Wolfram syndrome (WS) является генетическим нарушением, характеризующимся несахарным диабетом, сахарным диабетом, атрофией зрительного нерва и глухотой (DIDMOAD) и атрофией головного мозга, что приводит к гибели в средине зрелого возраста, обычно из-за респираторной недостаточности, вызываемой атрофией ствола мозга [1]. Приблизительно 60% пациентов с WS обнаруживают нейрологические или психиатрические нарушения, включая психозы, эпизоды тяжелой депрессии, импульсивное и агрессивное поведение. Важно, что аномалии головного мозга возникают на самых ранних стадиях в виде клинических симптомов, указывая на то, что WS оказывает выраженное влияние на раннее развитие головного мозга [2]. Большинство случаев WS связано с мутациями с гене Wolfram syndrome 1 (wolframin, WFS1), который кодирует белок, локализованный в мембране эндоплазматического ретикулума (ER). Ряд исследований подчеркивает участие WFS1 в гомеостазе Ca2+ и регуляции ER стрессов [3-5].Было предположено, что ER стрессы играют причинную роль в WS.
В то же самое время клинические симптомы WS напоминают симптомы митохондриальной болезни, такие как глухота, атрофия зрительного нерва и психиатрические нарушения. Более того, затронутые ткани и органы при WS обнаруживают высокие метаболические потребности и большинство клинических проявлений WS согласуются с дефектами энергетического метаболизма. Поэтому др. гипотеза говорит в пользу того, что WS вызывается дисфункцией митохондрий [6,7]. Эта гипотеза косвенно подтверждается недавними находками, что др. причинный ген, CISD2, идентифицированный у пациентов с типом 2 WS, ассоциирует с аномалиями митохондрий и активацией mitophagy [8,9].
Важно, что эти гипотезы не являются взаимно исключающими, поскольку ER стресс также способен нарушать функции митохондрий [10]. Это подтверждает идею, что митохондриальные нарушения участвуют в патогенезе WS.
Используя первичную культуру нейронов, мы показали, что подавление WFS1 приводит к заметному нарушению динамики митохондрий, это, в свою очередь, ингибирует развитие нервов. Мы продемонстрировали, что дефицит WFS1 запускает ER стресс, ассоциированный с дисфункцией inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R), приводя к изменению в клетках гомеостаза кальция. Последнее, в свою очередь, вызывает нарушение регуляции динамики митохондрий (mitophagy и цикл слияний-разделений) в нейронах.
Discussion
Наши результаты открыли цепочку причинных связей, связанных с ER стрессом, нарушениями цитозольного Ca2+, нарушениями динамики митохондрий и задержкой развития WFS1-дефицитных нейронов. Мы продемонстрировали. что дефицит WFS1 вызывает ER стресс в нейронах (как это уже было показано в др. типах клеток [5,15]), воздействуя на рецепторы IP3R. Это было связано с состояниями покоя при более высоком цитозольном Ca2+ (это согласуется с ранее описанным повышенным базовым уровнем цитозольного [Ca2+] в дефицитных по Wfs1 iPS клетках [16]), но с более низким максимальным [Ca2+] в условиях стимуляции, подтверждая снижение амплитуды IP3R-обусловленного высвобождения Ca2+ в WFS1-дефицитных нейронах. Мы показали, что амплитуда IP3R-обусловленного высвобождения Ca2+, вызываемая с помощью фотолиза caged IP3 или с помощью активации продукции эндогенного IP3 с помощью агониста метаботропного глютаматного рецептора DHPG, была достоверно ниже в WFS1-дефицитных нейронах. Точный механизм этой зависимой от WFS1 дисфункции IP3R неясен; однако, ранее было показано, что ER стресс вызывается подавлением IP3R путем нарушения взаимодействия IP3R-HSPA5 [13].
Далее мы продемонстрировали, что измененный гомеостаз Ca2+ нарушает динамику митохондрий. Митохондрии в WFS1-дефицитных нейронах не перемещаются соответственным образом, они не сливаются и не расщепляются столь часто как в норме и они подвергаются mitophagy более часто. Избыточная экспрессия активного фрагмента IP3R восстанавливает IP3R-обусловленное высвобождение Ca2+ и исправляет все нарушения динамики митохондрий, подтверждая, что эти события причинно связаны. Фармакологическое подавление IP3R с помощью Araguspongin B фенокопирует эффекты дефицита WFS1, подтверждая связь между пониженным высвобождением ER Ca2+ и нарушениями динамики митохондрий. Мы оказались способны скорректировать динамику митохондрий путем активации хранилищ, оперирующих поступлением кальция, или путем фармакологической активации L-type Ca2+ каналов, связанных с низким высвобождением ER Ca2+ при нарушенной динамике митохондрий. Потенциально имеется несколько путей того, как высвобождение ER Ca2+ может влиять на динамику митохондрий. Пониженные уровни высвобождения ER Ca2+ могут непосредственно активировать/деактивировать митохондриальные и/или цитоскелетные белки, участвующие в динамике митохондрий. Можно предположить, что Ca2+ влияет на активность или экспрессию этих белков посредством calcium/calmodulin (CaM) киназного сигнального каскада, который может быть недостаточно активирован при дефиците WFS1.
Мы также продемонстрировали, что механизм, связывающий обусловленный дефицитом WFS1 ER ст ресс с нарушениями динамики митохондрий, использует два связанных с болезнью Паркинсона белка, PINK1 и Parkin. Pink1 и Parkin shRNAs супрессируют дефицитом WFS1 обусловленную mitophagy до контрольных уровней. Эти данные подтверждают, что дефицит WFS1 может активировать путь PINK1 и Parkin (подтверждено нашей находкой, продемонстрировавшей повышенную транслокацю Parkin в митохондрии при базовых условиях), который, как было установлено, ингибирует перемещения митохондрий [17] и динамику слияний-разделений [18-20] и вызывает mitophagy [21-24]. Важно, что Pink1 и Parkin shRNAs восстанавливают также динамику слияний-разделений митохондрий и трафик, подтверждая, что активация пути PINK1-Parkin является первичным событием, приводящим к нарушениям трафика и скорости слияний, а также к mitophagy. Тот результат, что замалчивание PINK1 или Parkin (которое улучшает динамики митохондрий в дефицитных по WFS1 нейронах) не исправляет на ER стресс реакции Ca2+ при WFS1 дефиците, подтверждает, что регуляция динамики митохондрий с помощью пути PINK1-Parkin находится иерархически ниже по отношению гомеостаза цитозольного Ca2+.
В принципе имеются два потенциальных объяснения того, как может участвовать PINK1-Parkin путь. Во-первых, деполяризация митохондрий может приводить к накоплению PINK1 в наружной мембране митохондрий и к транслокации Parkin в митохондрии, ингибируя слияния митохондрий и трафик и вызывая поглощение митохондрий (mitophagy). Это объяснение может быть подтверждено нашей находкой, что митохондрии в WFS1-дефицитных нейронах были слегка деполяризованы. Др. объяснение заключается в том, что избыточная активация пути PINK1-Parkin происходит независимо от потенциала митохондриальной мембраны, приводя к удалению здоровых и поляризованных митохондрий. Ранее мы наблюдали сходный феномен в мутантных нейронах, экспрессирующих alpha-synuclein, где зависимая от PINK1-Parkin mitophagy начинала элиминировать поляризованные митохондрии [25]. Нельзя исключить, что оба этих объяснения сохраняют силу в отношении WFS1-дефицитных нейронов. Лёгкая деполяризация митохондрий может увеличивать скорость удаления митохондрий и PINK1-Parkin зависимая mitophagy может элиминировать функциональные или, по крайней мере, частично функциональные митохондрии. Такое избыточное удаление митохондрий д. заитем приводить к снижению плотности митохондрий и продукции ATФ, наблюдаемых в WFS1-дефицитных нейронах и нарушающих биоэнергетический статус клетки.
По сравнению с большинством др. типов клеток, в которых оборот митохондрий высок, в нейронаэх оборот митохондрий относительно низкий. Поэтому можно предположить, что нейроны не могут позволить себе потерю митохондрий с высокой скоростью, т.к. это будет приводить к дефициту энергии. Это может быть энергетически более благоприятным для нейронов, удерживающих "частично дефектные" митохондрий с тем, чтобы истреблять их с помощью mitophagy; др. словами, "частично дефектные" митохондрии являются менее вредными. Напротив, при патологических условиях, связанных с повышенными уровнями аутофагии и mitophagy, избыточное и нежелательное устранение митохондрий д. приводить к дефициту биоэнергии, вредному для нейронов (в нашем случае, повышенное количество частично дефектных митохондрий и повышенное удаление их, приведет к снижению массы митохондрий). Возможно, что это событие не ограничивается Wfs1-дефицитными нейронами, но может также наблюдаться и при др. нейродегенеративных заболеваниях.
Имеются также некоторые ограниченные доказательства, что WFS1 ассоциирован с Parkinson путями. Shadrina et al. [26] продемонстрировали. что синонимный полиморфизм C1645T в гене WFS1 повышает риск болезни Паркинсона у русских пациентов Parkinson's disease in Russian patients. Kоks et al. [27] продемонстрировали недавно, что замалчивание WFS1 в HEK клетках прежде всего затрагивает экспрессию генов, относящихся к Parkinson's signalling ingenuity каноническому пути. Более того, WFS1-дефицитные мыши демонстрируют нарушение функции допаминергической системы [28].
Др. важным открытием является то, что дефицит WFS1 задерживает развитие нейронов и нарушает жизнеспособность нейронов в первичных культурах нейронов. Ex vivo изображения с помощью ядерно-магнитного резонанса головного мозга Wfs1-/- мышей также продемонстрировали четкую атрофию и/или дегенерацию ствола головного мозга, которые являются главными атрофируемыми структурами у пациентов при Wolfram синдроме и вызывают гибель из-за дыхательной недостаточности [1]. Это также согласуется с более ранними клиническими исследованиями, показавшими, что WFS1 оказывает выраженное влияние на ранее развитие головного мозга [2]. По сравнению со здоровыми и контрольными группами при типе 1 диабета, когорта молодых WS пациентов на довольно ранних стадиях болезни обнаруживала меньших размеров внутричерепной объем и преимущественно затрагивался объем серого веществ и микроструктурная целостность белого вещества. Согласно нашим данным, связь дефицита WFS1с задержкой развития нейронов, по-видимому, обусловливается нарушениями динамики митохондрий, поскольку супрессия пути PINK1-Parkin также исправляет задержку развития. Наши результаты не позволяют выяснить точный механизм, с помощью которого нарушается динамика митохондрий, задерживающая развитие нейронов, но некоторые возможные механизмы могут быть предположены. Нарушения доставки (trafficking) митохондрий в WFS1-дефицитных нейронах могут негативно влиять на доставку митохондрий, продуцирующих энергию, в места, где энергия наиболее необходима. Напр., подавление транспорта митохондрий приводит к потере митохондрий из окончаний периферических нервов, приводя к снижению снабжения АТФ и нарушению АИТФ-зависимых процессов. Помимо, серьезных нарушений динамики слияний-разделений митохондрий, может быть нарушено поддержание функции митохондрий и дальнейшие нарушения потребностей в энергии в нейронах. нарушения слияний митохондрий приводят к дисфункции митохондрий и потере респираторной способности (for review, see [29]). Наконец избыточная mitophagy, уменьшающая массу митохондрий, также будет затрагивать общую продукцию энергии в нейронах. Естественно рост нейронов связан с повышенными энергетическими затратами и может быть замедлен при дефиците энергии.
Наше открытие, что дефицитом WFS1 вызванные нарушения гомеостаза Ca2+ приводят к нарушениям динамики митохондрий и нарушениям развития нейронов, может помочь понять патофизиологию некоторых психиатрических нарушений. В самом деле, WS ассоциирует с психиатрической патологией (rev. [30]), такой как тяжелая депрессия, психоз, деменция, импульсивно-агрессивное поведение, приводящие к попыткам самоубийства и частым госпитализациям [31]. Гетрозиготные носители мутантного WFS1, которых предположительно 1% от общей популяции, могут также обладать повышенным риском нарушений настроения. Swift et al. [32] полагают, что гетерозиготные носители WS в 26 раз более склонны нуждаться в психиатрической госпитализации по сравнению с не носителями и эти гетерозиготы могут составлять примерно 25% госпитализированных индивидов с депрессией и суицидальными попытками. Эти находки были подтверждены в нескольких работах [33-35], хотя некоторые сообщения не находят ассоциаций [36-38]. Это расхождение, скорее всего, связано с различиями в кагортах пациентов и нуждается в дальнейшем исследовании.
Итак, наши данные подтверждают причинную связь между ER стрессом, нарушениями цитозольного Ca2+, нарушениями динамики митохондрий и задержкой развития WFS1-дефицитных нейронов. Этот механизм проливает новый свет на развитие аномалий нейронов при Wolfram синдроме и подчеркивает потенциальные терапевтические мишени. Более того, наши результаты открыли две довольно неожиданные связи. Во-первых, относительно умеренный ER стресс и нарушение высвобождения ER Ca2+ могут серьезно нарушать динамику митохондрий, предоставляя тем самым объяснение, почему альтерации на уровне ER могут приводить к отклонениям митохондриального фенотипа. Во-вторых, нарушения динамики митохондрий могут влиять на развитие нейронов, подтверждая, что собственно динамика митохондрий может быть критической для развития нейронов. Поскольку альтерации функции WFS1 , по-видимому, имеют место при разных нейрологических нарушениях [30,32], то наша работа может иметь более широкое значение для понимания роли динамики митохондрий в нейро-психиатрических болезнях.
