Последнее обновление: 01/26/2025 06:28:18  Меню и поиск на этом сайте   ЗДЕСЬ  Дополнительная информация   ЗДЕСЬ!!
WMZ: Z191701361450
WMR: R209318204033


Без рекламы только Браузер Uran (скачать )
   Посещений:
АХОНДРОПЛАЗИЯ



Патогенез и терапия

Achondroplasia: Development, pathogenesis, and therapy
David M. Ornitz, Laurence Legeai-Mallet
Developmental Dynamics 246:291–309, 2017

Autosomal dominant mutations in fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) cause achondroplasia (Ach), the most common form of dwarfism in humans, and related chondrodysplasia syndromes that include hypochondroplasia (Hch), severe achondroplasia with developmental delay and acanthosis nigricans (SADDAN), and thanatophoric dysplasia (TD). FGFR3 is expressed in chondrocytes and mature osteoblasts where it functions to regulate bone growth. Analysis of the mutations in FGFR3 revealed increased signaling through a combination of mechanisms that include stabilization of the receptor, enhanced dimerization, and enhanced tyrosine kinase activity. Paradoxically, increased FGFR3 signaling profoundly suppresses proliferation and maturation of growth plate chondrocytes resulting in decreased growth plate size, reduced trabecular bone volume, and resulting decreased bone elongation. In this review, we discuss the molecular mechanisms that regulate growth plate chondrocytes, the pathogenesis of Ach, and therapeutic approaches that are being evaluated to improve endochondral bone growth in people with Ach and related conditions.

Achondroplasia (Ach) довольно распространенная форма карликовости у людей. Она возникает с частотой 1 на 15-25000 и 80% случаев являются спорадическими. Ach является аутосомно доминантным генетическим заболеванием со 100% пенетрантностью. Низкий рост при Ach в основном результат укорочения конечностей, при этом проксимальные сегменты повреждаются непропорционально, Голова крупная с фронтальными шероховатостями (bossing) и гипоплазией середины лица в результате дефектов роста хряща в основании черепа. Сужение foramen magnum и стеноз позвоночника довольно распространены и часто нуждаются в нейрохирургической коррекции. Размер туловища почти нормален, но часто деформирован из-за избыточного поясничного лордоза (Horton et al., 2007; Baujat et al., 2008).
Исследования генетического сцепления поместили ген Ach в короткое плечо хромосомы 4, а анализ мутаций выявил замену arginine на glycine в остатке 380 (p.Gly380Arg) в fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) почти у всех Ach пациентов европейцев, африканцев и азиатов (Rousseau et al., 1994; Shiang et al., 1994). Экспрессия FGFR3 в хондроцитах ростовой пластинки подтверждает прямое причинное взаимоотношение между мутацией в FGFR3 и функцией ростовой пластинки. Сравнение дикого типа и мутантного FGFR3 показало, что мутантные рецепторы обнаруживают повышенную передачу сигналов, это может еще больше усиливаться в присутствии лигандов fibroblast growth factor (FGF) (Naski et al., 1996; Legeai-Mallet et al., 1998). Такое усиление передачи сигналов может быть обусловлено частично увеличением стабильности белка, приводящему к снижению лизосомной деградации мутантных рецепторов (Cho et al., 2004).
FGFs являются сигнальными молекулами, которые действуют во время эмбрионального и постнатального развития. У взрослых FGFs участвует в гомеостазе и репарации ткани (Ornitz and Itoh, 2015; Li et al., 2016). 18 FGF лигандов обладают способностью активировать 4 FGFR тирозин киназных молекул. Альтернативный сплайсинг мРНК immunoglobulin-подобного домена III в FGFRs 1-3 дает b и c сплайс-варианты. Во многих тканях сплайс-варианты b экспрессируются в эпителиальных типах клеток, а сплайс-варианты c экспрессируются в происходящих из мезенхимны клетках (Belov and Mohammadi, 2013; Ornitz and Itoh, 2015; Li et al., 2016). Эти сплайс-варианты FGFR и молекулы ко-факторов, которые являются heparan sulfate proteoglycans, и белки семейства Klotho, также предопределяют силу и специфичность связывания лиганда и активации рецептора (Ornitz, 2000; Polanska et al., 2009; Itoh et al., 2015). Связывание heparan sulfate также служит для ограничения диффузии FGF по ткани (Sun et al., 2016).
Идентификация активирующих мутаций в FGFR3 в качестве этиологии Ach и родственных слабых форм карликовости, Hch, тяжелой и редкой карликовости, SADDAN, и тяжелой летальной хондроплазии, TD, подтверждает, что терапия ингибиторами может быть разработана для ослабления тяжести этих болезней. Исследования последних 20 лет выявили некоторые механизмы, используемые FGFR3, чтобы регулировать пролиферацию хондроцитов и дифференцировку ростовой пластинки. Были также идентифицированы сигнальные молекулы и пути, которые взаимодействуют с FGFR3, которые могли бы быть использованы для противодействия эффектам гипер-активированных FGFR3.

Growth Plate Structure and Function


Продольный рост кости управляется с помощью пролиферации и дифференцировки хондроцитов ростовой пластинки, структуры. расположенной между метафизом и эпифизом длинных костей. Окончательно сформированная ростовая пластинка состоит из трех принципиальных слоёв клеток, которые пространственно и по времени следуют согласно высоко отрегулированным программам развития (Fig. 1) (Caplan and Pechak, 1987; Hall and Miyake, 1992; Hunziker, 1994; Olsen et al., 2000; Wagner and Karsenty, 2001; Karsenty and Wagner, 2002; Ornitz and Marie, 2002, 2015). Резервная (или покоящаяся) зона хондроцитов служит в качестве популяции предшественников для возобновления, которые дают пролиферирующие хондроциты. Пролиферирующие хондроциты формируют клональные столбики из клеток, которые дифференцируются в пре-гипертрофические, а затем в гипертрофические хондроциты. На дистальном конце ростовой пластинки внеклеточный матрикс, продуцируемый гипертрофическими хондроцитами, начинает минерализоваться, а гипертрофические хондроциты или погибают, или далее дифференцируются в остеобласты, которые занимают primary spongiosa (Yang et al., 2014a, 2014b; Yeung Tsang et al., 2014; Zhou et al., 2014; Park et al., 2015). Т.о., ростовая пластнка действует как матрица для трабекулярной (primary spongiosa or spongy) кости.

Figure 1.

Histological organization of the postnatal growth plate. A: Histological section of the mouse proximal tibia showing growth plate chondrocytes at different stages of differentiation (resting, proliferating, prehypertrophic, and hypertrophic), perichondrium, and trabecular and cortical bone. B: Schematic of the postnatal growth plate showing progression of chondrocyte development and juxtaposition to trabecular and cortical bone, the groove of Ranvier and ring of LaCroix, and the secondary ossification center. C: Fgfr3 expression (in situ hybridization) in proliferating and prehypertrophic chondrocytes and trabecular osteoblasts in a 21-day-old mouse tibia (image courtesy of K. Karuppaiah). SOC, secondary ossification center; RC, reserve chondrocyte zone; PC, proliferating chondrocyte zone; PHC, prehypertrophic chondrocyte zone; HC, hypertrophic chondrocyte zone; TB, trabecular bone; BM, bone marrow.

Ростовая пластинка окружена надхрящницей, структурой, прилегающей к надкостнице. Тонкий слой надхрящницы занят плотно упакованными клетками в желобке Ranvier и окружающем надхрящничном кольце LaCroix (Ranvier, 1873, 1889; Shapiro et al., 1977). Эта структура важна для регуляции продольного роста кости и служит в качестве источника клеток предшественников, которые занимают надкостницу и кортикальную часть кости (Robinson et al., 1999; Fenichel et al., 2006; Karlsson et al., 2009). Надхрящница т.о. служит в качестве матрицы для образования кортикальной кости.
Гипертрофия хондроцитов объясняет приблизительно 60% продольного роста кости (Hunziker et al., 1987; Hunziker and Schenk, 1989; Hunziker, 1994; Wilsman et al., 1996; Noonan et al., 1998). Скорость продольного роста кости определяется пролиферацией хондроцитов, скоростью гипертрофической дифференцировки, изменениями высоты гипертрофических хондроцитов и количеством внеклеточного матрикса, продуцируемого гипертрофическими хондроцитами (Breur et al., 1991; Wilsman et al., 1996). Хотя сила, управляющая элонгацией кости, нуждается в пролиферации и гипертрофии хондроцитов, продольный рост кости нуждается также в элонгации надхрящницы и надкостницы, которая д. быть синхронизирована в хондрогенезом ростовой пластинки.

Overview of Signaling Pathways Regulating the Growth Plate


Пролиферация и дифференцировка хондроцитов в ростовой пластинке регулируется с помощью локально действующих секретируемых факторов роста, эндокринных факторов и биомеханических сил. Локально действующие сигналы включают parathyroid hormone-like peptide (PTHLH or PTHRP), Indian hedgehog (IHH), bone morphogenetic proteins (BMPs), transforming growth factor β (TGFβ), Wingless-type MMTV integration site family members (WNTs), Notch, C-natriuretic peptide (CNP кодируемый Nccp), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1), epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor α (TGFα), vascular endothelial growth factor A (VEGFA) и FGFs. Функции этих путей в росте и развитии скелета рассмотрены в обзорах (rev. Long and Ornitz, 2013; Lui et al., 2014; Kozhemyakina et al., 2015; Rosello-Diez and Joyner, 2015; Maes, 2016). Эндокринные факторы включают growth hormone (GH), thyroid hormone (T3), parathyroid hormone (PTH), FGF23 и половые стероиды (rev. Perry et al., 2008; Rosello-Diez and Joyner, 2015; Maes, 2016; Yakar and Isaksson, 2016). Участвующие механические силы включают те, что генерируются с помощью гидростатических сил, мышечных сокращений и гравитации. Гидростатическое сжатие хондроцитов ростовой пластинки непосредственно усиливает передачу сигналов IHH и пролиферацию хондроцитов (Shao et al., 2012). Пролиферация и гипертрофия хондроцитов также модулируется с помощью статических и динамических нагрузок (Villemure and Stokes, 2009). Напр., в отсутствие мышечных сил пролиферация снижается в ростовой пластинке эмбрионов кур (Germiller and Goldstein, 1997) , а у мышей с отсутствием скелетных мышц формирование первичного центра оссификации задерживается (Nowlan et al., 2010).
Обратимся к локальным сигналам, IHH, PTHLH, BMPs, Wnt, CNP и FGFs являются центральными факторами регуляции ростовой пластинки (Fig. 2). IHH и PTHLH образуют петлю негативной обратной связи, которая контролирует пролиферацию и дифференцировку хондроцитов. IHH производится пре-гипертрофическими и ранними гипертрофическими хондроцитами. Во время постнатального роста костей, после образования вторичного центра оссификации, передача сигналов IHH к своему рецептору, PTCH1, в резервной зоне хондроцитов регулирует экспрессию PTHLH (Chau et al., 2011). PTHLH, в свою очередь, передает сигналы своему рецептору, PTH1R (PTH type 1 receptor) в пре-гипертрофических хондроцитах и подавляет экспрессию IHHи гипертрофию хондроцитов. BMP2 и BMP4 экспрессируются в пре-гипертрофических и гипертрофических хондроцитах и передают сигналы к BMPR1a (BMP receptor type 1A) в проксимальной части пролиферирующих хондроцитов и пре-гипертрофических хондроцитах, чтобы регулировать пролиферацию хондроцитов (Feng et al., 2003; Nilsson et al., 2007; Shu et al., 2011). Ингибирование передачи сигналов Wnt путем инактивации гена Wintless (Wls) в хондроцитах или остеобластах приводит к снижению гипертрофии хондроцитов и маленькому скелету (Lu et al., 2013). CNP экспрессируется в пролиферирующих и пре-гипертрофических хондроцитах и передает сигналы к natriuretic peptide receptor 2 (NPR2 или NPR-B) в пролиферирующих и пре-гипертрофических хондроцитах (Chusho et al., 2001; Potter et al., 2006). Подобно BMP, IHH, PTHLH и CNP способствуют пролиферации хондроцитов (Karp et al., 2000; Chusho et al., 2001; Long et al., 2001; Hirai et al., 2011).

Figure 2.

Signaling pathways in the postnatal growth plate. A: During endochondral bone development, FGF9 and FGF18, derived from the perichondrium and surrounding tissue, signal to FGFR3 in chondrocytes. The balance of chondrocyte proliferation and differentiation is controlled by crosstalk of several signaling pathways. Expression of FGFR3 is enhanced by thyroid hormone (T3) and suppressed by PTHLH. FGFR3 signaling results in increased expression of Snail1, which is required for activation of STAT1 and MAPK signaling. Signaling from PTHLH, IHH and BMPs antagonizes the suppression of chondrocyte proliferation by FGFR3. Both FGFR3 and PTHLH function to suppress chondrocyte differentiation and antagonize the action of Wnt signaling, which promotes differentiation. FGFR3 negatively regulates the autophagy protein, ATG5. B: Activation of downstream signals, PP2a and STAT1, regulate p107, p21Waf1/Cip1activation, respectively, which function to suppress chondrocyte proliferation. Activation of the MAPKs, ERK1, and ERK2, regulate Sox9 expression, which functions to suppress chondrocyte terminal differentiation and endochondral ossification.

Fgfr3 экспрессируется в пролиферирующих хондроцитах во время эмбрионального и постнатального развития (Fig. 1C) (Peters et al., 1993; Delezoide et al., 1998; Monsonego-Ornan et al., 2000; Pandit et al., 2002; Barnard et al., 2005; Karuppaiah et al., 2016). Во время становления ростовой пластинки перед образованием центра вторичной оссификации, передача сигналов FGFR3 способствует пролиферации хондроцитов (Iwata et al., 2000, 2001; Havens et al., 2008). Однако, во время постнатального роста скелета передача сигналов FGFR3 пролиферацию и дифференцировку хондроцитов. Ингибирование хондрогенеза с помощью FGFR3 лежит в основе этиологии Ach и родственных нарушений, при которых активизированные мутации в FGFR3 супрессируют хондрогенез во время пре-пубертатного скелетного роста (Colvin et al., 1996; Deng et al., 1996; Naski et al., 1998, 1996; Chen et al., 1999; Li et al., 1999; Pannier et al., 2010).

FGFR3 Signaling in the Growth Plate


Мыши, экспрессирующие FGFR3 (p.Gly374Arg) активированную мутацию, которая соответствует мутации FGFR3(p.Gly380Arg) человека, обнаруживают Ach-подобный фенотип со сниженной пролиферацией хондроцитов и с пониженной дифференцировкой гипертрофических хондроцитов и продукцией матрикса (Naski et al., 1998; Wang et al., 1999). Механизмы внутриклеточной передачи сигналов, обеспечивающие эти фенотипические отклонения, обнаруживают сложную сеть сигналов, которые интегрируют передачу сигналов FGFR3 с несколькими др. сигнальными путями.
Передача сигналов FGFR активирует, по крайней мере, 4 нижестоящие пути передачи сигналов, включая, MAPK, PI3K/AKT, PLCγ и STATs (rev. Ornitz and Itoh, 2015; Brewer et al., 2016). В ростовой пластинке FGFR3 активирует STAT1 и ERK1/2 и p38 ветвь пути MAPK (Fig. 2) (Su et al., 1997; Chen et al., 1999, 2001; Li et al., 1999; Legeai-Mallet et al., 2004; Raucci et al., 2004; de Frutos et al., 2007; Parafioriti et al., 2009). Активация и избыточная экспрессия STAT1 является строгим кандидатом на роль регуляции (супрессии) пролиферации хондроцитов, стоящей ниже FGFR3, поскольку инактивация гена Stat1 восстанавливает пролиферацию хондроцитов, нарушенную у FGFR3(p.Gly374Arg) мышей. Однако, эти мыши всё ещё имеют Ach-подобный фенотип, демонстрируя, что STAT1 не достаточен, чтобы вызвать общие эффекты подавления роста, вызываемые FGFR3 (Murakami et al., 2004).
Напротив, экспрессия активированного аллеля MEK1 в хондроцитах мышей, лишенных функционального гена Stat1 дает Ach-подобный фенотип с выраженным уменьшением зоны гипертрофических хондроцитов, но пролиферация хондроцитов не снижена. Это согласуется с тем, что гипертрофия хондроцитов вносит вклад в удлинение кости в большей степени, чем пролиферация хондроцитов (Murakami et al., 2004). Это разделение между регуляцией пролиферации и дифференцировки далее было подтверждено наблюдением, что передача сигналов CNP усиливает рост кости путем повышения гипертрофической дифференцировки и продукции матрикса посредством подавления передачи сигналов MAPK (Yasoda et al., 2004).
SNAIL1 является транскрипционным фактором, который регулирует дифференцировку хондроцитов путем репрессии Collagen II и транскрипции Aggrecan (Seki et al., 2003). Несколько исследований продемонстрировали, что Snail1 функционирует ниже FGFR3 и важен для FGFR3 регуляции пролиферации и дифференцировки хондроцитов (de Frutos et al., 2007; Karuppaiah et al., 2016). Принудительная активация SNAIL1 у мышей супрессирует пролиферацию и дифференцировку хондроцитов на поздних эмбриональных стадиях, давая фенотип, напоминающий Ach (de Frutos et al., 2007). Дальнейший анализ выявил достоверное снижение пролиферации хондроцитов и корреляцию между экспрессией Snail1и расположением в ядре STAT1. Помимо регуляции STAT1, активация SNAIL1 увеличивала также фосфорилированные Erk1/2 и могла усиливать их локализацию в ядре (de Frutos et al., 2007; Smith et al., 2014). Эта функция SNAIL1 может быть подкреплена с помощью механизма упреждающего сигнала (feed forward), при этом активация ERK2 фосфорилирует и стабилизирует SNAIL1 и увеличивает его локализацию в ядре (Zhang et al., 2013). Стоящие ниже SNAIL1, активация STAT1 и ERK1/2 приводят к супрессии пролиферации хондроцитов и дифференцировки, соотв. Супрессия пролиферации обеспечивается с помощью активации p107 (и p130) и экспрессии ингибитора клеточного цикла, p21Waf1/Cip1 (Fig. 2B) (Cobrinik et al., 1996; Su et al., 1997; Aikawa et al., 2001; Laplantine et al., 2002; Dailey et al., 2003; Legeai-Mallet et al., 2004; Kolupaeva et al., 2013, 2008). Дифференцировка хондроцитов обеспечивается частично с помощью ERK1/2 (MAPK) регуляции Sox9, который д. быть супрессирован, чтобы сделать возможной терминальную гипертрофическую дифференцировку и эндохондральную оссификацию (Hattori et al., 2010; Ikegami et al., 2011; Kim et al., 2011; Shung et al., 2012; Zhou et al., 2015b).
Передача сигналов FGFR3 затрагивает также окружающую кость прямо и посредством регуляции передачи сигналов др. факторов роста в хондроцитах. Напр., инактивация FGFR3 глобально или в хондроцитах вызывает повышение экспрессии Ihh, Bmps 2, 4, 7, Tgfβ1, и Wnt4 и снижение экспрессии Noggin, приводя к увеличению костной массы (Naski et al., 1998; Zhou et al., 2015a; Wen et al., 2016), тогда как активация FGFR3 в хондроцитах приводит к снижению Ihh, BMP4 и Pthlh и приводит к снижению костной массы (Fig. 2A) (Naski et al., 1998; Chen et al., 2001; Su et al., 2010; Mugniery et al., 2012; Qi et al., 2014). Прямые эффекты FGFR3 на остеобласты подтверждаются кондиционными нокаутами Fgfr3 в остеобластах (OC-Cre), которые приводят к нарушению образования и ремоделирования кости (Xie et al., 2014). Функция остеобластов связана с остеокластами во время формирования и резорбции кости, а недавно было продемонстрировано, что инактивация Fgfr3 в остеокластах (LysM-Cre) нарушает резорбцию кости (Su et al., 2016).

Regulation of FGFR3 Expression


Передача сигналов FGFR3 контролируется частично путем регуляции уровня мРНК и белка Fgfr3. Активирующие мутации в FGFR3 приводят к увеличению экспрессии белка FGFR3, возможно благодаря снижению интернализации и деградации рецепторов (Cho et al., 2004; Legeai-Mallet et al., 2004; Qi et al., 2014). Паракринные и эндокринные сигналы также регулируют экспрессию Fgfr3 в хондроцитах ростовой пластинки. Эти сигналы связаны с FGF, thyroid hormone (T3), и PTHLH. Избыточная экспрессия FGF9 в надхрящнице/надкостнице активирует путь feed forward, который увеличивает экспрессию Fgfr3и супрессирует пролиферацию хондроцитов (Karuppaiah et al., 2016).
Мыши, лишенные thyroid receptor α (TRαo/o), который экспрессируется в скелетной ткани, обнаруживают скелетный hypothyroidism (снижение дифференцировки гипертрофических хондроцитов, задержка оссификации, дезорганизация структуры ростовой пластинки) (Gauthier et al., 2001). Мыши с мутантным thyroid hormone receptor β (TRβpv/pv), который экспрессируется в гипофизе, обнаруживают повышенную экспрессию TSH и thyrotoxicosis (повышенные уровни T3 и T4) (O'Shea et al., 2003). Такие мыши имеют снижение линейного роста, улучшенную эндохондральную оссификацию и краниосиностоз. Эти фенотипические отклонения могут быть объяснены частично регуляцией Fgfr3 в хондроцитах (Bassett and Williams, 2016). TRαo/o мыши имеют пониженные уровни экспрессии Fgfr3 в хондроцитах ростовой пластинки, тогда как гипертироидные TRβpv/pv мыши обнаруживают повышенные уровни Fgfr3 в хондроцитах ростовой пластинки (Barnard et al., 2005). Эта передача сигналов может быть прямой (Fig. 2), т.к. анализ промотора Fgfr3 выявил предполагаемый элемент чувствительности к тироидному гормону (McEwen et al., 1999). Кроме того, воздействие на культивируемые хондроциты T3 вызывало экспрессию Fgfr3 (Barnard et al., 2005).
Передача сигналов PTHLH может непосредственно регулировать Fgfr3 путем контроля регуляторного элемента транскрипции, который может быть репрессирован с помощью PTH благодаря соединению с cAMP чувствительным элементом в промоторе Fgfr3 (McEwen et al., 1999). Воздействие на первичные хондроциты с помощью PTH(1-34) супрессирует экспрессию Fgfr3 (Zhang et al., 2016), как это делеает и инъекция PTH(1-34) in vivo (Karuppaiah et al., 2016). Хотя и не изученная в хондроцитах, экспрессия Fgfr3 вызывалась с помощью гипоксии зависимым от транскрипции и HIF1α-зависимым способом в клетках рака мочевого пузыря (Blick et al., 2013). Сходная регуляция может происходить в относительно гипоксичной ростовой пластинке. Кроме того, BMP2индуцированная экспрессия Fgfr3 посредством ремоделирования хроматина и SP1 сайта в промоторе Fgfr3 (McEwen and Ornitz, 1998; Sun et al., 2009).

FGF Ligands that Regulate Endochondral Bone Growth


Несколько FGFs экспрессируются в ростовой пластинке и в окружающих надхрящнице и надкостнице. Во время развития Fgf2, Fgf9 и Fgf18 экспрессируются в надхрящнице/надкостнице и презумптивном пространстве сустава и, как было установлено, регулируют рост кости in vivo (Gonzalez et al., 1996; Liu et al., 2002; Ohbayashi et al., 2002; Hung et al., 2007; Reinhold and Naski, 2007). Fgf1, Fgf2, Fgf17, и Fgf19 присутствуют в хондроцитах ростовой пластинки (Logan et al., 1991; Krejci et al., 2007), но из них только Fgf2, как было установлено, регулирует рост кости in vivo. Мыши, лишенные Fgf2 (Fgf2-/- ) обнаруживают нормальную морфологию и функцию ростовой пластинки, но обнаруживают уменьшение костной массы, прежде всего в трабекулярной кости (Montero et al., 2000).
Мыши с врожденным отсутствием Fgf9 (Fgf9-/-) обнаруживают снижение роста длинных костей, которое затрагивает элементы проксимального скелета в значительно большей степени, чем дистальные элементы (rhizomelia) (Hung et al., 2007). Мыши, лишенные Fgf18 (Fgf18-/-) обнаруживают более униформное уменьшение роста скелета (Liu et al., 2007). Для обоих этих лигандов пролиферация хондроцитов снижена, это согласуется с наблюдаемыми фенотипами у Fgfr3-/- мышей во время эмбриональных стадий роста кости, где передача сигналов FGFR3 действует, чтобы обеспечивать пролиферацию хондроцитов (Iwata et al., 2000, 2001; Hung et al., 2007; Liu et al., 2007). Мыши, лишенные Fgf9 и Fgf18 имеют тяжелый дефект роста кости, который затрагивает все скелетные элементы (Hung et al., 2016). На поздних стадиях развития, Fgf9-/- и Fgf18-/- мыши обнаруживают увеличение размера зоны гипертрофических хондроцитов. Этот фенотип сильно напоминает таковой у Fgfr3-/- мышей, это согласуется с предположением, что функция FGFR3 заключается в супрессии пролиферации хондроцитов на поздних ст. развития и в постнатальной ростовой пластинке (Liu et al., 2002; Ohbayashi et al., 2002; Hung et al., 2007).

Autophagy in the Growth Plate


Макроаутофагия является зависимым от лизосом процессом деградации, который поддерживает клеточный гомеостаз в ответ на клеточные стрессы. Инициация образования макроаутофагосом нуждается во взаимодействиях субнаборов, по крайней мере, из 18 аутофагией регулируемых генов (Atg) (Feng et al., 2014). Во время развития ростовой пластинки аутофагия регулирует созревание и гипертрофию хондроцитов (Shapiro et al., 2014). Аутофагия является защитной в суставном хряще, а мыши, лишенные Atg5 в хондроцитах, обнаруживают зависимый от возраста остеоартрит (Bouderlique et al., 2016).
Исследования геномных ассоциаций позволили идентифицировать потенциальные связи между аутофагией и ростом человека (Pan et al., 2010). Целенаправленное генетическое устранение связанных с аутофгией генов, Atg5 или Atg7, в хондроцитах приводит к умеренной задержке роста со снижением пролиферации хондроцитов (Vuppalapati et al., 2015) и с нарушением секреции collagen type 2, главного компонента хрящевого внеклеточного матрикса (Cinque et al., 2015).
Роль аутофагии в FGF-регуляции хондрогенеза недавно была идентифицирована несколькими группами. Мыши гаплонедостаточные или нулевые по Fgf18 обнаруживают низкий уровень аутофагии в хондроцитах, приводя к пониженным уровням Col2 в ростовой пластинке (Cinque et al., 2015). Интересно, что эти фенотипы были приписаны передаче сигналов посредством FGFR4 скорее, чем FGFR3. Напротив, Wang et al. показали, что мыши, лишенные Fgfr3 в хондроцитах ростовой пластинки, обнаруживали повышенную аутофагию, а мыши, экспрессирующие постоянно активный FGFR3, имели низкую аутофагию (Wang et al., 2015).

Diseases Caused by Mutations in FGFR3


Achondroplasia


Диагноз Ach обычно устанавливается при рождении, но может быть заподозрен на основании пренатальных ультразвуковых изображениях. 80% случаев Ach возникает из-за спорадических мутаций в FGFR3. Ach является наиболее частой формой карликовости, характеризующейся укорочением длинных костей, непропорциональным укорочением проксимальных частей скелета (rhizomelia), нарушениями разгибания в локтевом суставе, с перекосом большеберцовой кости, преувеличенным поясничным лордозом, укорочением дужек позвонков и сужением расстояния между дужками позвонков, укорочением головки бедра, микроцефалией, гипоплазией средины лица, лобными буграми, потерей слуха и уменьшенным размером foramen magnum (Fig. 3) (Horton et al., 2007; Baujat et al., 2008). Ach может также включать частичное преждевременное слияние коронарного и сагитального швов, указывающие на роль FGFR3 в мембранозной оссификации (Twigg et al., 2009; Di Rocco et al., 2014). Ach является прогрессирующим заболеванием, а тяжесть фенотипа коррелирует с возрастом. Напр., с возрастом, обнаруживается прогрессирующая дезорганизация скелетных ростовых пластинок (Legeai-Mallet et al., 2004). Созревание костей (an assessment of skeletal maturation based on comparisons of radiographs of the wrist, hand, and fingers with standardized radiographs) задерживается у новорожденных Ach пациентов; однако, во время юношеского возраста созревание костей ускоряется и созревание костей приближается к хронологическому возрасту (Pannier et al., 2010). Ach пациенты обнаруживают значительный кифоз, приводящий к прогрессирующим деформациям. С возрастом у Ach пациентов развивается избыточный поясничный лордоз. Главным осложнением является сужение канала спинного мозга из-за дегенеративных изменений в спинальном канале, приводящее к сдавливанию нервных корешков и часто требует хирургической декомпрессии (Baujat et al., 2008).



Figure 3. Clinical features of skeletal disorders resulting from activating mutations in FGFR3. A: The head of a patient with Ach is characterized by macrocephaly, frontal bossing (arrow), and hypoplasia of the midface. B: MRI showing the cervicomedullary compression at the foramen magnum (arrow). C: Rhizomelic short stature (arrow) of a patient with Ach (image courtesy of Dr. G. Finidori). D: X-rays of the lower limb (femur and tibia) of a 24-week-old normal fetus (control) and fetuses with TDI (p.Arg248Cyst) and TDII (p.Lys650Glu) FGFR3 mutations. Note the short and curved femur compared with the age-matched control.


Генетический локус Ach был картирован в FGFR3 в 1994 (Le Merrer et al., 1994; Velinov et al., 1994). Более 97% случаев возникают в результате аутосомно доминантных миссенс мутаций (p.Gly380Arg), расположенных в трансмембранном домене FGFR3 (Fig. 4) (Shiang et al., 1994; Wilkin et al., 1998; Vajo et al., 2000). Ach пациенты, которые не имеют мутации p.Gly380Arg, обычно обнаруживают др. менее распространенные мутации FGFR3, такие как p.Ser217Cys, Ser279Cys, p.Ser344Cys и p.Gly375Cys (Superti-Furga et al., 1995; Zhang et al., 2007; Xue et al., 2014; Takagi et al., 2015). Эти менее распространенные мутации в FGFR3, которые добавляют остаток cysteine, скорее всего, являются результатом активации конституитивного рецептора, подобно тому, что наблюдается при TDI; однако, механизм их действия нуждается в дальнейших исследованиях. Ach мутации обнаруживают 100% пенетрантность. Редкие случаи гомозиготности Ach являются летальными с фенотипами, напоминающими таковой при TD (Stanescu et al., 1990; Tavormina et al., 1995).



Figure 4. The mutational spectrum of FGFR3. The relative location of gain-of-function and loss-of-function mutations causing genetic skeletal disease in humans is shown distributed over the entire FGFR3 coding region. Abbreviations for different types of genetic diseases are shown. FGF ligands are shown in blue and heparan sulfate co-factors are shown in green. Some of the mutations in FGFR3 change the affinity or specificity of the receptor for different FGF ligands, while others affect tyrosine kinase activity or receptor internalization and degradation. ECD, extracellular domain; ICD, intracellular domain; HS, heparan sulfate; I, II, III, immunoglobulin-like domains; TK, tyrosine kinase domains; TM, transmembrane domain (red).


Анализ мутаций у Ach пациентов показал, что почти все мутации возникают в отцовской хромосоме. Отцовское происхождение Ach мутаций в FGFR3 коррелирует с значительным возрастом отцов во всех исследованных случаях (Wilkin et al., 1998). Отцовское происхождение активирующих мутаций в FGF рецепторах объясняется позитивной селекцией и клональной экспансией сперматогониальных стволовых клеток с возрастом (Goriely and Wilkie, 2012; Shinde et al., 2013).
Мутации, вызывающие Ach вызывают активацию FGFR3 и его сигнальных путей, которые в дальнейшем могут быть усилены в присутствии FGF лигандов (Naski et al., 1996; Webster and Donoghue, 1996; Komla-Ebri et al., 2016). Увеличение активности может быть результатом нарушения интернализации и деградации рецепторов (Monsonego-Ornan et al., 2000; Cho et al., 2004). Биохимический анализ показал, что Ach мутации повышают эффективность фосфорилирования рецепторов в отсутствие лиганда (He et al., 2012). Ach фенотипы удавалось моделировать у мышей экспрессию мутантного Fgfr3 в хондроцитах или непосредственно вносить Ach мутации в ген Fgfr3 (Naski et al., 1998; Chen et al., 1999; Wang et al., 1999; Pannier et al., 2009a).

Thanatophoric Dysplasia Type I and II


Thanatophoric dysplasia type I and II (TDI and TDII) являются спорадическими, более тяжелыми формаим карликовости, которые обычно летальны. TD характеризуются короткими конечностями (Fig. 3), узким тораксом с короткими ребрами, макроцефалией и уродствами головного мозга с увеличением височных долей (Rousseau et al., 1995; Tavormina et al., 1995). Радиологические признаки позволяют отличать TDII, которые часто обнаруживаются в виде прямых бедер и черепом в виде клеверного листа.
TDI и TDII вызываются разными мутациями в FGFR3 (Fig. 4). Наиболее часто (75%) TDI миссенс мутации вносят остаток cysteine во внеклеточный (p.Arg248Cys, p.Ser249Cys) или трансмембранный (p.Tyr373Cys, p.Gly370Cys) домен рецептора. Менее часто мутации вносят стоп-кодон (p.X807Ser, X807Arg, X807Cys) и обнаруживаются в 20% случаев TDI (Rousseau et al., 1995). TDII возникает в результате FGFR3 мутации (p.Lys650Glu), расположенной в тирозин киназном домене рецептора. TDI и TDII мутации приводят к лиганд-независимой конституитивной активации рецепторов (Naski et al., 1996); однако, только TDII мутации препятствуют полному созреванию FGFR3 и вызывают преждевременное фосфорилирование рецептора (Lievens and Liboi, 2003; Gibbs and Legeai-Mallet, 2007). Анализ нижестоящей передачи сигналов показал, что TDI мутации строго активируют ERK1/2 и STAT1 (Legeai-Mallet et al., 2004; Krejci et al., 2008). Мышиные модели, экспрессирующие TDI и TDII мутации, все обнаруживают тяжелый фенотип карликовости (Li et al., 1999; Iwata et al., 2001; Pannier et al., 2009b).

Hypochondroplasia


Hypochondroplasia (Hch) является довольно умеренной формой карликовости, которая характеризуется многими общими фенотипическими признаками Ach. Большинство случаев Hch возникает в результате мутаций de novo в гене FGFR3, но в некоторых случаях имеется позитивный анамнез. При спорадических случаях диагноз этой слабой формы карликовости часто не устанавливается при рождении, а позднее во время детства, когда наблюдаются превратности кривой роста. Hch вызывается миссенс мутациями FGFR3, p.Asn540Lys, расположенными в тирозин киназном домене I и является наиболее распространенной мутацией Hch, встречающейся примерно в 60% случаев (Fig. 4). Др. менее распространенные мутации были идентифицированы в тирозин киназном домене II в FGFR3 (e.g. p.Lys650Asn) (Bellus et al., 1995; Tavormina et al., 1995; Bonaventure et al., 1996; Bellus et al., 2000) и во внеклеточном домене (Heuertz et al., 2006). Анализ in vitro мутации p.Lys650Asn выявил слабую активацию киназного домена FGFR3 (Lievens et al., 2004; Gibbs and Legeai-Mallet, 2007). Анализ мутации p.Asn540Lys показал активацию ERK1/2, но не STAT1 (Krejci et al., 2008).

SADDAN Syndrome and Platyspondylic Lethal Skeletal Dysplasia, San Diego Type (PLSD-SD)


Тяжелая ахондроплазия с задержкой развития и acanthosis nigricans (SADDAN) и platyspondylic lethal skeletal dysplasia, San Diego type (PLSD-SD) являются очень редкими летальными хондродисплазиями, которые сопровождаются acanthosis nigricans (гиперпигментация и утолщение кожи), и уродства головного мозга. Эти синдромы и классический TDI все они вызываются мутацией p.Lys650Met в FGFR3 (Fig. 4) (Bellus et al., 1999; Brodie et al., 1999; Tavormina et al., 1999; Farmakis et al., 2015). Анализ p.Lys650Met мутации показал сильную активацию ERK1/2 и STAT1 (Krejci et al., 2008). Мышиная модель, проявляющая мутацию SADDAN, обнаруживает фенотип, сходный с таковым при патологии SADDAN синдрома у человека (Iwata et al., 2001).

Proportionate Short Stature


Доминантная мутация (p.Met528Ile), которая вызывает пропорциональное уменьшение роста (PSS) была идентифицирована в FGFR3 (Fig. 4) (Kant et al., 2015). Функциональные исследования показали, что эта мутация является активирующей, подобно мутации p.Gly380Arg, которая вызывает Ach; , однако, механизмы, которые предопределяют пропорциональность или rhizomelic укорочение конечностей, неизвестны.

Patients With Tall Stature


Редкие патогенные мутации в FGFR3 обусловливают высокий рост. Синдром CATSHL (camptodactyly, tall stature, and hearing loss) возникает в результате мутации, вызывающей доминантную потерю функции FGFR3 (p.Arg621His) (Fig. 4). Такие пациенты характеризуются избыточным ростом скелета, нейросенсорной глухотой и микроцефалией (Toydemir et al., 2006; Makrythanasis et al., 2014; Escobar et al., 2016). Предполагается, что эта мутация возникает в результате потери функции или экспрессии доминантного негативного белка. Редкая мутация рецессивной функциональной потери FGFR3 (p.Thr546Lys) также была описана у пациентов с высоким ростом, микроцефалией и умеренной потерей слуха и умственной отсталостью (Makrythanasis et al., 2014).
Подобные фенотипы согласуются с таковыми у мышей, лишенных Fgfr3, обнаруживающих избыточный рост скелета (Colvin et al., 1996; Deng et al., 1996; Eswarakumar and Schlessinger, 2007) и глухоту (Colvin et al., 1996), и у овец, с рецессивной мутацией FGFR3 (p.Val700Glu), вызывающей spider lamb syndrome (SLS), характеризующийся длинными конечностями, кифосколиозом, уродливыми ребрами и грудиной, Roman носом, отсутствием на теле жира и мышечной атрофией (Beever et al., 2006). Гетерозиготные овцы с этой мутацией обнаруживали умеренное усиление роста скелета (Smith et al., 2006).

Craniosynostosis and Hearing Loss Associated With FGFR3 Mutations


Патогенные доминантные мутации в FGFR3 также вызывают краниосиностоз (преждевременное заращение черепных швов). Muenke синдром (MS) является наиболее распространенным синдромом краниосиностоза (Sabatino et al., 2004). Это аутосомно доминантное нарушение характеризуется преждевременным слиянием коронарного шва, потерей слуха, задержкой развития и умственной отсталостью (Kruszka et al., 2016). Синдром Muenke вызывается миссенс мутацией (p.Pro250Arg) расположенной во внеклеточном домене FGFR3 связующем участке между immunoglobulin-подобными доменами II и III (Fig. 4) (Bellus et al., 1996; Gripp et al., 1998). Интересно, что эта мутация изменяет специфичность обоих сплайс-вариантов, FGFR3b и FGFR3c, делающей возможной активацию FGF10 (Mansour et al., 2013). Это сходно с эффектами, соответствующих мутациям в FGFR2c, которые вызывают синдром Apert (Yu et al., 2000). Отцовское происхождение, ассоциирующее со значительным возрастом отца, также было описано при синдроме Muenke (Rannan-Eliya et al., 2004). Мышиные модели с мутацией p.Pro244Arg также обнаруживают краниосиностоз и потерю слуха (Mansour et al., 2013, 2009; Twigg et al., 2009; Laurita et al., 2011; Nah et al., 2012).
Синдром Crouzon, ассоциированный с acanthosis nigricans (CAN) является редким синдромом, характеризующимся краниосиностозом, глазным птозом, гипоплазией вредины лица и гиперкератозом и гиперпигментацией кожи. Пациенты с этим синдромом несут доминантную миссенс мутацию (p.Ala391Glu) в FGFR3 (Meyers et al., 1995; Wilkes et al., 1996). Эта мутация локализуется в трансмембранном домене рецептора, дистальнее повторяющейся Ach мутации (p.Gly380Arg). Различия в фенотипах (краниосиностоз в противовес хондродисплазии) мутаций p.Ala391Glu и p.Gly380Arg могут быть объяснены относительным увеличением образования гетеродимеров FGFR3 с мутацией p.Ala391Glu (He et al., 2011).

Therapeutic Approaches


В 1994 исследования в области хондродисплазии сделали важное открытие, что активирующие мутации в гене FGFR3 лежат в основе этиологии широкого клинического спектра хондродисплазий, включая Hch, Ach, SADDAN и TD. Потенциальный терапевтический подход для Ach необходим в промежуток времени между рождением и половым созреванием (Fig. 5A).

Figure 5.

Therapeutic approaches for FGFR3-related disorders. A: Schematic representation of key milestones in bone and growth plate activity during skeletal development. The location of the active growth plates and bone sutures are shown in red, according to age. As skeletal development progresses, growth plates and skull sutures fuse (green). B: Tibia intramedullary lengthening in a 16-year-old girl with Ach using the PRECICE system (image courtesy of Dr. D. Paley). C: Schematic representation of therapeutic approaches for Ach that are currently being evaluated. (1) Soluble FGFR3 bind and sequester FGF ligands. (2) Anti-FGFR3 antibodies block ligand binding to the receptor and subsequent downstream signaling pathways. (3) Tyrosine kinase inhibitors block receptor phosphorylation of substrates. (4) Stabilized CNP (BMN-111) antagonizes RAF activation through the activation of the natriuretic peptide receptor 2 (NPR2), a guanylyl cyclase. cGMP activates cyclic GMP-dependent protein kinase II (cGKII) and p38 MAPK. (5) Meclozine, an anti-emetic drug, suppresses high ERK1/2 phosphorylation. (6) PTH(1-34) treatment leads to increased chondrocyte proliferation and suppression of Fgfr3expression. (7) Indirect effect of r-hGH on bone growth (8) Statin promotes degradation of FGFR3.

Surgical Approaches


Хирургическое вмешательство является распространенной формой терапии пропорциональной и непропорциональной карликовости (e.g., Ach, Hch). Хирургическое удлинение конечностей с использованием классической процедуры Елизарова, при которой кортикальные длинные кости рассекаются (osteotomy), наружные фиксаторы помещаются проксимальнее и дистальнее остеотомии и прилагается растяжение в течение нескольких мес. для удлинения длинных костей (Paley, 1988; Schiedel and Rodl, 2012). В среднем удлинение составляет приблизительно 20.5 см. после множественных процедур (затрагивающих бедро и тибию) (Kim et al., 2014; Donaldson et al., 2015). Такое хирургическое лечние позволяет достичь функционального прироста и улучшить качество жизни. Однако, эта процедура болезненна и связана с осложнениями, включая инфекцию и мышечные контрактуры и увеличение риска переломов (Paley, 1990; Donaldson et al., 2015). Недавние инновации, такие как использование внутримозговой (intramedullary) фиксации (Fig. 5B), может улучшить исход и уменьшить риск (Paley, 2015). Необходима пред-опреативная психологическая оценка высокого риска осложнений в противовес увеличению роста.

Approaches to Treat Hypochondroplasia


Преимущественной терапией, предлагаемой пациентам с Hch, является лечение recombinant human growth hormone (r-hGH) или хирургическое вмешательство (Tanaka et al., 2003; Kim et al., 2014; Burghardt et al., 2015; Massart et al., 2015). R-hGH показан для лечения низкого роста у детей с др. скелетными дисплазиями, такими как Leri-Weill dyschondrosteosis и идиопатический низкий рост, ассоциированными с мутациями в гене SHOX (Fukami et al., 2016). При клинических испытаниях, лечение r-hGH увеличивало скорость роста у таких пациентов (Blum et al., 2007, 2013). R-hGH терапия эффективна также при Hch , успешность такого лечения описана во многих исследованиях (Ramaswami et al., 1998; Tanaka et al., 2003). R-hGH хорошо переносится и эффективно улучшает рост у пациентов с Hch, особенно если начато лечение рано (Pinto et al., 2014; Massart et al., 2015). Механизм действия r-hGH не связан с непосредственным воздействием на пути передачи сигналов FGFR3; скорее, r-hGH стимулирует рост хряща за счет pro-anabolic свойств (Fig. 5C-7) (Wang et al., 2004).

Approaches to Treat Achondroplasia


Лечение осложнений Ach связано борьбой с симптоматикой, хирургическим вмешательством и уходом в течение всей жизни. Проблемы со здоровьем обычно связаны: cervico medullary сдавлением, которое может присутствовать в первые несколько мес. жизни из-за уменьшенного foramen magnum; повторяющиеся otitis media, которые распространены у молодых пациентов и необходимостью лечения для предупреждения кондуктивной тугоухости; ограничивающей дыхательной недостаточности из-за небольших размеров грудной клетки; и у взрослых сдавливание поясничного отдела спинного мозга (Fig. 3).
Для лечения низкого роста и нарушений линейного роста, хирургические вмешательства и не хирургические стратегии. Преимущественной терапевтической стратегией Ach пациентов является r-hGH. Увеличение скорости роста описывается после кратковременного воздействия r-hGH, но нет ясности успешности долговременного воздействия (Miccoli et al., 2016). Однако, эффект на пропорции тела всё ещё неизвестен и на сегодня r-hGH для лечения Ach не является рутинной рекомендацией.

Therapies Aimed at FGFR3 Signaling


Большинство не хирургических стратегий имеет целью снижение избыточной активации FGFR3, чтобы стимулировать линейный рост костей при Ach. Многие стратегии заимствованы концептуально из области онкологии, это не удивительно, поскольку генетические повреждения ведут к связанным с FGFR3 нарушениям скелета, идентичным тем, что обнаруживаются при FGFR3-управляемых раковых опухолях (напр., опухоли мочевого пузыря, множественная миелома) (Chesi et al., 1997; Cappellen et al., 1999; Turner and Grose, 2010; Patani et al., 2016). Несколько исследований было сконцентрировало на FGFR-избирательных низкомолекулярных tyrosine kinase inhibitors (TKI), чтобы непосредственно снижать высокую тирозин киназную активность, результат мутаций FGFR3 (Fig. 5C-3). Терапевтическая эффективность TKI CHIR-258 была продемонстрирована на ксенотрансплантатах модельных мышей с FGFR3-индуцированной multiple myeloma (MM) (Trudel et al., 2005) и A31 оказал эффект на увеличение роста эксплантата бедра от Fgfr3 (p.Tyr367Cys) мутантных мышей (Jonquoy et al., 2012).
Два др. FGFR TKIs, PD173074 и SU5402, также оказались способны подавлять рост и индуцировать апоптоз MM клеток. Однако, эти TKIs не являются избирательными в отношении FGFR3 (Mohammadi et al., 1997; Dimitroff et al., 1999). Недавно был использован NVP-BGJ398, TKI более избирательный к FGFR3, чем к др. FGFRs (Gudernova et al., 2016) на преклинических мышиных моделях для лечения некоторых FGFR-обусловленных раков, таких как злокачественные rhabdoid опухоли (Wohrle et al., 2013b), гепатоцеллюлярная карцинома (Scheller et al., 2015) и скелетные нарушения, включая FGF23-обусловленный гипофосфатемический рахит (Wohrle et al., 2013a) и Ach (Komla-Ebri et al., 2016). Важно, что NVP-BGJ398 обнаруживал in vivo снижение активации FGFR3 (p.Tyr367Cys) и улучшение скелетного фенотипа у Ach-похожих мышей (Komla-Ebri et al., 2016). После изучение безопасности и фармакокинетики это соединение может быть предложено для оценки в клинических испытаниях у пациентов Ach.
Др. подход по ингибированию FGFR3 заключается в использовании моноклональных антител, чтобы целенаправленно воздействовать на внеклеточную часть рецептора и блокировать связывание лиганда или использовать растворимые рецепторы ловушки, которые могут связываться и секвестрировать FGF лиганды, препятствия их взаимодействию с эндогенными рецепторами (Fig. 5C-2). Несколько исследований показали, что FGFR3-специфические моноклональные антитела высоко эффективны в замедлении роста разных линий клеток от рака мочевого пузыря и были способны снижать рост FGFR3-зависимых опухолей у мышей и FGFR3-экспрессирующих опухолевых ксенотрансплантатов (Rauchenberger et al., 2003; Martinez-Torrecuadrada et al., 2005; Trudel et al., 2006; Gorbenko et al., 2009; Qing et al., 2009; Gust et al., 2013; Yin et al., 2016). FGFR3-специфические моно-клоанальные антитела пока не были оценены in vivo на мышах, моделирующих Ach.
Soluble FGFR3 extracellular domain decoy receptors (sFGFR3) были недавно разработаны с целью связывания, секвестрирования доступных FGF, чтобы конкурировать с эндогенными FGFR3 за связывание FGF лигандов, которые функционально регулируют хондрогенез (Fig. 5C-1) (Liu et al., 2002; Ohbayashi et al., 2002; Hung et al., 2007; Liu et al., 2007; Garcia et al., 2013). Подкожные инъекции рекомбинантного sFGFR3 трансгенным мышам, моделирующим Ach (Col2a1 promoter driving expression of FGFR3(p.Gly380Arg), Fgfr3Ach/+mice) (Naski et al., 1998), показали снижение гибели и улучшение скелетного роста (Garcia et al., 2013).

Targeting non-FGF Signaling Pathways that Control Chondrocyte Proliferation and Differentiation


Многие сигнальные молекулы и транскрипционные факторы участвуют в развитии и созревании ростовой пластинки (Fig. 2). У Ach, баланс между пролиферацией и дифференцировкой хондроцитов сильно нарушен. Среди факторов, играющих критическую роль, PTH/PTHrP (PTHLH) хорошо изученный регулятор пролиферации и дифференцировки хондроцитов ростовой пластинки (Fig. 5C-6). Чтобы откорректировать дефекты пролиферации и дифференцировки при Ach, системные перемежающиеся инъекции PTH (1-34) были применены к Fgfr3K544E/+ мышам. Эти пре-клинические исследования показали устранение задержки развития скелета у этих мышей (Xie et al., 2012). Однако, клиническое использование PTH (1-34) (Teriparatide) ограничено 2 годами у людей для лечения остеопороза (Hodsman et al., 2005). Использование teriparatide у людей для лечения Ach нуждается в долговременном применении и поэтому нужны новые клинические испытания для оценки безопасности и эффективности.
Недавно появились др. стратегии. Напр., Meclozine, an over the-counter H1 рецепторный ингибитор, используемый для лечения укачивания (motion sickness). В разных клеточных линиях Meclozine способен обеспечивать усиление пролиферации и дифференцировки хондроцитов и ослабление ERK1/2 фосфорилирования (Fig. 5C-5) (Matsushita et al., 2013). В культуре ex vivo Meclozine увеличивал продольный рост эмбриональных нормальных и Fgfr3Ach/+ эксплантов тибии. Оральное применение Meclozine у Fgfr3Ach/+ мышей увеличивало продольный рост костей, но было неспособно увеличивать размер foramen magnum и поясничного канала для спииного мозга (Matsushita et al., 2015). Необходим дальнейших гистологический анализ ростовой пластинки для подтверждения устранения дефектов ростовой пластинки.
Др. примером являются статины, класс понижающих холестерол лекарств (Fig. 5C-8). Добавление статинов в культуральную среду устраняет дефекты хондрогенеза, наблюдаемые у хондроцитов, происходящих из induced pluripotent stem cells (iPS) от Ach пациентов и корректирует скелетный фенотип у Fgfr3Ach/+ мышей in vivo (Yamashita et al., 2014). Однако, остаются препятствия относительно использования статинов в качестве терапевтического подхода Ach, поскольку недавние исследования показали, что лечение статинами задерживает развитие хряща и снижает экспрессию принципиальных регуляторов роста хрящевой пластинки (Wu and De Luca, 2004; Woods et al., 2009). Механизм, с помощью которого статины смогут модифицировать рост костей у Ach нуждается в дальнейшем исследовании (Bush et al., 2015).

C-Type Natriuretic Peptide


Наиболее многообещающей терапией Ach является использование стабилизированных форм C-type natriuretic peptide (CNP), наз. BMN-111 (Lorget et al., 2012; Wendt et al., 2015). CNP и его рецептор, natriuretic peptide receptor B (Npr2, guanylyl cyclase B) считаются важными регуляторами продольного роста костей (Chusho et al., 2001). Мутации потери функции Npr2 ответственны за acromesomelic dysplasia Maroteaux типа, непропорциональная карликовость у людей (Bartels et al., 2004), а гетерозиготы по инактивирующей мутации Npr2 ассоциированы с низким ростом (Olney et al., 2006). Мутантные мыши с нарушениями CNP (Nppc-/-) также обнаруживают диспропорциональную карликовость с короткими конечностями (Chusho et al., 2001). Напротив, высокий рост был описан у пациента, гетерозиготного по активирующей NPR2 мутации (Hannema et al., 2013)и избыточный рост скелета наблюдался у пациентов с избыточной экспрессией CNP, вызванной сбалансированной транслокацией (Bocciardi et al., 2007; Moncla et al., 2007). Тот же самый фенотип описан у трансгенных мышей с избыточной экспрессией brain natriuretic peptide (BNP) (Suda et al., 1998). Интересно, что избыточная экспрессия CNP в хряще или непрерывная доставка CNP посредством внутривенных вливаний нормализует карликовость у Fgfr3Ach/+ мышей (Yasoda et al., 2009, 2004), подтверждая, что применение CNP является потенциальной стратегией лечения Ach.
Передача сигналов CNP посредством NPR2 в хондроцитах и ингибирует путь передачи сигналов MAPK на уровне RAF1 (Fig. 5C-4) (Yasoda et al., 2004; Krejci et al., 2005; Geister et al., 2013). Роль пути MAPK в обеспечении активности FGFR3 иллюстрируется карликовостью мышей с постоянной активацией extracellular signal regulated kinases 1 (ERK1/MEK1) и, напротив, избыточным ростом длинных костей у мышей с инактивацией ERK1/2 (Sebastian et al., 2011). Предпринято несколько исследований, чтобы объяснить сигнальный каскад, запускаемый с помощью CNP в ростовой пластинке. NPR2/CNP-индуцированный cGMP активирует зависимую от cyclic GMP protein kinase II (cGKII, кодируемую PRKG2) и p38 (MAPK14). MAPK14 функционально противодействует RAF1 активации MEK (MAP2K1), это является критическим путем, регулирующим гипертрофию хондроцитов (Murakami et al., 2004; Ozasa et al., 2005; Agoston et al., 2007; Hutchison, 2012; Peake et al., 2014). Передаче сигналов FGF лигандов посредством FGFR3 функционально противодействует передача сигналов CNP (BMN-111) посредством NPR2, это снижает фосфорилирование ERK1/2 в хондроцитах человека и увеличивает скорость гипертрофии хондроцитов и роста скелета у мышей, моделирующих Ach (Fgfr3Y367C/+) (Lorget et al., 2012). Предполагаемые гемодинамические эффекты BMN-111 были протестированы на нормальных молодых человекообразных обезьян. Эхокардиографические параметры оказываются незатронутыми при любой дозе BMN-111, и не обнаруживаются клинические признаки пониженного давления или истощения (distress) во время лечения (Wendt et al., 2015). Фаза 2 клинического испытания BMN-111 (Vosoritide) нацелена на лечение Ach (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02055157). Фаза 3 клинического испытания также начата.

Conclusion and Future Directions


Considerable progress has been made during the past 20 years in understanding FGFR3-related disorders as well in developing a rationale for effective therapeutic strategies to treat FGFR3-associated bone growth defects. Although there has been some success in developing therapies, a clear challenge for the future will be to further improve the care and treatment of children and adults with Ach. As reviewed here, there are several novel therapeutic strategies that need to be considered in the future. Additionally, it will be important to investigate the potential for synergy of two or more pharmacological inhibitors of FGFR3 and its signaling pathways, which could lead to more effective treatments for Ach patients. Progress in developing therapies for Ach will also contribute to the treatment of other diseases such as cancer (multiple myeloma, lung adenocarcinoma, bladder, gastric, colorectal cancers), ostheoarthitis, and aging that result from activation of FGF signaling pathways.
Further analyses and understanding of FGFR3 downstream signaling pathways in the growth plate, of mechanisms that regulate communication between cortical and trabecular bone and the growth plate, and mechanisms by which endocrine signals interact with FGFR3 signaling pathways will likely lead to additional therapeutic strategies. Finally, studies of the role of FGFR3 in extra skeletal tissue (e.g., heart, inner ear, lung) could explain some of the clinical features associated with mutations in FGFR3 and will need to be considered during clinical trials for Ach.