Посещений:
НАРУШЕНИЯ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛОВ Notch



Фенотипические нарушения

The developmental biology of genetic Notch disorders
Jan Masek, Emma R. Andersson
Development 2017 144: 1743-1763; doi: 10.1242/dev.148007

Notch signaling regulates a vast array of crucial developmental processes. It is therefore not surprising that mutations in genes encoding Notch receptors or ligands lead to a variety of congenital disorders in humans. For example, loss of function of Notch results in Adams-Oliver syndrome, Alagille syndrome, spondylocostal dysostosis and congenital heart disorders, while Notch gain of function results in Hajdu-Cheney syndrome, serpentine fibula polycystic kidney syndrome, infantile myofibromatosis and lateral meningocele syndrome. Furthermore, structure-abrogating mutations in NOTCH3 result in CADASIL. Here, we discuss these human congenital disorders in the context of known roles for Notch signaling during development. Drawing on recent analyses by the exome aggregation consortium (EXAC) and on recent studies of Notch signaling in model organisms, we further highlight additional Notch receptors or ligands that are likely to be involved in human genetic diseases.
Передача сигналов Notch возникла у многоклеточных (Gazave et al., 2009; Richards and Degnan, 2009) и рассматривается как один из основных сигнальных путей, контролирующих эмбриональное развитие. В самом деле, от губок и круглых червей до мышей передача сигналов Notch контролирует множественные критические процессы во время развития (Andersson et al., 2011). С момента открытия мутантных мух с notched крыльями, ген приобрел название Notch (N), более 100 лет тому назад (Dexter, 1914), и последующая идентификация ответственного геномного региона (Morgan, 1917), открыла путь многочисленных исследований по выяснению пути Notch (rev. Bray, 2016; Kopan and Ilagan, 2009), по генерации нокаутов у модельных организмов и открытию Notch генов, мутантных у человека (Gridley, 2003) - подтвердив важную роль передачи сигналов Notch в развитии человека.
Разные виды имеют отличающиеся репертуары Notch рецепторов и лигандов (Fig. 1 and Gazave et al., 2009). У людей, напр.. экспрессируются 4 Notch receptors (NOTCH1-NOTCH4) и 5 разных Notch лигандов (JAG1 and JAG2, and DLL1, DLL3 and DLL4) (Fig. 2), тогда как у плодовых мушек имеется один рецептор (Notch) и два лиганда (Delta и Serrate). Активация пути обычно происходит, когда связанный с мембраной гетеродимерный, один раз пересекающий мембрану Notch рецептор взаимодействует с Notch лигандом в контактирующей клетке (Fig. 3). Эти взаимодействия приводят к серии протеолитических расщеплений, обеспечиваемых секретазой ADAM и γ -secretase комплексом, приводя к высвобождению Notch intracellular domain (NICD), который транслоцируется в ядро, где он действует совместно с RBPJκ и MAML, чтобы активировать транскрипцию. Этот процесс далее тонко управляется c помощью многочисленных пост-трансляционных модификаций как рецепторов, так и лигандов и посредством ко-активарторов или ингибиторов, которые действуют на каждом уровне, обманчиво простой путь передачи сигналов (Andersson et al., 2011; Bray, 2016).
Fig. 1. The evolution of Notch receptors and ligands. Protein sequences of Notch receptors (A) and ligands (B) were aligned using multiple sequence alignment by MAFFT L-INS-I and default parameters (http://www.genome.jp/tools/mafft/). The evolutionary history was inferred using the maximum likelihood method based on the JTT matrix-based model (Jones et al., 1992). The percentage of trees in which the associated taxa clustered together is shown next to the branches. Initial tree(s) for the heuristic search were obtained automatically by applying neighbor-join and BioNJ algorithms to a matrix of pairwise distances estimated using a JTT model, and then selecting the topology with superior log likelihood value. The trees are drawn to scale, with branch lengths measured in the number of substitutions per site. All positions containing gaps and missing data were eliminated. There were a total of 940 positions in the final dataset A and 163 in B. Evolutionary analyses were conducted in MEGA7 (Kumar et al., 2016). Groups of vertebrate receptors and ligands clustering with individual human NOTCH receptors and JAGGED and DLL ligands are enclosed in separate brackets. Foraccessionnumbers, pleasesee Table S1.



Fig. 2. The human Notch repertoire. Protein domain arrangement of human Notch receptors (A) and ligands (B). Structures are based on InterPro protein domain prediction and other studies (Ehebauer et al., 2005; Lubman et al., 2005). ANK, ankyrin repeats; DLL, Delta-like protein; DSL, Delta/Serrate/LAG-2 domain; EGF, epidermal growth factor; HD, heterodimerization domain; JAG, jagged; JSD, Jagged Serrate domain; LNR, Lin-Notch repeats; MNNL, Notch ligand N-terminal domain; NRR, negative regulatory region; PDZL, PDZ ligand domain [PDZ, post synaptic density protein (PSD95)]; PEST, proline (P), glutamic acid (E), serine (S) and threonine (T) degradation domain; RAM, Rbp-associated molecule domain; s, cleavage site; SP, signal peptide; TAD, transactivation domain; TM, transmembrane domain; vWFC, von Willebrand factor type C domain.

Fig. 3. The core Notch pathway. The canonical Notch signaling pathway is at its core a straightforward signaling mechanism in which a Notch ligand on a signal-sending cell binds to a heterodimeric Notch receptor on a contacting signal-receiving cell. Binding leads to cleavage of the receptor by ADAM secretase (not pictured) and subsequent cleavage by the γ-secretase complex, which is composed of nicastrin (NCSTN), presenillin enhancer 2 (PEN2), presenillin 1 (PSEN1) and anterior pharynx 1 (APH1). Cleavage releases the Notch intracellular domain (NICD), which translocates to the nucleus to activate the transcription of target genes, acting together with recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region [RBPJκ, also known as CSL for CBF1/Su(h)/LAG-1] and the co-activator mastermind-like (MAML).
Мутации в компонентах семейства Notch обычно вызываются c помощью путей, существенных для онтогенетических функций, хотя идентифицированы и мутации, которые обусловливают тяжелые врожденные нарушения и нарушения приспособленности (Table 1). Открытие врожденных болезней, связанных с дефектами передачи сигналов Notch началось в 1996, при этом анализ сцепления базировался на открытии мутаций в хромосоме 19, в частности мутаций NOTCH3, у индивидов с диагнозом CADASIL (cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy) (Joutel et al., 1996). Затем две группы показали, что JAG1 является геном, который локализован в хромосоме 20p12, которая соответствует синдрому Alagille (Li et al., 1997; Oda et al., 1997). Затем идентифицированы несколько наследственных нарушений, вызываемых мутациями генов Notch (Table 1). До этих открытий, хромосомные перестройки в NOTCH1 человека и интеграции вирусов в мышиный Notch4, как было установлено, вызывают T-ALL и опухоли молочных желез, соотв. (Ellisen et al., 1991; Uyttendaele et al., 1996), подчеркивая ключевую роль Notch при раке (rev. Nowell and Radtke, 2017).

Table 1. Genetic disorders associated with mutations in Notch receptors or ligands

Многие из врожденных болезней, связанных с путем Notch, редки, с распространенностью несколько на 100,000, подчеркивая как раз насколько критическими являются компоненты передачи сигналов Notch для жизнеспособности человека, а также на присутствие серьёзного узкого места для изучения влияния этих генов на человека. К счастью, генерация нокаутных мышей и исследования др. животных моделей представляют исследователям обширную информацию относительно функции гена Notch, выявляя роль специфических компонентов Notch в развитии человека и болезнях.
Путь Notch участвует в развитии большинства органов. Мы сконцентрируемся в основном на процессах развития, лежащих в основе патологий, проявляющихся в связанных с Notch врожденных заболеваниях. Мы обсудим недавний анализ 'big data' целого генома и секвенирования всего генома, указывающие на присутствие или отсутствие мутаций в компонентах Notch в популяции людей.
Table 2. Components of the Notch pathway are crucial for human development

Adams-Oliver syndrome: roles for NOTCH1, DLL4 and RBPJk in human development


До 1940s дети, рождающиеся с недоразвитыми верхними или нижними конечностями, определялись как имеющие врожденные ампутации, состояние сегодня известное как поперечное отсутствие терминальных частей конечностей. Эти дефекты приписывали амниотическим перетяжкам или стягиванием пупочного канатика конечностей (amniotic band syndrome). В 1945, Clarence Paul Oliver и Forrest H. Adams описали пациента с аномалиями стопы и одной руки, а также с вырубкой (denuded) области скальпа, при этом череп был более тонким. Наиболее важно то, что они установили у многих членов семейства наличие сходных симптомов и предположили, что состояние наследственное (Adams and Oliver, 1945).

Characteristics and genetics of Adams-Oliver syndrome


Синдром Adams-Oliver диагностируется на основании терминальных поперечных уродств конечностей, отсутствию кожи (обозначаемой как aplasia cutis congenita) и частичному отсутствию костей свода черепа (Fig. 4A). Кожа затрагивается наиболее существенно, повреждая регион свода черепа, хотя aplasia cutis congenita может также затрагивать кожу живота. Обычно при рождении регион поврежденной кожи напоминает залеченную рубцовую кожу, а биопсия кожи выявляет отсутсвие эпидермиса, атрофию дермы и отсутствие кожных структур и эластических волокон. Однако симптомы варьируют от полного отсутствия кожи до участков кожи, лишенных волос. Сходным образом, симптомы свода черепа могут варьировать от отсутствия свода до почти нормального свода (Lehman et al., 1993). Кроме того, некоторые индивиды имеют сосудистые аномалии, включая расширенные поверхностные кровеносные сосуды, которые делают кожу мраморного вида (cutis marmorata telangiectatica), вызывают легочную или портальную гипертензию и гиперваскуляризацию сетчатки; около 23% имеют врожденные пороки сердца. Предполагается, что большинство симптомов синдрома Adams-Oliver обусловлены нарушениями циркуляции (Patel et al., 2004; Stittrich et al., 2014; Swartz et al., 1999).

Fig. 4. Adams-Oliver syndrome. (A) The hallmarks of Adams-Oliver syndrome include absent or scarred skin, usually occurring in the scalp region, with an underlying thin skull, and terminal transverse limb defects. Terminal transverse limb defects can resemble amputations, and patients may also have syndactyly. Adams-Oliver syndrome can be caused by mutations in DLL4 (B) or in NOTCH1 (C), as well as in RBPJ, EOGT, ARHGAP31 or DOCK6 (not pictured). DLL4 mutations appear more randomly distributed in the ligand, even including two truncation mutations of the C-terminal domain. NOTCH1 mutations are most often missense mutations in cysteines, especially in EGF repeat 11, in particular in the ligand-binding domain. However, truncation mutations, splice sites and entire deletions are also involved in Adams-Oliver syndrome. Mutations known to have incomplete penetrance are in gray. Asterisks indicate stop; fs is frameshift. NOTCH1 and DLL4 structures are based on InterPro protein domain prediction and other studies (Ehebauer et al., 2005; Lubman et al., 2005). ANK, ankyrin repeats; DSL, Delta/Serrate/LAG-2 domain; EGF, epidermal growth factor; fs, frame shift; HD, heterodimerization domain; LNR, Lin-Notch repeats; MNNL, Notch ligand N-terminal domain; NRR, negative regulatory region; PEST, proline (P), glutamic acid (E), serine (S) and threonine (T) degradation domain; RAM, Rbp-associated molecule domain; SP, signal peptide; TAD, transactivation domain; TM, transmembrane domain.
Это редкое генетическое нарушение может быть аутосомно доминантным, аутосомно рецессивным или вызываться мутациями de novo. Аутосомно рецессивные формы вызываются мутациями в EOGT, который кодирует компонент пути Notch, или в DOCK6, который кодирует регулятор передачи сигналов Rho GTPase (Lehman et al., 2014; Shaheen et al., 2011, 2013; Sukalo et al., 2015a,b), тогда как доминантные формы вызываются мутациями в NOTCH1, RBPJ или DLL4, все они являются компонентами сигнального пути Notch, или в nARHGAP31, который кодирует др. Rho GTPase регулятор (Hassed et al., 2012; Isrie et al., 2014;Meester et al., 2015; Southgate et al., 2011, 2015; Stittrich et al., 2014). В случае DLL4, было отмечено, что ассоциированные с болезнями мутации распределяются посредством лиганда (Meester et al., 2015; Fig. 4B), и пока не идентифицировано определенного паттерна мутаций. Однако, некоторые генотип-фенотипические корреляции начинают выявляться. Напр., индивиды с NOTCH1 мутациями более часто имеют кардиальные дефекты по сравнению с индивидами с ARHGAP31 или DOCK6 мутациями (Southgate et al., 2015). Итак, мутации обнаруженные таким образом объясняют около 50% пациентов, указывая на то, что многие ассоциированные гены, скорее всего, не открыты.
Необходимо отметить, что мутации NOTCH1 могут также вызывать ряд изолированных сердечно-сосудистых дефектов, включая дефекты клапанов аорты, синдром гипоплазии левого желудочка и тетраду Фалло (Garg et al., 2005;Kerstjens-Frederikse et al., 2016; McBride et al., 2008; McKellar et al., 2007; Mohamed et al., 2006). Такие мутации включают миссенс, нонсенс и мутации укорочения, указывающие, что гетерозиготная потеря функции NOTCH1 может приводить или к синдрому Adams-Oliver (Fig. 4C) или врожденным порокам сердца. Дальнейшим подтверждением идеи стало то, что ARHGAP31 мутации также приводят к синдрому Adams-Oliver (Southgate et al., 2011) и врожденным порокам сердца (Kerstjens-Frederikse et al., 2016). Однако, в каждом из семейных случаев синдрома Adams-Oliver или врожденного порока сердца, встречаются бессимптомные члены семьи, несущие мутации, вызывающие болезнь, демонстрируя, что пенетрантность не 100%. Это сходно с синдромом Alagille (discussed below), при котором члены семьи несущие одни и те же JAG1 мутации, могут иметь разные симптомы или не иметь их вообще.
Почему мутации NOTCH1 и мутации др. компонентов Notch имеют не 100% пенетрантность? Линейный путь передачи сигналов Notch, который не включает ступени амплификации сигнала, столь чувствителен к дозе. Генетические и средовые факторы, скорее всего, сдвигают врожденную продолжительность или силу передачи сигналов Notch, изменяя переносимость мутаций у разных индивидов. В самом деле, скрининг модификаторов Notch-зависимых фенотипов или передачи сигналов per se у Drosophila (Go and Artavanis-Tsakonas, 1998; Shalaby et al., 2009), мышей (Rubio-Aliaga et al., 2007) и in vitro (Mourikis et al., 2010) выявили множество кандидатов на роль модификаторов зависимых от Notch болезней. Напр., потеря Itch (a negative regulator of Notch signaling) у мышей взаимодействует с избытком Notch1 в развивающихся тимоцитах, чтобы вызывать аутоиммунное заболевание, тогда как потеря одного аллеля Dll3 у Notch1 гетерозиготных мышей приводит к дефектам сегментации оси у 30% двойных гетерозиготных мышей (Loomes et al., 2007a). Это указывает на то, что прочность передачи сигналов Notch, которая может быть модифицирована в результате этих взаимодействий, сказывается на конечном исходе. В подтверждение этого было показано, что гемогенный эндотелий мышей, на разные уровни активации передачи сигналов Notch в ответ на Jag1 в противоположность Dll4, приводит к переключению между приобретением гемогенной и артериальной эндотелиальной судьбы (Gama-Norton et al., 2015). Следовательно, модификации генов, которые влияют на передачу сигналов Notch, влияют также на проявление болезни.

The biology of Adams-Oliver syndrome: insights from knockout mice


Notch1, Dll4 и Rbpj, или их гомологи, необходимы для эмбрионального развития большинства животных моделей (Conlon et al., 1995; Dexter, 1914; Gale et al., 2004; Oka et al., 1995; Swiatek et al., 1994), а эти модели бесценны для выяснения механизмов, управляющих синдромом Adams-Oliver syndrome. В то время как NOTCH1, DLL4 и RBPJ мутации вызывают аутосомно доминантное заболевание у людей, у мышей только Dll4 мутация вызывает тяжелое фенотипическое отклонение в гетерозиготном состоянии (Gale et al., 2004), хотя в этом случае оно настолько тяжелое, что большинство гетерозиготных Dll4 нокаутных мышей погибает in utero. Сходным образом, Dll4 гетерозиготные-нулевые мыши обнаруживают зависимую от генетического фона эмбриональную летальность, при этом нарушено ремоделирование сосудов и задержка эмбрионального роста (Duarte et al., 2004; Koch et al., 2008; Krebs et al., 2004). Dll4 нокаутные мыши, генерируемые из немногих выживших гетерозиготных мышей, погибают на день эмбриогенеза (E) 10.5, обнаруживая задержку роста, маленькое сердце и неспособность к ремоделированию сосудов (Duarte et al., 2004). Эти исследования, вместе с разными др. исследованиями передачи сигналов Notch во время сосудистого развития (summarized in Box 1) выявили зависимую от дозы Dll4-индуцированную передачу сигналов Notch1, необходимую для развития артерий и жизнеспособности.

Box 1. The Notch pathway and vascular development

Notch signaling controls most aspects of vascular development, from vasculogenesis and angiogenesis to arterial identity and mural cell attachment, identity and maintenance. For example, during sprouting angiogenesis, Dll4+ endothelial tip cells extend numerous filopodia sprouting forwards while trailing Jag1+ stalk cells proliferate to form the vessel trunk. Vascular endothelial growth factor (VEGF) upregulates Dll4 in tip cells, which activate Notch1 on adjacent stalk endothelial cells, downregulating VEGF receptor 2/3 (VEGFR2/3) and suppressing the tip cell phenotype in these trailing cells. Accordingly, Dll4 and Jag1 mutations lead to blood vessel architectural defects, in both mouse models and human disease. Notch signaling is also important in mural cells: Notch3+ mural cells, such as vascular smooth muscle cells and pericytes, are recruited to maturing blood vessels in a process that is dependent on endothelial Jag1. In line with this, loss of Jag1 in the endothelium or defective Notch3 in mural cells leads to defective mural cell coverage of arteries and capillaries; in humans this results in, for example, the vascular dementia syndrome CADASIL.


Notch1 гомозиготные нокаутные мыши являются также эмбриональными леталями до ст. E11 (Conlon et al., 1995; Swiatek et al., 1994), и это воспроизводится у processing-deficient Notch1 эмбрионов (Huppert et al., 2000) и у Rbpj-/- эмбрионов (Oka et al., 1995), указывая, что каноническая передача сигналов Notch1 необходима для сосудистого развития и жизнеспособности эмбрионов. Однако, делеция в эндотелии Notch1 в особенности с использованием Tie2-Cre, специфически экспрессируемая в эндотелиальных клетках, оказывается значительно менее тяжелой и 50% мышей доживают до ст. 8 недель, хотя и с сосудистыми аномалиями (Alabi et al., 2016). Это находится в резком контрасте с более ранним исследованием, в котором использовали др. Tie2-Cre линию (Limbourg et al., 2005), подтверждая, что потеря Notch1 в эндотелии была единственное причиной эмбриональной гибели, наблюдаемой у нулевых мышей; однако, в дальнейшем было отмечено, что Tie2 промотор, используемый в этой линии, активен также в зародышевой линии самок (de Lange et al., 2008).
Сосудистое развитие четко устраняется при потере Notch1, и эти исследования на мышах ставят перед вопросом, действительно ли дефектная сосудистая сеть является главной причиной синдрома Adams-Oliver. Такая гипотеза была высказана до открытия первого причинного гена (Swartz et al., 1999), а совсем недавно была уточнена, предположив, что дисфункция перицитов, в частности, является главным двигателем возникновения дефектов скальпа и свода черепа, а также дефектов конечностей у людей (Patel et al., 2004; Stittrich et al., 2014). Дальнейшим подтверждением этого стало временное замалчивание передачи сигналов Notch (с использованием доминантно негативного Maml) в предшественниках vascular smooth muscle cell (vSMC) подавляет их дифференцировку и приводит к кровоизлияниям в голове и межпальцевых пространствах (Chang et al., 2012). Однако, мезенхимные Notch1 и Notch2 (Pan et al., 2005) , активированные с помощью Jag2 (Jiang et al., 1998; Sidow et al., 1997), чтобы регулировать развитие конечностей посредством Rbpj, показали, что некоторые Notch-регулируемы процессы могут действовать вместе, чтобы контролировать развитие конечностей.
Разные исследования показали, что передача сигналов Notch1 играет также существенную роль в развитии кожи (rev. Nowell and Radtke, 2013). Делеция Notch1 в коже мыши ведет к опухолям (Demehri et al., 2009; Nicolas et al., 2003) и атопическому дерматиту (Dumortier et al., 2010), подтверждая, что индивиды с синдромом Adams-Oliver должны оцениваться в отношении риска озлокачествления кожи или болезней кожи, т.к. они могут быть предрасположены к возникновению кожных болезней. Кроме того, принимая во внимание, что замалчивание Notch1 у новорожденных приводит к уменьшению тимуса и блокирования развития T клеток (Radtke et al., 1999), удивительно, что пациенты с Adams-Oliver не испытывают недостаточности тимуса.
В целом, фенотипические проявления мышиных моделей подтверждают, что разные симптомы при синдроме Adams-Oliver отражают чувствительность к дозе пути Notch в развитии сосудистой сети. Воздействие на развитие сосудистой сети могут вызывать терапевтические затруднения, поэтому современные способы лечения обычно включают хирургию, чтобы устранить дефекты скальпа и свода черепа, или хирургию сердца. В то время как многие современные клинические испытания концентрируются на подавлении передачи сигналов Notch сж низкомолекулярных ингибиторов или антител (Andersson and Lendahl, 2014), терапевтические активаторы передачи сигналов Notch разработать значительно труднее - но они могут предоставлять преимущества для временной и точной поддержки сосудистого развития.

Alagille and Hajdu-Cheney syndromes: roles for NOTCH2 and JAG1 in development


Синдром Alagille и синдром Hajdu-Cheney являются аутосомно доминантными, мульти-системными нарушениями со значительным перекрыванием затрагиваемых тканей. Синдром Alagille (известен также как Alagille-Watson синдром или arteriohepatic dysplasia) характеризуется дефектами в печени, глазах, ушах, почках, поджелудочной железе, сердце, сосудистой системе, лице и скелете, а также задержкой роста (Fig. 5) (Alagille et al., 1975; Watson and Miller, 1973; for a review, see Penton et al., 2012). Индивиды с синдромом Hajdu-Cheney, с др. стороны, страдают от остеопороза и прогрессивной фокальной деструкции костей, дефектов черепно-лицевого развития, дефектов сердца, дефицита слуха и образования почечных кист (Cheney, 1965; Hajdu and Kauntze, 1948; for a review, see Canalis et al., 2014).

Fig. 5. Hallmarks of Alagille syndrome. (A) Alagille syndrome is diagnosed based on the presence of five hallmarks of disease: (1) characteristic facial features, including a prominent forehead, pointed chin and deep-set eyes; (2) an eye defect known as posterior embryotoxon; (3) heart defects ranging from pulmonary stenosis to tetralogy of Fallot; (4) vertebral defects, such as butterfly vertebrae; and (5) jaundice/cholestasis due to intrahepatic bile duct paucity. (B) In addition to the diagnostic hallmarks, 50-90% of patients are growth delayed (Alagille et al., 1975; Emerick et al., 1999), 40% of patients experience renal symptoms (Kamath et al., 2013), and 10-25% of patients have vascular structural anomalies and bleeds (Emerick et al., 1999; Kamath et al., 2004). BD, bile duct; CV, central vein; HA, hepatic artery; OA, overriding aorta; PS, pulmonary stenosis; PT, portal triad; PV, portal vein; VSD, ventricular septation defect.

Эти два синдрома представляют две стороны одной и той же монеты. Синдром Alagille вызывается гаплонедостаточностью JAG1 (~94% случаев) (Li et al., 1997; Oda et al., 1997) или мутациями в NOTCH2 (~2% пациентов) (McDaniell et al., 2006), и рассматривается как фенотипическое отклонение в результате потери функции Notch (Fig. 6A). Напротив, синдром Hajdu-Cheney, который вызывается продукцией стабилизированного NOTCH2, лишенного функционального домена деградации PEST, вызывается мутациями избыточности функции в NOTCH2 (Fig. 6B) (Gray et al., 2012; Han et al., 2015; Isidor et al., 2011a,b; Majewski et al., 2011;Simpson et al., 2011). Большое количество тканей и органов затронуты при этом синдроме, это, скорее всего, является отражением варьирующих и обязательных ролей - как показывают различные исследования in vitro и нокаутные исследования на животных моделях Jag1 и otch2 в процессах развития.

Fig. 6. Mutations associated with Alagille syndrome or Hajdu-Cheney syndrome. (A) Mutations in JAG1 cause Alagille syndrome. Mutations can be deletions, truncations, splice site, nonsense or missense. It was previously thought that mutations could occur anywhere in the CDS for JAG1, but analysis of 87 missense mutations reveals that the Alagille-causing deleterious mutations predominantly cluster in the N-terminal region of JAG1, with two other smaller sub-clusters: one in EGF repeats 11-12 and one in the von Willebrand Factor type C/Jagged Serrate domain (also known as the cysteine-rich domain). Jag1mouse mutants generated in ENU mutagenesis screens, such as Ozzy (Vrijens et al., 2006), Headturner (Kiernan et al., 2001), Slalom (Tsai et al., 2001) and Nodder (Hansson et al., 2010), harbor mutations that cluster in the N-terminal missense-mutation hotspot. (B) Mutations in NOTCH2 lead to Alagille syndrome (black) or Hajdu-Cheney syndrome (red). Alagille NOTCH2 mutations generally abrogate cysteines in the ligand-binding EGF repeats, or arginines in the ankyrin repeats, while Hajdu-Cheney NOTCH2 mutations are generally frameshift or nonsense mutations that lead to absence of the PEST domain and thus gain of function of NOTCH2 activity (Descartes et al., 2014; Gray et al., 2012; Han et al., 2015;Isidor et al., 2011a,b; Majewski et al., 2011; Narumi et al., 2013; Simpson et al., 2011; Zhao et al., 2013). ANK, ankyrin repeats; DSL, Delta/Serrate/LAG-2 domain; EGF, epidermal growth factor; HD, heterodimerization domain; JSD, Jagged Serrate domain; LNR, Lin-Notch repeats; MNNL, Notch ligand N-terminal domain; NRR, negative regulatory region; PDZL, PDZ ligand domain [PDZ, post synaptic density protein (PSD95)]; PEST, proline (P), glutamic acid (E), serine (S) and threonine (T) degradation domain; RAM, Rbp-associated molecule domain; SP, signal peptide; TAD, transactivation domain; TM, transmembrane domain; vWFC, von Willebrand factor type C domain. Notch2 and Jag1 function in the liver

Развитие печени млекопитающих сложный процесс, который регулируется c помощью множественных сигнальных путей, включая путь Notch. Передача сигналов Notch особенно тесно связана с развитием желчных протоков (rev. Gordillo et al., 2015). У мышей инициация экспрессии Jag1 в portal vein mesenchyme (PVM) маркирует начало развития желчных протоков около E12.5 (Hofmann et al., 2010;Zong et al., 2009). Здесь Jag1 взаимодействие c Notch2 в соседних клетках желчного эпителия, чтобы индуцировать экспрессию Hes1, Hnf1β и Sox9, которые в дальнейшем регулируют формирование протоковой (ductal) пластинки и морфогенез внутрипеченочных желчных протоков (Antoniou et al., 2009; Geisler et al., 2008; Kodama et al., 2004; Zong et al., 2009). Jag1 необходим специфически в PVM, но ни в эндотелии портальной вены (Hofmann et al., 2010), ни в клетках желчного эпителия (Loomes et al., 2007b), где он тем не менее также экспрессируется. Компаундные гетерозиготные Jag1 и Notch2 гипоморфные мыши воспроизводят некоторые характеристики синдрома Alagille, включая желтуху, задержку роста, нарушения дифференцировки внутрипеченочных желчных протоков и сердца и дефекты почек (McCright et al., 2002). Подобно др. фенотипическим отклонениям Jag1 (Kiernan et al., 2007), желчные нарушения сильно зависят от генетического фона, поскольку возвратное скрещивание Jag1+/- на фоне C57BL/6J приводит к дефектам, сходных с теми, что наблюдаются у двойных гетерозигот Jag1/Notch2 (Thakurdas et al., 2016). Это исследование также выявило, что стабильность Jag1 негативно регулируется c помощью O-glucosyltransferase 1 (POGLUT1, также известной как Rumi), и что сниженные уровни Rumi у Jag1+/-Rumi+/- животных устраняют желчные нарушения у Jag1-дефицитных. Дефицит Notch2 приводит перинатальному агенезу желчных протоков и к вторичному формированию желчных протоков после отнятия от груди (Falix et al., 2014), процесс, который, по-видимому, не зависит от Notch (Walter et al., 2014). Сходное восстановление от печеночного фенотипа сообщалось у индивидов с синдромом Alagille (Riely et al., 1979), хотя пока неясно, происходит восстановление за счет JAG1 или NOTCH2 генотипа, если вообще от них.

Roles for Notch2 and Jag1 in the development of sensory organs


Индивиды с синдромом Alagille обнаруживают дефекты внутреннего уха и глаз, подчеркивая роль Jag1 и Notch2 в развитии сенсорных органов. Одним из наиболее легко наблюдаемых признаков синдрома Alagille - posterior embryotoxon (нарушение линии Schwalbe's) - это доброкачественный дефект, который довольно распространен в общей популяции (Emerick et al., 1999; Ozeki et al., 1997). Однако, необходимо отметить, что posterior embryotoxon довольно труден для изучения у грызунов, который вместо этого проявляет глазные дефекты, такие как аномалии радужки (Xue et al., 1999). Jag1 и Notch2 экспрессируются в развивающемся хрусталике и ciliary body (CB), а Notch2 экспрессируется в retinal pigmented epithelium (RPE) (Le et al., 2009; Saravanamuthu et al., 2012). Во время развития, Jag1-экспрессирующее внутреннее CB взаимодействуeт c Notch2-экспрессирующим наружным CB (derived from RPE) , чтобы регулировать пролиферацию и передачу сигналов BMP во время морфогенеза CB (Zhou et al., 2013). Было также показано, что специфичная для эктодермы делеция (используя Ap2a-Cre) Jag1 приводит к аресту отделения хрусталикового пузырька от поверхностной эктодермы и к аресту развития хрусталика (Le et al., 2012). Делеция Notch2 в хрусталике (посредством Lens-Cre) нарушает также дифференцировку хрусталика (Saravanamuthu et al., 2012), хотя этот фенотип подобен фенотипу самой гетерозиготной Lens Cre-экспрессирующей линии мышей (Dor? et al., 2014).
Jag1 и Notch2 регулирует также развитие внутреннего уха. Глухота и нарушение равновесия были идентифицированы у 4-х индуцированных c помощью ethylnitrosourea (ENU) Jag1 мутантных линий мышей: Slalom (Tsai et al., 2001), Headturner (Kiernan et al., 2001), Ozzy (Vrijens et al., 2006) и Nodder (Hansson et al., 2010). Эти фенотипы вызывались, когда зависимая от Jag1 передача сигналов Notch была неспособна детерминировать презумптивный сенсорный эпителий уха и поддерживать соотв. соотношение между пролиферацией в популяции волосковых клеток и поддерживающих клеток посредством Hes1-зависимой экспрессии p27kip (Brooker et al., 2006; Kiernan et al., 2006; Murata et al., 2009; Pan et al., 2010). Напротив экспрессия Notch1ICD (Notch1 intracellular domain) в развивающемся слуховом пузырьке вызывала эктопическое образование сенсорных и поддерживающих клеток в улитке и преддверии (Pan et al., 2010), предоставляя возможное объяснение дефицита слуха, обнаруживаемое у пациентов с Hajdu-Cheney (Isidor et al., 2011a). Развитие сенсорного органа обнаруживало сходную зависимость от дозы, наблюдаемую в др. Notch-регулируемых процессах, при этом тщательно титруемая, умеренная редукция активности передачи сигналов Notch c помощью glycosyltransferases lunatic fringe (Lfng) и manic fringe (Mfng) создавали границу между просенсорным зачатком домена слуховой улитки и органом Kolliker's. Это происходит до выбора судеб между первыми дифференцирующимися внутренними волосковыми клетками и ассоциированными с ними поддерживающими клетками, подтверждая чувствительность этого органа даже к очень незначительным изменениям интенсивности передачи сигналов Notch (Basch et al., 2016). Следует также отметить, что укороченные задние полукружные каналы и отсутствие ампулы обнаруживаются у Jag1del1/+ и Foxg1Cre+/-;Jag1fl/+ гетерозиготных мышей (Kiernan et al., 2006), и что тяжесть нарушения вестибулярного аппарата у Jag1del1/+ мышей зависит от генетического фона.

Notch2 and Jag1 function during kidney development


Развитие почек тонко регулируется c помощью передачи сигналов Notch и хотя нет диагностических критериев, многие индивиды с синдромом Alagille страдают от серьезных почечных проблем (Kamath et al., 2013). Во время развития почек Notch2 впервые экспрессируется в ветвящихся мочеточниковых зачатках и окружающей покровной (cap) мезенхиме, при этом возникает экспрессия Jag1 вместе с экспрессией Notch2 и Notch1 в эпителиальных пузырьках (агрегатах, происходящих из cap мезенхимы посредством мезенхимно-эпителиального перехода - MET). Эти пузырьки трансформируются в течение стадии тел в форме запятой и S-образных тел в полностью развитые нефроны, в которых Jag1 обнаруживается в гломерулярном эндотелии, а Notch1 и Notch2 обнаруживаются в гломерулярных эпителиальных клетках (rev. Kamath et al., 2013;Kopan et al., 2014). В соответствии с этими паттернами экспрессии, было установлено, что мыши, гаплонедостаточные по Notch2 и лишенные одного из аллелей Jag1, обнаруживают дефекты гломерулогенеза (McCright et al., 2001), тогда как специфичное для cap мезенхимы истощение Notch2, но не Notch1, блокирует развитие перед образованием S-образного тела, приводя к ранней постнатальной летальности (Cheng et al., 2007). Интересно, что Notch1 и Notch2 активируются c помощью или Jag1 или Dll1 (Liu et al., 2013), означая неравные потребности в передаче сигналов Notch1 и Notch2 во время почечного развития, которые, скорее всего, вызываются различиями в их внеклеточных доменах или во взаимодействии с Lfng, или обоими. В самом деле, Lfng усиливает Notch2-обеспечиваемую передачу сигналов большей степени, чем обеспечиваемую Notch1 передачу сигналов, и это может быть ключевым фактором, позволяющим достичь порога, необходимого для индукции образования проксимальных структур (Liu et al., 2013). Однако это ещё предстоит проверить в генетических экспериментах. Необходимо также отметить, что хотя MET может происходить без передачи сигналов Notch (Cheng et al., 2007; Chung et al., 2016), передача сигналов Notch может замещать путь Wnt/β-catenin во время MET (Boyle et al., 2011), и её активность в медиальных и проксимальных сегментах, которая способствует передаче сигналов BMP, взаимно исключающая с высокими уровнями передачи сигналов Wnt/β-catenin (Lindstr?m et al., 2015).
Хотя приведенные выше исследования о высокой ключевой роли Notch2 и Jag1 в развитии почек, остается неясно, как специфические мутации у человека, ассоциированные с этим синдромом, приводят к дефектам почек. Напр., не обнаруживаются фенотипические отклонения в почках. Напр.. не были описаны фенотипические отклонения в почках мышей, моделирующих синдром Hajdu-Cheney, несущих Notch2Q2319X мутацию (Canalis et al., 2016). Тем не менее некоторые результаты иллюстрируют, что высокие уровни передачи сигналов Notch негативно воздействуют на развитии почек. Напр., конституитивно активный Notch1ICD (Cheng et al., 2007) или Notch2ICD (Fujimura et al., 2010) в метанефрической мезенхиме (Six2-GFP::Cre) управляют патологическим развитием почек. В то время как избыточная экспрессия Notch1ICD управляет формированием одиночных мочеточниковых зачатков, сопровождаемым избыточной трансформацией проксимальных частей канальцев в подоциты и дистальные части канальцев (за счет дифференцировки мезенхимных предшественников) (Cheng et al., 2007), избыточная экспрессия Notch2ICD усиливает экспрессию Wnt4 на ст. E11.5, вызывая преждевременную дифференцировку канальцев и истощение предшественников нефронов на ст. E14.5, сопровождаемое образованием многочисленных кист и общим ухудшением почек (Fujimura et al., 2010).

Notch2 and Jag1 in the pancreas


Нарушения панкреатической функции при синдроме Alagille рассматриваются как широко распространенные (Rovner et al., 2002), и панкреатит также ассоциирует с синдромом Alagille (Devriendt et al., 1996). Однако это мнение недавно было пересмотрено, было установлено, что дисбаланс панкреатической функции обнаружен только у двух из 42 индивидов с синдромом Alagille (Kamath et al., 2012). Тем не менее известно, что Notch2 и Jag1 играют важные роли во время панкреатического развития у мышей, что возможно объясняет дефекты поджелудочной железы у некоторых пациентов. Передача сигналов Notch контролирует как первичную (возникающую на ст. E8.5-E12.0 у мышей) (Ahnfelt-R?nne et al., 2012; Jensen et al., 2000) , так и вторичную (возникающую на ст. E13.0-E16.0) (Murtaugh et al., 2003; Shih et al., 2012) волны дифференцировки панкреатических предшественников, которые дают полный набор эндокринных (α-, β-, δ- ε и PP-клеток), ацинарных и протоковых клеток (Li et al., 2016; for a review, see Afelik and Jensen, 2013). Jag1 регулирует развитие поджелудочной железы путем подавления передачи сигналов Dll1-Notch во время эмбриональных стадий и посредством активации передачи сигналов Notch во время постнатальных стадий (Golson et al., 2009a). Кондиционная делеция Jag1 в панкреатическом эпителии (с использованием Pdx1-Cre) приводит к дефектному образованию протоков, фиброзу и хроническому панкреатиту (Golson et al., 2009b), тогда как кондиционная компаундная делеция Notch1 и Notch2 приводит неожиданно к незначительным эффектам на пролиферацию панкреатических эпителиальных клеток (Nakhai et al., 2008), хотя возможно, что фенотипические отклонения устраняются c помощью Notch3 (Apelqvist et al., 1999).

Notch2 and Jag1 function in heart development


Развитие сердца нуждается в одновременной индукции, пролиферации, дифференцировки, миграции и в сложных морфогенетических событиях, включая формирование и петлеобразование (for a review, see Sedmera, 2011). Jag1 и Notch2 экспрессируются с ранних ст. формирования сердца и вместе с др. компонентами пути Notch (summarized in Boxes 2 and 3; rev. D'Amato et al., 2016a; Lux?n et al., 2016) - регулируют некоторые критические ступпени кардиального развития. Хотя всё ещё неясно, как чсвязаны дискретные JAG1 мутации, обладающими эффектами на доставку и активность JAG1, давая ряд кардиальных дефектов, наблюдаемых у индивидов с синдромом Alagille (Bauer et al., 2010), было установлено, что развитие некоторых компартментов сердца зависит от сбалансированной активности Jag1 и Notch2.

Box 2. Notch function during heart development Notch signaling regulates multiple aspects of mammalian heart development, being expressed and acting in various tissue types and compartments (also see Box 3). Loss-of-function mutations in NOTCH1 (Garg et al., 2005; Theodoris et al., 2015) and the E3 ubiquitin ligase mind bomb1 (MIB1) (Lux?n et al., 2013) have been implicated in calcific aortic valve disease (CAVD), and left ventricular noncompaction (LVNC) congenital cardiovascular diseases, respectively. Dll4 is a key Notch1 inducer that regulates endothelial-to-mesenchymal transformation (EndoMT) (MacGrogan et al., 2016). As Dll4 expression in the endocardium diminishes with the progression of endocardial cushion formation around E10, Jag1/Notch1 signaling-induced expression of heparin-binding EGF-like growth factor (Hbegf) becomes crucial to limit the BMP-driven proliferation of cardiac valve mesenchyme (MacGrogan et al., 2016). Jag1, together with Jag2, also regulates the maturation and compaction of the ventricular chamber myocardium. At first, Jag1/Jag2-mediated activation of Notch1 is suppressed by Dll4 and Mfng in the endocardium, but later, after E11, Dll4 and Mfng diminish and Jag1/2 can activate Notch1 signaling, inducing proliferation and compaction of the chamber myocardium. Notch signaling also functions in the epicardium, which is a crucial source of cells for coronary vessel formation (for a review, see Perez-Pomares and de la Pompa, 2011). Balanced Notch signaling in/from the epicardium is indispensable for correct heart development (Grieskamp et al., 2011). Accordingly, the ablation of Notch1 negatively affects the formation of coronary vasculature in the compact myocardium, while Notch1ICD overexpression abrogates subepicardial ECM, decreases thickness of compact myocardium, and disrupts the integrity of the epicardium (Del Monte et al., 2011). The exact roles of Jag1 and Notch2, which are also expressed in the epicardium, and Notch3 and Dll4, which are expressed in epicardium-derived vSMCs, remain to be elucidated.

Box 3. The expression of Notch pathway components during heart development
Several key Notch pathway components, including Jag1, Dll4, Notch1 and Notch2, are expressed during heart development, as summarized. AAA, aortic arch arteries; A, atrium; AVC, atrioventricular canal; ?-gal, ?-galactosidase; FHF, first heart field; ICD, intracellular domain; LA, left atrium; LV, left ventricle; OFT, outflow tract; SHF, second heart field; SMA, smooth muscle actin; RA, right atrium; RV, right ventricle; vSMC, vascular smooth muscle cell.


Устранение экспрессии Jag1 в эндокарде приводит к дефектам тракта оттока (OFT) , гиперпластичности аортальных клапанов, тетраде Фалло и кальцификации клапанов, воспроизводя спектр кардиальных патологий, часто присутствующий при синдроме Alagille (Hofmann et al., 2012; MacGrogan et al., 2016). Эти фенотипы, по крайней мере частично, связаны с клетками кардиального нервного гребня (CNC), активно мигрирующей популяции клеток, которые возникают на краю нервной пластинки (Jiang et al., 2000). Специфичная для CNC делеция (с использованием Pax3-Cre) или Jag1 (Manderfield et al., 2012) или Notch2 (Varadkar et al., 2008) показывает, что для миграции CNC они не обязательны per se, но что Jag1 является ключевым индуктором дифференцировки происходящих из CNC, vSMC. Notch2-обеспечиваемая передача сигналов, между тем, поддерживает пролиферацию vSMC вокруг артерий аортальных дуг и OFT (Varadkar et al., 2008). Нарушения передачи сигналов Jag1 и Notch2 приводят также к дефектам разделения желудочков, дефектам формирования паттерна аортальных дуг и к стенозу пульмональной артерии, все они присутствуют у индивидов с синдромом Alagille (Manderfield et al., 2012; Varadkar et al., 2008). Др. объяснением врожденных пороков сердца, обнаруживаемых у пациентов с Hajdu-Cheney (Crifasi et al., 1997), является предполагаемая роль Notch2 в формировании трабекулярного миокарда: при физиологических условиях активность Notch2 д. быть супрессирована c помощью Numb и Numbl, чтобы сбалансировать образование компактного в противовес трабекулярному миокарду и этот избыток вызывает избыточную трабекуляцию, дефекты non-compactation и разделения перегородками (Yang et al., 2012). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы объяснить, как Notch2 осуществляет эти роли, когда развивающийся миокард лишен экспрессии Notch2 мРНК (D'Amato et al., 2016b).

Notch2 and Jag1 function during skeletal development


Передача сигналов Notch также выполняет важную роль в развитии скелета и в соответствии с этим аномалии скелета встречаются при синдромах Alagille и Hajdu-Cheney (rev. Zanotti and Canalis, 2016), а также при др. врожденных Notch нарушениях (напр. spondylocostal dysostosis). Делеция во всем организме Jag1 или Notch2 не выявляет какие-либо связанные с сомитами фенотипы, которые могли бы указывать на их участие в ранних событиях формирования костей (Hamada et al., 1999; Xue et al., 1999). Однако Jag1 и Notch2 в скелетогенной мезенхиме негативно регулирует дифференцировку мезенхимных предшественников в остеобласты in vitro и у молодых мыцшей, а их устранение приводит к прогрессивной потере костей у взрослых мышей (Hilton et al., 2008; Nobta et al., 2005; Youngstrom et al., 2016). Важно, что делеция Jag1 в мезенхимных предшественниках вызывает экспансию кортикальной части костей, уменьшая при этом массу трабекулярной кости, указывая тем самым на противоположные эффекты передачи сигналов Jag1 на кортикальные и трабекулярные остеобласты (Youngstrom et al., 2016). Этот дисбаланс приводит к дефектам позвоночника и к образованию расщепленных позвонков в форме бабочки, характерных для синдрома Alagille (Emerick et al., 1999;Youngstrom et al., 2016). Более того, исследования клинических и геномных ассоциаций выявили положительную корреляцию между мутациями в JAG1 и снижением плотности минералов в костях и остеопорозными переломами (Bales et al., 2010; Kung et al., 2010). Формирование черепно-лицевых костей, которые возникают в результате внутримембранозной оссификации мезенхимы, происходящей из нервного гребня (NC), также нуждается в Jag1: его делеция в клетках NC нарушает мезенхимную дифференцировку и приводит к устранению минерализации и к деформациям черепно-лицевого скелета, др. признак, общий у индивидов с синдромами Alagille и Hajdu-Cheney (Hill et al., 2014; Humphreys et al., 2012).
Недавно избыточная функция Notch2 у мышей, несущих мутацию Q2319X, как было установлено, обнаруживают усиление образования остеокластов, приводя к компенсирующей остеопении кортикальной кости и усилению резорбции кости (Canalis et al., 2016). Такой фенотип сильно отличается от фенотипов, наблюдаемых у мышей с избыточной функцией, специфичной для одонтобластов и остеоцитов (Canalis et al., 2013). Такая изменчивость может быть вызвана различиями между конституитивным и Cre-зависимым подходами, разными уровнями активации Notch или неизвестными факторами, внутренне присущим скелетогенной мезенхиме, которая ответственна за фенотип при синдроме Hajdu-Cheney.

Roles for Notch2 and Jag1 in the vasculature


Компоненты пути Notch регулируют некоторые аспекты сосудистого развития, от сосудистого роста и выбора между эндотелиальными кончиковыми и стержневыми (stalk) клетками до развития vSMC (see Box 1). Системный нокаут Jag1 является летальным для эмбрионов мышей на ст. ~E11.5 de результате дефектов ангиогенеза эмбриональной и желточного мешка сосудистой сети (Kiernan et al., 2007; Xue et al., 1999). Сходным образом гомозиготные нокаутные Notch2 мыши погибают на ~E10.5, обнаруживая распространенный апоптоз (Hamada et al., 1999; McCright et al., 2006). Специфичная для эндотелия делеция (c помощью Tie1- или Tie2-Cre) Jag1 напоминает системную делецию Jag1, указывая, что отсутствие передачи сигналов Jag1 от сосудистого эндотелия, скорее всего, вызывает дефекты дифференцировки, потерю vSMCs и тяжелые нарушения ангиогенеза, наблюдаемые у мутантов Jag1 (Benedito et al., 2009; High et al., 2008). Сходная потеря vSMCs обнаруживается у эмбрионов с гомозиготным гипоморфным Notch2 (McCright et al., 2001; Wang et al., 2012). Недавно было предположено, что околососудистое покрытие вновь сформированных сосудов c помощью vSMCs и перицитов облегчается c помощью Jag1-индуцированной экспрессии интегрина αvβ3, который обеспечивает соединение с белковым фактором von Willebrand, специфичным для базальных мембран (Scheppke et al., 2012). У взрослых Jag1 вместо этого действует ниже передачи сигналов Dll4/Notch1, чтобы способствовать созреванию vSMCs после повреждений c помощью обусловленной P27kip1 репрессии пролиферации (Boucher et al., 2013; Pedrosa et al., 2015).
Jag1 регулирует также разрастание во время ангиогенеза; эксперименты с потерей и избыточной функцией в эндотелиальных клетках показали, что Jag1 способствует врастанию новых кончиковых клеток во время ангиогенеза в сетчатке (High et al., 2008; rev. Benedito and Hellstr?m, 2013). Интересно, что сбалансированное разрастание достигается c помощью Dll4-индуцированной 'высокой' передачи сигналов Notch, а супрессия разрастания посредством подавления передачи сигналов VEGFR в кончиковых клетках, которое противостоит стержневым (stalk) эндотелиальным клеткам, обладающих Jag1-обусловленной 'низкой' передачей сигналов Notch (Benedito et al., 2009; Pedrosa et al., 2015). Хотя эти различные аспекты передачи сигналов Jag1 и Notch2 ещё не удалось связать с синдромами Alagille или Hajdu-Cheney, они могут вносить вклад в тяжесть этих болезней и, скорее всего, в острые сосудистые расстройства, включая разрыв аневризмы и кровотечения (Kamath et al., 2004).

Do primarily vascular defects cause Alagille pathologies?


Некоторые патологические отклонения при синдромах Alagille и Hajdu-Cheney, по-видимому, имеют свои корни в дефектах развития сосудов. Как упоминалось ранее, Jag1 экспрессируется в мезенхиме портальной вены и необходим для развития желчных протоков в печени (Hofmann et al., 2010). Сходным образом нарушен ия передачи сигналов Notch в эндотелиальных клетках нарушает образование сосудов в кости и Notch-зависимое высвобождение noggin [антагонист bone morphogenetic protein (BMP) ] из эндотелиальных клеток, приводя к редукции остеогенеза, укорочению длинных костей, дефектам хондроцитов, потере трабекул и снижению костной массы (Ramasamy et al., 2014). Это особенно интересно в свете дефектов капилляров, наблюдаемых в пальцах индивидов с синдромом Hajdu-Cheney с акроостеолизом (Damian et al., 2016). Наконец, верхняя челюсть и участки нёба от мутантов со специфической для нервного гребня делецией Jag1 обнаруживают снижение окраски на PECAM (platelet endothelial cell adhesion molecule) и SMA (smooth muscle actin), это снова подтверждает вклад в нарушения сосудистой сети, фенотипическое отклонение, наблюдаемое в др. системах органов (Hill et al., 2014;Humphreys et al., 2012). Итак, Jag1 и Notch2 регулируют развитие нескольких отличающихся систем органов, а их устранение приводит широкому диапазону дефектов и симптомам при синдромах Alagille и Hajdu-Cheney.

NOTCH3 in development: a cornucopia of congenital disorders


И аутосомно доминантные и рецессивные мутации NOTCH3 были описаны в ассоциации с , по крайней мере, 4 разными нарушениями: cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy (CADASIL), артериопатия с ранним началом с кавитационной лейкодистрофией, с синдромом бокового менингоцеле и детским миофиброматозом (Table 1). Среди них имеются мутации, затрагивающие форму, но не функцию NOTCH3, nonsense мутации, приводящие к потере канонической функции, и nonsense мутации, приводящие к продолжительной канонической передаче сигналов и избыточности функции, обусловленные потерей домена деградации. Эти наблюдения вместе с исследованиями животных моделей представляют яркую картину функции Notch3 в развитии.
CADASIL, которая обусловливается гетерозиготными мутациями NOTCH3, является аутосомно доминантным наследственным вызывающим паралич (stroke) нарушением в результате мультиинфарктной деменции (Fig. 7A,B; Joutel et al., 1996). Пациенты испытывают множественные ишемические приступы, а магнитно резонансные исследования (MRI) выявляют повреждения белого вещества. Такая артериопатия обусловливается нарушениями vSMCs - популяции клеток, в которой NOTCH3 экспрессируется на высоком уровне (Joutel et al., 2000). Хотя Notch3 регулирует пролиферацию, созревание и жизнеспособность vSMC (Domenga et al., 2004; Wang et al., 2012), большинство связанных с CADASIL мутаций NOTCH3 не устраняют возможность рецептора осуществлять передачу сигналов. Вместо этого, большинство, если не все, вызывающие CADASIL мутации NOTCH3 приводят к добавлению или удалению цистеинового остатка во внеклеточных повторах EGF (Fig. 7A), приводя к агрегации внеклеточного доменаNOTCH3 (ECD) во внеклеточные отложения гранулярного осмиофильного материала (GOM). Такой способ патогенеза подтверждает, что CADASIL-вызывающие мутации NOTCH3 не вызывают устранение функции; скорее всего, они являются неоморфными или токсичными. Это ещё больше подтверждается наблюдением, что пациенты, обладающие гомозиготной CADASIL мутацией, обнаруживают сходные или лишь слегка более тяжелые симптомы (Abou Al-Shaar et al., 2016; Liem et al., 2008; Pippucci et al., 2015; Ragno et al., 2013; Soong et al., 2013; Tuominen et al., 2001; Vinciguerra et al., 2014); если мутации вызывали потерю функции, то гомозиготные пациенты должны были страдать более тяжело. Интересно, что предыдущие сообщения описывали образование кластеров CADASIL-вызывающих NOTCH3 мутаций в экзоне 4 (Fig. 7B; Joutel et al., 1997), или в экзоне 11 (Dotti et al., 2005), но картирование миссенс мутаций обнаруживало нормальные размеры экзонов (this Review), выявляя 4 'горячие точки' для CADASIL мутаций скорее, чем одну или две (Fig. 7A).

Fig. 7. NOTCH3 mutations are associated with four genetic disorders. (A,B) The most common CADASIL (cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and lesions)-causing mutations in NOTCH3 lead to missense mutations of cysteines, followed by missense of mutations of amino acids into cysteines, resulting in an uneven and unpaired number of extracellular cysteines. (B) When missense mutations per exon are normalized to exon size, it is clear that missense mutations are enriched in EGF repeats 1-6, but also somewhat in EGF repeats 9-15. Calculating mutations per exon without taking exon size into account shows that most mutations (in absolute numbers) occur in exon 4, which encodes EGF repeats 3-5. (C) One patient with early onset arteriopathy and cavitating leukoencephalopathy has been described, who had a homozygous C966* truncation mutation in NOTCH3. (D) One patient with infantile myofibromatosis was found to be heterozygous for an L1519P mutation in the HD domain-encoding region of NOTCH3, which was predicted to result in NOTCH3 gain of function. (E) Six patients with lateral meningocele syndrome were found to have NOTCH3 truncating mutations, resulting in deletion of the PEST domain and stabilization of the NOTCH3 intracellular domain. ANK, ankyrin repeats; EGF, epidermal growth factor; HD, heterodimerization domain; LNR, Lin-Notch repeats; PEST, proline (P), glutamic acid (E), serine (S) and threonine (T) degradation domain; RAM, Rbp-associated molecule domain; SP, signal peptide; TM, transmembrane domain.

У одного пациента были обнаружены артериопатия с ранним началом и потеря функции NOTCH3. этому пациенту первоначально был поставлен диагноз синдром Sneddon в возрасте 11 (Parmeggiani et al., 2000), но ухудшение нейрологических симптомов с cavitating leukoencephalopathy, множественными лакунарными инфарктами и диссеминированными микрокровотечениями, заставило перепроверить диагноз и была выявлена гомозиготная нонсенс мутация в EGF25 в NOTCH3 (Fig. 7C; Pippucci et al., 2015). Оба родителя не имели симптомов, но обнаруживали ишемические изменения мелких сосудов, как было установлено при MRI головного мозга. Важно, что пациент не обладал GOM. Т.о., хотя большинство ассоциированных с CADASIL NOTCH3 мутаций не устраняет передачи сигналов Notch3 (Joutel, 2011), возможно, что спектр сосудистых заболеваний, вызываемых мутациями NOTCH3 с варьирующей пенетрантностью, в зависимости от того вызывает ли мутация GOM и/или негативно влияет на передачу сигналов Notch3.
Напротив, избыточность функции NOTCH3 - обусловленная потерей домена деградации PEST или дестабилизацией домена гетеродимеризации - ассоциирует с синдромом бокового менингоцеле (Ejaz et al., 2016; Gripp et al., 2015) и детским миофиброматозом (Lee, 2013), соотв. (Fig. 7D,E). Синдром бокового менингоцеле является редким скелетным нарушением, известным также как синдром Lehman, характеризуется выпячиваниями паутинообразной и твердой (dura) оболочки через спинальное отверстие (spinal foramina), характеризующееся лицевыми признаками, гипотонией и скелетными и урогенитальными аномалиями (Lehman et al., 1977). Пациенты могут также иметь двухстворчатыае аортальные клапаны и дефекты межжелудочковой перегородки. Интересно, что скелетные дефекты иногда очень схожи с теми что обнаруживаются при синдроме Hajdu-Cheney, змеевидная fibula, синдром поликистозных почек и spondylocostal дизостоз со сколиозом, слияния позвонков или scalloping, и вставочные кости черепа, подтверждая, что избыточность функции NOTCH2 и NOTCH3 приводят к сходным дефектам. Детский миофиброматоз является очень различающимся состоянием, характеризующимся ростом доброкачественных опухолей в коже, костях, мышцах и мягких тканях (Purdy Stout, 1954). Иногда, но значительно реже, внутренние органы также затрагиваются. Только один пациент с детским миофиброматозом и мутацией NOTCH3 был описан столь подробно (Lee, 2013). Хотя потеря домена деградации PEST и дестабилизация домена гетеродимеризации, как полагают, приводит к избыточности функции NOTCH3, проявления этих двух болезней драматически различаются, указывая тем самым, что передача сигналов при этих двух вариантах мутации не эквивалентна.
Ряд исследований на мышах был предпринят, чтобы выяснить механизмы, лежащие в основе приведенных выше связанных с NOTCH3 патологий. Напр., было показано, что Notch3-нокаутные мыши жизнеспособны и плодовиты (Krebs et al., 2003) , но обнаруживают дефекты формирования паттерна circle of Willis, дефекты артериальной дифференцировки и потерю vSMC и протекание сосудов (Domenga et al., 2004; Fouillade et al., 2012;Henshall et al., 2015; rev. Joutel, 2015). Важно, что регуляция церебрального кровотока нарушается при потере функции Notch3 у мышей, приводя к challenge-индуцированным ишемическим инсультам (Belin De Chantem?le et al., 2008; Domenga et al., 2004). Функция Notch3 т.о. необходима для развития артерий и vSMC. Более того, большинство связанных с CADASIL мутаций NOTCH3 действуют не негативно, влияя на передачу сигналов (Joutel, 2011), и в некоторых случаях могут даже восстанавливать потерянную функцию Notch3 (Monet et al., 2007), некоторые действуют, аннулируя способность передачи сигналов (Peters et al., 2004). Ещё больше запутывает дело архетипичная мутация R169C, которая усиливает передачу сигналов Notch3 (Baron-Menguy et al., 2017). Т.о., кажется, что некоторые механизмы вносят вклад в повреждения сосудов, характерные для CADASIL. Гипотеза каскада NOTCH3 ECD (Monet-Lepr?tre et al., 2013) подтверждает, что NOTCH3-индуцированная GOM сборка внеклеточного матричного белка, вносит вклад в токсические эффекты. Эта гипотеза подтверждается также модельными животными, у которых наиболее сильный фенотип CADASIL наблюдается у мышей, экспрессирующих наивысшие уровни мутантного Notch3 (Rutten et al., 2015).
Патология, наблюдаемая у индивидов с cavitating leukodystrophy, скорее всего, не может быь смоделирована путем какой-либо потери функции Notch3 и необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять, как потеря функции Notch3 может приводить к таким с ранним началам нейрологическим симптомам. Наконец, поскольку синдром бокового менингоцеля и инфантильного миофиброматоза ещё не были смоделированы на мышах, проведен недавний скрининг ENU мутаций по Notch3 у мутантных мышей, наз. Humpback, у которых обнаруживаются мышечные фенотипические отклонения и сильно искривленный позвоночник (http://www.informatics.jax.org/reference/J:157222). Такие мыши, у которых устранен донорский сплайс-сайт Notch3 в интроне 31 (Fairfield et al., 2011), могут оказаться интересными для изучения нарушений в результате избыточной функции Notch3.

Spondylocostal dysostosis: DLL3 in development and disease


Spondylocostal дизостоз - это скелетное заболевание с уродливыми и слитыми позвонками и ребрами, коротким туловищем и сколиозом (Rimoin et al., 1968). Благодаря уменьшенным размерам торакса, дыхательная способность нарушена. Идентифицировано несколько мутантных генов у пациентов, наиболее часто обнаруживаются мутации в DLL3 (Bulman et al., 2000), который кодирует атипический лиганд для Notch, являющийся негативным регулятором передачи сигналов Notch (Ladi et al., 2005).
Во время развития позвонки и ребра возникают из центральной и медиально-вентральной частей сомитов - временных тканевых структур, генерируемых парами и последовательным сж тонко регуляции с помощью передачи сигналов Wnt, Notch и Fgf (Pourqui?, 2011). В соответствии с этим 'Pudgy' мыши, обладающие мутацией в Dll3 имеют укороченное тело, дефекты образования сомитов во время эмбриогенеза и воспроизводят spondylocostal дизостоз (Kusumi et al., 1998). Далее было показано, что потеря Dll3 у мышей или deltaD у рыбок данио дифференциально затрагивает цикличность и стадио-специфическую экспрессию генов во время формирования сомитов (Kusumi et al., 2004; Lewis et al., 2000). Важно. что мутации в гене Notch с низкой пенетрантностью взаимодействуют с эмбриональной гипоксией, приводя к более тяжелому фенотипу и более высокой пенетрантности, подтверждая взаимодействия ген-среда при этом нарушении (Sparrow et al., 2012). Итак, имеющиеся данные показывают, что функция Dll3 заключается в регуляции часов осцилляции во время сегментации сомитов (Dunwoodie et al., 2002;Sewell et al., 2009), тем самым объясняются дефекты, наблюдаемые при spondylocostal дизостозе.

Insights from 'big data' analyses


С осуществлением геномного секвенирования и более продвинутых технологий стало возможным секвенирование всего генома, дающее важную информацию относительно роли генетики в болезнях человека (McPherson and Tybjaerg-Hansen, 2016; Mitchell, 2011). Недавно, Exome Aggregation Consortium (EXAC) объединил совокупность данных и рессурсов для генерации крупнейшей базы данных секвенирования генома, включающей 60706 индивидов (Lek et al., 2016). Важно, что эта огромная база данных делает возможным углубленный анализ, какие гены или наборы генов мутантны в популяции людей с ожидаемой долей и какие обнаруживают ограничение свой функции так, что они редко обнаруживаются мутантными в популяции. Напр., наиболее сильно ограниченные гены кодируют факторы, участвующие в важных биологических процессах, включая компоненты сплайсесом, рибосом и протеосом (Lek et al., 2016).
Этот ценный рессурс (http://exac.broadinstitute.org/) сегодня позволят исследователям задаваться вопросом, какие гены мутируют в генеральной популяции и какие ограничены благодаря своей существенной функции (Table 2), и, базируясь на исследованиях модельных организмов, можно было бы предсказывать, какие др. врожденные пороки могут быть сцеплены с мутациями компонентов пути Notch.

Identifying highly constrained genes and predicting Notch-associated diseases


Как и ожидалось, гены, вызывающие тяжелые нарушения, такие как JAG1 для синдрома Alagille или DLL4 для синдрома Adams-Oliver, чрезвычайно ограничены, а мутации потери функции в этих генах не обнаруживаются в генеральной популяции. Однако, NOTCH3 мутации, вызывающие деменцию с началом у взрослых в гетерозиготном состоянии или DLL3 мутации, вызывающие spondylocostal дизостоз, не являются столь вредными на уровне популяции и , по-видимому, оказываю минорный или не оказывают воздействия на репродуктивную способность.
Интересно, что JAG2 и DLL1 пока не связаны с каким-либо специфическим нарушением в online Mendelian inheritance in man (OMIM) базе данных, хотя EXAC база данных выявляет эти гены как сильно ограниченные (constrained): среди более 60000 секвенированных индивидов, только 5 индивидов несли аллель потери функции JAG2 (по сравнению с ожидаемыми ~36 индивидами), тогда как ни один индивид не нёс мутации потери функции DLL1 (по сравнению с ожидаемыми ~20), указывая тем самым, что эти гены сильно ограничены (Table 2). Это согласуется с тяжелым летальным фенотипом гомозигот для обоих генов у мышей (de Angelis et al., 1997; Jiang et al., 1998; Sidow et al., 1997), хотя неясно, почему один дефектный аллель достаточен, чтобы вызвать тяжелые пороки развития у людей, тогда как гетерозиготные мыши по этим и др. Notch компонентам относительно нормальные. Заметным исключением является гибель Dll4 гетерозиготных мышей (Gale et al., 2004; Krebs et al., 2004), недавно стало ясно, что Jag1 гетерозиготные мыши моделируют синдром Alagille в определенной степени (Thakurdas et al., 2016). Было бы интересно узнать, действительно ли врожденные нарушения, вызываемые мутациями JAG2 или DLL1, скорее всего, существуют в популяции человека или действительно ли гаплонедостаточность у людей несовместима с жизнью.
Jag2 мутантные мыши впервые были обнаружены спонтанно как мутанты под определением syndactylism (sm), исходя из слияний мягких тканей и костей пальцев в передних и задних конечностях (Gr?neberg, 1956). Фенотип Jag2sm является рецессивным, а гомозиготы погибают вскоре после рождения. Интересно, что Hans Gr?neberg наблюдал, что некоторые фенотипы зависят от генетического фона, как это упоминалось ранее в отношении Jag1 (Kiernan et al., 2007). Более того, sm/sm мыши часто имели скрученный или загнутый хвост, что указывало на дефекты нервной трубки, хотя в данном случае это было, по-видимому, связано с эпидермальной гиперплазией. Было также отмечено, что sm/sm эмбрионы обнаруживают преждевременную кератинизацию кожи, приводящую к наросто-образным структурам, хотя эти признаки не обнаруживались после рождения. Мутация sm это G-to-A миссенс мутация, приводящая к замене глицина на серин (G267S) в первом EGF повторе (Sidow et al., 1997), и, по-видимому, является гипоморфным аллелем в сравнении с мутациями Jag2, у которых домен DSL был подвергнут нокауту (Jag2ΔDSL). Jag2ΔDSL/ΔDSL мыши были гомозиготными и погибали при рождении из-за расщепления нёба, ведущего к затруднению дыхания (Jiang et al., 1998), которое, скорее всего, объясняет гибель, наблюдаемую у части sm/sm мышей. Jag2ΔDSL/ΔDSL обнаруживали также ту же самую синдактилию, что и sm/smмыши, а также дефекты тимуса.
Базируясь на этих фенотипах, наблюдаемых у Jag2 мутантных мышей, можно предполагать, что нарушения у человека с возникновением синдактилии или расщепления нёба связаны с мутациями JAG2. Фактически мутации в JAG2 оказываются ассоциированными с расщеплением нёба в ряде исследований (De Araujo et al., 2016; Ghazali et al., 2015; Neiswanger et al., 2006; Parana?ba et al., 2013; Scapoli et al., 2008; Vieira et al., 2005), хотя они объясняют лишь 2% случаев. В самом деле, single-nucleotide polymorphisms (SNPs) были идентифицированы в интронных регионах JAG2, а также в его EGF повторах 8, 9, 10 и 11, где они приводят к миссенс мутациям. Такая локализация довольно неожиданная в этих регионах и не рассматривается как имеющая ключевую функцию в отличие от домена DSL и первх двух EGF повторов, в которых локализуется sm мутация. Чувствительная к дозе роль передачи сигналов Notch при формировании нёба подчеркивается тем фактом, что индивиды с боковым менингоцеле и NOTCH3 мутациями с избыточной функцией иногда также обнаруживают расщепление нёба (Gripp et al., 2015) или нёбо с высоким сводом (Ejaz et al., 2016).
Напротив, Dll1 экспрессируется и влияет на развитие многих органов мыши. Он экспрессируется на высоком уровне в пресомитной мезодерме, конденсирующихся сомитах и миотомах (Bettenhausen et al., 1995), где он регулирует сегментацию ростро-каудальных сомитов (de Angelis et al., 1997). В более позднем развитии Dll1 экспрессируется в ряде органов, включая развивающиеся почки и поджелудочную железу, скелетные мышцы и гладкие мышцы кишечника, головной мозг, клетки сосудистого эндотелия и сенсорные органы (Beckers et al., 1999). Он контролирует клеточную судьбу и ветвление эпителия в поджелудочной железе (Apelqvist et al., 1999), развитие черепно-лицевых и туловищных мышц (Czajkowski et al., 2014), и развитие маргинальной зоны B клеток, но не T клеток (Hozumi et al., 2004). Dll1 необходим также для артериального развития (Limbourg et al., 2007; Sorensen et al., 2009) и регулирует развитие волосковых клеток внутреннего уха (Kiernan et al., 2005). Более того, гаплонедостаточность Dll1 приводит к дефектам метаболизма, иммунной системы и скелетной системы (Rubio-Aliaga et al., 2009). Кроме того, мыши, несущие миссенс мутацию в Dll1 (Dll1E26G) сомитах обнаруживают эктопическую нервную трубку и подобно Dll1 нокаутным мышам (Przemeck et al., 2003), обнаруживают рандомизированное петлеобразование сердца (Wansleeben et al., 2011). Т.о., Dll1 необходим для большого количества онтогенетических процессов, подтверждая, что люди, несущие мутации в DLL1, скорее всего, страдают от тяжелых последствий. Вообще-то это объясняет, почему мутации потери функции не обнаруживаются в базе данных EXAC; мутации DLL1 у людей могут быть несовместимы с жизнью.

Conclusions


In summary, the Notch signaling pathway regulates a vast array of developmental processes that are essential to life. Mutations in genes encoding components of the Notch pathway therefore have detrimental effects, leading to an array of congenital disorders in humans. Considering the fine-tuning of Notch signaling by auxiliary mechanisms, such as glycosylation, fucosylation and phosphorylation, to name but a few (Andersson et al., 2011; Bray, 2016), it is likely that a great many genetic modifiers influence the risk for, and dictate the severity of, various disorders. This may also partially explain why both Alagille syndrome and Hajdu-Cheney syndrome present with variable penetrance and an alternating spectrum of symptoms. Furthermore, investigation into the role of Notch in the vasculature, as a driver of several of the pathologies, may open up new avenues for therapeutic options, while ongoing efforts to develop more specific Notch agonists and antagonists offer exciting possibilities for personalized medicine.
Ongoing efforts to map human genetic variation will be essential for an improved understanding of which combinations of Notch components and modifiers regulate human development. It is interesting to note that many Notch mutations in congenital disorders are de novo mutations occurring in germ line cells of a parent, meaning that a large proportion of patients will have a genetic disorder that is not manifested in either parent. Such diseases are more challenging to diagnose, and their genetic components are only now, thanks to whole-genome sequencing, being elucidated. Further efforts into understanding the transcriptional control of Notch genes, and the transcriptional machinery of the Notch signaling pathway itself, will be essential for deciphering how non-protein-coding mutations affect gene regulation and impact on disease. Mutations in DNA encoding non-coding RNAs (Makrythanasis and Antonarakis, 2013) and in regulatory elements, including enhancers and insulators, are gaining recognition as causes of Mendelian disorders (Chong et al., 2015; Lowe and Reddy, 2015). Identifying all Notch-associated genetic conditions will require continued improvements in whole-genome sequencing and analysis, standardization of patient phenotyping, and global sharing of genomic and phenotypic data.