Посещений:
НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫЕ БОЛЕЗНИ

Роль микроРНК

MicroRNAs and neurodegeneration: role and impact
Masashi Abe, Nancy M. Bonini
Trends in Cell Biology, Volume 23, Issue 1, 30-36, 01 October 2012


miRNAs and neurodegeneration


Нейродегенеративные болезни это группа обычно с поздним началом прогрессирующих нарушений, приводящих к когнитивным и/или двигательным аномалиям. Некоторые из наиболее изученных включают t Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS) и polyglutamine (polyQ) нарушения, такие как (HD) и spinocerebellar ataxias (SCAs) [1,2,3,4,5]. Эти заболевания обнаруживают общие признаки, такие как аномальное накопление белка, сюда входят бляшки и клубки при AD, Lewy тельца при PD, bunina тельца при ALS и ядерные и цитоплазматические накопления при polyQ болезни. При этих заболеваниях ключевые белки накапливаются, гены которых могут обнаруживать семейные мутации. Механизмы, которые влияют на патогенез болезни, включают множественные фундаментальные клеточные пути, в том числе белки укладки и процессов очистки. Т.о., понимание патогенетических механизмов нуждается в исследовании широкого спектра основных клеточных аппаратов.
miRNAs являются малыми РНК приблизительно из 20-24 нуклеотидов (nt), которые регулируют трансляцию или уровни транскриптов мРНК мишеней [6,7,8,9]. Сотни miRNAs открыты у растений и животных, которые влияют на различные биологические процессы. miRNAs образуются в результате урезания первичного транскрипта в ядре (pri-miRNAs) с помощью Drosha/DGCR8 (Drosha/Pasha in Drosophila) микропроцессора, чтобы создавать предшественников miRNA (pre-miRNA) (Figure 1).



Эта pre-miRNA экспортируется в цитоплазму, где Dicer расщепляет её, высвобождая двунитчатый miRNA дуплекс. Одна из этих нитей преимущественно ассоциирует с комплексом Ago, чтобы сформировать miRNA-induced Silencing Complex (miRISC), тогда как др. нить обычно деградирует. У животных miRNAs распознают свои мишени, прежде всего, благодаря комплементарности с seed последовательностью нуклеотидов 2-8 на 5' конце miRNA. Сотни mRNA мишеней могут существовать для miRNA семейства и возможно, что большинство белок-кодирующих генов являются мишенями miRNAs.
Три основных подхода используются для изучения эффектов miRNAs на долговременную целостность головного мозга и нейродегенеративные болезни. Bo-первых, нарушение собственно биогенеза miRNA , сопровождаемое изучением эффекта на головной мозг с течением времени. Во-вторых, идентификация индивидуальных miRNAs, которые нацелены на специфические гены, вызывающие болезни, и их влияния. В-третьих, исследование влияния ассоциированных с болезнью белков на путь miRNA, такой как биогенез miRNA или функцию замалчивания мРНК (Figure 2).



Disrupting the miRNA biogenesis pathway causes neurodegeneration


Ряд подходов- включая клонирование miRNAs, анализ miRNA микромассивов и глубокого секвенирования малых РНК - выявил экспрессию избранных miRNAs в развивающемся головном мозге млекопитающих и первичных культурах нейронов [10,11,12,13]. Анализ паттерна экспрессии miRNAs с использованием гибридизации in situ с заблокированными зондами locked nucleic acid (LNA) у рыбок данио выявил их тканеспецифические паттерны [14]. Такие паттерны демонстрируют потенциальную роль miRNAs в развитии и функции нейронов. Последующие исследования выявили роли специфических miRNAs, таких как miR-124, в этих процессах [15,16,17].
Функциональная связь между miRNAs и нейродегенерацией была открыта в исследованиях эффекта глобального нарушения биогенеза miRNA на развитие нейронов. Мутантные Dicer мыши погибают рано, до нейруляции, не позволяя исследовать функцию их в головном мозге [18]. Однако, разрушение Dicer у рыбок данио выявляет существенную роль в морфологии головного мозга и в дифференцировке нейронов [19]. Инъекции miR-430 дуплекса устраняли дефекты морфологии головного мозга, указывая на важность этой специфической miRNA. Затем обусловленное нарушение Dicer в разных популяциях нейронов или клеточных линиях выявило эффект miRNA пути на пролиферацию, миграцию и дифференцировку, а также долговременную нейральную целостность [20,21,22,23,24,25]. Напр., уменьшение Dicer в embryonic stem (ES) снижает способность клеток дифференцироваться в допаминергические нейроны среднего мозга [24] - основной популяции нейронов, представленной при PD. Трансфекция фракции малых РНК из клеток эмбрионального среднего мозга мышей, устраняла дефект, указывая на роль малых РНК. В соответствии с этим делеция Dicer в допаминергических нейронах среднего мозга у мышей вызывает прогрессирующую потерю клеток, одновременно нарушение подвижности как при PD [24].
Др.пример, потеря Dicer из клеток Пуркинье в мозжечке мышей не вызывает нарушения клеточной морфологии или функции в молодом возрасте (8-10 нед.). Однако, на 13 неделе клетки Пуркинье, которые являются клеточным типом, представляющим большинство атаксий, прогрессивно дегенерируют. Интересно, что более старые мыши также обнаруживают легкий тремор и слабо выраженную атаксию, которая ухудшается с возрастом [20]. Разрушение Dicer в спинальных двигательных нейронах воспроизводит клинические и патологические признаки ALS, болезни, ассоциированной с потерей двигательных нейронов, указывая на возможное влияние пути miRNA на патогенез этой болезни [26]. Интересно, что некоторые ключевые белки, ассоциированные с этой болезнью, обнаруживают модуляцию биогенеза или функции miRNA (see below). Делеция Dicer в глиальных клетках, таких как астроциты и олигодендроциты может вызывать дегенерацию нейронов у мышей [27,28]. Кроме того, обусловленная потеря Dicer в Шванновских клетках у мышей выявляет его важность для целостности аксонов [29]. У человека уровень белка Dicer, как было установлено, снижен в височной доле при эпилепсии у пациентов с потерей клеток гиппокампа (sclerosis), при этом около половины miRNAs в этой ткани имеют пониженные уровни [30].
У Drosophila, нокдаун Dicer-1 также ассоциирует с потерей допаминергических потерь и дефектами подъёма [31]. Потеря Dicer-1 также повышает токсичность патогенных нейродегенеративных белков Ataxin-3 (ассоциированного с spinocerebellar ataxia type 3) и Tau (ассоциированного с AD и frontotemporal dementia [FTD]) у человека [32]. Интерсно, что уменьшение Dicer в клетках HeLa человека также повышает токсичность ассоциированного с болезнью белка Ataxin-3 , которая устраняется добавлением обратно фракции малых РНК, указывая тем самым на роль miRNAs. Это исследование идентифицировало специфическую miRNA, bantam, которая модулирует токсичность Ataxin-3 и Tau. Подтверждена роль miRNAs в патогенезе polyQ болезни, исследование Drosophila miR-34 выявило мощную нейрозащитную функцию в смягчении токсичности патогенных форм Ataxin-3 [33]. Помимо Dicer, гаплонедостаточность DGCR8, компонента микропроцессорного комплекса, который расщепляет pri-miRNAs, чтобы дать pre-miRNAs, ведет к нейрональной дисфункции у мышей [34,35,36].
Эти исследования, которые нацелены на разрушение компонент пути биогенеза miRNA, строго подтверждают, что активность miRNA влияет на долговременную целостность головного мозга. Заметим, однако, что идентификация индивидуальных miRNAs является критическим таких исследований. Дело в том, что потенциальный эффект нарушения биогенеза miRNA сказывается на собственно экспрессии многих родственных и неродственных генов. Др. причина того, что нарушение основных компонентов биогенеза miRNA может вызвать дисфункцию или дегенерацию независимо от эффекта на miRNAs. Напр., Drosha, др. компонент микропроцессора, регулирует нейрогенез путем контроля экспрессии Neurogenin 2 независимо от его роли в процессинге miRNA [37]. Эта функция влечет за собой связывание Drosha и расщепление шпилечной структуры в 3' untranslated region (UTR) РНК Neurogenin 2. Недавнее исследование также показало, что DGCR8 оказывает более широкое воздействие на процессинг РНК помимо miRNAs [38].

Individual miRNAs target disease genes


Попытки установить профили miRNAs в тканях от пациентов с нейродегенеративными заболеваниями позволили идентифицировать miRNAs, которые неправильно регулируются в головном мозге, некоторые из них, как было установлено, непосредственно нацелены на транскрипты генов семейных болезней. Недавние обзоры обсуждают роль miRNAs в общераспространенных нейродегенеративных заболеваниях [39,40,41]. В целом открытие специфических miRNAs, которые нацелены на 3'UTR ключевых генов болезни, чем оценка паттерна экспрессии и уровня этих miRNAs, может раскрыть степень, с которой они могут влиять на уровень болезнь вызывающего белка и тем самым на патогенез.
AD это наиболее широко распространенное нейродегенеративное заболевание и хотя оно преимущественно спорадическое, анализ семейных ситуаций выявил критические гены для его этиологии [2]. Патологические признаки AD связаны с отложением внутриклеточных нейрофибриллярных клубков, содержащих белок Tau и внеклеточными бляшками, содержащими amyloid-beta (Aβ ) пептиды в головном мозге. Повышенная продукция и нарушенная очистка от Aβ , скорее всего, является причиной накопления Aβ. Различные Aβ пептиды продуцируются в результате расщепления amyloid precursor protein (APP) с помощью β -site APP-cleaving enzyme 1 (BACE1) и γ-secretase. Некоторые из этих событий преобразования способствуют образованию амилоида, тогда как др. нет [3].
Исследования AD выявляют прирожденные и сложные петли регуляции miRNA. miR-29a/b оказывается подавленной у ряда AD пациентов, которые обнаруживают повышенную экспрессию белка BACE1, который, как полагают, способствует образованию амилоидогенного пептида [42]. 3'UTR у BACE1 содержит сайт мишень для miR-29a/b и эти miR-29 воздействуют на BACE1. BACE1 3'UTR также содержит сайты для др. miRNAs, включая miR-107, miR-124 и miR-195 [43,44,45]. miR-107 подавлена при AD и воздействует на cofilin, компонент палочковидной актиновой структуры в головном мозге пациентов AD. miR-15a, которая принадлежит к семейству miR-107/103, также подавляется у пациентов AD [46]. Интересно, что семейство miR-15 может воздействовать на extracellular signal-regulated kinase 1 (ERK1), которая является Tau kinase, и это может в принципе приводить к аномальному Tau фосфорилированию in vivo, др. патологическому признаку AD [47]. Др. miRNAs также участвуют в патологии AD, включая miR-16, miR-101, miR-106a, miR-520c и miR-153, которые целенаправленно воздействуют на APP [48,49,50]. В целом эти находки подчеркивают критическое влияние избранных miRNAs на регуляцию экспрессии центральных белков в патогенезе и прогрессировании AD.
ALS характеризуется дегенерацией двигательных нейронов в головном и спинном мозге, обнаруживая общий клинический и патологический спектр признаков с FTD, второй широко распространенной деменцией [4]. РНК-связывающие белки TDP-43 и FUS участвуют в патогенезе ALS и FTD. TDP-43 мутантен у ряда ALS пациентов, а нокдаун TDP-43 в клетках человека ведет к аберрантной экспрессии некоторых miRNAs [51]. У мышей дефицит miR-206 ускоряет прогрессирование болезни в моделях ALS [52], это вместе с эффектом потери Dicer воспроизводящем патогенез ALS [26], подчеркивает важность собственно регуляции miRNAs и пути miRNA в патогенезе ALS.
Напр., открытие петли miRNA-мишень, которая законсервирована у мух и людей и была выявлена в исследовании miR-8 miRNA и одной из её мишеней (Atrophin 1) у мух [53]. Белок Atrophin-1/Dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA) мутантен и накапливается при polyQ болезни DRPLA. Белок DRPLA соединяется с ортологичным белком RERE in vitro, а избыточная экспрессия RERE вызывает неправильную локализацию белка DRPLA [54]. miR-200b и miR-429 у человека в принципе могут воздействовать на транскрипты RERE [53]. Интересно, что Drosophila miR-8, которая имеет ту же самую seed последовательность, что и miR-200b и miR-429 у людей, воздействует у Drosophila на мРНК Atrophin 1. Далее, делеция miR-8 у мух (которая д. приводить к увеличению уровней белка Atrophin 1) вызывает умеренное увеличение апоптоза в личиночном головном мозге и дефекты подъема у взрослых мух с возрастом, один из признаков болезни. Эти находки показывают потенциально законсервированную роль семейства miR-8/miR-200 в нейродегенерации, вносящего вклад в патогенез DRPLA.

miRNAs can target pathways that impact brain integrity and disease


Многие miRNAs могут оказаться неправильно регулируемыми при нейродегенеративных заболеваниях, некоторые из которых играют причинную роль в патогенезе. Однако часто неясно, что вызывает неправильную регуляцию miRNA . Одним из примеров miRNA с предположительно известным механизмом является miR-133b. miR-133b подавляется в среднем мозге у PD пациентов и у мышей, моделирующих дефицит допаминергических нейронов (Aphakia линия) [24]. Мыши Aphakia имеют мутацию в Pitx3, транскрипционном факторе, в котором single nucleotide polymorphisms (SNPs) ассоциируют с PD во многих сообщениях [55,56,57]. Pitx3 избыточная экспрессия ведет к усилению активности pre-miR-133b в дифференцирующихся ES клетках, тогда как miR-133b непосредственно ингибирует Pitx3 посредством его 3'UTR [24]. Это указывает на негативную обратную связь, в которой Pitx3 активирует экспрессию miR-133b, а miR-133b в свою очередь репрессирует экспрессию Pitx3. Это исследование открывает возможность, что наблюдаемая неправильная регуляция miR-133b при PD может быть связана с SNPs, связанными с PD, в Pitx3, по крайней мере, в некоторых ситуациях PD, хотя имеются сообщения о негативной ассоциации [58,59,60]. Хотя нокаут miR-133b у мышей не обнаруживает видимых дефектов в допаминергических нейронах среднего мозга во время развития или старения, или в экспрессии нейрональных генов, включая Pitx3 [61], существование др. miRNAs в семействе miR-133 может объяснить отсутствие эффектов.
miR-34 определяет семейство miRNA, которое сильно законсервировано у людей, мух и Caenorhabditis elegans. У человека семейство miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c) неправильно регулируется при многих типах опухолей, а регуляция этих miRNA с помощью p53, воздействующих на апоптоз и контролирующих клеточный цикл, хорошо изучена [62,63]. Получение профиля miRNA в нервной системе взрослых мышей выявила концентрацию miR-34a в спинном мозге и областях ствола головного мозга (medulla oblongata и pons) [11] , а miR-34a увеличивается с возрастом в коре и гиппокампе [64,65]. miR-34a также обогащена в коре мозжечка у мышей, моделирующих Alzheimer's [66], а miR-34c увеличивается с возрастом гиппокампе мышей и человека, AD пациентов и мышей, моделирующих AD [67]. Мишени включают SIRT1, чья регуляция с помощью miR-34c ассоциирует с нарушениями памяти у мышей [67], и обратным образом скоррелирована с экспрессией miR-34a в коре и гиппокампе с возрастом [65]. В исследованиях клеток miR-34c также функционально ингибирует трансляцию Bcl-2, анти-апоптического белка, чья функция также может включать моделирование процессинга APP [66,68]. Далее, miR-34b увеличена в плазме пациентов с HD [69].
Напротив, у PD пациентов, miR-34b/c подавляется на ранней (pre-motor) стадии в выборках головного мозга [70]. Это исследование подтверждает, что дефицит miR-34b/c может способствовать дисфункции митохондрий, одновременно со снижением экспрессии Parkin и DJ1, двух генетических локусов , ассоциированных с рецессивным паркинсонизмом. В целом эти исследования подчеркивают неправильную регуляцию семейства miR-34 при нейродегенеративных болезнях, хотя остается неясным, является ли эта неправильная регуляция причиной или следствием патогенеза болезни.
У Drosophila, miR-34 обогащена в головном мозге взрослых. Делеция miR-34 вызывает с ранним началом потерю двигательного поведения, чувствительность к стрессам, дегенерацию головного мозга и укорочение продолжительности жизни [33]. Кроме того, усиление активности miR-34 снижает polyQ дегенерацию. Одной из мишеней miR-34 является E74A, ген, критический для развития у животных [33]. Эта петля miRNA-мишень подтверждает идею антагонистической плейотропии; ген мишень выгоден в ранней жизни, но вреден в более поздней жизни, поэтому подавление гена у взрослых может защищать животных от его вредных функций на взрослой стадии [71,72]. Так, одиночная miRNA оказывается связанной с возрастной физиологией у животных (climbing, stress), с ассоциированной с возрастом экспрессией гена головного мозга и долговременным поддержанием головного мозга [33]. У C. elegans, потеря функции miR-34 ведет к увеличению продолжительности жизни посредством регуляции генов аутофагии [73]. Принимая во внимание, что альтерации miR-34 в головном мозге мыши и человека ассоциированы с возрастом и болезнью, хотя точная роль (защита или напротив обеспечение потери целостности головного мозга и связанных с возрастом функций) может быть разной или зависеть от точности мишеней, miR-34 является интригующей молекулярной связью, которая может координировать эти зависимые от возраста биологические процессы у многих организмов.

Disease proteins themselves may impact miRNA biogenesis and/or function


Помимо miRNAs, влияющих на уровни ключевых болезненных белков или путей, болезнь-причиняющие белки сами по себе могут непосредственно влиять на биогенез miRNA или замалчивание мишени мРНК. Белок Huntingtin (Htt) человека, экспансия чьих CAG повторов вызывает HD, взаимодействует с белком Ago2 в клеточных P-тельцах (сайтах разложения мРНК) [74]. Истощение Htt нарушает молчание мишеней мРНК [74] , а у животных, моделирующих HD, многие miRNAs регулируются неправильно [75]. Это может быть обусловлено, по крайней мере, частично усилением активности Repressor Element 1 Silencing factor (REST), транскрипционного фактора, который активируется в HD нейронах и может репрессировать сотни нейральных генов [76,77]. Интересно, что REST-связывающие мотивы обнаруживаются в тесной близости к субнабору miRNA генов в геноме человека, включая miR-9/miR-9*, miR-29a/b, miR-124 и miR-132 [78,79,80,81]. Кроме того, REST и его кофактор coREST имеют функциональные сайты мишени для miR-9 и miR-9*, соотв. [82], а miR-9 неправильно регулируется у пациентов с HD [83]. Т.о., REST может быть необходим для экспрессии многих miRNA генов, хотя реакция может зависеть от контекста, такого как состояние дифференцировки клеток [84].
Неправильная локализация и мутация TDP-43 ассоциируют с ALS, а потеря функции TDP-43, также как избыточность функции могут вносить вклад в болезнь [4,85]. В клетках человека экспрессия некоторых miRNAs затрагиваются нокдауном TDP-43 [51]. Интересно, что TDP-43 взаимодействует с Drosha и Dicer комплексами (которые участвуют в генерации pri-miRNAs и pre-miRNAs, соотв.) и связывают избранные pri-miRNAs и pre-miRNAs в ядре и цитоплазме, соотв., посредством терминальных шпилечных петель [86]. Более того, TDP-43 облегчает Drosha-зависимое расщепление избранных pri-miRNAs, тогда как цитоплазматический TDP-43 способствует Dicer-зависимому расщеплению избранных pre-miRNAs [86]. Интересны механизмы, с помощью которых TDP-43 влияет на процессинг только субнабора pri- и pre-miRNAs, и точное воздействие дефектов такого процессинга на патогенез болезни.
Экспансия PolyQ в Ataxin-2 (Atx2) ассоциирует с spinocerebellar ataxia-2 (SCA2), parkinsonism и ALS [87,88]. Как и в случае др. болезненных ситуаций возможно, что аспекты потери функции, также как и избыточной функции вносят вклад в болезни. У мух, Atx2 необходим для активности замалчивания избранных miRNAs; в Atx2-дефицитных клетках, некоторые miRNA репортеры (хотя не все) оказываются активизированными [89]. Детальные механизмы, с помощью которых белок Atx2 воздействует на замалчивание miRNA и выполняемая Atx2 роль в замалчивании miRNA, имеет ли отношение к болезням, ассоциированным с измененным Atx2, пока неизвестны.
Эти находки подтверждают роль связанных с болезнями белков в биогенезе miRNA или целенаправленном замалчивании miRNA. Учитывая потенциал этих белков в воздействии на эти генеральные аспекты miRNAs и предполагаемое огромное количество мРНК мишеней для miRNAs, вполне возможно, что нарушение этих процессов может приводить к атипической экспрессии многих белков. Такие крупные нарушения обладают потенциалом существенно влиять на долговременную функцию и целостность нейронов.

Concluding remarks


Recent technological advances in high-throughput small RNA profiling in vivo have identified changes in the small RNA population in neurodegenerative disease or with age. So far, functions of only a handful of these miRNAs have been revealed, and an important question will be identifying the roles of the many other miRNAs that change in disease or in an age-associated manner. In addressing this question, studies of C. elegans have provided crucial insights into miRNA function; not all miRNAs that change with age lead to modulated lifespan upon altered activity [90] and many miRNAs are not required for development or viability [91,92]. Redundancy among different miRNAs is one possibility. Alternatively, the changes of such miRNAs could be a result, rather than cause, of age-associated physiological events. Another possibility is that such miRNAs might be required only in a perturbed environment or genetic background to confer ‘robustness’ on gene expression [93,94,95]. Considering this, sensitizing the background when studying loss of function of miRNAs [94,96] or examining stressful conditions might uncover novel roles. Another important question is what initiates misregulation of miRNAs in age or disease, especially for those miRNAs that impact age-associated events or the onset or progression of neurodegeneration. We have only limited examples of such mechanisms, such as where the disease-relevant genes themselves seem to trigger the misregulation of miRNAs.
Profiling of miRNAs by deep-sequencing analyses reveals that, in addition to simple up- or downregulation, miRNAs show potential differential isoform accumulation in the HD context [83] or clearly with age such that – in the case of Drosophila miR-34 – only the shorter 21 nucleotide form accumulates [33]. It is intriguing that production of different isoforms of miRNAs is regulated by a specific exonuclease in flies [97,98]. This indicates that miRNA 3' end trimming may be a biologically critical process. Future careful analyses promise to reveal the unidentified function of many miRNAs and the impact of controlling miRNA isoform accumulation with age and/or disease. As with Drosophila miR-34, studying the expression and function of individual miRNAs throughout adult life might reveal a coordinated role of miRNAs in various aspects of age-associated processes from lifespan to long-term brain integrity. To this end, Drosophila and C. elegans remain key model organisms with their relatively short lifespan and ease of observing defects at the organismal level. Identifying more miRNAs that are modulated with age and detailed studies of individual miRNAs in multiple systems will bring more insights into the impact of miRNAs in age-associated processes and brain disease.

Therapeutic potential of miRNAs


Based on disease-associated changes in miRNA levels, such as the miR-34 family, one could potentially use changes in miRNA expression as biomarkers of aging and age-associated processes such as neurodegenerative disease [69,99]. In addition, with the identification of miRNAs with functions like miR-34 and the successful delivery of disease-modulating miRNAs, it is tantalizing to target the miRNA itself in vivo to mitigate disease onset or progression. Spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA) is a polyQ disease with expansion in the androgen receptor (AR) gene [1]. miR-196a and miR-196b were identified as miRNAs that decrease the level of both the normal and CAG repeat-expanded AR transcripts [100]. Interestingly, these miRNAs directly target the mRNA of CUGBP Elav-like family member 2 (CELF2), whose protein positively regulates the AR mRNA level through a site on the transcript that is distinct from the CAG repeat – that is, a CTG repeat. Silencing of the CELF2 mRNA in spinal cord motor neurons by delivering miR-196a via an adeno-associated viral vector (AAV) improves the motor function of SBMA model mice. These findings, together with other examples, highlight the complex pathways and loops-within-loops of gene regulation that are impacted by miRNAs. They also offer promise that targeting and tweaking miRNAs through various approaches could have therapeutic potential for neurodegenerative diseases.