Посещений:
ВРОЖДЕННЫЕ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА



Секвенирование Экзомов

(2016) Family Based Whole Exome Sequencing Reveals the Multifaceted Role of Notch Signaling in Congenital Heart Disease.
Preuss C, Capredon M, Wunnemann F, Chetaille P, Prince A, Godard B, et al.
PLoS Genet 12(10): e1006335. doi:10.1371/journal.pgen.1006335

Left-ventricular outflow tract obstructions (LVOTO) encompass a wide spectrum of phenotypically heterogeneous heart malformations which frequently cluster in families. We performed family based whole-exome and targeted re-sequencing on 182 individuals from 51 families with multiple affected members. Central to our approach is the family unit which serves as a reference to identify causal genotype-phenotype correlations. Screening a multitude of 10 overlapping phenotypes revealed disease associated and co-segregating variants in 12 families. These rare or novel protein altering mutations cluster predominantly in genes (NOTCH1, ARHGAP31, MAML1, SMARCA4, JARID2, JAG1) along the Notch signaling cascade. This is in line with a significant enrichment (Wilcoxon, p< 0.05) of variants with a higher pathogenicity in the Notch signaling pathway in patients compared to controls. The significant enrichment of novel protein truncating and missense mutations in NOTCH1highlights the allelic and phenotypic heterogeneity in our pediatric cohort. We identified novel co-segregating pathogenic mutations in NOTCH1 associated with left and right-sided cardiac malformations in three independent families with a total of 15 affected individuals. In summary, our results suggest that a small but highly pathogenic fraction of family specific mutations along the Notch cascade are a common cause of LVOTO.
Left-ventricular outflow tract obstructions (LVOTO) представлены группой кардиальных нарушений, которые ограничивают кровоток в левой части сердца. Этот гетерогенный подкласс кардиальных нарушений обычно ассоциирует с болезнью аортальных клапанов и ранним началом аортопатий, включая тяжелый стеноз и расширение аорты. Эти осложнения часто приводят позднее к высоким нагрузкам на болезнь, проявляясь в виде аневризмы торакальной части аорты и замещению клапанов. Несмотря на повторяющиеся сочетания признаков LVOTO среди членов семей и строго наследование компонентов [1,2], лежащая в основе генетическая причина болезни остается в основном неизвестной [3]. Недавнее секвенирование генома и генотипирование выявили одиночные нуклеотидные варианты (SNVs) и варианты числа копий (CNVs) в генах, которые играют важную роль в ходе развития раннего тракта оттока и в модификациях хроматина [4,5]. Список известных генов, вызывающих CHD, быстро увеличивается и может быть грубо подразделен на три функциональные группы: регуляторы транскрипции, кардиальные структурные белки и сигнальные компоненты. Разрушающие мутации в критических факторах, регулирующих экспрессию кардиальных генов, такие как NKX2-5, TBX5 и члены семейства генов GATA (GATA4-GATA6), были выявлены в семьях с congenital heart disease (CHD) [6-9]. Кроме того, редкие миссенс мутации в структурных белках кардиальных мышц, включая FLNA и MYH6 оказались связанными с нарушениями одиночных генов и с изолированными случаями CHD [10]. Однако, большая часть пациентов с CHD не может быть объяснена мутациями известных генов, вызывающих болезни [3]. Недавние исследования подтвердили, что многие гены в законсервированных сигнальных путях обеспечивают важные сигналы для критических процессов во время раннего эмбрионального развития и вносят вклад в возникновение болезней. Семейное и спорадической возникновение LVOTO оказалось ассоциированным с мутациями генов сигнального каскада Notch [11,12]. Многогранная передача сигналов Notch играет критическую роль в регуляции выбора судеб кардиальных клеток и в регуляции морфогенеза камер и клапанов сердца [13-15]. Недавнее исследование показало, что гаплонедостаточность по NOTCH1 изменяет специфические сети генов, влияя на развитие клапанов, и на остеогенные факторы, которые, в свою очередь, приводят к болезням аортальных клапанов [16]. Это согласуется с идентификацией NOTCH1лигандов JAG1 и DLL4, которые, как было установлено, вызывают синдром Alagille и болезнь аортальных клапанов у людей и модельных животных [17-19]. Однако, высокая функциональная перекрываемость сигнального каскада Notch и масса перекрывающихся фенотипов между взаимодействующими генами указывает на определенный уровень гетерогенности локуса, ассоциированного с болезнью. Здесь мы описываем наши результаты по семьям с целью расшифровать лежащую в основе генетическую гетерогенность признаков LVOTO в группе детей, включающей 182 пациента из 51 семьи French Canadian происхождения. Центральной для нашего подхода является семейная единица для генотип-фенотипических корреляций.

Discussion


В данном исследовании мы осуществляли секвенирование всего экзома и целенаправленно неов кандидатов в семьях с LVOTO , чтобы вычленить подлежащую генетическую архитектуру CHD. Мы идентифицировали кластер редких совместно сегрегирующих мутаций в высоко законсервированных генах оси передачи сигналов Notch.

NOTCH1 mutations in LVOTO


Поскольку мутации избыточности и потери функции описаны для NOTCH1 [11,12,48], но идентификация семей с многими затронутыми членами, несущими новые нонсенс мутации происходит редко в контексте врожденных болезней сердца. В нашей группе мы наблюдали образование кластеров на внеклеточных NOTCH1 концах в трех семьях с 15 затронутыми носителями мутаций. Это подтверждает мнение, что разрушение цитозольного домена, но не части белка, связывающей лиганд, вносит вклад в болезнь клапанов. Наши находки согласуются с недавними исследованиями, что нарушения стоящей ниже NOTCH1 передачи сигналов может затрагивать эпителиально-мезенхимный переход в ходе развития тракта оттока [30,49]. Во время этого процесса развития, который богат на редкие вредные мутации в нашей группе LVOTO, эндокардиальные клетки отсоединяются, чтобы стать миграторными мезенхимными клетками, которые, в свою очередь, являются критическими для собственно формирования кардиальных клапанов [30]. Заметим, мы не наблюдали строгие генотип-фенотипические корреляции с дефицитом NOTCH1 и с подтипами LVOTO среди семей нашей группы. Наличие обструкций правостороннего тракта оттока в семьях 1 и 3 демонстрирует степень фенотипической гетерогенности для этого локуса. Это согласуется со множественными болезненными ассоциациями с NOTCH1 с правосторонними повреждениями, описываемыми в более 18% носителей мутации NOTCH1 , обнаруживающих правосторонние кардиальные нарушения [11,50]. Фенотипическая экспансия с группе наших семей интересна из-за предыдущей ассоциации NOTCH1 и ARHGAP31 с синдромом Adams-Oliver (AOS) [40,41]. Если анализировать молекулярные пути, нарушенные при AOS и LVOTO, то кажется очень вероятным, что специфический CDC42/RAC1 регулятор ARHGAP31, который экспрессируется на высоком уровне в развивающемся сердце мышей [40], а путь Notch сходится с ним на общем сигнальном пути, критическом для развития тракта оттока. Заметим, что мы не наблюдали признаков синдрома Adams-Oliver у пациентов с NOTCH1 нонсенс мутациями, но встретился случай болезни аортальных клапанов.

Enrichment of deleterious mutations along the NOTCH signaling cascade


Более того, ремоделирование хроматина является важным механизмом в клетках нервного гребня в процессе образования подушек клапанов и необходимо для формирования тракта оттока. Этот процесс обеспечивается несколькими генами кандидатами вдоль оси передачи сигналов Notch, идентифицированным в данном исследовании, включая SMARCA4, JARID2 и MAML1. Мы полагаем, что нарушения в модификаторах хроматина, таких как MAML1, который действует как транскрипционный ко-фактор для NOTCH1, могут вызывать предрасположенность у пациентов к наблюдаемому фенотипическому отклонению дефектов тракта оттока в нашей группе. Целенаправленное нарушение стоящей ниже Notch передачи сигналов в клетках нервного гребня с помощью доминантно негативного MAML1 (DNMAML) приводит к сходным нарушениям тракта оттока у животных, моделирующих болезнь [43]. Это согласуется с ткане-специфической ролью репрессоров транскрипции Notch JARID2 и SMARCA4 (BRG1). Истощение Brg1 в эндотелиальных клетках часто приводит к двухстворчатости аортальных клапанов у мышей, а эндотелиальный JARID2 необходим для нормального кардиального развития [44,51,52]. Эти находки подтверждают роль гетерогенности локуса в болезни аортальных клапанов, где нарушение функционально родственных членов одного и того же пути может приводить к сходным фенотипам у мыши и человека. Это подчеркивается идентификацией высоко патогенных и редких сегрегирующих вариантов болезней при EPHB4. В мышиной модели, потеря функции Ephb4 воспроизводит эффект мутаций Notch1, приводящих к сходным нарушениям аорты [53].

Sensitized genetic background in CHD


Наше исследование подчеркивает, что семейная сегрегация и взвешенность вариантов в пользу патогенности могут служить в качестве важного ресурса для описания потенциала болезни по вызыванию вариантов CHD в отсутствие крупных размеров выборки. Строгая фильтрация аллелей порогами (ExAC < 0.1% MAF) показатель CADD, базирующийся на ранжировании патогенности (скалированный CADD показатель более 15) являются особенно пригодными для анализа варьирующих генов, таких как KMT2D и MYH6. Такая фильтрация позволила нам идентифицировать две рецессивные мутации MYH6 в семье с плейотропными кардиальными нарушениями, включая HLHs, дефект ы перегородки и нарушения аорты. Доминантные MYH6 мутации, как известно, имеют изменчивую пенетрантность и несмотря на отсутствие экспрессии MYH6 в тракте оттока, описываются нарушения сосудистой функции и снижение кровотока у модельных животных [54]. Это подчеркивает, как аутосомно доминантно передаваемые миссенс мутации могут создавать сенсибилизированный генетический фон, который предрасполагает членов семьи к CHD вопреки полной пенетрантности. Присутствие второй мутации в том же локусе или внешне-средовых нарушений д. быть необходимо для достижения состояния болезни. Такая наиболее похожая ситуация у показательного пациента с HLHs в семье 5 (Family 5, III-3) (S5a Fig), где материнская мутация MYH6 с более высокой патогенностью унаследована от ветви семьи без превалирования CHD в истории семьи.

Limitations and conclusions


Хотя мы наблюдали обогащение вредными мутациями в высоко консервативных генах- вдоль многогранного сигнального каскада NOTCH, но наше исследование имеет ограничения. Во-первых, ни один из наших локусов кандидатов не обнаружил в геноме достоверной ассоциации с болезнью. Это может быть обусловлено малой выборкой нашей группы, которая предоставляет ограниченную статистическую силу, различия последовательностей, обогащаемых kits и платформы секвенирования или что более важно подлежащей сложной генетической архитектурой CHD.
Кроме того, средовые факторы, такие как аортальный кровоток или различия в генетическом фоне у членов семей, не были учены в нашем исследовании. Однако, эти факторы, скорее всего, вносят вклад в фенотипическую гетерогенность и неполную пенетрантность, наблюдаемые в семьях с CHD. Дальнейшая функциональная оценка идентифицированных мутаций во множественных локусах, будет необходима для выяснения их роли в течении болезни. Итак, наше исследование предоставило более широкую информацию о генетическом и фенотипическом гетерогенном ландшафте CHD. Мы обнаружили совместную сегрегацию мутаций, которые, скорее всего, вносят вклад в болезнь у 12 из 51 семей (23.5%) по множественным локусам, это согласуется с недавними исследованиями, подчеркивающими паттерн олигогенного наследования не синдромальных CHD в семьях [45,55-57]. Т.к. количество генов, ассоциированных с CHD, увеличивается с каждым исследованием экзомов, растут и доказательства, что эти гены конвергируют в комплексы, до сих пор дискретной сети, управляющей трактом оттока и сосудистым развитием [16,58,59].