HOXD13 принадлежит к большому семейству гомеобоксных транскрипционных факторов, выполняющих множественные функции во время формирования эмбрионального паттерна. Геном позвоночных обладает 39 HOX генами, собранными в 4 кластера (HOXA-HOXD), которые, скорее всего, возникли из единственного родоначального кластера с помощью дупликаций и дивергенции. Каждый кластер расположен на разных хромосомах (7p14, 17q21, 12q13 и 2q31 для HOXA-HOXD, соотв.) и содержит 9-11 генов. Физическое положение генов внутри каждого кластера совпадает с его пространственно-временной экспрессией во время развития. Гены на 3' конце кластера экспрессируются раньше в передних и проксимальных регионах, тогда как гены на 5' конце экспрессируются позже и в более задних и дистальных регионах развивающегося эмбриона. Это обозначается как "временная и пространственная колинеарность" (Duboule и Morata, 1994). HOXD13 и HOXA13 оба располагаются на 5' конце соотв. кластеров и совместно контролируют развитие наиболее дистальных частей конечностей (аутоподов формирующихся рук ног), нижней части мочеполового тракта и половой бугорок.

Становление передне-задней асимметрии в конечностях (AP оси, от большого пальца к мизинцу) нуждается в регуляторной сети из сигнальных молекул, чья экспрессия, как полагают, скоординирована во времени и пространстве (rev.Duboc и Logan, 2009; Zeller, 2010). Небольшая группа мезенхимных клеток на заднем крае развивающегося зачатка конечности - Zone of Polarizing Activity (ZPA) - действует как организатор, который инициирует спецификацию анатомии наших кистей и стоп. Образование пальцев в основном зависит от последовательного каскада событий, инициируемого с помощью локальной экспрессии Sonic Hedgehog (Shh) из ZPA (Riddle et al., 1993). Во время появления зачатка конечности активируется экспрессия др. паттерн-формирующих генов, включая dHand, Twist1 и самых 5' членов кластера Hoxd генов в задней части зачатка конечности, и создается петля позитивной обратной связи для поддержания экспрессии Shh (Knezevic et al., 1997; Zakany et al., 2004). Тем временем репрессор транскрипции, формируемый из Gli3 (Gli3R) в передней мезенхиме, ограничивает экспрессию dHand, 5' Hoxd генов и Shh задним компартментом зачатка конечности (Sheth et al., 2007; Wang et al., 2007). Интеграция возникающих в результате противоположных пространственных градиентов из Shh (задний) и Gli3R (передний) (Wang et al., 2000) и кинетики транскрипции нижестоящих генов мишеней затем специфицируют количество и отличительные особенности пальцев (rev. Benazet и Zeller, 2009; Zeller, 2010).

Показано, что дефекты генов, формирующих паттерн, таких как HOXD13 вызывают у человека синполидактилию (Muragaki et al., 1996), тогда как мутации HOXA13 , как было установлено, ассоциируют с hand-foot-genital синдромом (Mortlock и Innis, 1997).

Ген HOXD13 представлен двумя экзонами, разделенными интроном в 808 п.н. (Goodman et al., 1998). Сравнение последовательностей гена Hoxd13 у разных видов выявило дополнительный in-frame стартовый кодон в 24 п.н. выше предполагаемого первого триплета AUG. В предыдущих сообщениях последовательность, фланкируемая с помощью этих двух AUG кодонов, считалась не кодирующей, но несколько линий доказательств указывают на то, что этот регион участвует в кодировании белка у высших позвоночных (Nakano et al., 2007; Brison et al., 2012). Недавно стала доступна информация о структуре гена HOXD13 в публичной базе данных (ENSEMBL, Pubmed), описывающая вышестоящий кодон AUG в качестве места старта транскрипции in vivo, т.е. кодирование белка в 343 аминокислоты вместо 335 (Fig. 1). Одним из следствий использования альтернативного инициаторного AUG является изменение в нумерации последовательности аминокислот в HOXD13, вопрос, затрагиваемый немногими исследователями в этой области (напр. G3A vs. G11A мутация описана Brison et al., 2012), но не был учтен в предыдущих сообщениях о мутациях в HOXD13 как показано на Figure 1.

Экзон 1 представлен 45 повторами тринуклеотидных пар оснований, кодирующих полиаланиновый трек в 15-остатков в N-терминальном регионе HOXD13. Экзон 2 обладает последовательностью в 180 пар оснований, наз. гомеобоксом. Последний кодирует гомеодомен, высоко консервативный мотив для связывания ДНК в C-терминальном регионе белка, посредством которого HOXD13, подобно всем др. HOX белкам, соединяется с сайтом мишенью соотв. консенсусной последовательности ДНК.

HOXD13 ген экспрессируется в генитальном зачатке, в хвосте и в дистальной задней части возникающего зачатка конечности (Dolle et al., 1991; Nelson et al., 1996). Экспрессия 5' HOXD генов в конечностях происходит в две фазы, на ранней колинеарной фазе, характеризующейся перекрыванием заднего ограничения доменов их экспрессии, и на поздней фазе, когда они подвергаются изменчивой экспансии в направлении переднего края зачатка конечности (rev. Zakany и Duboule, 2007).

HOXD13 Mutations in Synpolydactyly

SPD (OMIM 186000) это синдром аутосомно доминантного врожденного уродства, который согласно номенклатуре Temtamy и McKusick, был отнесен к "type II syndactyly" (Temtamy и McKusick, 1978). Кстати, известны три генетически отличающихся synpolydactylies, обозначаемые как SPD1, SPD2 и SPD3 (Malik и Grzeschik, 2008). SPD1, вызывается мутациями в HOXD13. SPD2 (OMIM 608180) характеризуется центральной и пост-аксиальной SPD кистей и пост-аксиальной синдактилией стоп. Ген FBLN1, расположенный на хромосоме 22q13.31, как полагают, ответственен за этот тип SPD (Debeer et al., 2002b). Клинические признаки SPD3 (OMIM 610234) включают центральную SPD кистей и пост-аксиальную SPD стоп. Эта аномалия картирована в локусе 14q11.2-q12 (Malik et al.,2006).

В целом фенотипический спектр SPD находится в пределах от типичных признаков до минорных вариантов или даже необычных признаков (Table 1). Обычно SPD проявляется синдактилией по mesoaxial линии кистей и в пост-аксиальной части стоп, в особенности между третьим и четвертым пальцем, и между четвертым и пятым пальцем стоп, с частичным или полным удвоением пальца в синдактиличной складке (web) (Fig. 2A,D-F). Кроме того, SPD может быть ассоциирован с брахидактилией, камптодактилией или клинодактилией пятых пальцев (Fig. 2B), и изменчивой синдактилией со второго по пятый пальцы ног, сопровождаемой гипоплазией средних фаланг (rev.Brison et al., 2011). Др. минорные деформации стоп, такие как синдактилия между вторым и третьим пальцем ног или изменение параметров (overriding) четвертого или пятого пальцев ног, могут быть даже единственным клиническим проявлением у слабо затронутых индивидов (Fig. 2C; Goodman et al.,1997). В кистях, контрактуры межфаланговых соединений вызывают кожные срастания пальцев, часто удерживаемых в типичном пассивном сгибании (Fig. 2B,E).

Table 1. Phenotypic spectrum of Synpolydactyly (adapted from Malik и Grzeschik, 2008)

Clinical phenotypes of patients harboring HOXD13 mutations.

A: Классическая SPD, вызываемая мутациями расширения полиаланинового тракта HOXD13. Характерна кожная синдактилия и удвоение пальца в синдактиличной кожной складке. B,C: Классическая SPD может проявлять в варьирующей степени клинодактилию и камптодактилию в кистях (B) или небольшой ротированный кнаружи палец ноги с частичной кожной синдактилией в стопе (C). D-G: Гомозиготные носители мутаций с увеличенными полиаланиновыми участками, обнаруживающие более тяжелые фенотипы со сложным типом SPD. D: на стопе имеется широкий пробел между первым и вторым пальцем и синдактилия из мягких тканей между с третьего по пятый пальцы. Пятые пальцы ног характеризуются билатеральными выпячиваниями, состоящими исключительно из мягких тканей при отсутствии каких-либо костных структур. E: На кистях имеются частичные удвоения средних пальцев, а также кожная и костная синдактилия, затрагивающая средний, безымянный пальцы и мизинец.F,G: Рентгеновские изображения демонстрируют удвоения дистальных частей четвертого луча со слиянием костей дистальных фаланг (F) и отсутствие или гипоплазия средних фаланг всех пальцев (G). [D-F are adapted with permission from Horsnell et al., 2006.]

Имеется широкий спектр меж- и внутрисемейной фенотипической изменчивости при SPD. Помимо этой клинической гетерогенности, пониженная пенетрантность и генетическая гетерогенность могут приводить к неправильной классификации SPD-фенотипа. Malik и Grzeschik (2008) опубликовали превосходный обзор о клинических проявлениях SPD. Table 1 показывает типичные SPD фенотипические признаки вместе с минорными вариантами, которые часто ассоциируют с SPD и необычным фенотипом. Помимо этих фенотипических характеристик, Low и Newbury-Ecob (2012) описали девочку с гомозиготной нонсенс мутацией в HOXD13, ассоциированной с расщеплением губы и интактным нёбом. Необходимо отметить, однако, что HOXD13 обычно не экспрессируется рострально, затрудняет понимание связи между мутацией в HOXD13 и лицевыми отклонениями. Единственное возможное объяснение это, что нарушение регуляции секретируемых молекул, таких как BMP или Shh, на системном уровне этих белков может приводить к дефектам в др. частях эмбриона. Альтернативно дополнительная мутация в др. гене может быть ответственна за этот фенотип и дальнейшее генетическое исследование д. разрешить этот вопрос.

Molecular Genetics и Pathogenesis

Мутации в HOXD13 распадаются на три отличающихся класса, каждый действует за счет разных молекулярных патогенетических механизмов: (i) расширение или сокращение полиаланинового участка, (ii) мутации укорочения и аминокислотных замен, затрагивающие функцию ДНК-связывающего гомеодомена, и (iii) мутации, располагающиеся в ранее не охарактеризованных регионах.

(i) Polyalanine tract expansion/contraction mutations
Мутации увеличения полиаланинового тракта в HOXD13 были первыми обнаруженными мутациями HOX у человека и они привлекли внимание к функциональной важности N-терминального региона HOX белков. Кстати, 43 неродственных семей обнаруживали классические SPD1 фенотипы и несли мутации в N-терминальном polyalanine треке HOXD13 (Chessa et al., 1990; Sayli et al., 1995; Akarsu et al., 1996; Muragaki et al., 1996; Goodman et al., 1997; Johnson et al., 2003; Kjaer et al., 2005; Horsnell et al., 2006; Zhao et al., 2007; Garcia-Barcelo et al., 2008; Wajid et al., 2009; Gong et al., 2011; Jin et al., 2011; Xin et al., 2012). затронутый индивид имел увеличение этих повторов, добавляя 7, 8, 9, 10 или 14 дополнительных остатков аланина к нормальному полиаланиновому треку из 15 остатков в HOXD13. В отличие от динамической экспансии триплетов, лежащих в основе болезни Гентингтона или миотонической дистрофии, полиаланиновые повторы мейотически стабильны по размеру, что согласуется с отсутствием генетической антиципации (проявление признаков заболевания в последующих поколениях в более раннем возрасте). Вместо этого, благодаря использованию четырех альтернативных кодонов для аланина (GCN, где N означает A, C, G или T), расширение полиаланинового трека объясняется присутствием небольших дупликаций, вызываемых неравным кроссинговером между двумя нормальными аллелями, которые оказываются неправильно расположенными во время репликации, всё же поддерживая рамку считывания (Warren, 1997). Как пенетрантность, так и тяжесть фенотипа SPD, как было установлено, увеличиваются параллельно с увеличением размера экспансии триплетов (Goodman et al., 1997). Это наблюдение также приложимо к фенотипам, вызываемым мутациями экспансии триплетов у описанных гомозиготных пациентов (Akarsu et al.,1995; Muragaki et al., 1996; Goodman, 2002; Horsnell et al., 2006; Wajid et al.,2009). Т.о., комбинация неполной пенетрантности SPD и наложение влияния дополнительных генетических и средовых факторов делает невозможным вынесение общего заключения, касательно генотип-фенотипических корреляций у затронутых членов семейства (rev. Malik и Grzeschik,2008). Было предположено, что полиаланиновые треки в транскрипционных факторах могут действовать как гибкие спейсеры между др. доменами (Karlin и Burge, 1996), или они могут связывать белки, с которыми транскрипционные факторы взаимодействуют, такие как ДНК-связывающие партнеры или транскрипционные кофакторы (Han и Manley, 1993; Licht et al., 1994). Из работ на мышиных моделях стало очевидным, что мутанты Hoxd13, несущие увеличеные полаланиновые треки, вызывают SPD фенотипы путем проявления "super" доминантного негативного эффекта не только в отношении остального дикого типа Hoxd13, но и также в отношении Hoxd11 и Hoxd12 (Zakany и Duboule, 1996; Bruneau et al., 2001). Более того, In vitro исследования, проведенные Albrecht et al. (2004), продемонстрировали, что экспрессия HOXD13 с расширенными полиаланиновыми треками выше определенного порога (22 остатка аланина) вызывают образование цитоплазматических агрегатов, которые секвестрируют дикого типа HOXD13, предупреждая позднее его вступление в ядро. Эти результаты подтвердили доказательства, что увеличение полиаланиновых повторов в транскрипционных факторах приводит к неправильной упаковке, деградации и агрегации в цитоплазме мутантного белка. Т.о., расширение полиаланиновых повторов в HOXD13 более, чем на 7 аланинов обусловливает доминантный негативный фенотип (Goodman et al., 1997; Kuss et al., 2009; Villavicencio-Lorini et al., 2010). Было предположено, что избыток из 6 или менее аланиновых остатков или даже потеря двух или 4-х аланиновых остатков (уменьшение полиаланиновых треков) остается без клинических проявлений (Albrecht et al., 2004; Kjaer et al., 2005; Malik et al., 2007; Zhao et al., 2007). Однако недавно описаны некоторые пациенты с укороченным полиаланиновым трактом на 4 или 7 аланиновых остатков, который сегрегировал с SPD-фенотипом (Nakano et al., 2007; Zhao et al., 2007; Garcia-Barcelo et al., 2008). Механизмы, с помощью которых уменьшение длины полиаланиновых трактов может вызывать болезнь, пока полностью не установлены, хотя имеются всё увеличивающиеся доказательства, что их патогенетический механизм затрагивает комбинированную потерю и избыточность функции, последнее объясняет доминантный негативный эффект на др. HOX гены (Kuss et al., 2009; Villavicencio-Lorini et al., 2010). Сходный доминантный негативный механизм действия был выявлен у Hoxd11-13 нокаутных мышей (Zakany и Duboule,1996). Возникли споры, действительно ли этот эффект в самом деле, обозначает, как предполагаемый авторами "neomorphic" признак (Kuss et al., 2009), поскольку это д. означать, что HOXD13 приобретает новую биологическую активность. Но это, по-видимому, не так, поскольку все фенотипы, описанные авторами (synpolydactyly и extraneous chondrogenesis) попадают в ранее описанные биологические активности для HOXD13.

(ii) Mutations affecting the function of the homeodomain a. Мутации потери функции (сдвига рамки, сайта сплайсинга или нонсенс). Помимо классической SPD, вызываемой увеличением или сокращением полиаланинового тракта, описан атипичный вариант SPD с особым фенотипом в ногах в 7 неродственных семьях (rev. Malik и Grzeschik, 2008). Три внутригенные делеции со сдвигом рамки считывания в HOXD13 дают укороченный белок, лишенный функционального гомеодомена, что делает белок неспособным соединяться с ДНК (Goodman et al., 1998). Кроме того, Kan и colleagues (2003) описали 758-2delA мутацию, разрушающую консенсус AG акцепторного сплайс-сайта экзона 2, это делает его склонным к неправильному сплайсингу при этом устраняется продукция функционального белка с мутантного аллеля. Наиболее вероятным механизмом действия, вызывающим в действительности тот же самый фенотип у 4-х мутаций, упомянутых выше, является функциональная гаплонедостаточность по HOXD13. Хотя необходимы функциональные исследования для подтверждения этой гипотезы, но мы предполагаем тот же самый патогенетический механизм и для 5 недавно описанных нонсенс мутаций: R319X (Furniss et al., 2009), E181X (Brison et al., 2011), R274X (Jamsheer et al., 2012), Q240X (Low и Newbury-Ecob, 2012) и Q248X (Kurban et al., 2011) поскольку мутантный белок лишен полностью или частично гомеодомена и отсюда вытекает результат частичной или полной неспособности связывать ДНК. Сходным образом, пациенты, страдающие от синдрома микроделеции 2q31.1, обнаруживают фенотипы, которые могут быть объяснены гаплонедостаточностью по HOXD генам, включая HOXD13, из-за гемизиготности по HOXD кластеру и окружающим его регуляторным последовательностям (Goodman et al.,2002; Tsai et al., 2009; Dimitrov et al., 2011; Ghoumid et al., 2011). Однако, не было исследовано, дают ли эти мутации стабильные белки, которые хотя и неспособны соединяться с ДНК, могут тем не менее оказывать вредный функциональный эффект за счет своих оставшихся терминальных порций посредством доминантного негативного механизма. Последнее не просто предполагает гаплонедостаточность по HOXD13, но и может позволять доминантный интерферирующий эффект мутантов посредством межбелковых взаимодействий.

b. Amino acid substitutions in the homeodomain

В литературе миссенс мутации внутри гомеодомена преимущественно распознаются за счет использования соглашения по различному цифровому кодированию, при этом начинают считать гомеодомен как остаток 1. Для ясности, во всем этом обзоре соглашение о числовом порядке было адоптировано по отношению к мутациям, которые располагаются в гомеодомене, тогда как на Figure 1, приведены альтернативные обозначения.

В настоящее время 5 миссенс мутаций были идентифицировано в гомеодомене (R31Q, R31W, I47L, S41C и Q50R), все они продуцируют отличающиеся фенотипы. Замена R31W, как полагают, дестабилизирует комплекс гомеодомен-ДНК, приводя к фенотипу потери функции с аномалиями пальцев, которые сильно напоминают таковые, вызываемые делециями сдвига рамки считывания в HOXD13 (Debeer et al., 2002a). Пациенты, имеющие мутацию R31Q, обнаруживают билатеральную кожную синдактилию или билатеральную клинодактилию указательных пальцев (Wang et al.,2012). Носители мутации I47L обнаруживают уникальный синдром боахидактилии-полидактилии, перекрывающийся с брахидактилией типа E (MIM 113300), со значительной вариабельностью в тяжести и проявлении (Caronia et al., 2003; Johnson et al., 2003). Рентгеновская кристаллография и MRI исследования комплексов гомеодомен-ДНК показали, что аминокислоты 31 и 47 являются высоко консервативными остатками внутри спирали распознавания гомеодомена, это делает возможными специфические для оснований контакты с ДНК (Gehring et al., 1994; Fraenkel и Pabo, 1998). Обе R31Q и I47L замены обусловливают мутации потери функции, поскольку они, как было установлено, нарушают функцию активации транскрипции HOXD13 (Caronia et al., 2003; Wang et al., 2012). Более того, мутации I47L изменяют скорее, чем устраняют связывание ДНК, поскольку они избирательно нарушают способность HOXD13 распознавать сайты мишени, соответствующие одному из двух консенсусных связывающих последовательностей, приводя к избирательной скорее, чем генерализованной потере функции HOXD13 in vitro и in vivo (Caronia et al., 2003; Johnson et al.,2003). Характерные признаки у пациентов, имеющих S41C или Q50R мутации, напоминают брахидактилию типа D (MIM 113200) и E (MIM 113300) (Johnson et al., 2003) или синдактилию типа V (MIM 186300) (Zhao et al., 2007), соотв. S41C аминокислотная замена, по-видимому, слегка изменяет скорее, чем устраняет ДНК-связывание (Johnson et al., 2003), тогда как Q50R мутация оказывает вредный эффект на активацию HOXD13-индуцируемой транскрипции EPHA7 промотора человека (see 1.3.3; Zhao et al., 2007). Для этих мутаций, предлагается смешанный механизм избыточной- и недостаточной функции в качестве объяснения для сложных перекрывающихся фенотипов уродств конечностей (Johnson et al., 2003; Zhao et al., 2007).

(iii) HOXD13 mutations outside previously characterized domains Лишь недавно идентифицирована первая миссенс мутация вне гомеодомена HOXD13. Одна мутация связана с гетерозиготным G-to-T переходом в экзоне 1 в позиции 659 кодирующей последовательности, которая замещает эволюционно сильно законсервированный Glycine в позиции 220 на Valine (G220V) (Fig.2; Fantini et al., 2009). Затронутые члены семьи обнаруживают варианты от SPD с некоторыми характерными признаками "классической" SPD вместе с дополнительными признаками, такими как клинодактилия пятого пальца (Fantini et al., 2009). Стабильность HOXD13(G220V), как было установлено, нарушается внутри клеток и мутантные белки накапливаются в нежные цитозольные агрегаты (Fantini et al., 2009). Это делает белок менее способным как к активации, так и репрессии транскрипции гена мишени. Замена G220V, следовательно, представляет собой доминантную мутацию потери функции, подтверждая гаплонедостаточность HOXD13 у человека.

Гомозиготная замена G-to-C в позиции 32 кодирующей последовательности (G11A, или G3A в соответствии с предыдущей номенклатурой) дает сложный фенотип SPD с клиническим перекрыванием с Brachydactyly type A1 (BDA1) и Brachydactyly type E (BDE). На молекулярном уровне, мутация не меняет ни субклеточную локализацию, ни активность связывания ДНК, ни функцию регуляции транскрипции HOXD13 in vitro, но вместо этого вызывает достоверное уменьшение периода полу-жизни белка по сравнению с диким типом (Brison et al.,2012). Поскольку HOXD13 непосредственно соединяется с GLI3R (Chen et al., 2004), то мутантная форма направляет GLI3R на преждевременную деградацию, вызывая тем самым фенотип, сходный с тем, что вызывается истощением GLI3R, а именно, образование дополнительных пальцев. Миссенс G11A мутация привела к открытию нового функционального домена в HOXD13, важного для стабильности белка, и продемонстрировала недооцененную функцию HOXD13 в регуляции количества пальцев посредством взаимодействия с GLI3R.

Недавно идентифицирована др. N-терминальная мутация (A6V) внутри HOXD13. Пробанд обнаруживал сложный синдром синдактилии-брахидактилии с лицевым дисморфизмом, включая расщепление губы (Ravel et al., 2011). Nakano et al. (2007) описали несколько новых мутаций в гене HOXD13, среди них 4 новые миссенс мутации в экзоне 1, две новые мутации сдвига рамки считывания и мутации в 5'UTR HOXD13. Необходимо отметить однако, что эти мутации не были пока охарактеризованы на молекулярном уровне. Следовательно, они могут служить в качестве платформы для обнаружения функций новых доменов в HOXD13, которые позволят понять молекулярный патогенез сложных фенотипов синполидактилий.

Сложность клинической картины у пациентов с SPD существенно ограничивает интерпретацию генотип-фенотпических взаимоотношений. В дополнение к клинической гетерогенности SPD, снижение пенетрантности также может затруднить генетический анализ и может повлиять на генетическое консультирование и оценку риска (Malik и Grzeschik, 2008). Более того, благодаря кооптированию существующих молекулярных путей на разных стадиях развития, неудивительно, что мутации, вызывающие уродства конечностей также влияют на развитие др. систем органов (Scott et al., 2005; Wilkie, 2003). Т.о., перекрывание с др. деформациями (конечностей) (Scott et al., 2005; Brison et al., 2011), добавляет ещё один уровень сложности. Отсутствие детальных структурно-функциональных данных по HOXD13 ещё больше осложняет мутационный анализ.

Animal Models of Synpolydactyly

Существующие животные модели,. которые сегодня используются для изучения нарушений функции HOXD13 пригодны для выяснения потенциальных генотип-фенотипических корреляций. Подходы, базирующиеся на мышах и курах позволяют исследования in vivo патогенетических механизмов, c помощью которых мутации HOXD13 вызывают фенотипы SPD, а также помогают в идентификации транскрипционных мишеней.

(i) Mouse models for synpolydactyly

Получены некоторые мыши с генетически модифицированным Hoxd13 или выше и нижестоящими регуляторными последовательностями в комбинации или без с критическими игроками в формировании паттерна конечностей позвоночных (Zakany и Duboule, 1996; Peichel et al., 1997; Spitz et al., 2001; Kmita et al., 2002, 2005; Zakany et al., 2004; Tarchini et al., 2006; Williams et al., 2006). Три наиболее информативные мышиные модели SPD включают synpolydactyly homolog (spdh) мышей, Hoxd13 нокаутных мышей и Hoxd11-13 нулевых мышей (Fig. 3). Мыши spdh являются спонтанной мышиной моделью мутаций экспансии полиаланинового тракта человека, дающей фенотип клинически сравнимый с типичной SPD у людей (Johnson et al., 1998; Bruneau et al., 2001). Как и при SPD человека , фенотип spdh у мышей согласуется с характером дефектов, которые вызывают полидактилию, отсутствие образования суставов между фалангами и тяжелыми дефектами хондрогенеза и остеогенеза (Albrecht et al., 2002). Недавние находки подтвердили, что мутантный Hoxd13 у spdh мышей вызывает полидактилию за счет снижения синтеза RA (Kuss et al., 2009). Гомозиготные Hoxd13 нулевые мыши, несущие целенаправленные разрушения гомеобокса Hoxd13 , имеют брахидактилию, слияние суставов, задержку хондрификации и оссификации и частичную пост-аксиальную полидактилию (Dolle et al., 1993; Davis и Capecchi, 1996). Гетерозиготы иногда обнаруживают легкие аномалии конечности, включая минорные метакарпальные и карпальные дефекты или рудиментарные добавочные пост-аксиальные пальцы в передних конечностях. Интересно, что ни , Hoxd13^-/-, ни Hoxd13^+/- мыши не проявляют каких-либо классических SPD фенотипов, включая синдактилию или центральную или преаксиальную полидактилию, подтверждая разные последствия гаплонедостаточности по HOXD13 у человека и мыши. Hoxd11-13^-/- мыши имеют целенаправленную делецию Hoxd11-13, фенокопируя тем самым признаки SPD человека, такие как укорочение, синдактилия, слияния и удвоения пальцев (Zakany и Duboule,1996). Интересно, что инактивация Hoxd13 вызывает занчительно более легкие фенотипические отклонения пальцев (Dolle et al., 1993; Davis и Capecchi, 1996), тогда как Hoxd12 и Hoxd11 , нокаутированные по отдельности или вместе оказываются даже менее затронутыми, когда Hoxd13 остается функциональным (Davis и Capecchi, 1994, 1996; Kondo et al., 1996; Kmita et al.,2002). Всё же комбинированная тройная потеря функции вызывает тяжелые SPD фенотипы, которые согласуются с функциональным доминированием Hoxd13 над др. более задними Hoxd генами. Figure 3.

Кроме того, мышиные модели, обладающие мутациями внутри регуляторного ландшафта кластера Hoxd, наиболее желательны поскольку наши современные о выше- и нижестоящих транскрипционных энхансерах или репрессорах лишь недавно подвинулись вперёд (Andrey et al., 2013). Однако они, скорее всего, продуцируют (сходные) фенотипические отклонения конечностей, что подтверждается тяжелыми нарушениями конечностей у ulnaless мутантных мышей (Herault et al., 1997; Peichel et al.,1997). Последний, радиационно-индуцированный полудоминантный мутант мыши нарушает паттерн экспрессии Hoxd11-13 генов в отсутствие хромосомной перестройки или мутации в белок кодирующем регионе. Причинная мутация, следовательно, как полагают, затрагивает цис-действующий регуляторный элемент, контролирующий весь кластер (Herault et al., 1997; Peichel et al., 1997).

(ii) Retroviral gene delivery in the chick

Хот я современные мышиные модели воспроизводят большинство аспектов SPD фенотипов человека, они в основном базируются на полной или частичной потере функции гена и на сегодня не существует мышиной модельной системы, базирующейся на точковой мутации в Hoxd13. Использование стратегий, базирующихся на курах, рассматривается как обязательное для выяснения молекулярного патогенеза различных скелетных деформаций, вызываемых аминокислотными заменами в HOXD13 (Yokouchi et al., 1995; Goff и Tabin, 1997; Caronia et al., 2003; Fantini et al., 2009; Brison et al., 2012). Куриные модели имеют преимущества, т.к. являются более экономичными, с меньшими затратами труда и более быстрыми. Подходы с избыточностью функции у кур включают доставку генов c помощью электропортации (Funahashi и Nakamura, 2008; Sauka-Spengler и Barembaum, 2008), ретровирусных векторов (Gordon et al., 2009), и недавно также c помощью (преходящего) трансгенеза кур (Mozdziak и Petitte, 2004; Han, 2009).

a. Study of skeletal development using the RCAS retroviral expression system

Доступность способных к репликации RCAS ретровирусов для доставки генов в яйцо обеспечивает совместную экспрессию желаемых белков в развивающихся зачатках конечностях эмбрионов кур (rev. Morgan и Fekete, 1996; Gordon et al., 2009). Эта система эффективна и легко реализуется и нуждается лишь в Class 1 тканевой культуре, поскольку вирус реплицируется только в клетках птиц. Он участвует в инфекции конечностей кур вирусами, экспрессирующими интересующий ген, напр., дикого типа или мутантные формы HOXD13 или eGFP в качестве контроля эффективности инфекции (Fig. 4A,B). Короче, cДНК субклонируется в RCAS-BP ретровирусный вектор, вирусы продуцируются и инъецируются в латеральную пластинку мезодермы на Hamburger-Hamilton ст. 10 (HH10) эмбрионов кур (Logan и Tabin, 1998). Контралатеральная конечность используется в качестве внутреннего контроля, необходимого для фенотипического анализа. Морфология скелетных элементов затем исследуется на ст. HH34-36 c помощью Alcian Blue/Alizarin Red окрашивания хрящей и костей, соотв. (Fig. 4C).

Необходимо отметить, однако, что HOXD13 как и многие др. паттерн-формирующие гены ограничивают как временное, так и пространственное окно экспрессии во время формирования конечностей эмбрионов кур. RCAS вирионы, несущие HOXD13 трансген, необходимо инъецировать перед началом развития конечности (на HH10) чтобы эктопически экспрессироваться по всему зачатку конечности. Причина двойная: во-первых, для репликации вирус нуждается в интеграции в геном хозяина, которая происходит только во время митотической фазы клеточного цикла (Hughes, 2004). Это событие также детерминирует временную рамку, необходимую для уровней экспрессии трансгена, чтобы преодолеть порог для индукции физиологическ4ого эффекта (Logan и Tabin, 1998). Во-вторых, глобальная инфекция зачатка конечности нуждается в раннем присутствии вируса уже внутри поля конечности, т.е. перед возникновением зачатка конечности, как и при регионализованной инфекции, когда инъекции происходит на более поздних стадиях (HH16-18) (Logan и Tabin, 1998; Gordon et al., 2009).

b. Targeted misexpression of wild-type HOXD13

Эктопическая экспрессия HOXD13 дикого типа в развивающихся конечностях кур, как было установлено, вмешивается прежде всего в развитие скелетных элементов stylopod, zeugopod и проксимальной части autopod (Fig. 4; Goff и Tabin, 1997; Caronia et al., 2003; Fantini et al., 2009; Brison et al., 2012). Повышенные уровни дикого типа HOXD13 не влияют на нормальное развитие дистальных частей конечностей, поскольку не было описано деформаций аутоподов, обычного места экспрессии Hoxd13 у кур. Однако эти находки находятся в контрасте с фенотипами полидактилии при эктопической экспрессии дикого типа Hoxd13 у мышей (Williams et al., 2006). Отсутствие любого из фенотипических отклонений в дистальных частях аутопода эмбрионов кур д. поэтому быть скоррелировано с уровнем и/или временем эктопической экспрессии HOXD13(WT). Заметное укорочение проксимальных элементов скелета конечностей (тибии и фибулы) вызываемое эктопической экспрессией дикого типа HOXD13 , скорее всего, обусловлено функциональными помехами эндогенным HOX белкам (posterior prevalence), в особенности тех, что принадлежат группе паралогов 11 (Zakany и Duboule, 2007). Было предположено, что механизм, c помощью которого эктопическая экспрессия HOXD13 вызывает изменения в длине костей, обусловлено изменениями скорости их пролиферации (Goff и Tabin, 1997). Необходимо отметить однако, что эктопическая экспрессия HOXD11 на поздних ст. развития также вызывает укорочение длинных костей в zeugopod, что нелегко объяснить в терминах заднего превалирования (posterior prevalence), поскольку этот эффект появляется в его обычном домне экспрессии. Возникает альтернативная возможность, что поздняя избыточная экспрессия 5'Hoxd генов негативно затрагивает хондрогенез, как было показано Kuss et al. (2009), это может быть наиболее очевидным в длинных костях zeugopod.

c. Modeling of SPD phenotypes caused by point mutations in HOXD13

Эффект in vivo разных точковых мутаций был исследован с использованием RCAS-обеспечиваемой избыточной экспрессии мутантного HOXD13 у развивающихся эмбрионов кур. Эмбрионы с эктопической экспрессией HOXD13(I47L) обнаруживали тяжелые укорочения хрящей zeugopodal, при отсутствии аномалий фаланг (Fig. 4; Caronia et al.,2003). Типичная морфология хряща длинной кости тибии иногда превращалась в округлый хрящ с изгибанием фибулы (Caronia et al.,2003). Кроме того, некоторые эмбрионы имели эктопические хрящи в zeugopod. Ни одно из этих специфических изменений тибии, ни эктопический хрящ не обнаруживались у эмбрионов с эктопической экспрессией дикого типа HOXD13 (Goff и Tabin, 1997; Caronia et al., 2003). Биохимическое сравнение мутантного и дикого типа белков показало, что замена I47L нарушает связывание ДНК по субнабору сайтов, распознаваемых белком дикого типа, тогда как эктопическая экспрессия HOXD13(I47L) вызывает избирательный фенотип потери функции. Проксимальные хрящи у эмбриона с эктопической экспрессией HOXD13(IQN), искусственного мутанта, несущего замены аланина в позиции 47(I), 50(Q), и 51(N) гомеодомена, вызывая тем самым его неспособность связывать ДНК, были более короткими, чем у эмбрионов с эктопической экспрессией дикого типа HOXD13 (Caronia et al., 2003). Поразительно, фенотип, вызываемый мутантами HOXD13, неспособными связывать ДНК, количественно сходен с, но качественно более тяжелый, чем тот, что продуцируется дикого типа HOXD13. Этот эффект д. указывать на то, что эффект доминантного интерферирования мутанта осуществляется возможно благодаря межбелковым взаимодействиям в случае стабильного, укороченного белка.

Эктопическая экспрессия ретровирусного HOXD13(G220V) приводит к общему ослаблению скелета по сравнению с нормой (Fantini et al., 2009). Не наблюдается достоверных нарушений нормального развития пальцев при неправильной экспрессии HOXD13(G220V) в конечностях кур. Т.о., HOXD13(G220V) экспрессия в дистальных частях аутопода не мешает функции эндогенного Hoxd13, демонстрируя, что HOXD13(G220V) не действует посредством доминантного негативного механизма или др. механизма избыточности функции. Более того, эти результаты находятся в согласии с данными in vitro, показавшими нарушение способности HOXD13(G220V) активировать или репрессировать транскрипцию за счет свуязывания ДНК, и активировать in vivo непосредственную нижестоящую мишень для HOXD13 (Fantini et al., 2009). Итак, эти данные показывают, что мутация G220V не действует посредством доминантно-негативного механизма, а вместо этого является мутацией потери функции, подтверждая гаплонедостаточность HOXD13 у человека.

Осуществлена стратегия инъекции двойной RCAS, комбинирующая два RCAS вируса, экспрессирующие разные типы гликопротеинов оболочки, чтобы обойти вмешательство рецепторов (Gordon et al., 2009) и инфицировать клетки эмбрионов кур одновременно HOXD13 и GFP. Это делает возможным выбор эмбрионов, которые экспрессируют униформно трансгены и исключительного по всей инъецированной задней конечности, обогащая тем самым пул эмбрионов с наиболее тяжелыми проявлениями фенотипического спектра. Эта техника позволяет существенно снизить экспериментальную вариабельность и была осуществлена во время анализа фенотипических последствий мутации HOXD13(G11A). Кроме того, в дополнение к обычной метке эктопической экспрессии HOXD13 внутрим конечности, мутация G11A вызывала эктопическое образование переднего хряща или пальцев у трети инъецированных эмбрионов. Brison et al. (2012) подтвердили, что HOXD13(G11A) истощает зачаток передней конечности от антагонистического действия Gli3 репрессора, способствуя его деградации, модулируя тем самым деликатный баланс между генами формирования паттерна конечностей HOXD13, dHand и Gli3. Эти находки подтвердили, что мутация G11A может действовать посредством механизма избыточности функции, поскольку она также затрагивает дистальные части аутопода в противовес дикому типу или др. мутантам (Goff и Tabin, 1997; Caronia et al., 2003; Fantini et al., 2009). Это особенная мутация является достаточно мощной , чтобы фенокопировать типичную для человека синполидактилию у кур, предоставляя новый инструмент для изучения молекулярных основ нарушений в деталях (Fig. 3F).

Хотя использование RCAS-управляемой эктопической экспрессии мутантов HOXD13 может помочь раскрытию патологического механизма действия вновь идентифицированных HOXD13 мутаций, присутствующих в разных пока не установленных частях белка, которые в свою очередь прольют свет на сложность клинических проявлений синполидактилии у человека.

GENERAL DISCUSSION AND CONCLUSIONS

The study of human congenital limb malformations does not only allow the identification of the causative gene mutations, which is imperative for genetic counseling и disease prevention, it also provides insights into the complex pathways orchestrating normal limb development. In fact, the genotype-phenotype correlation works in both directions. A better understanding of the phenotypes in patients from the genotypic background is not always straightforward, but when (partially) resolved, it could yield crucial insights into the process of proper limb development. Alternatively, awareness of the key events during normal limb development could guide the screen for the best candidate gene of the syndrome.

In this survey, we provide an overview of the HOXD13 mutation spectrum causing human limb malformations, thereby focusing on synpolydactyly. We highlight the importance of the chicken embryo as a model system for vertebrate limb development и disease.

However, despite continuous progress in the HOXD13 research field, some hurdles still remain to be overcome. The complexity of the clinical phenotype in SPD patients severely limits the interpretation of the genotype-phenotype relationship. In addition to the clinical heterogeneity of SPD, the reduced penetrance may also compromise the genetic analysis и may have implications on the genetic counseling и risk estimation (Malik и Grzeschik,2008). Moreover, due to the co-option of existing molecular pathways at different stages of development, it is not surprising that mutations causing limb malformations also affect the development of other organ systems (Wilkie,2003; Scott et al., 2005). Thus, the overlap with other (limb) deformities (Scott et al., 2005; Brison, 2011), adds another level of complexity. In addition to these clinical issues, lack of detailed structure-function data of HOXD13 further complicates the mutation analysis. A continuous и close collaboration between clinicians, pathologists и molecular or developmental biologists is necessary to screen for novel mutations to add to the mutation spectrum ofHOXD13, the most interesting being the ones located in a region of the protein that has not been characterized before. Finally, our understanding of the molecular mechanisms by which HOX gene expression is regulated, or how they act in concert with their cofactors or collaborators to regulate expression of their downstream target genes, has lagged behind (Mann et al., 2009). The generation of high quality antibodies against the protein, и both microarray approaches и ChIP-on-Chip analyses could add more candidates to the list ofHOXD13 regulated genes и could put in perspective different players in the development of a normal autopod.

Altogether, these efforts will make it possible for future studies to approach the quest to unravel the SPD genotype-phenotype correlation from new angles. Also, it will reinforce the interpretation of the effects of novel mutations within the HOXD13 protein that cause complex SPD phenotypes.

Joining the fingers: A HOXD13 story Nathalie Brison, Philippe Debeer, Przemko Tylzanowski Developmental Dynamics 243:37-48, 2014.

Joining the fingers: A HOXD13 story
Nathalie Brison, Philippe Debeer, Przemko Tylzanowski
Developmental Dynamics 243:37-48, 2014.