Посещений: 
ПИГМЕНТНЫЙ РЕТИНИТ
Генетическая обусловленность
|
|
Genes and mutations causing retinitis pigmentosa S P Daiger, L S Sullivan, S J Bowne  Clinical Genetics
Volume 84, Issue 2, pages 132–141, August 2013 |
Retinitis pigmentosa (RP) is a heterogeneous set of inherited retinopathies with many disease-causing genes, many known mutations, and highly varied clinical consequences. Progress in finding treatments is dependent on determining the genes and mutations causing these diseases, which includes both gene discovery and mutation screening in affected individuals and families. Despite the complexity, substantial progress has been made in finding RP genes and mutations. Depending on the type of RP, and the technology used, it is possible to detect mutations in 30–80% of cases. One of the most powerful approaches to genetic testing is high-throughput ‘deep sequencing’, that is, next-generation sequencing (NGS). NGS has identified several novel RP genes but a substantial fraction of previously unsolved cases have mutations in genes that are known causes of retinal disease but not necessarily RP. Apparent discrepancy between the molecular defect and clinical findings may warrant reevaluation of patients and families. In this review, we summarize the current approaches to gene discovery and mutation detection for RP, and indicate pitfalls and unsolved problems. Similar considerations apply to other forms of inherited retinal disease.
|
Наследственные болезни сетчатки затрагивают более 200,000 американцев и миллионы людей во всем мире [1-3]. Десятки разных типов болезней входят в этот набор и идентифицировано более 190 генов в качестве причины одной или др. формы наследственной болезни сетчатки [4, 5]. Retinitis pigmentosa (RP) объясняет приблизительно половину всех случаев. RP сам по себе является очень гетерогенным: мутации более 50 генов известны в качестве причины не синдромального RP и почти 3100 мутаций было описано в этих генах [5, 6]. Синдромальные формы RP столь же гетерогенны: мутации в 12 генах вызывают синдром Usher и 17 генов ассоциированы с синдромом Bardet-Biedl; вместе эти два заболевания насчитывают др. 1200 патогенных мутаций. Помимо генетической и мутационной гетерогенности, разные болезни могут вызываться мутациями в том же самом гене, симптомы разных болезней могут перекрываться и существует значительная изменчивость в клинической экспрессии даже среди индивидов, имеющих одни и те же мутации в одном и том же гене.
Несмотря на сложность достигнут существенный прогресс по идентификации новых RP генов и в скрининге пациентов с патогенетическими мутациями. Это частично результат разработки техники высокопроизводительного картирования и секвенирования, но существуют также доказательства большого количества исследователей, работающих в этой области. В последние 20 лет количество групп исследователей, сфокусированных на генетике RP исчислялось от группки до десятков. Потенциальные подходы к лечению также заметно выросли. treatments have also increased markedly. Ссылки здесь приведены только в качестве иллюстрации; более всеобъемлющий список см. в RetNet, http://www.sph.uth.tmc/edu/retnet [5]. Наследуемые ретинопатии, широкий класс болезней, анализируется в др. обзорах publications [4, 7].
Heterogeneity
Retinitis pigmentosa прогрессирующее, дегенеративное заболевание сетчатки, ведущее к выраженной потере зрения или слепоте [3]. Клинические отличительные признаки RP это ночная слепота, часто возникающая в молодом возрасте в результате прогрессивной потери периферического зрения и в последствие к потере центрального зрения. В среднем возрасте пациенты с RP могут сохранять небольшую степень центрального зрения, но в большинстве случаев кульминацией болезни является полная слепота. Находки, обнаруживаемые при изучении сетчатки, включают 'bone spicule' отложения пигмента, уменьшение сосудов сетчатки и характерные изменения характера electroretinogram (ERG). На клеточном уровне упрощенное представление RP это прогрессирующая дисфункция и потеря фоторецепторов палочек, сначала затрагивается ночное зрение в богатой палочками в средней и периферической части сетчатки, затем прогрессирует на богатую колбочками центральную часть сетчатки, при этом может возникнуть и потеря колбочек или как прямой результат болезненного процесса или вторично из-за гибели палочек.
Внутри этой широкой картины существует существенная изменчивость в возрасте начала, скорости прогрессирования, вовлечения палочек или колбочек, вовлечения др. клеток сетчатки, таких как RPE, во вторичных симптомах, таких как cystic macular отёк и многие др. признаки. RP, который присутствует при рождении или появляется вскоре после рождения часто обозначается как Leber congenital amaurosis (LCA). RP может появляться в одиночестве, как не синдромальный RP, без др. клинических находок или как синдромальный или системный RP с др. нейросенсорными нарушениями, аномалиями развития или сложными клиническими фенотипами . Usher синдром это RP с врожденной или рано возникающей глухотой. Bardet-Biedl syndrome (BBS) является RP с болезнью почек, ожирением, полидактилией и задержкой развития. RP может быть также вторичным по отношению системным нарушениям, таким как митохондриальные болезни или различные формы болезни дегенерации мозжечка. Др. синдромальные и системные формы RP перечислены в RetNet [5].
Retinitis pigmentosa чрезвычайно гетерогенен. Сюда входит (i) генетическая гетерогенность-множество разных генов могут вызывать один и тот же болезненный фенотип; (ii) аллельная гетерогенность-может существовать множество разных болезнь-вызывающих мутаций в каждом гене; (iii) фенотипическая гетерогенность-разные мутации в одном и том же гене могут вызывать разные болезни; и (iv) клиническая гетерогенность-одна и та же мутация у разных индивидов может вызывать разные клинические проявления, даже среди членов одной и той же семьи. Степень гетерогенности RP может запутывать пациентов и клиницистов и является фактором, вызывающим замешательство при диагностике.
Наиболее очевидными осложнениями являются генетические и аллельные. Сегодня известны мутации в 56 генах как вызывающие не синдромальный RP (Table 1). 12 генов связаны с синдромом Usher и 17 с BBS (Tables 2 and 3). Если включить гены для LCA и др. синдромных или системных форм RP , то, по крайней мере, становится известными примерно 100 'RP-related' генов. Аллельная или мутационная гетерогенность одинаково поразительны. Подсчет всех генов, вызывающих не синдромальный RP, это почти 3100 болезнь-вызывающих мутаций в базе данных (Table 1). Подсчеты, перекрывающие не синдромные RP, гены, вызывающими Usher синдром и BBS объясняют, по крайней мере, 1200 мутаций (Tables 2 and 3).
Table 1. Genes causing non-syndromic retinitis pigmentosa
Symbol Location Protein Type of retinitis pigmentosa Other diseases Mutations
1 ABCA4 1p22.1 ATP-binding cassette transporter-retinal Autosomal recessive Recessive macular dystrophy; recessive fundus flavimaculatus; recessive cone-rod dystrophy 680
2 BEST1 11q12.3 Bestrophin 1 Autosomal dominant; autosomal recessive Dominant vitreoretinochoroidopathy; recessive bestrophinopathy; dominant Best type macular dystrophy 232
3 C2ORF71 2p23.2 Chromosome 2 open reading frame 71 Autosomal recessive 13
4 C8ORF37 8q22.1 Chromosome 8 open reading frame 37 Autosomal recessive Recessive cone-rod dystrophy 4
5 CA4 17q23.2 Carbonic anhydrase IV Autosomal dominant 6
6 CERKL 2q31.3 Ceramide kinase-like protein Autosomal recessive Recessive cone-rod dystrophy with inner retinopathy 8
7 CLRN1 3q25.1 Clarin-1 Autosomal recessive Recessive Usher syndrome 23
8 CNGA1 4p12 Rod cGMP-gated channel alpha subunit Autosomal recessive 8
9 CNGB1 16q13 Rod cGMP-gated channel beta subunit Autosomal recessive 6
23 CRB1 1q31.3 Crumbs homolog 1 Autosomal recessive Recessive Leber congenital amaurosis; dominant pigmented paravenous chorioretinal atrophy 183
11 CRX 19q13.32 Cone-rod otx-like photoreceptor homeobox transcription factor Autosomal dominant Recessive, dominant and de novo Leber congenital amaurosis; dominant cone-rod dystrophy 51
12 DHDDS 1p36.11 Dehydrodolichyl diphosphate synthetase Autosomal recessive 1
13 EYS 6q12 Eyes shut/spacemaker (Drosophila) homolog Autosomal recessive 118
14 FAM161A 2p15 Family with sequence similarity 161 member A Autosomal recessive 6
15 FSCN2 17q25.3 Retinal fascin homolog 2, actin bundling protein Autosomal dominant Dominant macular dystrophy 1
16 GUCA1B 6p21.1 Guanylate cyclase activating protein 1B Autosomal dominant Dominant macular dystrophy 3
17 IDH3B 20p13 NAD(+)-specific isocitrate dehydrogenase 3 beta Autosomal recessive 2
18 IMPDH1 7q32.1 Inosine monophosphate dehydrogenase 1 Autosomal dominant Dominant Leber congenital amaurosis 14
19 IMPG2 3q12.3 Interphotoreceptor matrix proteoglycan 2 Autosomal recessive 10
20 KLHL7 7p15.3 Kelch-like 7 protein (Drosophila) Autosomal dominant 3
21 LRAT 4q32.1 Lecithin retinol acyltransferase Autosomal recessive Recessive Leber congenital amaurosis 10
22 MAK 6p24.2 Male germ-cell associated kinase Autosomal recessive 9
23 MERTK 2q13 c-mer protooncogene receptor tyrosine kinase Autosomal recessive 27
24 NR2E3 15q23 Nuclear receptor subfamily 2 group E3 Autosomal dominant; autosomal recessive Recessive Stargardt disease; Goldmann-Favre syndrome; recessive enhanced S-cone syndrome 45
25 NRL 14q11.2 Neural retina lucine zipper Autosomal dominant; autosomal recessive Recessive retinitis pigmentosa 14
26 OFD1 Xp22.2 Oral-facial-digital syndrome 1 protein X-linked Orofaciodigital syndrome 1, Simpson-Golabi-Behmel syndrome 2 127
27 PDE6A 5q33.1 cGMP phosphodiesterase alpha subunit Autosomal recessive 16
28 PDE6B 4p16.3 Rod cGMP phosphodiesterase beta subunit Autosomal recessive Dominant congenital stationary night blindness 39
29 PDE6G 17q25.3 Phosphodiesterase 6G cGMP-specific rod gamma Autosomal recessive 1
30 PRCD 17q25.1 Progressive rod-cone degeneration protein Autosomal recessive 2
31 PROM1 4p15.32 Prominin 1 Autosomal recessive Dominant Stargardt-like and bulls eye macular dystrophy; dominant cone-rod dystrophy 9
32 PRPF3 1q21.2 Human homolog of yeast pre-mRNA splicing factor 3 Autosomal dominant 3
33 PRPF6 20q13.33 Human homolog of yeast pre-mRNA splicing factor 6 Autosomal dominant 2
34 PRPF8 17p13.3 Human homolog of yeast pre-mRNA splicing factor C8 Autosomal dominant 21
35 PRPF31 19q13.42 Human homolog of yeast pre-mRNA splicing factor 31 Autosomal dominant 65
36 PRPH2 6p21.1 Peripherin 2 Autosomal dominant; digenic with ROM1 Dominant macular dystrophy; dominant vitelliform MD; dominant cone-rod dystrophy; dominant central areolar choroidal dystrophy 123
37 RBP3 10q11.22 Retinol binding protein 3, interstitial Autosomal recessive 2
38 RDH12 14q24.1 Retinol dehydrogenase 12 Autosomal dominant; autosomal recessive Recessive Leber congenital amaurosis 66
39 RGR 10q23.1 RPE-retinal G protein-coupled receptor Autosomal recessive Dominant choroidal sclerosis 7
40 RHO 3q22.1 Rhodopsin Autosomal dominant; autosomal recessive Dominant congenital stationary night blindness 161
41 RLBP1 15q26.1 Retinaldehyde-binding protein 1 Autosomal recessive Recessive Bothnia dystrophy; recessive retinitis punctata albescens; recessive Newfoundland rod-cone dystrophy 20
42 ROM1 11q12.3 Retinal outer segment membrane protein 1 Autosomal dominant; digenic w/ PRPH2 11
43 RP1 8q12.1 RP1 protein Autosomal dominant; autosomal recessive Autosomal dominant and recessive 67
44 RP2 Xp11.23 Retinitis pigmentosa 2 (X-linked) X-linked 76
45 RP9 7p14.3 RP9 protein or PIM1-kinase associated protein 1 Autosomal dominant 2
46 RPE65 1p31.2 Retinal pigment epithelium-specific 65?kDa protein Autosomal dominant; autosomal recessive Recessive Leber congenital amaurosis 134
47 RPGR Xp11.4 Retinitis pigmentosa GTPase regulator X-linked X-linked cone dystrophy 1; X-linked atrophic macular dystrophy 151
48 SAG 2q37.1 Arrestin (s-antigen) Autosomal recessive Recessive Oguchi disease 11
49 SEMA4A 1q22 Semaphorin 4A Autosomal dominant Dominant cone-rod dystrophy 3
50 SNRNP200 2q11.2 Small nuclear ribonucleoprotein 200?kDa (U5) Autosomal dominant 7
51 SPATA7 14q31.3 Spermatogenesis associated protein 7 Autosomal recessive Recessive Leber congenital amaurosis 15
52 TOPORS 9p21.1 Topoisomerase I binding arginine/serine rich protein Autosomal dominant 8
53 TTC8 14q32.11 Tetratricopeptide repeat domain 8 Autosomal recessive Recessive Bardet-Biedl syndrome 14
54 TULP1 6p21.31 Tubby-like protein 1 Autosomal recessive Recessive Leber congenital amaurosis 31
55 USH2A 1q41 Usherin Autosomal recessive Recessive Usher syndrome 392
56 ZNF513 2p23.3 Zinc finger protein 513 Autosomal recessive 1
Total 3064
Tables are based on the RetNet database, http://www.sph.uth.tmc.edu/retnet/, accessed May 2013 [5], and the Human Gene Mutation Database, http://www.hgmd.cf.ac.uk/, accessed May 2013 [6]. References are in RetNet. Some genes appear in more than one table so the sum total of distinct genes in the tables, 82, is less than the sum of the three tables together.
Table 2. Genes causing Usher syndromea
Symbol Location Protein Type of Usher syndrome Other diseases Mutations
1 ABHD12 2p11.21 Abhydrolase domain containing protein 12 Autosomal recessive type 3-like Recessive PHARC syndrome type 5
2 CDH23 10q22.1 Cadherin-like gene 23 Autosomal recessive 1d; digenic with PCDH15 Recessive deafness without retinitis pigmentosa 167
3 CIB2 15q25.1 Calcium and integrin binding family member 2 Autosomal recessive type 1J 7
4 CLRN1 3q25.1 Clarin-1 Autosomal recessive type 3 Recessive retinitis pigmentosa see RP
5 DFNB31 9q32 Whirlin Autosomal recessive type 2 Recessive deafness without retinitis pigmentosa 13
6 GPR98 5q14.3 Monogenic audiogenic seizure susceptibility 1 homolog Autosomal recessive type 2 Dominant/recessive febrile convulsions 54
7 HARS 5q31.3 Histidyl-tRNA synthetase Autosomal recessive Recessive HARS syndrome 2
8 MYO7A 11q13.5 myosin VIIA Recessive type 1b; recessive USH3-like Recessive deafness without retinitis pigmentosa 263
9 PCDH15 10q21.1 Protocadherin 15 Autosomal recessive type 1f; digenic with CDH23 Recessive deafness without retinitis pigmentosa 52
10 USH1C 11p15.1 harmonin Autosomal recessive Acadian Recessive deafness without retinitis pigmentosa; recessive RP with late-onset hearing loss 26
11 USH1G 17q25.1 Human homolog of mouse scaffold protein containing ankyrin repeats and SAM domain Autosomal recessive Usher syndrome 11
12 USH2A 1q41 Usherin Autosomal recessive type 2a Recessive retinitis pigmentosa see RP
Total 600
RP, retinitis pigmentosa.
a
Tables are based on the RetNet database, http://www.sph.uth.tmc.edu/retnet/, accessed May 2013 [5], and the Human Gene Mutation Database, http://www.hgmd.cf.ac.uk/, accessed May 2013 [6]. References are in RetNet. Some genes appear in more than one table so the sum total of distinct genes in the tables, 82, is less than the sum of the three tables together.
Table 3. Genes causing Bardet-Biedl syndrome (BBS)a
Symbol Location Protein Type of BBS Other diseases Mutations
1 ARL6 3q11.2 ADP-ribosylation factor-like 6 Autosomal recessive 14
2 BBS1 11q13 BBS1 protein Autosomal recessive 65
3 BBS2 16q12.2 BBS2 protein Autosomal recessive 61
4 BBS4 15q24.1 BBS4 protein Autosomal recessive 29
5 BBS5 2q31.1 Flagellar apparatus-basal body protein DKFZp7621194 Autosomal recessive 18
6 BBS7 4q27 BBS7 protein Autosomal recessive 26
7 BBS9 7p14.3 Parathyroid hormone-responsive B1 protein Autosomal recessive 27
8 BBS10 12q21.2 BBS10 (C12orf58) chaperonin Autosomal recessive 76
9 BBS12 4q27 BBS12 protein Autosomal recessive 45
10 CEP290 12q21.32 Centrosomal protein 290?kDa Autosomal recessive Recessive Joubert syndrome; recessive Leber congenital amaurosis; recessive Meckel syndrome; recessive Senior-Loken syndrome 157
11 INPP5E 9q34.3 Inositol polyphosphate-5-phosphatase E Autosomal recessive Recessive MORM syndrome; recessive Joubert syndrome 7
12 LZTFL1 3p21.31 Leucine zipper transcription factor-like 1 Autosomal recessive 1
13 MKKS 20p12.2 McKusick-Kaufman syndrome protein Autosomal recessive 44
14 MKS1 17q22 Meckel syndrome type 1 protein Autosomal recessive Recessive Meckel syndrome 26
15 SDCCAG8 1q43 Serologically defined colon cancer antigen 8 Autosomal recessive Recessive ciliopathy-related nephronophthisis, 13
16 TRIM32 9q33.1 Tripartite motif-containing protein 32 Autosomal recessive Recessive limb-girdle muscular dystrophy 8
17 TTC8 14q32.11 Tetratricopeptide repeat domain 8 Autosomal recessive Recessive retinitis pigmentosa see RP
Total 617
RP, retinitis pigmentosa.
a
Tables are based on the RetNet database, http://www.sph.uth.tmc.edu/retnet/, accessed May 2013 [5], and the Human Gene Mutation Database, http://www.hgmd.cf.ac.uk/, accessed May 2013 [6]. References are in RetNet. Some genes appear in more than one table so the sum total of distinct genes in the tables, 82, is less than the sum of the three tables together.
Хотя некоторые из опубликованных мутаций позднее могут оказаться не патогенными, это всё ещё существенная недооценка, поскольку многие новые мутации представлены в приватных базах данных и ещё не представлены общественности, напр., Leiden Open Variation Database [8].
Столь же сбивающим с толку является перекрывание между типами болезней, названиями болезней и клиническими последствиями. Напр., даже большинство мутаций rhodopsin вызывает аутосномно доминантный RP , а большинство RPE65 мутаций вызывает рецессивный LCA, некоторые мутации rhodopsin могут быть рецессивными, а некоторые RPE65 мутации могут быть доминантными [9-13]. Мутации при синдроме Usher рецессивные и вызывают и глухоту и RP, но мутации в двух Usher генах, CLRN1 и USH2A, могут вызывать только рецессивный RP [14, 15].
Для не синдромальных RP, мутации в 23 генах, как известно, вызывают аутосомно доминантный RP, 36 генов вызывают рецессивный RP и 3 гена вызывают X-сцепленный RP [5]. Однако, Table 1 показывает, что некоторые из этих заболеваний перекрываются др. с др., а Tables 1-3 показывают, что многие гены вызывают множественные болезни. В некоторых случаях 'вторичные' болезни редки (напр., рецессивные rhodopsin или доминантные RPE65 мутации), но в некоторых случаях они довольно распространены (напр. рецессивные RP и USH2A). В целом, не существует простого соответствия между геном и болезнью в большинстве случаев.
Наконец, даже идентичные мутации в том же самом гене могут продуцировать разные клинически проявления. Вариации между индивидами по возрасту начала или скорости прогрессирования не неожиданны, но, напр., мутации в PRPF31 оказываются не пенетрантными у некоторых членов семьи, [16, 17] а мутации в PRPH2 (RDS) продуцируют широкий круг макулярных, периферических или характерных для всей сетчатки симптомов [18, 19]. Одним из следствий является то, что члены одной семьи, имеют разные клинические проявления, могут иметь диагнозы, согласующиеся с находками у индивида, но не согласующиеся с семьей. Итак, имеется существенное перекрывание между болезнями, вызываемыми генами RP , даже разные названия, даваемые специфическим типам болезни. Это хорошо иллюстрируется перекрыванием номенклатуры болезней, предложенной Berger et al. для врожденных болезней сетчатки [4].
Technical approaches
Стандартные техники для обнаружения генов и мутаций-картирование сцепления и секвенирование ДНК-использовались многие годы. Однако разработка высокой плотности и высоко производительной техники в последние 10 лет повысило силу этих методов на порядки величин.
Для картирования сцепления массивы высокой плотности SNP (single-nucleotide polymorphism), такие как affymetrix 6.0 SNP/CNV массив, [20] позволяют тестировать сцепление для почти 1 миллиона генетических маркеров. По практическим причинам, они часто уменьшаются до 10000 наиболее информативных маркеров с известными взаимоотношениями с прилегающими маркерами. Однако, даже с небольшим набором маркеров, возникают серьезные споры относительно большого числа независимых тестов (множественных сравнений), ведущих к кажущемуся сцеплению 'hits' лишь случайно. К счастью имеется значительно больше, высоко изменчивых генетических маркеров в геноме человека, что может быть использовано для очистки картирования сцепления [9]. Некоторые RP гены впервые были локализованы с помощью картирования сцепления в последние годы [21-25].
Одним из следствий доступности наборов плотных SNP маркеров является то, что возможно идентифицировать регионы на гомологичных хромосомах, которые идентичны по происхождению, т.е., регионы на совместимых парах хромосом, которые происходят из одиночной хромосомы у относительно недавнего предка. Это идентифицирует хромосомное расположение идентичных рецессивных мутаций в семьях с кровным родством или в недавних скрещиваниях внутри семьи. Этот подход к картированию рецессивных генов наз. картированием гомозиготности или картированием autozygosity [26]. Это оказалось очень продуктивным в идентификации RP генов в инбредных семьях и в этнических популяциях, в которых распространен инбридинг [27-31]. Неожиданно, даже в семьях без указаний на кровное родство, рецессивные RP мутации более часто оказываются identical-by-descent, чем ожидалось, тем самым расширяется пригодность картирования гомозиготности [26].
Методы для обнаружения мутаций на уровне последовательностей ДНК включают Sanger секвенирование, всё ещё наз. золотым стандартом секвенирования, базирующаяся на массивах детекция специфических мутаций (напр. APEX, 'array-primer extension' [32-34]), ультра высоко производительном секвенировании и др. Из них, основной прогресс в последние годы в обнаружении RP генов связан с использованием ultra-high-throughput секвенирования, обычно обозначаемого как next-generation sequencing (NGS) [35]. Обычное Sanger секвенирование обычно осуществляется с использованием полуавтоматического, многополосного капиллярного электрофореза (само по себе являющееся крупным улучшением по сравнению с более ранними методами). Напротив, NGS осуществляет миллионы секвенирований, идущих параллельно на микронного размера кусочках (beads) или на сравнимых micro-wells, осуществляющих до биллиона считываний пар оснований на прогон (per run). Следовательно, NGS секвенирование, по крайней мере, в 1000 быстрее, чем обычное секвенирование и значительно менее дорогое на последовательность.
Существует несколько NGS методов и многочисленных самостоятельных приложений [36, 37]. Большинство обычно используемых методов является short-read, shot-gun секвенированием: ДНК сначала фрагментируется на короткие последовательности, считываемые длины в пределах 100 - 200 пар оснований и используются компьютерные методы для 'воссоздания' коротких считываний в более крупные конструкции. Это позволяет очень аккуратное, чрезвычайно быстрое секвенирование крупных регионов генома человека, но определенные признаки ДНК человека, такие как делеции и перестройки, длинные повторы и гаплотипы, оказываются недоступными для NGS без дополнительных ступеней. Также, поскольку необходимы истинные объемы данных, продуцируемых с помощью NGS, убедительные биоинформационные ресурсы, чтобы полностью использовать результаты.
Несмотря на эти ограничения, NGS является исключительно продуктивным в обнаружении генов и мутаций при RP. В целом существуют три NGS стратегии: NGS секвенирование всего экзома, NGS всего генома и нацеленное и усеченное (targeted-capture) NGS. NGS всего экзома использует захват всех белок-кодирующих регионов, т.е., всех экзонов, что составляет примерно 1.5% от генома человека, с помощью NGS. По определению эта техника ограничивается находкой мутаций в кодирующих регионах, но несмотря на это она привела к идентификации нескольких RP генов и новых мутаций [9, 38, 39]. NGS всего генома покрывает почти весь геном человека (приблизительно 98%), и избегает потенциальных артефактов, вносимых отлавливанием экзонов, но оно не является ещё рутинным для обнаружения генов. Принципиальным ограничением является цена секвенирования и проведение и анализ получаемого набора массивных данных. Однако очень возможно, что секвенирование всего генома станет рутинным в ближайшем будущем особенно с развитием технологий 'третьего поколения' [40].
Целенаправленный отбор, третья NGS стратегия, ограничивается тестированием экзонов известных генов, вызывающих болезнь [41]-в случае болезни сетчатки, напр., тестирование только 190-plus генов в RetNet [5]. Это неудобно, конечно,т.к. не выявляются новые гены. Преимуществом является то, что анализ 'пространства' значительно меньшего, более известного, a priori, практически любого гена, и цена намного ниже. Т.о.. на сегодня это оптимальный подход к скринингу мутаций для RP, со многими приложениями [42-47].
Наконец, некоторые мутации нелегко обнаружить обычным секвенированием или NGS, особенно крупные делеции и перестройки. Некоторые делеции могут быть обнаружены с помощью SNP массивов, а affymetrix 6.0 SNP/CNV массивы включают copy-number probes (CNVs) для детекции делеций [20]. На PCR-амплификации базирующиеся методы, такие как MLPA или qPCR, могут выявлять значительно более мелкие делеции. Это важный вопрос, поскольку почти 3% случаев аутосомно доминантных RP вызываются делециями в PRPF31, недоступными секвенированию [17, 48]. Сходные делеции и перестройки обнаруживаются в ABCA4, наиболее распространенная причина рецессивных RP, и в RPGR, принципиальной причине X-сцепленных RP [49]. Однако, X-сцепленные делеции легко выявить у гемизиготных самцов и принципиальная проблема в секвенировании RPGR заключается в повторяющейся природе ORF15.
Current status of gene discovery and mutation detection
Идентификация новых генов, вызывающих наследственные заболевания сетчатки, включая RP, прогрессирует постоянно с линейной скоростью для почти 20 лет (Fig. 1). Хотя инструменты для открытия генов стали значительно мощнее, но постоянная скорость в последние годы указывает, что в целом, новые гены всё реже и труднее выявляются. Геномное NGS может ускорить открытие генов, но также возможно, что оставшиеся неизвестными RP гены окажутся очень редки. Но есть способ предсказать оставшееся количество RP генов.
Figure 1. Mapped and identified retinal disease genes over three decades.
The meaningful questions in this context are (i) in what fraction of RP patients can disease-causing mutations be detected today, and (ii) when will it be possible to find mutations in nearly all patients, say, at least 95%? The answer to the first question depends on the technology used and the type of RP. Combining results from conventional Sanger sequencing and targeted-capture NGS, using rough estimates, it is possible to detect the underlying pathogenic mutation or mutations in 20-30% of autosomal recessive RP cases, 60-70% of autosomal-dominant cases, 80-85% of X-linked cases, and more than 85% of Usher and BBS cases [44, 50] [and S.P. Daiger, unpublished data].
Simplex (изолированные ) RP случаи более сложны. Традиционно simplex RP случаи считались рецессивными при наличии не затронутых родителей носителей. Это верно во многих случаях, но имеются исключения. По крайней мере, 15% мужчин с RP при отсутствии др. затронутых членов семьи имеют мутации в X-сцепленных генах RPGR или RP2 [51]. De novo аутосомно доминантные мутации объясняют примерно 1-2% simplex случаев [45, 52]. Целенаправленное NGS идентифицировало мутации в 19-36% simplex RP случаев, но подтверждение патогенности в этих случаях проблематично [44-47]. Дальнейшим осложнением является то, что частота носительства для всех мутаций врожденных болезней сетчатки у незатронутых индивидов может составлять 20% [53]. Т.е., каждая мутация чрезвычайно редка, но существует столь много генов и столь много мутаций, которые в целом оказываются широко распространенными.
Предсказания рискованны, но учитывая быстрые успехи методов секвенирования ДНК и продолжающуюся идентификацию новых генов RP, разумно ожидать, что в течение 5 лет будет возможно выявлять болезнь-вызывающие гены и мутации или мутации у 95% пациентов. Это предполагает, что большинство оставшихся случаев будет моногенными, т.е. будут вызываться единственным геном у каждого из индивидов. Поскольку двугенные формы RP и трехаллельные формы BBS уже известны, то полигенное наследование болезней сетчатки не может быть исключено.
Наконец, диагностика RP сможет изменять семейный диагноз или возникающие вопросы о взаимоотношениях между генотипом и фенотипом. Напр., e family diagnosis or raise questions about the relationship between genotype and , по крайней мере, 8% семей с предварительным диагнозом аутосомно доминантного RP в действительности будут иметь мутации в X-сцепленных RP генах [56]. Мутации в генах, широко ассоциированных с синдромом Usher или BBS могут оказаться не синдромальными RP [14, 15, 57]. Др. примеры возникнут в результате targeted-capture NGS. В некоторых случаях потребуется переопределение семейной болезни. Выверенный клинический фенотип, семейная история и генетические находки станут критическими, новыми ступенями в диагностике наследуемых болезней сетчатки.
|