическим для развития нейродегенерации (Liu-Yesucevitz et al., 2011). Кроме того, эти цитоплазматические агрегаты являются позитивными маркерами SG. Понимание этих наблюдений может привести к новому пониманию патогенеза ALS и в принципе к идентификации др. RBPs при болезнях нервной системы.
Было также предположено, что альтерации в RBPs ассоциируют с влиянием транскриптов на их регуляцию, оборот и сплайсинг. Недавно сообщалось, что уровни мРНК и сплайсинг некоторых мРНК, кодирующих белки, участвующих в синаптических функциях, зависит от уровней TDP-43. TDP-43, по-видимому, является критическим для поддержания нормальных уровней и паттернов сплайсинга более чем 1000 мРНК, богатых транскриптами для кодироания белков, связанных с синаптической активностью. Кроме того, TDP-43 регулирует экспрессию некоторых связанных с болезнью транскриптов, напр., FUS/TLS или Grn (encoding progranulin) мРНК и обеспечивает альтернативный сплайсинг своих собственных транскриптов (Polymenidou et al., 2011). Xiao et al. (2011) идентифицировали 5 генов, которые потенциально регулируются с помощью TDP-43 и подвергаются аномальному сплайсингу при ALS, включая FGF1 и NPLOC4. Эти два гена, в свою очередь, участвуют сами в ALS. Однако растут доказательства в пользу участия TDP-43 в стабилизации мРНК и поддержании физиологических уровней мРНК.
Большинство индивидов, страдающих от ALS, не имеют семейной истории. Однако в небольшой пропорции случаев обнаруживается ассоциация с некоторыми генетическими дефектами (Strong, 2010; Andersen & Al-Chalabi, 2011). Два недавних исследования,опубликованных в том же номере Neuron (Renton et al., 2011) пролили новый свет как на с хромосомной 9 сцепленные ALS и FTD, приобщив их к классу нарушений с увеличенными некодирующими повторами. Они показали, что экспансия повтора в 6 нуклеотидов является генетической основой семейных и спорадических случаев ALS. Авт. показали сцепление, которое является общей причиной семейных ALS, и является одной из наиболее важных причин спорадических ALS. Итак, эти экспансии оказывают не только специфическое влияние на ALS и FTD, но и даже подкрепляют гипотезу, что аберрантный метаболизм РНК вносить важный вклад во все нарушения с оющими признаками нарушений двигательных нейронов.
В заключение, ALS и лобно-височная дегенерация, являются нейродегенеративными заболеваниями, которые обнаруживают множество сходств в клинических симптомах и патологических находках. Более 45 мутаций FUS/TLS, по-видимому, играют роль в возникновении ALS (Da Cruz & Cleveland, 2011). Для TDP-43, более 40 мутаций ассоциируют с ALS и FTD, подтверждая прямую связь этих RBP с патогенезом болезней. Почти все мутации собраны в кластеры в C-терминальном богатом глицином регионе. Более того, аберрантный процессинг TDP-43 , как полагают, непосредственно ведет к нейродегенерации. Необратимая агрегация обоих RBPs оказывает влияние на ALS и FTD. Это открывает возможность новых терапевтических стратегий, имеющих целью предупредить агрегации RBP (Liu-Yesucevitz et al., 2011). Box 1 - ALS Epidemiology: Although ALS is among the most common of the motor neuron diseases, its overall incidence (1-3/100 000) and prevalence (3-8/100 000) are still low. The disease can develop in all age groups but peaks between 50 and 70 years with a median onset at age 56-58. An onset < 20 years is rare. There is a slight male predominance (1.5 : 1). Most cases of the disease are sporadic with familial forms accounting for only about 5-10% of cases. In about 10-20% of these familial forms a mutation in copper/zinc superoxide dismutase (SOD1) is found. Recent studies in familial forms have identified several other mutations. Symptoms: ALS is a degenerative progressive disease affecting the upper as well as the lower motor neuron. Early symptoms can be unspecific with cramping and muscle fasciculations. Progression is characterized by muscle weakness often starting distally in the arms and legs or affecting bulbar muscles leading to early dysarthria and dysphagia (bulbar forms). At the beginning, symptoms can be asymmetric. Muscle atrophy (lower motor neuron) is typically accompanied by increased muscle tone, spasticity and hyper-reflexia including pathological reflexes (upper motor neuron). Between 15% and 40% of patients develop pseudobulbar symptoms consisting of uncontrollable laughter and crying. Most patients do not develop cognitive impairment or personality changes. However, psychiatric co-morbidity, mainly severe depression, is common. During the further course of the disease, patients lose the ability to walk and develop respiratory insufficiency due to effects on the respiratory muscles. There is no specific treatment for the disease and current treatment strategies consist mainly of symptomatic therapies. Most patients die within 3-5 years from symptom onset with very few patients showing a more benign course with survival > 10 years. Box 2 - FTD Epidemiology: FTD accounts for approximately 5-10% of all cases of dementia but is the second most prevalent form of dementia among patients with a symptom onset < 60 years. Its prevalence is unknown but is estimated to be between 3 and 15/100 000. Symptom onset is usually at age 50-60 with a wide range. Symptoms: FTD is part of a wider range of diseases caused by degeneration of the frontal and/or temporal lobe (frontotemporal lobar degeneration). General classifications subdivide into: (i) behavioural variant frontotemporal dementia; (ii) progressive non-fluent aphasia; and (iii) semantic dementia. More recent classifications also include ALS + FTD as well as cortico-basal degeneration and progressive supranuclear palsy. FTD is mainly characterized by behavioural and personality changes as well as speech disturbance early in the course of the disease. Differentiating FTD from Alzheimer's dementia can be difficult but typical early behaviour combined with early onset of the dementia have a high predictive value. Neuroimaging including single-photon emission computed tomography (SPECT), position emission tomography (PET) and magnetic resonance imaging (MRI) may support the diagnosis later in the course of the disease showing hypoperfusion, hypometabolism and atrophy of the frontal and/or temporal structures. Molecular overview of survival of motor neuron Survival of motor neuron (SMN) это повсеместно экспрессируемый белок, который находится как с ядре, так и цитоплазме нейронов (Kolb et al., 2007). SMN белки содержат законсервированный домен tudor (Selenko et al., 2001). Интересно, что белок tudor дрозофилы, как полагают, вносит критический вклад в локализацию определенных mtrRNAs у эмбрионов, выполняя ключевую роль в образовании полярных клеток (Amikura et al., 2001). Более того, этот домен ответственен за взаимодействие со стержневыми белками сплайсесом, patient Smith (SM). Структурный анализ выявил, что домен tudor обеспечивает межбелковые взаимодействия с RBPs скорее, чем связывание РНК непосредственно (Selenko et al., 2001).
SMN необходим для сборки сплайсесом (Liu et al., 1997). Аберрантный сплайсинг был предположен в качестве молекулярной основы spinal muscular atrophy (SMA) (Selenko et al., 2001). Кроме того, SMN важен для образования SGs (Hua & Zhou, 2004). Клетки с пониженными уровнями SMN обнаруживают нарушения локализации РНК, т.е. пониженные уровни poly(A) мРНК в аксонах (Fallini et al., 2011). Прямое взаимодействие SMN с транскриптами грузами пока не наблюдалось. Однако, SMN ассоциирует с ELAV-like protein 4 (HuD), hnRNP R и Q (Syncrip), KSRP (KH-type splicing protein) и FMRP (Fallini et al., 2011). HnRNP R, в свою очередь, соединяется с 3'-UTR vHYR β-actin (Zhang et al., 2003), после чего локализуется в аксонах двигательных нейронов. Пониженные уровни β-actin в ростовых конусах также снижают рост аксонов развивающихся нейронов, происходящих от SMA (SMN-/-; SMN2-positive; see below) модельных мышей, подтверждая, что SMN играет важную роль в локализации β-actin. Rossoll et al. (2003) пришли к заключению, что аксональные отростки короче, что жизнеспособность нейритов не снижена в двигательных нейронах от этих животных, моделирующих SMA.
Ведение ростового конуса базируется на локальной трансляции β-actin (Leung et al., 2006). Прерывание локальной трансляции вносит вклад в патофизиологию SMA (Rossoll et al., 2003) , это подтверждается находками, что SMN физически ассоциирует с FMRP (Piazzon et al., 2008), известным регулятором трансляции (Laggerbauer et al., 2001). Влияет ли отсутствие SMN на трансляцию, предстоит установить.
В противоположность людям, которые имеют два гена SMN (SMN1 and SMN2), только один ген Smn гомолог человеческого SMN1) существует у мышей (SMN). Мышиные модели показали, что потеря гена Smn вызывает эмбриональную летальность (Schrank et al., 1997). Летальность может быть устранена внесением двух копий человеческого гена SMN2, но дает мышей с SMA (Monani et al., 2000). Нейроны, полученные от этих мышей (SMN-/-; SMN2-positive) обнаруживают слабое окрашивание β-actin в ростовых конусах и дистальных частях аксонов (Rossoll et al., 2003). Survival of motor neuron disease link - spinal muscular atrophy Спинальная мышечная атрофия, наследственное заболевание (Lukong et al., 2008), которое обусловлено прогрессирующей дегенерацией клеток передних рогов спинного мозга, приводящее в конечном итоге к нарушениям нижних двигательных нейронов (see Box 3 - SMA).
Нарушение обусловлено потерей или гомозиготными мутациями в теломерной копии гена SMN (SMN1) (Lefebvre et al., 1995). Центромерная копия (SMN2) неспособна полностью компенсировать SMN1 и защитить от SMA (Lorson et al., 1999). В противоположность SMN1, экспрессирующему транскрипт полной длины, SMN2 прежде всего генерирует укороченную изоформу, лишенную экзона 7 (SMN?7). Возникающий в результате SMN2 белок олигомеризуется с меньшей эффективностью и затем быстро деградирует (Lorson et al., 1998). SMA характеризуется пониженными уровнями белка SMN. Было показано, что в большинстве случаев уровни белка SMN коррелируют с тяжестью болезни (Lefebvre et al., 1997).
Учитывая критическую роль SMN в сборке сплайсесом, патофизиологические нарушения SMA, как полагают, возникают из-за дефектов в биогенезе spliceosomal small nuclear ribonucleoprotein (snRNP) (Liu et al., 1997). Единодушно принимается, что модель, единственно объясняющая SMA посредством дефектов сплайсинга, по-видимому, слишком проста в отношении важности SMN в различных RNP гранулах (Liu-Yesucevitz et al., 2011). Сегодня возможное влияние SMN на трансляцию остается неподтвержденным (см. выше). Возможно, что SMA вызывается дефектами метаболизма РНК потенциально на уровне сборки RNP и последующей локализации мРНК (Rossoll et al., 2003).
Почему двигательные нейроны в спинном мозге специфически склонны к потере SMN? Было предположено, что нижние двигательные нейроны содержат очень высокие концентрации SMN и SMN-interacting protein 1 по сравнению с др. тканями (Liu et al., 1997). Такие уровни могут быть необходимы для локализации достаточных количеств мРНК. Дефектные выросты аксонов, однако, в принципе объясняют высокую специфичность SMA в двигательных нейронах (Rossoll et al., 2003). Итак, взаимодействия SMN с известными RBPs и его роль в сборке RNP и локализации мРНК предоставляют новую информацию о патофизиологии SMA.
Можно предположить, что дефекты в метаболизме мРНК и важность участвующих RBPs ранее были недооценены при аксонопатиях, таких как ALS (см. выше, FUS/TLS и TDP-43). Поэтому мы полагаем, что многие новые РНК и ассоциированные молекулы будут идентифицированы по их участию в нейродегенеративных болезнях в будущем. Box 3 - SMA Epidemiology: SMA is an autosomal recessive disease with degeneration of the lower (spinal) motor neurons. Even though SMA is the leading genetic cause of infant death, it is an overall rare disease with an incidence of approximately 10/100 000 births. SMA is subdivided into four main disease manifestations: Type I (severe, Werding-Hoffmann disease) with an onset at 0-6 months; Type II (intermediate), onset 7-18 months; Type III (mild, Kugelberg-Welander disease), onset > 18 months; and Type IV (adult) with an onset in the second or third decade of life. Symptoms: SMA is characterized by degeneration of the lower motor neurons. In contrast to ALS, there is no involvement of the upper motor neuron. Thus, symptoms consist of muscle hypotonia, weakness and atrophy. Manifestation varies depending on the type of SMA and ranges from very early and severe muscle weakness leading to early respiratory complications to only mild weakness developing in later life decades. Other clinical findings consist of missing tender reflexes and fasciculations. Diagnosis can be supported using electromyography, showing signs of denervation with spontaneous activity with positive sharp waves and fasciculations. Recruitment is decreased and action potentials show high amplitudes. As > 90% of SMA cases are caused by mutations in the SMA gene, genetic testing can often confirm the diagnosis. Fragile X mental retardation protein Molecular overview Белок Fragile X mental retardation является ещё одним интересным RBP, который вносит критический вклад в транспорт мРНК, а также в контроль трансляции в синапсах (Dictenberg et al., 2008; reviewed in Bassell & Warren, 2008). FMRP является частью RNPs, которые не только обнаруживаются в клеточных телах, но и также в отрастающих нейритах, аксонах (Price et al., 2006) а также в дендритах (Feng et al., 1997). Как и др. RBPs, FMRP является мультидоменовым белком, обладающий новым N-терминальным доменом FMRP (Adinolfi et al., 2003), мотивом на N-конце, двумя KH доменами и одним RGG-типа РНК-связывающим доменом (Ramos et al., 2003). Он соединяется с РНК с высоким сродством (Lukong et al., 2008), включая локализуемые мРНК, такие как MAP1B (Antar et al., 2005), CaMKIIa (Kao et al., 2010), PSD-95 (Zalfa et al., 2007) , а также со своим собственным транскриптом (Ceman et al., 1999). В большинстве случаев (66%), FMRP распознает свои мишени РНК внутри кодирующей последовательности (Darnell et al., 2011).
Интересно отметить, что идентифицировано несколько разных РНК мотивов, распознаваемых FMRP. Во-первых, RGG box из FMRP, как известно, распознает мотивы G-квартета, структуру из 4-х остатков гуанина, которые расположены в плоскостной конформации (Ramos et al., 2003). Во-вторых, KH2 домен в FMRP распознает элемент из специфической последовательности внутри сложной третичной структуры, называемой FMRP kissing комплекс (Darnell et al., 2005). Эти in vitro надавно были перепроверены в новом исследовании с использованием HITS-CLIP (Darnell et al., 2011). Интересно, что ни один из двух упомянутых выше мотивов РНК, не был обогащен в мишенях для FMRP. Напротив, FMRP HITS-CLIP выявил неожиданный способ взаимодействия белок-РНК, который пока не понятен на молекулярном уровне. Конечно, FMRP д. распознавать новые и ещё неизвестные мотивы РНК. Альтернативно, он может быть рекрутирован на свои мишени посредством дополнительных RBPs и нуждается в кооперативном связывании.
Белок Fragile X mental retardation в первую очередь ассоциирует с рибосомами (Darnell et al., 2011), связывая их с аппаратом трансляции. Эта ассоциация теряется, когда точковая мутация вносится во второй домен связывания РНК (I304N) в FMRP (Zang et al., 2009). Серия исследований предоставила доказательства, что FMRP регулирует трансляцию белков, важных для собственно синаптической функции. In vitro, экзогенный FMRP ингибирует трансляцию разных транскриптов (Laggerbauer et al., 2001). Дополнительная работа связана с участием FMRP в репрессии следующих мишеней, напр., MAP1B, CaMKIIa или activity-regulated cytoskeleton-associated protein (Arc/Arg3.1) (Zalfa et al., 2003).
Интересно, что имеются также доказательства, что он может также участвовать в активации трансляции (Bechara et al., 2009). Как уже упоминалось выше системные HITS-CLIP исследования Darnell et al. (2011) идентифицировали крупную серию мишеней для FMRP (Darnell et al., 2011). Конечно. не все из этих мишеней могут регулироваться в синапсах; однако, большинство из них кодируют хорошо известные постсинаптические белки, особенно mGluR5 (see below) и компоненты рецепторного комплекса N-methyl-D-aspartic acid r (Darnell et al., 2011, and references therein). Следовательно, неудивительно, что оба эти сигнальные пути в синапсах критически используются в синаптической long-term potentiation (LTP) и long-term depression (LTD), нейропатических болях и функционировании рецепторов gamma-aminobutyric acid в нейрона среди прочего.
Как же регулируется FMRP в качестве репрессора трансляции? Предполагается участие фосфорилирования и дефосфорилирования аминокислоты серина в позиции 499 в FMRP млекопитающих (Ceman et al., 2003; Coffee et al., 2011). Отмечается, что FMRP скорее всего высвобождает от трансляционной репрессии FMRP мишени после синаптической активности (Narayanan et al., 2008). Поскольку FMRP ассоциирует с RNA-induced silencing complex (RISC) и microRNAs путем взаимодействия с РНК, то предполагается, что microRNAs может вносить вклад в регуляцию FMRP-зависимой трансляции. Однако, связь между FMRP, microRNA-индуцированным комплексом замалчивания и микроРНК, как полагают, очень сложна (Krol et al., 2010).
Др. интересной функцией FMRP помимо регуляции трансляции в дендритах и даже в дендритных шипах, как недавно установлено Dictenberg et al. (2008), которые предоставили строгие доказательства, что FMRP непосредственно ассоциирует с кинезином, молекулярным мотором, который перемещается вдоль микротрубочек. Это позволило авт. предположить, что FMRP функционирует как адаптор для мотора, внося вклад в зависимый от микротрубочек транспорт мРНК зависимым от стимулов образом. Итак, FMRP регулирует трансляцию белка внутри клеточного тела, а также в синапсах. Кроме того, он осуществляет функции по локализации мРНК в дистальных частях дендритов. Fragile X mental retardation protein and fragile X syndrome/fragile X-associated tremor/ataxia syndrome Увеличение повторов триплетов внутри гена fragile X mental retardation 1. Fragile X syndrome (FXS) (see Box 4 - FXS) было первым генетическим заболеванием, сцепленным с регуляцией РНК, затрагивающим когнитивную функцию у человека (Bassell & Warren, 2008). FXS обусловливается экспансией повторов триплета CGG в 5'-UTR в гене fragile X mental retardation 1 (FMR1). FMR1 относится к семейству генов, которые включают два аутосомных члена, FXR1 и FXR2 (Lukong et al., 2008). Однако, их ассоциация с болезнью человека установлена недостаточно по сравнению с FMR1. У здоровых индивидов наиболее распространенная нормальная длина этого повтора в 5'-UTR FMR1 равняется 30 триплетам. Индивиды с FXS, напротив, имеют более 200 повторов, которые обозначаются как полная мутация. Ингибирование транскрипции при FXS, ведет к небольшому количеству или отсутствию FMRP мРНК и к потере FMRP белка (Penagarikano et al., 2007). Пациенты с 55-200 повторами, с часто наз. премутациями, ещё не проявляют FXS, но обнаруживают ассоциацию с fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (FXTAS). При FXTAS, транскрипция мРНК FMRP увеличивается, тогда как эффективность трансляции снижается, приводя к слишком большому количеству мРНК и к нормальным или слегка уменьшенным уровням белка (see Box 6 - FXTAS) (Jacquemont et al., 2007). Нейроны, происходящие от FXS, autism spectrum disorders (ASDs) или болезни Алцгеймера, как известно, обнаруживают измененную морфологию дендритных шипов, тогда как ни количество. ни размер дендритных шипов не изменены (Fiala et al., 2002; Penzes et al., 2011). В случае нейронов FXS, наблюдается высокая плотность удлиненных и увеличенных шипов (Wisniewski et al., 1991).
Box 4 - FXS Epidemiology: FXS is the most common cause of intellectual disability, mental retardation and the most common single gene cause of autism. Due to the wide range of severity of symptoms, the exact incidence of the disease is unknown but FXS is estimated to affect about 1 in 4000 individuals worldwide. The disease is caused by a CGG-triplet expansion in the FMR1 gene on the X-chromosome. The normal repeat count varies from 6 to about 55 triplets, 55-200 are usually referred to as permutation and > 200 triplets as full mutation leading to a penetrance of almost 100% in male patients. Both genders can be affected but women show a less severe phenotype due to inactivation of the affected X-chromosome copy in somatic cells. Symptoms: The severity of symptoms can vary between mild intellectual impairment (normal IQ) with only minor learning difficulties up to severe mental retardation. Cognitive symptoms mainly affect short-term and visual memory, executive functions and mathematical performance. The average IQ of male patients carrying the full mutation is 40. Other signs include psychiatric symptoms such as social anxiety, atypical social development, gaze avoidance and stereotypical movements. Severely affected individuals show a syndrome that meets diagnostic criteria for autism (approximately 5% of autistic disorders). Typical somatic findings are a characteristic elongated face, large protruding ears, macro-orchidism and low muscle tone. Epileptic seizures occur in up to 20% of cases. Box 5 - ASDs Symptoms: Characteristic features are impaired social interaction, language deficits and repetitive behaviours or interests, typically referred to as the three core domains. ASDs show a strong tendency to associate with other syndromic disorders, such as FXS (Abrahams & Geschwind, 2008). These disorders are often characterized by a set of shared features, although the key domains can be differently affected. For example, abnormal social interaction including decreased (non-verbal) communication, e.g. facial expression or body language, as well as gaze avoidance or reduced attempts to interact and focus on others; language deficits are delayed or absent speech, as well as difficulties in initiating or maintaining a conversation. Features in the repetitive domain include abnormal preoccupations, repetitive execution of rituals or routines, e.g. stereotypical motor behaviours. Эпидемиология: затронуто от 600 до 700 на100 000 индивидов (Fombonne, 2009). Интересно, что мальчики, по-видимому, обнаруживают повышенный риск заболеть. Термин ASDs в целом обозначает группу распространенных нарушений развития. Он может быть далее подразделен на следующие подклассы, которые сортируются в соответствии с их превалированием в отношении уменьшения: (i) распространенное нарушение развития - не специфицировано в др. отношениях (распространенность приблизительно 300 на 100 000) (Fombonne, 2009); (ii) аутистические нарушения (распространенность примерно 200 на100 000) (Fombonne, 2009); (iii) синдром Asperger (распространенность 26 на 100 000) (Abrahams & Geschwind, 2008); (iv) синдром Rett (распространенность до 9 на 100 000 женщин) (Laurvick et al., 2006); и (v) childhood disintegrative disorder syndrome (распространенность до 2 на 100 000) (Fombonne, 2009).
Широко распространенное нарушение развития - не специфицировано в др. отношениях: этот термин 'not otherwise specified' указывает на то, что пациенты обнаруживают нарушения в каждом из трех основных доменов, но урезанные множества для собственно диагностики не достаточны (Abrahams & Geschwind, 2008), оно не классифицируется ни как тяжелое аутистическое заболевание ни как его более легкая форма синдрома Asperger.
Аутистическое нарушение: очевидно наиболее широко известное нарушение в этом контексте, аутистическое нарушение представляет наиболее тяжелый конец линейки ASDs. Аутистическое нарушение, в свою очередь, является гетерогенным и характеризуется дефицитом в каждом из трех основных доменов уже в возрасте 3-х лет: (i) нарушение социального взаимодействия, (ii) речь и (iii) диапазон интересов (see above). При аутистических нарушениях соотношение затронутых мальчиков к девочкам 4 : 1 (Abrahams & Geschwind, 2008). Если учитывать только тяжелые случаи, то это соотношение может быть до 1 : 1 (Abrahams & Geschwind, 2008).
Asperger syndrome: Пациенты, страдающие от синдрома Asperger обнаруживают существенный дефицит своих социальных взаимодействий и пределов своих интересов, но они не соответствую критериям вовлечения домена речи. Они соотв. используют соответствующий возрасту язык и не страдают от умственной отсталости.
Rett syndrome: Это нарушение в основном затрагивает женщин. Клиническими признаками являются маленькие руки, споты и голова (микроцефалия) а также повторяющиеся движения рук. Последние включают повторяющиеся потирания рук или заталкивание рук в рот. Наблюдаются часто судороги, сколиоз, недостаточность роста, запоры и желудочно-кишечные нарушения (Abrahams & Geschwind, 2008).
Childhood disintegrative disorder syndrome: Затронутые индивиды обнаруживают позднее начало, а именно, в возрасте двух лет, а также дефицит в трех основных доменах - социальных взаимодействиях, языке и пределах интересов. Это часто сопровождается последующей регрессией уже достигнутых способностей (Abrahams & Geschwind, 2008). Потеря навыков, включая социальные, языковые и моторные потери более тяжелые по сравнению с аутистическими нарушениями. Синдром Childhood disintegrative disorder часто сопровождается потерей контроля над мочевым пузырем и кишечником, судорогами и умственной отсталостью (Kurita et al., 2005).
Box 6 - FXTAS Epidemiology: This disease was first described by Hagerman et al. (2001). The exact incidence and prevalence are unknown. The disease is associated with a shorter premutation in the FMR1 gene and is clinically distinct from FXS. In contrast to FXS, which is present from birth and usually does not show progression in adulthood, FXTAS presents as a neurodegenerative disease with a late onset (> 50 years) and shows progressive worsening. There is a gender predominance for male patients and it is estimated that up to 75% of > 80-year-old patients with an FMR1 premutation develop symptoms of FXTAS. Symptoms: Symptoms consist of a predominant (gait) ataxia, intention and postural tremor, distal peripheral polyneuropathy and parkinsonism with early gait disturbance and falls. The clinical syndrome is often difficult to differentiate from other multi-system atrophies. Symptoms progress over time with most patients losing the ability to walk and take care of most activities of daily living. Cognitive decline leads to attention control, loss of working memory, executive functions and learning, whereas the speech is often spared. Involvement of the autonomic nervous system is often present and leads to bowel and bladder incontinency, impotence and orthostatic failure. Endocrinological problems can occur. Falls occur at a mean of 6 years after onset of symptoms with the necessity of gait support between 5 and 15 years. Life expectancy is about 20 years after first motor symptoms occur. Потеря fragile X mental retardation белка ведет к увеличению трансляции в отсутствие FMRP, как при FXS, выявляется остановка рибосом, тем самым ускоряется трансляция мРНК мишеней для FMRP. Кроме того, многие рибосомы рекрутируются после 'run-off', приводя в результате к изменению синаптической функции, что ведет к когнитивным и поведенческим симптомам, обычно наблюдаемым при FXS (Darnell et al., 2011). Эта гипотеза нуждается в подтверждении, поскольку авт. получили мало доказательства, что мРНК (происходящие с зависимых от дозы генов), кодирующие синаптические белки, существенно избыточно экспрессируются когда FMRP - трансляционный тормоз - отсутствует. Это ставит множество интересных вопросов. Как осуществляет FMRP остановку рибосом на своих мРНК мишенях? Как этот трансляционный контроль функции FMRP регулируется посредством внутриклеточной передачи сигналов? Кроме того, убедительные доказательства прямой связи потери FMRP-зависимой остановки (stalling) рибосом с синаптической дисфункцией у пациентов с FXS всё ещё отсутствуют, но представляются интересными в качестве рабочей гипотезы (Darnell et al., 2011).
Итак, Darnell et al. (2011) продемонстрировали, что FMRP регулирует трансляцию во время фазы элонгации. Более того, находки подтверждают модель гомеостатичной синаптической пластичности для FMRP, т.e. предоставляют верхний предел реакции нейронов на стимуляцию на клеточном уровне скорее, чем на уровне индивидуальных синапсов.
Согласно теории Metabotropic glutamate рецепторов fragile X syndrome Long-term депрессия является формой зависимой от синтеза белка синаптической пластичностью и запускается с помощью активации mGluRs (Huber et al., 2002). FRMP синтезируется после активации mGluR и затем ограничивает LTD путем ингибирования mGluR-зависимой трансляции синаптических мРНК, кодирующих предполагаемые 'LTD белки' (Krueger & Bear, 2011). Интересно, что LTD увеличивает у мышей дефицит в FMRP, указывая тем самым на вклад FMRP в зависимую от активности синаптическую пластичность. mGluR теория FXS предсказывает, что в отсутствие FMRP повышенная трансляция белков будет вносить вклад в синаптическую пластичность в ответ на активацию mGluR5 (Huber et al., 2002). Эти находки могут служить основой для новых терапевтических подходов для FXS. Снижение активности mGluR должно в принципе восстанавливать синтез регулярных синаптических белков, хотя FMRP отсутствует. Это представляет возможную стратегию целенаправленного лечение без замещения самой молекулы FMRP (Krueger & Bear, 2011). По крайней мере, FXS мышиные модели показывают, что антагонисты mGluR5 снижают симптоматику (хотя не всю) (Yan et al., 2005). Более того, антагонисты N-methyl-D-aspartic acid receptor (NMDAR) также участвуют, обнаруживая позитивный эффект.
Др. биологические пути также нарушены при FXS. Помимо пути mGluR GABAergic путь нарушается специфически. Кроме того, выявлена ассоциация с функцией калиевых каналов и мускариновыми холинергическими рецепторами при FXS (Rooms & Kooy, 2011). Fragile X mental retardation protein and autism Fragile X syndrome (see Box 5 - FXS) является наиболее распространенной одиночной генетической причиной аутизма (2-6% всех случаев аутизма) (Hagerman et al., 2010). Darnell et al. (2011) также пролили новый свет на молекулярные механизмы познавательной деятельности и поведения. Поиски в базах данных (Croning et al., 2009) вновь идентифицированных РНК мишеней для FMRP выявили интересные параллели с синаптическими белками головного мозга мышей. Более того, существует значительное перекрывание генов, которые хорошо известны как гены кандидаты на роль при ASD [база данных Autism Research (SFARI) ] (Banerjee-Basu & Packer, 2010), включая neuroligin-3, neurexin-1, Shank3 или tuberous sclerosis (complex) (TSC)2 (см. ниже). Все эти молекулы участвуют в патогенезе ASDs (Darnell et al., 2011). В этом контексте, захватывающая гипотеза была предложена, исходя из предположения, что мутации белков, которые ограничивают трансляцию, могут вызывать аутизм (Kelleher & Bear, 2008). FXS обнаруживает строгую клиническую ассоциацию с ASD (see Box 4 - FXS and Box 6 - FXTAS). Исследования Darnell et al. (2011) показали новые значения FMRP в ASDs. FMRP, как было установлено, связывает РНК и вносит вклад в локализацию РНК и регуляцию трансляции. Итак, эта работа также успешно продвинула вперед наши знания нейрональной регуляции и когнитивной способности. Помимо информации на молекулярном уровне, эти находки также выдвинули новые идеи относительно терапевтических подходов. Кроме того, поскольку транслокация рибосом не останавливается в отсутствие FMRP, некоторые антибиотики, которые снижают транслокацию рибосом, уже стали объектом обсуждения относительно клинических испытаний (see also Therapy strategies and outlook). Принимая во внимание данные, предоставленные Darnell et al. (2011), дальнейшими кандидатами на роль лекарств являются пути сигнальной трансдукции Extracellular-signal Regulated Kinases (ERK) и mammalian target of rapamycin (mTOR), а также некоторые их компоненты, которые регулируются посредством FMRP (Narayanan et al., 2008), и в принципе могут ослаблять симптомы FXS и аутизма (Darnell et al., 2011) (see Mammalian target of rapamycin).
Помимо участия FMRP в контроле трансляции и его связи с аутизмом, альтернативные ассоциации FMRP в патогенезе ASD уже были предложены ранее. FMRP не только присутствует на постсинаптической стороне синапсов, но и также обнаруживается в пресинаптических компартментах в комплексах, обозначаемых как fragile X гранулы, в основном обнаруживаются в развивающемся головном мозге (Christie et al., 2009). FMRP локализация в аксонах и ростовых конусах может также служить для регуляции локальной трансляции белков, напр., необходимых для ведения аксонов. Это в принципе указывает на ключевую роль FMRP во время развития головного мозга (Li et al., 2009). Пациенты с ASD часто развиваются нормально вплоть до 2-х лет. Большинство пациентов затем страдают от регрессии имеющихся способностей (Christie et al., 2009). Хорошо известным признаком ASDs у детей является увеличенный головной мозг (Courchesne et al., 2003). Это потенциально подталкивает в направлении дефектов в урезании, которое обычно затрагивает пресинаптические сайты (Aylward et al., 1999). Дефекты урезания per se является ключевым признаком FXS (Irwin et al., 2001). Поэтому было предположено, что клинические признаки при FXS также как и при аутизме могут быть обусловлены потерей функции FMRP в пресинаптических сайтах (Christie et al., 2009). Fragile X mental retardation protein and epilepsy Др. интересной мишенью для FMRP является Kv4.2 мРНК, кодирующая напряжением управляемые калиевые каналы, участвующие в регуляции синаптической пластичности. FMRP ко-локализуется с Kv4.2 мРНК и соединяется с её 3'-UTR, указывая на ассоциацию FMRP и Kv4.2 мРНК в дендритах. Lee et al. (2011) предположили, что FMRP регулирует локальную трансляцию Kv4.2 мРНК, но не важен для её локализации в дендритах. Необходимость локального синтеза белка для синаптической пластичности или формирования долговременной памяти продемонстрирована недавно (Kang & Schuman, 1996; reviewed in Sutton & Schuman, 2006).
Интересно, что экспрессия Kv4.2 мРНК повышается каак у fmr1 нокаутных мышей, так и у индивидов, страдающих от FXS. Lee et al. (2011) установили, что после временной активации NMDAR, уровни белка Kv4.2 снижаются, что сопровождается усилением трансляции Kv4.2 мРНК, зависмой от FMRP и обеспечиваемой с помощью Kv4.2 3'-UTR. Потеря функции Kv4.2из увеличивает индукцию LTP (Chen et al., 2006), тогда как увеличение Kv4.2 снижает величину LTP, это ассоциирует с эпилепсией или болезнью Алцгеймера (Birnbaum et al., 2004). В этом контексте следует отметить, что активация NMDAR ведет к дефосфорилированию mTOR [нуждается в protein phosphatase 1 (PP1)], сопровождаемому дефосфорилированием субстратов из S6 kinase1 (S6 kinase1 субстраты являются нижестоящими эффекторами mTOR). Последние включают рибосомальный белок S6, а также FMRP (оба дефосфорилируются с помощью PP1). При базовых условиях трансляция Kv4.2 супрессируется с помощью FMRP, но после активации NMDAR экспрессия Kv4.2 увеличивается (Lee et al., 2011). Предполагается, что нейроны от fmr1 нокаутных (KO) мышей обнаруживают аномальную синаптическую пластичность, обусловленную избытком активности каналов Kv4. В свою очередь, блокатор канала Kv4 heteropodatoxin был предложен для клинической оценки (see also Therapy strategies and outlook), т.к. его применение восстанавливает LTP на срезах головного мозга от fmr1 нокаутных мышей (Lee et al., 2011).
Итак, непосредственное подавление Kv4.2 (посредством деградации) также как и последующая активация Kv4.2 важны для гомеостаза. Т.к. трансляционная регуляция Kv4.2 зависит от FMRP и т.к. FXS характеризуется потерей FMRP, поэтому исследование Lee et al. (2011) связывает умственную отсталость при FXS с нарушением LTP, обусловленным дефектным контролем трансляции, который зависит от FMRP. Находки, представленные здесь, могут также определенное значение и при ASDs. Более того, определенные добавочные трансмембранные субъединицы, а именно, dipeptidyl aminopeptidase-like protein 6 (DPP6) и dipeptidyl aminopeptidase-like protein 10 (DPP10), влияют на экспрессию, также как и на открытие каналов Kv4.2 и влияют на чувствительность к аутизму (Marshall et al., 2008). Кроме того, измененные уровни канала Kv4.2 участвуют в эпилепсии и болезни Алцгеймера (Birnbaum et al., 2004). Следовательно, эти исследования открывают новые области изысканий, которые, безусловно, приведут к лучшему пониманию этих болезней и к целенаправленно терапии. Pur alpha Molecular overview Pur alpha (Pur α) который связывает как ДНК, так и РНК. Во-первых, он распознает однонитчатую ДНК и может действовать как транскрипционный фактор, или активируя или репрессируя экспрессию генов (Darbinian et al., 1999). Изменения уровня белка Pur a происходят в ходе всего клеточного цикла (Stacey et al., 1999) и белок участвует в контроле как репликации, так и транскрипции ДНК.
В головном мозге, Pur a участвует в пролиферации нейронов и дендритогенезе (Hokkanen et al., 2012). В нейронах, Pur a присутствует как в теле клетки, так дендритах зависимым от времени способом (Johnson et al., 2006). Более того, Pur a участвует в транспорте дендритной мРНК, т.к. он является одним из компонентов гранул нейрональных РНК (Kanai et al., 2004; Johnson et al., 2006), ко-локализуется с Staufen1, а также с локализованными в дендритах мРНК (Kanai et al., 2004). Более того, Pur a участвует также в локальной трансляции мРНК microtubule-associated protein 2 (MAP2). Это подтверждается наблюдением Hokkanen et al. (2012), что экспрессия MAP2 снижается у мышей, лишенных Pur a, указывая на ключевую роль Pur a в регуляции MAP2. Более того, Pur a ассоциирует как со свободными, так и со связанными с мембраной полирибосомами посредством своих рибосомальных субъединиц, указывая на участие в цитоплазматической трансляции (Ohashi et al., 2002).
Предположен и др. механизм репрессии трансляции. Некодирующие РНК играют важные роли в регуляции трансляции локализованных мРНК в дендритах (Wang et al., 2005) и в синапсах (Wang & Tiedge, 2004). Исследование Johnson et al. (2006) выявило, что Pur a ассоциирует как с некодирующими РНК, напр., brain cytoplasmic RNA 1 (BC1) (Kobayashi et al., 2000), так и с мРНК, которые доставляются в дендриты in vivo (Johnson et al., 2006). Итак, эти находки подтверждают роль Pur a в супрессии трансляции (Gallia et al., 2001).
первая информация о возможной функции в нейронах Pur a получена в исследовании, которое анализировало нейроны, происходящие от Pur a нокаутных мышей (see below). Эти дефицитные по Pur a нейроны обладали аномальным образованием синаптических соединений, на что указывало отсутствие значительного количества PSD-95 фокусов (Johnson et al., 2006). Кроме того, MAP2, это хорошо известный маркер дендритов (Caceres et al., 1984), заметно снижен у purine-rich element protein 1 (PURA)-/- мышей, указывая тем самым на критическую роль Pur a в доставке специфических мРНК в дендритные сайты и потенциально в их локальной трансляции. Более того, наружный гранулярный слой, как было установлено, не мигрирует внутрь у PURA-/- мышей во время развития мозжечка (Johnson et al., 2006). Ранее миграция внутрь наружного гранулярного слоя была идентифицирована как критическая для образования дендритов (Goldowitz & Hamre, 1998), указывая на влияние Pur a, посредством аберрантной ламинации, на аномальное образование дендритов. Более того, имеются доказательства, что Pur a и др. RBPs, такие как Staufen, преимущественно обнаруживаются в точках ветвления дендритов и в основании дендритных шипов, но не в аксонах нейронов гиппокампа крыс (Johnson et al., 2006). В предыдущих исследованиях полирибосомы были обнаружены в этих точках ветвления и в основании дендритных шипов (Bartlett & Banker, 1984), которые были идентифицированы как предполагаемые сайты локальной трансляции мРНК (Tiedge & Brosius, 1996). Итак, имеющиеся доказательства указывают, что Pur a играет роль в образовании дендритов в развивающихся нейронах; однако его точная роль при этом остается неясной. Также известна его роль в некоторых физиологических процессах, Pur a связан с патофизиологией FXTAS (see Pur alpha and fragile X-associated tremor/ataxia syndrome). Pur alpha and fragile X-associated tremor/ataxia syndrome Fragile X-associated tremor/ataxia syndrome (see Box 6 - FXTAS) отличается от FXS (Jin et al., 2007). Строгие доказательства указывают на участие Pur a в FXTAS, делая Pur a мышиную модель важным исследовательским инструментом, который позволяет выявлять лежащую в основе патофизиологию. Отсутствие Pur a у мышей приводит к аномальной морфологии головного мозга и ранней гибели (Khalili et al., 2003; Hokkanen et al., 2012). Мыши, которые выживают обнаруживают мегалоэнцефалию. Имеющиеся данне подтверждают Pur a может вносить критический вклад в функцию головного мозга и важен для пролиферации клеток нейральных предшественников во время постнатального развития голового мозга (Hokkanen et al., 2012).
Первоначально FXS and FXTAS были единственными связанными с экспансией повторяющихся триплетов в гене FMR1 (см. Box 4 - FXS и Box 6 - FXTAS). Особенно пациенты с FXTAS являются носителями предмтационных аллелей (55-200 CGG повторов) в гене FMR1. Первоначально knockin мышиная модель, содержащая (CGG)98 повторов служила в качестве пригодного инструмента для изучения FXTAS (Van Dam et al., 2005). Центральным признаком как FXTAS так и соотв. мышиной модели является нейродегенерация. Интересно, что сходные нейропатологические изменения наблюдались также у Pur a нокаутных мышей (Hokkanen et al., 2012). RNA inclusions in fragile X-associated tremor/ataxia syndrome Несколько RBPs, участвующих в связывании РНК, содержат типичные для FXTAS CGG повторы и образуют включения в нейронах. Эти RBPs включают hnRNP A2/B1, Muscleblind-like 1 белок и скорее всего Pur a. hnRNP A2/B1 ассоциирует с предмутационной длиной rCGG повторов (Jin et al., 2007). Сходным образом, секвестрация Muscleblind-like 1, как полагают, ведет к образованию ядерных фокусов (Iwahashi et al., 2006) и нейродегенерации (Lukong et al., 2008).
Лежащий в основе FXTAS патофизиологический механизм остается неизвестным. Модель токсической функции избыточности РНК, как полагают, ведет к образованию внутриядерных включений в нейронах и астроцитах (Hagerman & Hagerman, 2004). Pur a обнаруживается во включениях головного мозга пациентов с FXTAS (Greco et al., 2006). Drosophila Pur a, как было установлено, соединяется с CGG повторами, которые возникают при FXTAS (see Box 6 - FXTAS). Одна модель предполагает, что RBPs д. секвестрировать CGG-содержащие РНК во включения, которые в конечном итоге ведут к гибели нейронов. Альтернативно, увеличение повторов д. приводить к аномальному связыванию Pur a с РНК. После насыщения связывания, функциональные Pur a могут отсутствовать или их уровни существенно редуцированы. В дальнейшем Pur a может быть оттитрован от физиологических мишеней и это не позволит ему выполнять свою физиологическую роль. Это подтверждается тем фактом, что избыточная экспрессия Pur a у Drosophila предупреждает деградацию нейронов. Это указывает на то, что увеличение повторов триплетов при FXTAS может быть обусловлено токсичностью РНК вместо дефекта в аберрантном белке, который является продуктом самого гена, продуцирующего повторы. Отсутствие функционального Pur a может приводить к недостаточности локализации мРНК внутри нейронов, потенциально вызывая гибель клеток нейронов (Jin et al., 2007). Сходный механизм был предположен при миотонической дистрофии (Roberts et al., 1997). Принимая во внимание, что сиквенс-специфическое связывание Pur a законсервировано у Drosophila и млекопитающих , Pur a может играть важную роль в патогенезе FXTAS. Cap-binding protein 80 and the exon junction complex Molecular overview У позвоночных имеется ядерный cap-binding complex (CBC), который состоит из двух cap-binding proteins (CBPs), CBP20 и CBP80. CBC соединяется с предшественниками мРНК в ядре и остается ассоциированным с мРНК во время её созревания и экспорта из ядра. Эти находки указывают на важную роль в сплайсинге и экспорте из ядра РНК из m7G-capped мРНК (Ishigaki et al., 2001). В цитоплазме необходим т. наз 'пионерский раунд трансляции', чтобы удалять CBC и компоненты exon junction complex (EJC) с транскриптов, которые содержатся в этих RNPs (Ishigaki et al., 2001). Вместо этого цитоплазматический CBP eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) теперь ассоциирует с мРНК для эффективной 'устойчивой' трансляции.
Имеются доказательства, что CBP80 присутствует в RNPs, которые участвуют в локализации РНК в клетках млекопитающих. Исследование Jonson et al. (2007) идентифицировало CBP80 - вместе с компонентами EJC - в качестве инициаторов FLAG-tagged IMP1 (ZBP1)-содержащих гранул, изолированных из эмбриональных почечных клеток 293 (HEK293) человека. Поскольку eIF4E и 60 S рибосомальные субъединицы не были найдены, то это позволило авт. предположить, что внедренные мРНК ещё не были транслированы (Jonson et al., 2007). Эти находки прекрасное добавление к двум разным исследованиям, одно с использованием ооцитов Drosophila и одно с использованием нейронов гиппокампа. Оба идентифицировали стержневые члены EJC всё ещё ассоциированные с локализованной oskar мРНК на заднем полюсе ооцитов (Hachet & Ephrussi, 2004), а др. с Arc мРНК в дендритах вблизи синапсов (Giorgi et al., 2007). Более того, недавняя работа di Penta et al. (2009) убедительно показала, что CBP80 не только существует в ядре, а также в теле клетки, но также и в дискретных фокусах в дендритах нейронов гиппокампа (di Penta et al., 2009). Итак. эти находки указывают на то, что CBP80- и EJC-позитивные RNPs формируются в ядре и что некоторые из них оказываются локализованными в самостоятельных компартментах, содержащих локализованные мРНК. которые ещё не подверглись трансляции. Possible links to spinal muscular atrophy and autism spectrum disorder/tuberous sclerosis (complex) Сегодня существует мало прямых доказательств, что CBC связаны с заболеваниями нейронов. Интересно отметить. что недавнее исследование выявило похожий Sm protein 1 (LSm1)-CBP80-mRNA-содержащий комплекс в рибонуклеопротеиновых частицах (mRNP) в аксонах двигательных нейронов спинного мозга (di Penta et al., 2009). Поскольку SMN ко-локализуется с этими RNPs, то можно предположить, что возможно существует потенциальная связь с SMA (see Box 3 - SMA). Более того, некоторые белки внутри CBP80-связывающих mRNPs оказываются фосфорилированными после стимуляции инсулином. Поскольку фосфорилирование было чувствительно к rapamycin, то было предположено, что mTOR может регулировать такие CBP80-позитивные mRNPs (Ma et al., 2008). Насколько мы смогли обрисовать Mammalian target of rapamycin, это может представлять возможную связь с ASDs (see Box 5 - ASDs) . а также с tuberous sclerosis (TS) (see Box 7 - TS). Box 7 - TS Epidemiology: TS, also referred to as TSC, is an autosomal dominant disease associated with the growth of harmatomas and other non-malignant tumours typically in the brain, skin, eyes, heart, lungs and kidneys. The prevalence is estimated to be around 10-16 cases per 100 000 newborns and 7-12 cases per 100 000 in the total population. TS occurs in both genders with no gender predominance. Symptoms: Symptoms depend on the affected organ. Often the diagnosis is made after occurrence of epileptic seizures caused by cortical tubers. Other brain manifestations consist of subependymal nodules and giant cell astrocytomas often leading to blockage of the foramen of Monroi with subsequent hydrocephalus. In addition to seizures, which are typical of TS, neurological manifestations may include developmental delay and behavioural problems. Learning difficulties are observed in about half of the patients. Almost all patients show skin abnormalities often consisting of facial angiofibromas with a butterfly pattern around the nose and early pigment abnormalities ('ash leaf spots'). Other non-neurological manifestations involve non-malignant tumours of the kidneys (60-80%), cysts in the lungs, rhabdomyomas of the heart that regress over time and astrocytic harmatomas in the eye. Factors that regulate mRNA localization Mammalian target of rapamycin Molecular overview mTOR является serine/threonine kinase protein kinase, которая регулирует клеточный рост, клеточную пролиферацию, подвижность клеток, жизнеспособность клеток, транскрипцию, синтез белка (Hay & Sonenberg, 2004) and dynamics of the cytoskeleton (Sandsmark et al., 2007). Одной из основных функций является то, что она критически используется для инициации cap-зависимой трансляции. В клетках существуют комплексы из двух белков: mTOR complex 1 (mTORC1) содержит mTOR и адапторный белок Raptor, и mTORC2 содержит mTOR и др. адапторный белок Rictor. Rapamycin, бактериальный иммуносупрессант, который используется для предупреждения отторжения при трансплантации органов, ингибирует mTOR путем ассоциации с его внутриклеточный рецептор FK506-binding protein 12 (FKBP12) и разрушает mTORC1 (Richter & Klann, 2009). Интересно, что компоненты сигнального пути mTOR были найдены в синапсах, где они регулируют локальный синтез белков (Hay & Sonenberg, 2004). Более того, mTOR регулирует серию важных нижестоящих мишеней, напр., eIF4E-связывающие белки и S6 kinase, которые присутствуют в синапсах (Tang et al., 2002). Интересно, что имеются указания, что mTOR также регулирует RBPs, которые являются компонентами РНК гранул в нейронах, напр., FMRP (Narayanan et al., 2008) или nucleophosmin (NPM). NPM является снующим между ядром и цитоплазмой белком, который участвует в регуляции экспорта из ядра рибосом, снующими между ядром и цитоплазмой (Sandsmark et al., 2007). Эти RBPs участвуют в локализации РНК в дендритах, а также в локальном синтезе белков. Более того, имеются доказательства, что mTOR может участвовать в регуляции трансляции локализованных транскриптов, напр., MAP2, CaMKIIa мРНК (Gong et al., 2006) или PSD-95 мРНК (Lee et al., 2005). Локальный белковый синтез с транскриптов, таких как MAP2 и CaMKIIa, в свою очередь, является обязательным условием для формирования памяти и синаптической пластичности, включая LTP и LTD (Miller et al., 2002; Bramham & Wells, 2007). Итак, эти данные указывают на роль mTOR в регуляции в синапсах нового синтеза белка с транскриптов, локализованных в дендритах.
Gong et al. (2006) продемонстрировали важную роль рецепторов глютамата, напр., NMDARs, AMPA рецепторов и mGluRs, и сигнального пути mTOR в регуляции синтеза белков в дендритах в живых нейронах. Напротив, этот phosphatidic acid-обусловленный эффект на локальную трансляцию в дендритах устраняется после добавления rapamycin. Кроме того, они сообщили, что rapamycin разрушает трансляцию от NMDAR- и mGluR-stimulation-dependent репортерной конструкции в дендритах. Итак, эти результаты строго указывают на то, что активация рецепторов глютамата затем повышает передачу сигналов mTOR, это, в свою очередь, запускает локальную трансляцию ключевых синаптических белков. Т.о., активация пути mTOR возможно регулирует LTP и LTD (Gong et al., 2006).
Lee et al. (2005) предоставили в своей работе интересное доказательство, что инсулин индуцирует локальную трансляцию мРНКl PSD-95. Напротив, инсулин не влияет на уровни мРНК PSD-95. Авт. показали, что индукция локальной трансляции PSD-95 скорее всего регулируется посредством активации tyrosine kinase-Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-Protein Kinase B (PKB/Akt)-mTOR сигнального пути (Lee et al., 2005). Mammalian target of rapamycin dysregulation in diseases affects neuronal mRNA localization Растут доказательства, указывающие, что неправильная регуляция mTOR ассоциирует с болезнями человека, включая рак и диабет (Inoki et al., 2005). Наиболее уместными для этого обзора являются нарушения развития нейронов, нейродегенеративные и нейропсихиатрические болезни, напр., аутизм (Hoeffer & Klann, 2010) и FXS (Sharma et al., 2010). Более того, нарушения негативных регуляторов mTORC1 вмешиваются в синтез белков в синапсах и поэтому изменяют синаптическую пластичность и функцию памяти (Santini & Klann, 2011). Далее представлены примеры специфических нейрологических нарушений, которые, как было установлено, обнаруживают аберрантную передачу сигналов mTOR в качестве общего молекулярного механизма, строго указывающего на во влечение в их этиологию.
Повышенная передача сигналов mTORC1 недавно была описана несколькими группами на мышах, моделирующих FXS (Liu-Yesucevitz et al., 2011 and references therein). Следовательно, mTORC1 может в принципе делать возможной реверсию синаптической дисфункции, когда FMRP отсутствует (Narayanan et al., 2008; Santini & Klann, 2011), делая mTOR кандидатом на роль терапевтической мишени (see also Therapy strategies and outlook)при FXS и аутизме.
Tuberous sclerosis (комплекс) аутосомно доминантное нарушение, вызываемое мутациями гена или TSC1 (hamartin) или TSC2 (tuberin) (Inoki et al., 2005). Продукты этих генов негативно регулируют передачу сигналов mTOR . Мутации только в одном из двух аллелей (TSC1/2) достаточны. чтобы вызывать усиление передачи сигналов пути mTOR . разрушение TSC1 приводит к увеличению экспрессии белка NPM (see above) и к NPM-зависимому увеличению биогенеза рибосом (Pelletier et al., 2007). В этом отношении NPM является ключевым компонентом пути передачи сигналов mTOR.
Интересно, что дефицит обучаемости и памяти у TSC2 гетерозиготных нокаутных мышей снижается после применения ингибитора mTORC1, rapamycin (Ehninger et al., 2008). Такие поведенческие дефициты были также обнаружены у мышей, моделирующих TSC, при отсутствии типичных нейропатологических признаков (see Box 7 - TS), включая опухоли головного мозга (tubers) и аберрантную плотность дендритных шипов, что ранее считалось как причина когнитивных нарушений при TS (Santini & Klann, 2011 and references therein). Избыточная передача сигналов mTOR может быть лежащим в основе молекулярным механизмом, который вызывает дефицит когнитивной способности и поведенческие отклонения при TS. Нейропатологические признаки могут быть результатом активности и др. молекулярных факторов (Santini & Klann, 2011) или могут быть обусловлены усилением передачи сигналов mTOR.
В мышиных моделях, которые дефектны по TSC или phosphatase и гомологу tensin, оба представляют собой вышестоящие негативные регуляторы mTORC1, были обнаружены ASD-подобные симптомы, которые напоминают поведение, сходное с таковым при ASDs у человека, и которые ослабляются при применении rapamycin (Liu-Yesucevitz et al., 2011 and references therein). Итак, повышенная передача сигналов mTORC1, по-видимому, является ключевым механизмом синаптической дисфункции, потенциально проявляющимся в унифицированных молекулярных дефектах ASDs.
Это д. быть конечной целью для разработки новых стратегий терапевтических вмешательств (see also Therapy strategies and outlook) на самой ранней из возможных фаз различных болезней скорее, чем попытка ослабить симптомы у пациентов, у которых болезнь длится уже несколько лет. Специфические патологические признаки, которые являются основой нарушений нейронов, поведения и когнитивной способности у пациентов. страдающих от нарушений нейрального развития , включая аберрантную морфологию дендритных шипов (reviewed in Fiala et al., 2002).
mTORC1 также играет критическую роль в нейропсихиатрических заболеваниях. таких как депрессия или шизофрения, в нейродегенеративных заболеваниях, включая болезнь Паркинсона,Гентингтона и Алцгемера, а также нарушения нейрального развития, такие как FXS, TSC или ASDs. Localized RNAs В этом обзоре мы сфокусировались на болезнях, вызываемых мутациями в RBPs (see also Lukong et al., 2008; Cooper et al., 2009) и их вредных последствиях. Хотя очень мало имеется хорошо задокументированных случаев таких дефектов в локализованных РНК, особенно в ЦНС, мы ожидали, что мутации РНК, которые нарушают паттерн её локализации, д. иметь столь же радикальные последствия. как и мутации их соотв. RBPs. Во-первых, мРНК FMR1, кодирующая FMRP, локализована в дендритах и синапсах (Antar et al., 2004; Dictenberg et al., 2008). Во-вторых, мутантные мыши, которые лишены дендритной CaMKIIa мРНК и поэтому значительно сниженные синаптические CaMKIIa белки, проявляются нарушениями пространственной памяти, ассоциативным нагнетанием страхов и нарушением памяти распознавания объектов. Эти находки указывают на то, что локализация мРНК в дендритах вносит критический вклад в синаптическую пластичность и консолидацию памяти (Miller et al., 2002). Поэтому время поразмышлять, почему нарушения локализации мРНК в дендритах скорее всего вызывают нейрологические болезни. В-третьих, Arc-дефицитные мыши, как было установлено, обнаруживают гипервозбудимость и повышенную чувствительность к судорогам (Peebles et al., 2010). Более того, экспрессия Arc мРНК снижена при болезни Алцгеймера, а Arc может участвовать в нейропсихиатрических заболеваниях (Korb & Finkbeiner, 2011). В-четвертых, Shank3 мРНК - кодирующая члена большого класса постсинаптических каркасных белков - присутствует в молекулярных слоях гиппокампа, указывая на локализацию в дендритах (Bцckers et al., 2004). Интересно, что Shank3 белок взаимодействует как с PSD-95, так и Neuroligins. Недавно мутации в Shank3 оказались сцеплены с ASD (Yasuda et al., 2011).
Итак, мы предполагаем, что вызывающие болезни мутации или в RBPs, которые вносят критический вклад в локализацию мРНК в дендритах, или в их соотв. мРНК мишенях, будут представлять собой новые терапевтические мишени. Therapy strategies and outlook Некоторые нарушения, затрагивающие нервную систему часто развиваются годами. Лежащий в основе молекулярный дефицит, однако, который в большинстве случаев неизвестен, приводит к симптомам, которые становятся очевидными только в поздний период жизни. Нашим желанием было предоставить новые доказательства связи различных нервных болезней со специфическим дефицитом в метаболизме РНК, включая сборку RNP, локализацию мРНК в дендритах и регуляцию трансляции.
Хотя это является очень молодой и в основном неисследованной областью, мы ожидаем, что установим значительно больше связей с локализацией мРНК в дендритах и с дисфункцией синапсов в будущем. Др. выдающийся пример RBP представляют белки Nova, которые регулируют нейрональный сплайсинг в синапсах (Ule et al., 2003). Систематические CLIP исследования выявили сеть РНК, где большинство членов выполняют важную синаптическую функцию.
Собрав всё вместе с новой информацией мы верим, что это может привести к открытию многообещающих мишеней для новых терапевтических стратегий (в направлении 'персонализованной медицины'). Приведенные примеры включают всё увеличивающуюся способность ZBP1 действовать после повреждения нервов и предупреждать агрегацию RBP при ALS/FTD. Др. пример, это снижение активности mGluR, чтобы восстанавливать регулярный синтез синаптических белков или замедлять транслокацию рибосом при FXS. Более того, mTORC1, как полагают, может выступать в качестве терапевтической мишени при FXS/autism. Наконец, мы убеждены, что такие стратегии, когда станут клинически доступными, будут применяться как можно раньше в ходе и даже до манифестации болезни.
|