Нейробластома одна из наиболее широко распространенных солидных опухолей у детей и обнаруживает широкий спектр клинического поведения: в некоторых случаях имеется благоприятный прогноз с минимумом терапии, тогда как в др. случаях имеется плохой прогноз, несмотря на агрессивную терапию (1, 2). Все случаи классифицируются на три группы: группы низкого, промежуточного и высокого риска, исходя из клинических и биологических характеристик (1, 2). Подобная, неслыханная гетерогенность бросает вызов объяснению вплоть до молекулярной генетики и биохимического анализа опухолей и начинает проливать свет на несоизмеримое клиническое поведение. Из многих генетических и биохимических признаков нейробластом, амплификация онкогена MYCN коррелирует с агрессивностью фенотипа и плохим исходом (1, 2). Недавние исследования показали, что MYCN обнаруживает не только онкогенную активность, но и также играет центральную роль в самообновлении нормальных нейральных стволовых клетки и клеток предшественников (3, 4).

Нейробластома возникает из клеток, которые обычно дают эмбриональную структуру, называемую нервным гребнем (5). Клетки нервного гребня состоят из мультипотентных и миграторных популяций клеток, которые дают разнообразные клеточные клоны, включая Шванновские клетки, меланоциты, черепно-лицевые хрящи и кости, гладкие мышцы, периферические и энтерические нейроны и глию (5). Т.о., клетки нервного гребня служат в качестве мультипотентных стволовых клеток, которые дифференцируются в зрелые нервные ткани. Сегодня предполагается, что мультипотентные клетки нервного гребня могут вносить вклад в туморогенез нейробластом благодаря аберрантной экспрессии MYCN (5).

Asymmetric cell division (ACD) это физиологический процесс во время развития и тканевого гомеостаза в большом разнообразии модельных организмов, таких как Drosophila, Caenorhabditis elegans и мыши (6, 7). Кроме того, ACD описан при гематопоэзе гематопоэтических клеток человека и клеток предшественников и легочных раковых клеток (8, 9). Стволовые клетки должны делиться асимметрично, так что одна дочерняя клетка сохраняет потенциал самообновления, тогда как др. предназначена для дифференцировки во временно амплифицирующиеся клетки. Кстати, ACD была исследована в системах, упомянутых выше и эти исследования ACD предоставили доказательства, что участвующие молекулы сильно консервативны у беспозвоночных и позвоночных (6, 7). Хотя некоторые стволовые клетки у взрослых делятся асимметрично при нормальном гомеостазе, они сохраняют способность делиться симметрично, чтобы восстановить пул стволовых клеток, истощенный при повреждении или болезни, как это наблюдается в нервной и гематопоэтической системах (10). Более того, известно, что баланс между самообновлением стволовых клеток и дифференцировкой точно контролируется, а дисбаланс ведет к туморогензу в нейробластах дрозофилы (11-13). Поэтому мы исследовали поведение ACD и symmetric cell division (SCD) в клетках нейробластомы человека.

ACD Preferentially Occurs in Human Neuroblastoma Cells with a Normal MYCN Copy, but Not in Cells with MYCN Amplification.

Мы сначала заинтересовались, является ли NuMA (Nuclear Mitotic Apparatus protein) (14-19), одним из консервативных полярных белков, расположенным в кортексе клетки, а также на полюсах веретена во время клеточных делений, используя клетки HeLa в качестве контроля (16). Эксперименты по иммуноокрашиванию показали, что NuMA локализуется в ядре во время интерфазы (15) и на полюсах веретена во время митозов (Fig. S1). Кроме того, мы установили, что NuMA локализуется также на обеих сторонах клеточного кортекса в поздней метафазе и этот сигнал локализации обнаруживает пик наивысшей интенсивности во время анафазы (Fig. S1). Центросомы также окрашивали анти-γ-tubulin антителами, чтобы избежать фальшивых результатов, вызванных неравномерным окрашиванием. Т.о., эти результаты показали, что клетки HeLa обнаруживают симметричные деления полярных клеток и что клетки, обнаруживающие асимметричные деления, были очень редки, когда окрашивание NuMA использовали в качестве маркера клеточного кортекса (0.7%, n = 301). Затем мы отобрали несколько клеточных линий нейробластом человека с или без амплификации гена MYCN. Статус гена MYCN был подтвержден в каждой клеточной линии с помощью fluorescence in situ hybridization (FISH) (Fig. S2). Мы непрерывно исследовали уровни экспрессии белка MYCN в линиях клеток нейробластом с помощью иммуноблоттинга и иммуноокрашивания (Fig. 1A and Fig. S3). Оба результата показали, что в то время как уровни экспрессии MYCN были очень низкими в клеточных линиях с нормальным количеством копий MYCN [NB69, SK-N-SH, SH-SY5Y (a subclone of SK-N-SH), (20) и SK-N-FI], уровни экспрессии MYCN были высокие, но слегка отличные от клеточных линий с амплифицированным MYCN [TGW, SK-N-BE (2), CHP-212, and SK-N-DZ (Fig. 1A and Fig. S3)]. Окрашивание на β-Catenin показало, что в то время как плотные соединения были полностью сформированными в клетках с одиночной копией MYCN (SH-SY5Y), они были частично [TGW and SK-N-BE (2)] или полностью разрушены (SK-N-DZ) в клетках с амплификацией MYCN (Fig. S3). Кроме того, экспрессия CD133, предполагаемого маркера нейральных стволовых клеток (21), была позитивной во всех MYCN-амплифицированных клеточных линиях за исключением CHP-212 (Fig. 1A). Однако экспрессия CD133 была негативной в клеточных линиях с нормальной копией MYCN (Fig. 1A). Для клеточной линии CHP-212 мы предположили, что в то время как CHP212 за пару минут формирует амплификацию MYCN, она происходит из первичного места опухоли (22), др. MYCN-амплифицирующие клеточные линии с гомогенно окрашиваемым регионом, формирующие амплификацию MYCN, происходят из метастазов в костный мозг (www.atcc.org). Используя эти клеточные линии, мы тестировали, могут ли эти клеточные линии нейробластомы обнаруживать асимметричное распределение NuMA в кортексе клеток. Во всех клеточных линиях с амплификацией MYCN, полумесяц NuMA располагался на обоих клеточных кортексах во время митозов (Fig. 1B and Fig. S4). Однако в линиях клеток с нормальным числом копий MYCN наблюдалось асимметричное распределение NuMA на одной стороне клеточного кортекса во время поздних митотических стадий (Fig. 1C and Fig. S4). Кроме того, мы также осуществляли анализ иммуноокрашивания, используя антитела к anti-pan в качестве маркера клеточной мембраны, чтобы избежать ложных картин, вызыванных неравномерным окрашиванием и установили асимметричное распределение NuMA, как и ожидалось (Fig. 1 D and E and Fig. S4). Мы дополнительно проделали сходные эксперименты с использованием нескольких одиночных клонов, изолированных из родительских клеточных линии с (TGW) или без (SH-SY5Y) амплификации MYCN, поскольку специфические популяции клеток внутри культивируемых клеток могли сохранять способность подвергаться ACD. В результате мы установили, что каждый клон не обнаруживает достоверных различий в показателе асимметричного распределения NuMA в митозах в сравнении с родительскими клеточными линиями (Fig. S5). Т.о., клеточные линии с не амплифицированным MYCN обнаруживают асимметричное клеточное распределение NuMA значительно чаще, чем MYCN-амплифицированные клеточные линии (P менее 0.0001) (Fig. 1F).

Centrosome Inheritance in the ACD of Human Neuroblastoma Cells.

Имеются некоторые противоречия относительно паттернов наследования центросом в процессе ACD из-за разных результатов, описанных в исследованиях, использовавших разные модельные системы. В G1 фазе клеточного цикла центросома содержит одну материнскую центриоль и одну дочернюю центриоль. После дупликации центриолей присутствуют три поколения центриолей: старая материнская, молодая материнская и две новые дочерние. Центросома со старой материнской центриолей наз. материнской центросомой. В случае Drosophila melanogaster самцовой зародышевой линии стволовых клеток материнская центросома остается в стволовой клетке, которая прикреплена к нише, тогда как дочерняя центросома мигрирует в клетки противоположной стороны с потенциалом дифференцировки (23). Однако в случае нейробластов Drosophila melanogaster материнская центросома не остается в дочерней клетке со способностью к самообновлению, а мигрирует в дочернюю клетку с потенциалом к дифференцировке (24, 25). Чтобы исследовать этот вопрос, мы предприняли исследование с иммуноокрашиванием клеток с (TGW) или без (NB69, SK-N-SH, SH-SY5Y, and SK-N-FI) амплификации MYCN, использовав антитела к маркеру материнской центросомы, ODF2/cenexin (26). ODF2/cenexin приобретается молодой материнской центриолью при переходе G2/M и во время митоза, а уровень ODF2/cenexin остается высоким в центросоме со старой материнской центриолью (Fig. S6) (26). Интересно, что наши результаты показали, что в то время как материнская центросома мигрирует в дочернюю клетку без полумесяца NuMA, то дочерняя центросома остается в др. дочерней клетке с полумесяцем NuMA в крупной популяции ACD клеток (Fig. 2 A-F). Кроме того, известно, что клетки с полумесяцем NuMA остаются как самообновляющиеся нейробласты, тогда как др. имеют большой потенциал дифференцировки в системе нейробластов дрозофилы (17, 18). Следовательно, по аналогии наши находки также подтверждают, что клетки с полумесяцем NuMA обладают большим потенциалом самообновления, чем др. клетки (14).

Knockdown of MYCN Expression Causes ACD in Human Neuroblastoma Cells with MYCN Amplification.

Как упоминалось выше, было подтверждено, что отсутствие экспрессии белка MYCN уменьшает популяцию самообновления и сохраняет баланс между стволовыми клетками и дифференцированным потомством посредством ACD. Напротив, в MYCN-амплифицированных клетках ACD едва обнаруживается, поскольку способность к самообновлению задается с помощью MYCN. Эти находки привели к идее, что MYCN может быть ключевым регулятором, который контролирует баланс между ACD или SCD. Чтобы проверить эту идею, подавляли экспрессию MYCN с помощью short-hairpin RNA (shRNA) в MYCN-амплифицирующих клетках [SK-N-BE (2) и SK-N-DZ (Fig. S7)]. После 72 ч после трансфекции shRNA подавление MYCN подтверждалось с помощью иммуноблоттинга (Fig. 3 A and Fig. S7A), а статус клеточного деления исследовался с помощью иммуноокрашивания (Fig. 3 B and Fig. S7B). Наши находки показали, что количества клеток с ACD фенотипом достоверно возрастали в обеих линиях клеток с нокдауном MYCN по сравнению с количеством в контрольных клетках (Fig. 3 C and Fig. S7C). Более того, паттерн наследоваия хромосом также оказался консервативным в этих клетках: материнская центросома мигрировала в дочерние клетки без полумесяца NuMA (Fig. 3 B and D and Fig. S7 B and D). Интересно, что экспрессия CD133 также подавлялась в обеих MYCN-амплифицирующих клетках, когда экспрессия MYCN подвергалась нокдауну (Fig. 3A and Fig. S7A).

Overexpression of MYCN Suppresses ACD and Enhances SCD in Human Neuroblastoma Cells with a Normal MYCN Copy

Следующая попытка индуцировать экспрессию MYCN, используя клеточную линию с tetracycline-репрессирумой экспрессией MYCN, которая наз. Tet21N (29). Линия клеток Tet21N происходит из клеточной линии нейробластомы, SH-EP (the substrate-adherent type), которая является субклоном SK-N-SH (the neuroblastic type) с нормальным числом копий MYCN (5, 20). Клетки Tet21N обнаруживают ACD фенотип, если экспрессия MYCN не индуцируется (Fig. 4 A and B). Спустя 72 ч после индукции экспрессии MYCN, которая подтверждена иммуноблоттингом (Fig. 4A), статус клеточных делений анализировали с помощью иммуноокрашивания (Fig. 4B). Как и ожидалось, индукция экспрессии MYCN приводила к супрессии ACD фенотипа и усиливала потенциал самообновления (Fig. 4 B and C). Кроме того, способ наследования центросом также оставался законсервированным в клетках, если экспрессия MYCN не была индуцирована (Fig. 4 D and E).

основной функцией MYCN, как известно, является транскрипция, которая регулирует экспрессию и репрессию большого разнообразия нижестоящих генов мишеней (30). Наконец, мы проверяли, ответственна ли транскрипция MYCN за ACD или SCD фенотип. Мы попытались индуцировать избыточную экспрессию MYCN (дикого типа) или MYCN-ΔLZ вектора, который является мутантным с делецией домена лейциновой застежки (31) и не может взаимодействовать с Max, приводя к дефициту транскрипции в клетках с нормальным числом копий MYCN (SH-SY5Y: the neuroblastic type). После 72 ч трансфекции MYCN или MYCN-ΔLZ вектора экспрессии, иммуноблоттинг подтвердил избыточную экспрессию MYCN или MYCN-ΔLZ в клетках (Fig. 4F), статус клеточных делений анализировался с помощью иммуноокрашивания (Fig. 4G). Когда избыточно экспрессировался MYCN в SH-SY5Y клетках, то экспрессия CD133 повышалась (Fig. 4F). Этот результат не является неожиданным, поскольку SH-SY5Y клетки, как известно, обнаруживают нейробластический фенотип (5). Напротив, экспрессия CD133 не повышалась в клетках, трансфицированных MYCN-ΔLZ вектором экспрессии (Fig. 4F) или в MYCN-индуцированных Tet21N клетках (Fig. 4A). Разный статус экспрессии CD133 может быть обусловлен разными фенотипами, представленными в двух клеточных линиях (neuroblastic или substrate-adherent), хотя они и произошли от одной и той же родительской линии клеток, SK-N-SH. Кроме того, когда MYCN избыточно экспрессируется, то клетки обнаруживают ACD фенотип значительно реже (Fig. 4 G and H). Однако, даже если избыточно экспрессируется MYCN-ΔLZ, то соотношение клеток, обнаруживающих ACD фенотип, было сходным между контрольными и MYCN-ΔLZ-трансфицированными клетками (Fig. 4 G and H). Эти результаты строго подтверждают, что MYCN контролирует баланс клеточных судеб в терминах будут ли они обладать ACD или SCD благодаря его транскрипционной функции.

Discussion

В данном исследовании мы установили, что клеточные линии нейробластомы человека без экспрессии MYCN обнаруживают фенотип ACD. Недавние исследования показали, что клетки нейробластомы человека содержат опухоль-инициирующие клетки, чей фенотип напоминает таковой раковых стволовых клеток, включая признаки, такие как самообновление, индукция многоклональной клеточной дифференцировки и высокая способность drug efflux (32, 33). Следовательно, представленная находка позволят добавить ACD фенотип в качестве признака рак-инициирующих/стволовых клеток, которые присутствуют в клеточных линиях нейробластомы с нормальным числом копий MYCN.

Наши находки показывают, что в то время как избыточная экспрессия MYCN супрессирует ACD и усиливает SCD, подавление MYCN вызывает ACD и супрессирует SCD в клетках нейробластомы человека. Эти результаты разумны, поскольку избыточная экспрессия MYCN может вызывать избыточную продукцию рак инициирующих/стволовых клеток с высокой частотой посредством SCD, приводя к появлению накапливающихся раковых стволовых клеток (10). Семейство генов MYC является ключевым транскрипционным фактором для продукции индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (34), и данное исследование с использованием дикого типа и делеционного мутантного MYCN вектора показало, что транскрипционная активность MYCN участвует в усилении накопления самообновляющейся популяции посредством SCD. Нейробластома с амплификацией MYCN, как известно, обнаруживает агрессивное поведение и данное исследование показывает. что избыточная продукция MYCN продуцирует избыток CD133-позитивных клеток посредством SCD и может объяснить один из механизмов, лежащих в основе агрессивности и печального исхода опухолей с амплификацией MYCN.

Мы полагаем, что MYCN является одним из компонентов, которые усиливают фенотип SCD и что могут существовать дополнительные позитивные регуляторы; одним из таких кандидатов является Bmi-1, который избыточно экспрессируется в MYCN-амплифицированных клетках (35-37) и необходим для самообновления стволовых клеток в периферической и ЦНС (38). Кроме того, окрашивание на β-catenin а данном исследовании показало, что в то время, когда плотные соединения полностью сформированы в клетках с одной копией MYCN (SH-SY5Y), они оказываются частично [TGW and SK-N-BE (2)] или полностью разрушены (SK-N-DZ) в клетках с амплификацией MYCN (Fig. S3). Полный набор плотных соединений и высокая частота ACD обнаруживаются в клетках с нормальным числом копий MYCN, указывая. что такие клетки могут получать внешние сигналы для ACD посредством межклеточных контактов (39).

Мы показали. что соотношение ACD варьирует в пределах от 1.7 до 30% в линиях клеток нейробластомы с или без амплификации MYCN. ACD является очень важной стратегией поскольку оно поддерживает соответствующие количества самообновляющихся и дифференцирующихся клеток с единственным делением; однако, нарушения этой стратегии приводит к тому, что стволовые клетки неспособны увеличиваться в числе (10). Соотношение ACD в 30% может быть верхним пределом линий клеток нейробластомы без экспрессии MYCN, поскольку клеточные линии будут терять свою популяцию самообновляющихся клеток, если более 30% клеток будут подвергаться ACD. Интересно, что человеческие CD34+ CD133+ гематопоэтические стволовые клетки и клетки предшественники обнаруживают ~20% ACD (8). Этот процент ACD сходен с таковым ACD, идентифицированным в данном исследовании линий клеток нейробластомы.

Мы показали, что MYC ингибитор, 10058-F4, супрессирует экспрессию MYCN, экспрессию CD133 и SCD и вызывает ACD в линиях клеток нейробластомы. Эти находки подтверждают, что определенные терапевтические агенты м. влиять на баланс между ACD и SCD в популяциях опухоль-инициирующих клеток.

В случае ACD, существует противоречие в отношении паттерна наследования центросом, поскольку описаны разные результаты на разных модельных системах: материнская центросома остается в дочерних клетках с потенциалом самообновлений в самцовой зародышевой линии стволовых клеток Drosophila male (23) и в клетках неокортекса развивающегося головного мозга мышей (40), тогда как материнская центросома мигрирует в дочерние клетки с потенциалом дифференцировки в нейробластах Drosophila (24, 25). Поскольку, как известно, NuMA (Mud: ортолог NuMA у Drosophila) соединяется с апикальными полярными белками, чтобы гарантировать апикально-базальную ориентацию митотического веретена в нейробластах Drosophila и мышиных эпидермальных клетках дермы (14, 18, 19), наши находки подтверждают паттерн миграции центросом, описанный в нейробластах Drosophila neuroblasts. Мы могли бы объяснить эти противоречивые результаты следующей возможностью. ODF2/cenexin, который был использован в качестве маркера старой материнской центросомы в наших экспериментах, как известно, является компонентом придатков материнской центриоли. Поскольку ODF2/cenexin обладает дифференцирующей активностью, такой как формирование первичной реснички (41), то мультипотентные стволовые клетки могут не выдерживать материнскую центросому из-за её дифференцирующего потенциала. Этот вопрос необходимо исследовать далее. In summary, we showed here that it is possible to analyze asymmetric cell division in human cancer by using cultured neuroblastoma cells. The manners of cell division of ACD or SCD and centrosome inheritance conserved in Drosophila neuroblasts are recapitulated in human cancer cells. Our findings may accelerate studies on the molecular mechanism of asymmetric cell division in human stem cells.

Evidence of asymmetric cell division and centrosome inheritance in human neuroblastoma cellsHideki Izumi and Yasuhiko Kaneko Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Oct 30;109(44):18048-53. doi: 10.1073/pnas.1205525109. Epub 2012 Oct 11.

Evidence of asymmetric cell division and centrosome inheritance in human neuroblastoma cells
Hideki Izumi and Yasuhiko Kaneko
Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Oct 30;109(44):18048-53. doi: 10.1073/pnas.1205525109. Epub 2012 Oct 11.