Cartilage Differentiation and the Growth Plate

Элементы скелета конечностей позвоночных развиваются в результате процесса эндохондрального окостенения, при котором матричная модель хряща служит прообразом для образования кости (Mackie et al., 2011; Long and Ornitz, 2013). На первой ступени этого процесса прехондрогенные мезенхимные клетки агрегируют и подвергаются хондрогенной дифференцировке, чтобы сформировать хрящевые конденсаты, которые подвергаются быстрому продольному и (соположенному (appositional) росту в результате пролиферации и отложения матрикса, чтобы сформировать хрящевую модель (DeLise et al., 2000). Хондроциты хрящевой модели затем вступают в скоординированную программу прогрессивной терминальной дифференцировки, известной как созревание хондроцитов (Kronenberg, 2003; Provot and Schipani, 2005; Adams et al., 2007). Прогресс созревания хондроцитов начинается, когда покоящиеся хондроциты начинают быструю направленную пролиферацию, увеличиваются и располагаются рядами (Hunziker, 1994). Эти хондроциты, которые известны как прегипертрофические хондроциты, экспрессируют Indian hedgehog (Ihh), характерный маркер для этой стадии созревания (Vortkamp et al., 1996; St-Jacques et al., 1999). Прегипертрофические хондроциты подвергаются дальнейшему увеличению, выходят из клеточного цикла и начинают экспрессию коллагена типа X, безусловного маркера гипертрофических хондроцитов (LuValle et al., 1989). Хотя пролиферация клеток и отложение матрикса вносят вклад в удлинение развивающихся скелетных элементов, но удлинение большинства скелетных элементов приписывается увеличению объёма самих гипертрофических хондроцитов (Cooper et al., 2013). Окончательная гипертрофическая дифференцировка сопровождается экспрессией факторов, таких как Runx2, Mmp-13 и фактор роста сосудистого эндотелия, и отложением кальцифицированного матрикса (Yoshida and Komori, 2005; Malemud, 2006; Maes, 2013). Эти сигналы запускают дифференцировку остеобластов из окружающей соседней надкостницы, чтобы сформировать надкостничную манжетку кости (Hartmann, 2009; Mackie et al., 2011). Гипертрофические хондроциты в конечном итоге подвергаются апоптозу, а инвазия сосудов из надкостницы приносит остеобласты и остеокласты в гипертрофический регион, это сопровождается удалением погибших клеток и их кальцифицированного хрящевого матрикса, в то же самое время закладывается каркас из трабекулярной кости, внутри которого развивается пространство для костного мозга (de Crombrugghe et al., 2001). Область развивающихся длинных костей, в которой происходит такое прогрессивное созревание хондроцитов, наз. ростовой пластинкой.

Созревание хондроцитов является ключом онтогенетического процесса, который предопределяет окончательную длину длинных костей. Изменение скорости пролиферации или дифференцировки хондроцитов влияет на размер пула хондроцитов, доступного для вовлечения в программу созревания и/или время и скорость, с которой они готовятся к гипертрофии (Kronenberg, 2003). Созревание хондроцитов регулируется за счет скоординированного баланса позитивных и негативных сигналов. Сюда входят позитивные регуляторы, такие как bone morphogenetic protein, канонический Wnt и Runx (Pogue and Lyons, 2006; Akiyama, 2008; Chun et al., 2008), им противостоят негативные сигналы, такие как fibroblast growth factors (FGFs) и transforming growth factor-beta (TGF-β) (Serra and Chang, 2003; Ornitz, 2005). Кроме того, ростовая пластинка позитивно регулируется с помощью системных ростовых гормонов (Savendahl, 2005). Соотв. изменения в программе развития хондроцитов, которые влияют на пролиферацию, дифференцировку или жизнеспособность хондроцитов ростовой пластинки д. в свою очередь влиять на длину длинных костей. За небольшими исключениями нарушение деликатного баланса между пролиферацией и дифференцировкой в ростовой пластинке приводит к уменьшению длины хрящевой матрицы и к последующему укорочению конечностей.

Chondrodysplasias

Хондродисплазии это смешанная группа генетических нарушений, которая нарушает развитие и рост хряща (Krakow and Rimoin,2010). Хотя каждое заболевание рассматривается как редкое, групповой показатель хондродисплазий составляет 1 на 4,000 родов. Фенотипические эффекты хондродисплазий могут включать деформации скелета, очень низкий рост (карликовость), черепно-лицевые аномалии, включая дефекты черепа и расщепление нёба и преждевременную дегенерацию суставов (остеоартрит); а также перинатальную гибель (Krakow and Rimoin, 2010). Хондродисплазии имеют разную этиологию, но многие связаны с мутациями в генах, которые кодируют молекулы хрящевого внеклеточного матрикса (ECM) (Olsen, 1995; Warman et al., 2011). Напр., spondyloepiphyseal dysplasia congenita (SEDC) вызывается мутациями в генах, кодирующих типа II коллаген, главный коллаген хряща; metaphyseal chondrodysplasia-Schmid type (MCDS) вызывается мутациями в типа X коллагене; а pseudoachondroplasia (PSACH) вызывается мутациями в cartilage-matrix oligomeric protein (COMP), в макромолекуле не коллагенового ECM (Warman et al., 2011). Мутации в COMP могут также вызывать multiple epiphyseal dysplasia (MED), которая также вызывается мутациями в типа IX коллагене и не коллагеновом ECM белком matrilin-3, который образует комплекс с COMP, чтобы сформировать стабильные ансамбль белков хряща в ECM (Jackson et al., 2012). Общие характеристики многих хондродисплазий, вызываются мутациями ECM? являются результатом неправильной упаковки, преобразования и/или экспорта аномальных молекул внеклеточного матрикса, приводя к их накоплению в endoplasmic reticulum (ER) хондроцитов (Boot-Handford and Briggs, 2010; Arnold and Fertala, 2013). Клеточным последствием сохранения мутантного белка ECM является активация стресса ER хондроцитов и unfolded protein response (UPR) в попытке клетки преодолеть неуместное накопление мутантного белка. Фенотипические последствия включают снижение пролиферации, нарушение дифференцировки и нарушение жизнеспособности хондроцитиов ростовой пластинки, нарушение эндохондрального окостенения и в результате длинные кости укорачиваются, приводя к низкорослости.

Figure 1. The unfolded protein response. Upon accumulation of misfolded protein, the ER resident chaperone, BiP, is released from the ER sensors PERK, ATF6, and IRE1. Release of BiP triggers activation of each sensor's respective downstream targets. Activation of PERK leads to phosphorylation of the translation initiation factor eIF2?. This leads to global repression of translation as a protective mechanism to prevent formation of more misfolded protein, as well as up-regulation of ATF4, which activates transcription of genes involved in mediating the Unfolded Protein Response including CHOP, a mediator of UPR induced apoptosis. Activation of ATF6 leads to translocation of ATF6 to the Golgi, where is it proteolytically processed. The N-terminus then translocates to the nucleus, where it activates UPR related targets including BiP, Protein Disulphide Isomerase (PDI; a foldase); XBP1, a transcriptional mediator of the UPR; and EDEM1, a mediator of ER assisted degradation (ERAD). IRE1 activation leads to splicing of XBP1 RNA to its variant XBP1s. XBP1s is a major transcriptional regulator of UPR genes including BiP and other chaperones, foldases and protein degradative factors. Activation of each branch of the UPR pathway produces overlapping as well as distinct cellular outcomes. The initial response is to restore ER homeostasis. In case of sustained ER stress, PERK and IRE1 activation mediate ERAD and autophagy. Prolonged ER stress ultimately results in cell death/apoptosis.

ER Stress and the UPR

Реакция на клеточные стрессы, запускаемая в результате накопления аномальных белков в ER, известна как стрессовая реакция ER или UPR (Fig. 1). UPR это эволюционно законсервированный механизм клеточной адаптации к ER стрессу (Hollien, 2013) его активация ведет к адаптивным клеточным реакциям, включая супрессию клон-специфической дифференцировки или блокирование трансляции, чтобы минимизировать дальнейший синтез мутантного белка; усиление синтеза клеточных шаперонов, чтобы улучшить укладку белка; и активация путей деградации, чтобы удалить аномальный белок (Chakrabarti et al., 2011; Walter and Ron, 2011). Если эти попытки клетки восстановить собственно гомеостаз, не удаются, то активируется завершающая реакция апоптической клеточной гибели, чтобы элиминировать клетки с накоплениями аномального белка в ER (Chakrabarti et al., 2011; Walter and Ron, 2011).

Figure 2. Mechanisms in chondrodysplasia. Accumulation of misfolded extracellular matrix proteins during development and growth of the growth plate leads to chondrodysplasia. Cartilage oligomeric matrix protein (COMP, blue) is expressed predominantly in the hypertrophic region of the growth plate, with lower levels of expression within the prehypertrophic and proliferative zones. Matrilin-3 (green) is expressed throughout the growth plate, where it interacts with COMP and type II collagen. Type II collagen (purple) is expressed in resting, proliferative, and prehypertrophic chondrocytes, with highest levels in the proliferative zone. Expression in the hypertrophic zone is generally low or absent. Type X collagen (orange) in expressed predominantly in the hypertrophic zone. Mutations in COMP, Matrilin-3, and types II and X collagen result in protein misfolding and retention in the ER, causing ER stress and UPR activation, and disorganization of the growth plate. Additionally, discrete effects on the growth plate have been attributed to distinct matrix mutations. For example, mutations in COMP cause reduced proliferation and increased apoptosis; mutations in Matrilin-3, cause reduced proliferation; and mutations in collagens type II and X result in suppression of hypertrophic maturation. Mutations in collagen type X also lead to adoption of a more proliferative fate within the hypertrophic zone. These changes in the growth plate result in chondrodysplasia. Disruption of cartilage matrix structure due to insufficiency of matrix components as a result of the mutations likely contributes to the chondrodysplasia phenotypes. The relative contribution of matrix disruption and UPR activation, as well as their relationship to each other in producing chondrodysplasia, requires additional investigation.

Присутствие ER стресса впервые обнаруживается в клетке по появлению с ER-мембраной связанных стрессовых сенсорных белков PERK (protein kinase RNA-like ER kinase), ATF6 (activating transcription factor 6) и IRE1 (inositol requiring enzyme 1) (Gardner et al., 2013) (Fig. 1). Эти сенсоры управляют активацией трех "плеч" UPR посредством уникальных событий сигнальной трансдукции, которые коллективно вызывают уменьшение присутствия и/или эффекта неправильно упакованного белка в ER. В клетках с отсутствием стресса, N-конец ER сенсоров ассоциирован с главным находящимся в ER шапероном, BiP (aka Grp78). В присутствии неправильно упакованного белка BiP вступает в соревнование отступя от ER мембраны и его освобождение от PERK, ATF6 и IRE1 позволяет принять участие в последующей активации этих путей трансдукции (Fig. 1). Соотв., BiP выполняет ключевую регуляторную роль в путях стрессовой реакции и рассматривается также как универсальный первый индикатор ER стресса и активации UPR (Ni and Lee, 2007). Отличающаяся механика каждого плеча UPR делает возможным в клетке точный контроль, ступенчато-образным способом, что отражает степень и продолжительность её реакции на начало и продолжение ER стресса.

Three Pathways of the UPR

Путь активации PERK является одним из первых ответов клетки на ER стресс. Основной функцией плеча PERK в UPR это контроль трансляции белка клеткой. PERK ответственна за фосфорилирование фактора инициации трансляции eIF2α . Фосфорилирование eIF2α , в свою очередь, снижает общую трансляцию в клетке, это сказывается на уменьшении общего объёма синтеза мутантного неправильно упакованного белка (Donnelly et al., 2013). Некоторые гены избегают генерального блока трансляции, накладываемого с помощью фосфорилирования eIF2α и вместо этого активируются; один из таких транскрипционный факторов это ATF4. ATF4 индуцирует способствующие апоптозу события как следствие продолжающегося присутствия ER стресса в клетке посредством активации CHOP (C/EBP homologous protein) (Sovolyova et al., 2014), а его последующая репрессия гена, способствующего выживанию, Bcl2 (Rodriguez et al., 2011).

Активация пути ATF6 делает возможной быст he. транскрипционную реакцию, которая специфически увеличивает транскрипцию генов, участвующих в элиминации ER стресса (Fig. 1). ATF6, после отсоединения от BiP, освобождается из ER мембраны, делая возможным его перенос в Гольджи для протеолитической переработки. Этот процессинг приводит к высвобождению его N-конца, это затем напрямую индуцирует транскрипцию UPR генов мишеней (Kincaid and Cooper, 2007). Этими мишенями являются клеточные шапероны (включая BiP) и foldases (sтакие как PDI; protein disulfide isomerase), предназначенные, чтобы исправлять неправильно упакованные белки и помогать их экспорту из ER (Ferrari and Soling, 1999; Chakrabarti et al., 2011). Кроме того, путь ATF6 обеспечивает транскрипцию компонентов, участвующих в устойчивой реакции на неправильно упакованные белки, таких как XBP1 (X-box-binding protein-1), основной активатор транскрипции BiP; и EDEM1 (ER degradation-enhancing alpha-mannosidase-like protein 1), который способствует деградации неправильно упакованных белков посредством пути ER-assisted degradative pathway (ERAD) (Kincaid and Cooper, 2007). Непрерывная активация ATF6 может также приводить к усилению активности CHOP, медиатора апоптоза, связанного с ER-стрессом (Yoshida et al., 2000).

Путь IRE1 эволюционно самый старый путь ER стресса (Mori, 2009) (Fig. 1). Активация пути IRE1 наступает после диссоциации BiP и может быть обусловлена непосредственным связыванием IRE1 с неправильно упакованными белками (Gardner et al., 2013). Путь IRE1 выполняет двойную способствующую выживанию и способствующую апоптозу роль (Chen and Brandizzi, 2013). Активированный IRE1 ответственен за преобразование мРНК XBP1, синтезируемую в ответ на активацию ATF6, чтобы дать сплайс-вариант, известный как XBP1s. XBP1s является главным транскрипционным медиатором синтеза BiP и способствует устойчивой транскрипционной активации ER шаперонов и факторов белковой деградации, используемых клеткой для коррекции и/или удаления неправильно упакованных белков (Chakrabarti et al., 2011). В ответ на постоянное присутствие неправильно упакованных белков путь IRE1 также усиливает деградацию белков посредством пути ERAD и стимулирует апоптоз (Chen and Brandizzi, 2013) (Fig. 1).

Degradative and Terminal ER Stress Responses

Если вновь синтезированный, но неправильно упакованный белок неспособен к коррекции посредством репаративного действия клеточных шаперонов или foldases, то он направляется на деградацию посредством ERAD (Kincaid and Cooper, 2007). Путь ERAD выполняет важную функцию по контролю качества белка и использует несколько этапов, которые приводят к транслокации неправильно упакованного белка из ER в цитозоль, где он убиквитинируется и становится предметом протеосомной деградации (Brodsky, 2012). Белковые компоненты ERAD включают EDEM1 (Walter and Ron,2011), который участвует в распознавании неправильно упакованных белков; Sec61, который может устанавливать канал для транслокации белка через мембрану ER (Braakman and Bulleid, 2011); и Derlins1-3, который может регулировать выход неправильно упакованного белка из ER и может выполнять др. ERAD функции (Oda et al., 2006). ERAD является прямым следствием активации ATF6 и IRE1 - UPR путей посредством XBP1-обеспечиваемого усиления транскрипционной активности EDEM1, и может быть также косвенным результатом, посредством которого осуществляются потенциальные функции BiP по сопровождению неправильно упакованных белков через ER мембрану (Maattanen et al., 2010; Hagiwara et al., 2011).

Аутофагия это консервативный гомеостатический механизм, который в условиях ER стресса и UPR, действует как реакция, способствующая выживанию, чтобы удалять неправильно упакованные белки (Levine and Klionsky, 2004) . В противоположность ERAD, которая деградирует мономерные неправильно упакованные белки, аутофагия очищает от крупных белковых агрегатов (Ishida and Nagata, 2009). Дифференциальная сортировка белков посредством ERAD в противоположность аутофагии была продемонстрирована для определенных мутаций в типа I коллагене (Ishida and Nagata, 2009) , которые вызывают скелетную дисплазию osteogenesis imperfecta (Warman et al., 2011). Во время UPR-индуцированной аутофагии мембранная структура, известная как аутофагосома, энкапсулирует аберрантные белки, а слияние аутофагосом с клеточными пузырьками образует аутофаголизосомы, которые затем деградируют (Kroemer et al., 2010). Аутофагия активируется ниже PERK и IRE1 сенсоров ER-стресса (Suh et al., 2012). Активация пути PERK посредством ATF4, усиливает синтез Atg12 и LC3, факторов, стабилизирующих образование аутофагосом. После активации аутофагии LC3 превращается в альтернативную форму LC3-II, которая ответственна за обеспечение нижестоящих событий (Suh et al., 2012).

Путь IRE1 активирует аутофагию посредством JNK, которая фосфорилирует анти-апоптический белок Bcl2 и высвобождает его от взаимодействия с регулятором аутофагии Beclin1 (Kang et al., 2011). У млекопитающих target of rapamycin (mTOR) является мощным активатором аутофагии при метаболических болезнях (Jung et al., 2010), а доказательства показывают взаимодействие между mTOR и UPR ER-стрессовыми путями, особенно IRE1, в регуляции аутофагии (Appenzeller-Herzog and Hall, 2012).

В конечном итоге продолжительный ER стресс, обусловленный UPR может запускать клеточную гибель за счет апоптоза (Sovolyova et al., 2014). Семейство белков Bcl2 играет центральную роль в интеграции сигналов клеточного стресса и клеточной гибели (Rodriguez et al., 2011), а баланс про-апоптических и способствующих выживанию членов Bcl2 регулируется с помощью нескольких факторов в каждом из плеч UPR пути. Про-апоптические члены Bcl2 могут регулироваться посредством PERK, ATF6 или IRE1-опосредованных NF-kappaβ сигналов или с помощью IRE1-обеспечиваемого JNK фосфорилирования (Sovolyova et al., 2014). Активация CHOP и ATF4 также является первостепенной мишенью пути PERK, приводящего к апоптозу посредством регуляции Bcl2, оксидативного стресса (гипоксии) и/или посредством изменений уровней кальция в ER, необходимых для функции шаперонов (Wouters and Koritzinsky, 2008; Rodriguez et al., 2011; Han et al., 2013; Sovolyova et al., 2014). Появляются доказательства, подтверждающие, что микроРНК могут быть важны в контроле баланса способствующих выживанию и гибели сигналов, путем воздействия на разные ступени в каждом из плеч пути регуляции сигналов CHOP, ATF6 или IRE1 (Bartoszewska et al.,2013) и/или путем воздействия на активность каспаз, участвующих в инициации и завершении финального акта клеткой (Sovolyova et al., 2014).

UPR Activation in Chondrodysplasia

Type X Collagen Mutations

Metaphyseal chondrodysplasia type Schmid (MCDS) является доминантным заболеванием, вызываемым missense, nonsense и frameshift мутациями в гене, кодирующем типа X коллаген. Типа X коллаген это короткий не фибриллярный коллаген уникально секретируемы гипертрофическими хондроцитами ростовой пластинки (Fig. 2). Подобно др. коллагенам, цепочки X коллагена синтезируются в ядре с кодирующих мРНК, отправляются в ER для пост-трансляционного преобразования и ферментативной модификации (гидроксилирование/гликозилирование) перед их само-сборкой в характерные тройные спиральные проколлагеновые молекулы. Взаимодействия между аминокислотными остатками в C-терминальном noncollagenous domain (NC1) пептидных цепочек существенно для их расположения в одном регистре и для соотв. сборки в тройную спиральную коллагеновую структуру (Ricard-Blum et al., 2000). Неспособность проколлагеновых молекул должным образом формировать нормальные тримерные структуры влияет на их способность впоследствии успешно выводиться из ER. Почти все случаи MCDS вызываются гетерозиготными мутациями в NC1 домена типа X коллагена (Warman et al., 1993; Bateman et al., 2005; Makitie et al., 2005). Фенотипически эти индивиды обнаруживают относительно легкую хондродисплазию, характеризующуюся нарушениями ростовой пластинки и экспансией гипертрофической зоны Ho et al., 2007).

Были получены трансгенные мыши, несущие вызывающие болезнь мутации в NC1 домене типа X коллагена, включая делецию 13 пар оснований (13del; Tsang et al., 2007); мутацию сдвига рамки считывания (Ho et al., 2007) и миссенс мутацию X локуса (Rajpar et al., 2009) (see Supp. Table S1, which is available online, for a summary of mouse models). Эти мыши обнаруживают характерные признаки MCDSЭ включая короткие конечности и расширенную гипертрофическую зону ростовой пластинки (Ho et al.,2007; Tsang et al., 2007; Rajpar et al., 2009). Типа X коллаген сохраняется в гипертрофических хондроцитах, а эндохондральная оссификация задерживается, вызывая хондродисплазию (Ho et al., 2007; Tsang et al., 2007; Rajpar et al., 2009). Кроме того, признаки ER стресса, включая including BiP, XBP1s, CHOP и/или ATF6 усиливаются в хондроцитах ростовой пластинки (Ho et al., 2007; Tsang et al., 2007; Rajpar et al., 2009), подтверждая молекулярную активацию UPR у этих моделей и подтверждая первичную роль ER стресса в патогенезе MCDS (Fig. 2). Прямым доказательством причинного участия UPR в MCDS в хондродисплазии явилась мышиная модель, где thyroglobulin, белок, вызывающий ER-стресс, эктопически экспрессируется в гипертрофических хондроцитах под контролем промотора типа X коллагена (Rajpar et al., 2009). Эктопический белок полностью сохраняется в ER и приводит к активации UPR, характеризующейся подъемом активности BiP и ATF6 (Rajpar et al., 2009).

Сравнение ростовых пластинок двух мышиных моделей MCDS (knock-in трансгенная мышиная модель, несущая болезнь вызывающую типа X коллагена мутацию в NC1 домене, и мышиная модель, в которой экспрессия thyroglobulin управляется с помощью промотора типа X коллагена) идентифицировало ключевые гены и клеточное поведение, которые могут представлять реакции на индукцию UPR, общие и др. хондродисплазиям (Cameron et al., 2011). В обеих моделях все три сенсора ER (PERK, IRE1 и ATF6) активированы и усиливают активность шаперонов и foldases (BiP, Grp94) и обнаруживается также активность ERAD аппарата (Derlin3) (Cameron et al., 2011). Интересно, что хондроциты в гипертрофическом регионе, в котором экспериментально активирована UPR у этих моделей, обладают характеристиками пролиферативных хондроцитов. Они обнаруживают морфологические признаки, такие как маленькие, уплощенной формы клетки и характерную структуру ядер, а также усиление активности генов, типичное для хондроцитов пролиферативной зоны, сопровождаемое подавлением генов, типичных для хондроцитов гипертрофической зоны (Cameron et al., 2011). Присутствие пролиферативных характеристик в хондроцитах гипертрофической зоны также было отмечено в более ранних мышиных моделях MCDS (Tsang et al., 2007). Итак, эти исследования подтверждают, что в гипертрофических хондроцитах, в которых активирована UPR, терминальная дифференцировка изменена и клетки репрограммированы к менее дифференцированному состоянию (Fig. 2). Эта направленная против дифференцировки реакция согласуется с защитным механизмом, активируемым клетками, подвергшимися ER стрессу и активации UPR, чтобы понизить синтез продукта мутантного гена и/или супрессировать клон-специфическую дифференцировку как средство уклониться от повреждений клеток, как это видно на примере панкреатических β-cells? подвергнутых ER стрессу (Szabat et al., 2011).

Matrilin-3 Mutations

Matrilin-3 является ECM белком, синтезируемым покоящимися, пролиферативными и гипертрофическими хондроцитами, которые выполняют важные роли в развитии и гомеостазе хряща (Klatt et al., 2002, 2011) (Fig. 2). В ECM, Matrilin-3 образует структурные взаимодействия с COMPи коллагенами типа II и IX (Klatt et al., 2011). Мутации в Matrilin-3 вызывают multiple epiphyseal dysplasia (MED), доминантно наследуемую хондродисплазию с клинически варьирующим, от умеренного до тяжелого фенотипического отклонения в росте (Chapman et al., 2001; Briggs and Chapman,2002; Warman et al., 2011). Исследование хрящевых клеток пациентов или хондроцитов in vitro, экспрессирующих мутантный matrilin-3, подтвердило, что при большинстве MED мутаций ER разрыхлен и Matrilin-3 сохраняется внутри клеток (Cotterill et al., 2005; Otten et al., 2005; Fresquet et al.,2008), вызывая клеточный стресс и активацию UPR в патофизиологии MED (Fig. 2).

Мышиная knock-in модель представляет болезнь, вызываемую мутацией Matrilin-3 (аналог мутации V194D), обнаруживает клинические признаки MED человека, включая карликовость из-за коротких конечностей, а также сравнимое по времени начало и прогрессирование болезни (Leighton et al., 2007) (see Supp. Table S1 for a summary of mouse models). В этой мышиной модели MED ростовая пластинка дезорганизована и имеет фенотип, сходный с таковым в клетках, происходящих от пациентов и хондроцитов in vitro, экспрессирующих мутантный Matrilin-3, обнаруживая внутриклеточное сохранение Matrilin-3, растяжение ER в ростовой пластинке и усиление активности клеточных шаперонов, включая BiP и Grp94, это предоставляет дополнительные доказательства роли UPR в возникновении хондродисплазии (Leighton et al., 2007; Nundlall et al., 2010). Кроме того, также индуцируются белки, ассоциированные с ERAD, такие как calreticulin и calnexin, которые выполняют функцию контроля качества в ER (Nundlall et al., 2010). Пространственная регуляция апоптоза нарушена в ростовой пластинке в модели MED, но в целом величина апоптоза не изменена, а экспрессия CHOP и Bcl2 не усиливается (Nundlall et al., 2010).

Неуместное внутриклеточное накопление мутантного Matrilin-3, наблюдаемое при MED подтверждает связь с образованием nonnative дисульфидных мостиков между цистеином тиоловых групп и неправильной экспозицией на неупакованном или неправильно упакованном мутантном matrilin-3 (Hartley et al., 2013). Прямое подтверждение этой гипотезы предоставлено наблюдением, что in vitro трансфекция хондроцитов с помощью болезнь-вызывающей конструкции Matrilin-3 модифицируется за счет аланинов, замещающих два терминальных цистеиновых остатка, предупреждая образования связанных дисульфидными мостиками агрегатов и усиливая секрецию мутантного белка Matrilin-3 (Hartley et al., 2013). Также согласуется с ролью образования аберрантных дисульфидных мостиков во внутриклеточном накоплении Matrilin-3 в ростовой пластинке мышей MED, наблюдаемая активация PDI, редуктазы, которая отслеживает правильное образование дисульфидных мостиков, а также Creld2, ассоциированного с ER фактора с предполагаемой PDI активностью (Hartley et al., 2013). Creld2 также активируется у мышей, моделирующих MCDS (Cameron et al., 2011), подтверждая, что образование дисульфидных мостиков также может быть компонентом патологического механизма хондродисплазии, вызываемой мутациями в типа X коллагене.

Mutations in COMP

COMP это не коллагеновый гликопротеин ECM, экспрессируемый развивающимися и созревающими хондроцитами ростовой пластинки (Fang et al., 2000) (Fig. 2). COMP обеспечивает взаимодействия между клетками и матриксом посредством вовлечения в сборку коллагеновых фибрилл, взаимодействия с matrilin-3 и типа IX коллагеном. Большинство COMP мутаций (85%) обнаруживается thrombospondin повторяющемся домене; второй кластер мутаций затрагивает C-терминальный глобулярный домен (Briggs and Chapman, 2002; Kennedy et al., 2005). Мутации в COMP вызывают MED, а также pseudoachondroplasia (PSACH), самостоятельную, но, скорее всего, клинически изменчивую доминантную хондродисплазию (Briggs et al., 1995; Hecht et al., 1995; Ikegawa et al., 1998; Briggs and Chapman, 2002; Merritt et al., 2007; Briggs et al., 2014).

Получены мышиные модели с мутациями COMP, обнаруживающие PSACH и MED (see Supp. Table S1 for a summary of mouse models). Некоторые PSACH модели связаны с мутациями D469del в thrombospondin повторяющемся регионе, которые ответственны, за 30% случаев пациентов с тяжелой хондродисплазией (Hecht et al., 1995; Ikegawa et al., 1998; Kennedy et al., 2005). Имеется некоторая вариабельность в том, как D469del мышиные модели воспроизводят некоторые болезненные фенотипы PSACH человека (Posey et al., 2008, 2009, 2012; Schmitz et al., 2008). Мышиная модель D469Δ-COMP, которая является трансгенной моделью с крысиным COMP под контролем промотора типа II коллагена человека, обнаруживает характеристики PSACH человека, включая укорочение длинных костей и туловища, а также задержку постнатального развития (Schmitz et al., 2008). Однако эта модель дает умеренную хондродисплазию, атипичную по сравнению с вызываемыми мутациями болезнями, а ограничение роста ограничивается мужчинами (Posey et al., 2008; Schmitz et al., 2008). Хотя трансгенная мышиная модель, использующая Tet-индуцибельный трансген с человеческим COMP, несущим мутацию D469del (Posey et al., 2009, 2012). Экспрессия мутантного COMP ограничена хрящевыми экспрессирующими клетками, использующими тетрациклиновым трансактиватором управляемый промотор типа II коллагена (Posey et al., 2009, 2012). Эта модель обнаруживает множество клинических признаков тяжелой PSACH человека, включая начинающуюся постнатально карликовость, существенное уменьшение длины длинных костей, укороченную выпуклую грудную клетку и уменьшение свода черепа (Posey et al., 2012).

Реакции на ER стресс участвуют в патологии болезни PSACH человека, вызываемой мутациями COMP в thrombospondin повторяющемся домене, поскольку хондроциты в выборках от пациентов, как было установлено, обнаруживают растяжение ERи внутриклеточное накопление COMP в ассоциации с ER шапероновыми белками (Vranka et al., 2001; Hecht et al., 2004) (Fig. 2). Однако исследования на мышиных моделях и системах культур клеток, несущих D469del COMP мутацию, не всегда предоставляют неотразимые доказательства канонической активации UPR. Напр., у трансгенных мышей, экспрессирующих D469del мутантный COMP под контролем промотора типа II коллагена (Posey et al., 2008, 2009, 2012; Schmitz et al., 2008); а также в случае D469del knock-in мышей (Suleman et al., 2012), карликовость с короткими конечностями и аномальная морфология ростовой пластинки сопровождаются сохранением мутантного COMP (в комплексе с matrilin-3 и типа IX коллагеном) в ER хондроцитов; и за счет снижения пролиферации и/или повышенного апоптоза в ростовой пластинке. Однако несмотря на внутриклеточное накопление мутантного белка, не наблюдаются изменения в Grp94, BiP и eIF2α, указывая тем самым, что каноническая UPR не индуцируется (Suleman et al., 2012). Вместо этого генный профиль оксидативного стресса, клеточный цикл, апоптоз и/или передача сигналов NF-Kappaβ изменены, что согласуется с потенциальным вовлечением новых независимых от UPR ER стрессовых путей (Posey et al., 2012; Suleman et al., 2012). Сходным образом, в линии клеток хондросаркомы, экспрессируемой некоторыми COMP делеционными мутантами (Coustry et al., 2012), внутриклеточное сохранение мутантного COMP приводит к усилению активности UPR маркеров только на уровне мРНК, но не уровне белка; тогда как маркеры оксидативного стресса мощно индуцируются (Coustry et al., 2012). Эти находки подтверждают, что могут участвовать новые механизмы клеточных стрессов в случае мутации D469del COMP, которая вызывает тяжелую PSACH болезнь.

В противоположность мутации D496del COMP, которая вызывает тяжелый PSACH фенотип, пациенты с мутациями в C-терминальном COMP домене имеют менее тяжелую форму болезни, рассматриваемую как умеренная PSACH или как MED (Rimoin et al., 1994; Briggs et al., 1998; Ikegawa et al., 1998; Kennedy et al., 2005). Мыши, носители p.Thr583Met knock-in мутации в C-терминальном домене COMP аналоге мутации T585M человека, обнаруживают сходное начало и течение более легкой болезни, как и у пациентов PSACH с мутациями в C-терминальной части COMP (Pirog-Garcia et al., 2007) (see Supp. Table S1 for a summary of mouse models). Мыши нормальные при рождении и обнаруживают характерный легкую карликовость, связанную с укорочением конечностей с возрастом. Кроме того, мыши обнаруживают бедренную дисплазию и клинические признаки ранней болезни суставов человеческой PSACH (Pirog-Garcia et al., 2007). В этой модели COMP секретируется скорее, чем сохраняется в клетках и что интересно, активируется мощная каноническая UPR в хондроцитах ростовой пластинки, на это указывает усиление активности BiP и CHOP (Pirog-Garcia et al., 2007; Pirog et al., 2014) , а также усиление активности calreticulin, фосфорилирование eIF2α, активация ATF6, расщепление каспазой (Pirog-Garcia et al., 2007). Т.о., было предположено, что в противоположность эффектам мутации D469del, приводящей к обширному внутриклеточному скоплению мутантного COMP и к активации новых и терминальных ER стрессовых путей (Coustry et al., 2012; Posey et al.,2012; Suleman et al., 2012); эффекты мутации T585X приводят к активации адаптивных функций UPR, достаточных, чтобы разрешить экспорт COMP из клеток, это может объяснить умеренный фенотип хондродисплазии у пациентов с C-терминальной мутацией COMP (Suleman et al., 2012).

Недавно ключевая роль ER-стрессом индуцируемого гена Chop была подтверждена на примере механизма болезни PSACH/MED (Posey et al.,2012; Pirog et al., 2014). В ростовой пластинке и D469del и T585M PSACH мышиных моделей, CHOP активируется, апоптоз увеличивается и/или нарушается его регуляция (Posey et al., 2012; Pirog et al., 2014). Однако, скрещивание D469del или T585M мышей с CHOP-нулевыми мышами привело к иному фенотипическому исходу (Posey et al., 2012; Pirog et al., 2014). В случае мутантов D469del отсутствие CHOP уменьшает внутриклеточное накопление мутантного белка в хондроцитах ростовой пластинки и предупреждает также преждевременную клеточную гибель (Posey et al., 2012). Напротив, в случае T585M мутанта отсутствие CHOP ухудшает скелетный фенотип, за счет от ER-стресса независимого механизма, потенциально связанного с эффектами на дифференцировку остеобластов (Pirog et al., 2014). Итак, эти исследования подчеркивают важность понимания точных механизмов болезни, с помощью которых разные белки ECM вызывают хондродисплазию, в смысле потенциальных терапевтических подходов.

Type II Collagen Mutations

Spondyloepiphyseal dysplasia congenita (SEDC) это от легкой до тяжелой степени хондродисплазия, вызываемая более чем 20 разными мутациями в гене, кодирующем типа II проколлаген (Lee et al., 1989; Anderson et al., 1990; Chan et al., 1993; Cole et al., 1993; Tiller et al., 1995; Sulko et al., 2005; Hoornaert et al., 2006; Xia et al., 2007). Наиболее распространенным классом мутаций, вызывающих SEDC являются замены Gly-X-Y мотива в центральном тройную спираль формирующем регионе молекулы типа II коллагена, в котором один остаток (обычно глицин) замещен громоздким цистеином (Eyre et al., 1991; Chan et al., 1993; Tiller et al., 1995; Hoornaert et al., 2006). Это приводит к синтезу типа II коллагеновой цепочки, которая после трансляции модифицируется сверх меры за счет избыточного гликозилирования hydroxylysine, и к образованию аномального тримера проколлагена.

Некоторые мышиные модели обладают мутациями в домене Gly-X-Y, как было установлено, имеют фенотип, характерный для SEDC (see Supp. Table S1 for a summary of mouse models). Трансгенные мыши, несущие человеческую болезнь-вызывающую мутацию R789C в тройном спиральном домене типа II коллагена обнаруживают клинические признаки человеческой SEDC; включая сильную карликовость с укороченным аппендикулярным и осевым скелетом и уменьшенный торакс, но это значительно тяжелее, чем проявление болезни у человека (Gaiser et al., 2002). Мыши sedc обнаруживают спонтанные миссенс мутации в тройном спиральном домене типа II коллагена, в том же самом положении, что и у R789C трансгенных мышей (Gaiser et al., 2002; Donahue et al., 2003). Мышиная sedc модель обнаруживает многие клинические признаки человеческой SEDC, включая тяжелую карликовость, аномальные эпифизы, уплощенные тела позвонков и потерю слуха и более точно представляет тяжесть аналогичной мутации у человека (Donahue et al., 2003). Др. модель трансгенные G904C мыши, носители трансгена с глицином 904 замещенным цистеином в тройном спиральном доемене типа II коллагена (So et al., 2001). Мыши G904C/G904C обладают признаками тяжелой SEDC, включая карликовость, короткие конечности, шею и морду (So et al., 2001). Изучение выборок пациентов (Eyre et al., 1991; Chan et al., 1993; Tiller et al., 1995; Hoornaert et al., 2006) и от трансгенных или спонтанных мышиных моделей, обладающих болезнь-вызывающими мутациями в типа II коллагеновом тройном спиральном домене (Garofalo et al., 1991; So et al., 2001; Gaiser et al., 2002; Donahue et al., 2003); выявило внутриклеточное накопление типа II коллагена и растяжение ER хондроцитов, в качестве распространенных характеристик хондродисплазии. Это указывает на то, что большинство типа II коллагеновых пептидов содержит мутации в тройном спиральном домене и сохраняется в клетках и что индукция ER стресса и активация UPR могут участвовать в этиологии этих болезнь-вызывающих мутаций (Fig. 2). В самом деле, повышенные уровни UPR маркера BiP, наблюдающиеся у мышиных моделей, вызываемых мутациями типа II коллагена в тройном спиральном домене (Tsang et al., 2007), согласуются с возможной индукцией ER стресса и активации UPR в этиологии SEDC.

Мутации в C-терминальном NC1 домене типа II коллагена, который необходим для инициации сборки гомотримерных коллагеновых цепочек, также вызывает SEDC или SEDC-подобные фенотипы у пациентов (Zabel et al., 1996; Unger et al., 2001; Richards et al., 2002; Zankl et al., 2004); и исследования на мышиных моделях мутаций С-терминального домена типа II коллагена также показали внутриклеточное накопление белка и индукцию мощных ER стрессов и активацию UPR в патологии хондродисплазии. C-терминальные мутации типа I коллагена также ассоциируют с активацией UPR при несовершенном остеогенезе (osteogenesis imperfecta) (Chessler and Byers, 1993; Chessler et al., 1993; Lamande et al., 1995; Lisse et al., 2008). Относительно типа II коллагена, мышиные модели с мутациями C-терминального типа II коллагенового NC1 домена обнаруживают проявления Disproportionate micromelia (Dmm) и Longpockets (Lpk) (Pace et al., 1997; Esapa et al., 2012). Фенотип мышей Dmm аналогичен фенотипу, наблюдаемому у людей при spondyloperipheral дисплазии, SEDC-подобной хондродисплазии, вызываемой мутациями в С-терминальном NC1 домене типа II коллагена (Zabel et al., 1996; Fernandes et al., 2003; Seegmiller et al., 2008). Dmm+/- мыши имеют укороченные конечности и вторичные артриты, типичные для человеческой SEDC, но не имеют характерных диспластических нарушений позвонков (Brown et al., 1981; Bomsta et al., 2006; Seegmiller et al., 2008; Esapa et al., 2012) Мутация Lpk это новая мутация в NC1 домене типа II коллагена, которая также вызывает фенотип, сходный с SEDC человека, включая клинические признаки, такие как укорочение конечностей, диспластичные позвонки и остеоартриты с ранним началом (Esapa et al., 2012). Dmm и Lpk мыши имеют укороченные конечности, дезорганизованные ростовые пластинки и внутриклеточное накопление типа II коллагена, характерное для SEDC (Pace et al., 1997; Fernandes et al., 2003; Seegmiller et al., 2008; Esapa et al., 2012). В ростовой Lpk пластинке размер покоящейся и пролиферативной зон увеличивается, тогда как размер гипертрофической зоны уменьшается, подтверждая вступление хондроцитов в программу терминального созревания задерживается (Esapa et al., 2012). Т.о., подобно MCDS моделям, вызываемым мутациями типа X коллагена (Tsang et al., 2007; Cameron et al., 2011), хондроциты, обладающие мутациями типа II коллагена, также неспособны завершать гипертрофию и сохраняют частично пролиферативный фенотип хондроцитов. Эти находки подчеркивают изменения в пролиферации хондроцитов и/или индукции онтогенетического ареста, важного механизма потенциально общего хондродисплазиям, вызываемым ER стрессами и UPR (Tsang et al., 2010) (Fig. 2).

Клеточная гибель хондроцитов в ростовой пластинке Lpk мышей предшествует появлению аутофагических вакуолей, содержащих фибриллярный материал, предположительно типа II коллагена (Esapa et al., 2012). Эти характеристики подтверждают, что реакции на ER стресс, такие как арест развития или аутофагия, могут быть результатом накопления типа II коллагена в ER, как и в др. хондродисплазиях, связанных с активацией UPR (Tsang et al., 2010). Потенциальная активация ER стресса и UPR не была описана при Lpk, но активация UPR, как показывает активация экспрессии BiP и фосфорилирование eIF2α происходит в ростовой пластинке мышей Dmm (Ricks et al., 2013). Напротив, внутриклеточное удержание типа II коллагена в ER хондроцитов у нового мутанта рыбок данио не сопровождается индукцией канонической UPR, но вызывает клеточную гибель хондроцитов и нарушает рост хряща (Neacsu et al., 2014).

Механизм, с помощью которого накапливаемый внутриклеточно типа II коллаген при SEDC мутациях индуцирует апоптоз и/или ER стресс, понятен не до конца, но исследования указывают на то, что аминокислотные замены, меняющие термостабильность типа II коллагеновых цепочек, могут вызывать частичное разворачивание мутантной молекулы при температуре тела (Ito et al., 2005) и инициировать реакцию на ER стресс. Доказательства этого предположения получены в исследовании, в котором клетки хондросаркомы крыс были трансфицированы in vitro болезнь-вызывающей конструкции типа II коллагена, которая приводила к термальной нестабильности белка (e.g., R75C, R579C, G853E) (Hintze et al., 2008; Chung et al., 2009). Эти исследования выявили, что мутации термолабильного типа II вызывают UPR ответ, как доказательство ассоциации мутантного белка с BiP и PDI, и повышенной экспрессии BiP и PDI в трансфицированных клетках (Hintze et al., 2008; Chung et al., 2009). Усиление активности PDI может быть также связано с присутствием атипичных дисульфидных мостиков, образуемых термолабильным мутантным типа II коллагеном (Fertala et al., 1997; Chung et al., 2009). Клетки, трансфицированные термолабильными конструкциями, также подвергаются апоптозу (Hintze et al., 2008), подтверждая, что клеточная гибель может быть частью этиологии SEDC. Интересно, что апоптическая реакция и ассоциация BiP/PDI не наблюдаются после трансфекции in vitro мутантным термостабильным типа II коллагеном (Hintze et al.,2008), включая коллаген, вызывающий тяжелую хондродисплазию у пациентов (Bogaert et al., 1992) и даже когда клетки трансфицируются термостабильным мутантым белком, вызывающим расширение ER (Hintze et al., 2008). Эти наблюдения согласуются с возможностью, что некоторые эффекты от определенных типа II коллагеновых мутаций могут не зависеть от реакций на ER стресс.

Role of the Matrix in ER-Stress-Related Chondrodysplasias

Хотя многочисленные доказательства подтверждают критическую роль клеточных стрессов и активации UPR, в патогенезе хондродисплазий участвуют мутации белков ECM, по крайней мере, в некоторых аспектах фенотипов хондродисплазий и, скорее всего, они обеспечиваются посредством количественных и/или качественных изменений в матриксе ростовой пластинки (Fig. 2). Доказательства количественных уменьшений в мутантном матриксе, обусловленных тотальной или частичной неспособностью секретировать мутантный ECM, получены в исследованиях ростовых пластинок от пациентов и модельных мышей с MCDS, MED, PSACH и SEDC болезнью, которые обычно содержат пониженные количества мутантного ECM белка при каждой болезни (типа X коллаген, Matrilin-3, COMP или типа II коллаген, соотв.) (Tiller et al., 1995; So et al., 2001; Gaiser et al., 2002; Barbieri et al., 2003; Ho et al., 2007; Leighton et al., 2007; Posey et al., 2009; Rajpar et al., 2009; Suleman et al., 2012). В некоторых случаях почти полная неспособность секретировать мутантный ECM белок может возникнуть, но не как результат внутриклеточного удержания в ответ на клеточный стресс, но как результат быстрого внутриклеточного распада мутантного белка. Это, скорее всего, может быть при некоторых SEDC фенотипах, при которых делеция или мутация в тройном спиральном домене типа II коллагена предупреждает сборку молекул нормального тримерного проколлагена. Напр., мутация del48 типа II коллагена, которая стала первой доминантно наследуемой SEDC мутацией, идентифицированной у человека (Lee et al., 1989), вызывает делецию экзона 48, который соответствует С-терминальному тройному спиральному домену типа II коллагена. Эта делеция не нарушает рамки считывания мРНК, а скорее нарушает нормальную сборку проколлагенового тримера из-за несовпадения в регистре между дикого типа и carboxyl-укороченной мутантной молекулой коллагена. Базируясь по аналогии на сходных мутация типа I коллагена, который вызывает несовершенный остеогенез, можно предсказать, что вся структура мутантного проколлагена становится предметом быстрой внутриклеточной деградации с помощью "procollagen suicide" (Prockop, 1984; Fitzgerald et al., 1999), приводящей к почти полной потере типа II коллагенового белка в матриксе. В самом деле, действительно отсутствуют типа II коллагеновые фибриллы в хрящевом матриксе ростовой пластинки трансгенных мышей, несущих мутацию del48 типа II (Metsaranta et al., 1992; Barbieri et al., 2003). Кроме того, типа II коллагеновые фибриллы также драматически снижаются в ростовых пластинках трансгенных мышей, которые имеют точковые мутации в тройном спиральном домене, а хондроциты, трансфицированные такой болезнь-вызывающей точковой мутацией in vitro неспособны секретировать мутантные пептиды (Gaiser et al., 2002). С помощью сходного механизма дефицит типа X коллагена в матриксе ростовой пластинки , как полагают, объясняет MCDS фенотипы у пациентов с нонсенс мутациями, при которых ожидается быстрая деградация типа X коллагена как результат нарушения сборки нормального тримера с помощью мутантных типа X коллагеновых цепочек (Chan et al., 1998; Bateman et al., 2005). Важно подчеркнуть, что поскольку потеря матрикса per se приводит к фенотипу хондродисплазии в этих случаях, то мыши, гетерозиготные по полной потере или типа II коллагена или типа X неожиданно обнаруживают минимальное фенотипическое отклонение, несмотря на драматическое снижение количества этих коллагенов в хрящевом матриксе (Rosati et al., 1994; Li et al.,1995), подтверждая, что общий уровень коллагена в матриксе не единственный, ответственный за фенотип хондродисплазии. Более того, у мышиной SEDC модели, вызываемой мутацией del48 типа II коллагена, ER хондроцитов раздут и обнаруживаются большие количества внутриклеточного материла (Metsaranta et al., 1992; Barbieri et al., 2003), тем самым открывается возможность, что в дополнение к эффектам, обусловленным недостаточностью матрикса, возникают также клеточно автономные эффекты, обусловленные частично удержанием коллагенового белка. Сходным образом, у мышиной модели с мутациями нонсенс и сдвига рамки типа X коллагена, некоторые мутантные белки избегают деградации, сохраняются и вызывают ER стресс и активацию UPR (Ho et al., 2007).

В дополнение к вредным эффектам, обусловленными количественным уменьшением количества специфических мутантных ECM белков, присутствующих при хондродисплазии в хрящевом матриксе, патофизиология хондродисплазий, возникающих в результате ECM мутаций, также, скорее всего, участвует в качественных изменения композиции всего хрящевого матрикса. Например, изменения ECM, описанные у модельных SEDC мышей, включают не только уменьшение типа II коллагена, но и также уменьшение типа IX коллагена, типа X коллагена и aggrecan (So et al., 2001). Сходным образом, профиль PSACH и MED внеклеточного матрикса характеризуется пониженными уровнями всех трех членов COMP/Matrilin-3/type IX collagen interactome (Vranka et al., 2001; Hecht et al., 2004; Posey et al., 2008). В некоторых SEDC случаях потеря типа II коллагена в матриксе сопровождается неподходящим присутствием типа I коллагена (Tiller et al., 1995); присутствие которого коррелирует со степенью тяжести фенотипического проявления (Mortier et al., 2000). Изменения в околоклеточном матриксе, включающие уменьшение или разрушение коллагеновых фибрилл, обнаруживаются в ростовой пластинке MED и PSACH модельных мышей, обладающих болезнь-вызывающими мутациями в Matrilin-3 или COMP, соотв., при этом мутантный белок секретируется частично (Leighton et al., 2007; Schmitz et al., 2008), подтверждая, что, по крайней мере, некоторые аспекты фенотипа не полностью обусловлены внутренне присущими эффектами внутри самих хондроцитов. Напр., исследования in vitro показали, что хондроциты, трансфицированные D469del мутантным COMP, обнаруживают обширное, но не тотальное внутриклеточное его удержание, следовательно, внутриклеточные изменения, ассоциированные со стрессом ER и индукцией UPR, также как и внеклеточные эффекты на образование коллагеновых фибрилл и их расположение в околоклеточном матриксе, приводят к подтверждению, что PSACH, вызываемая этой мутацией, использует как внутри- так и внеклеточные пути (Dinser et al., 2002). Нарушение архитектуры матриксe также наблюдается у модельных мышей с С-терминальной мутацией COMP, у которых мутантный COMP, как полагают, полностью секретируется в матрикс (Pirog-Garcia et al., 2007). Сходным образом, нарушение образования коллагеновых фибрилл в околоклеточном матриксе происходит вследствие трансфекции хондроцитов с болезнь-вызывающей конструкцией Matrilin-3, которая эффективно секретируется из клеток (Otten et al., 2005). Впоследствии было показано, что этот мутант, который аналогичен мутации T303M MED, также нарушает образование коллагеновых фибрилл in vitro (Otten et al., 2010). Эти исследования демонстрируют, что изменения компонентов матрикса и/или архитектуры, происходящие как результат мутации ECM белков, особенно в случаях, когда мутантный ECM белок секретируется частично или полностью, скорее всего, играют, по крайней мере, некоторую роль в хондродисплазии.

Недавние исследования продемонстрировали пригодность протеомного профилирования для идентификации ключевых составляющих ECM, нарушаемых при хондродисплазии. В одном исследовании сравнение протеома хряща у мышей с отсутствием типа IX коллагена по сравнению с нормой, выявило количественные изменения в уровнях типа II, X и XII коллагенов, а также изменения в уровнях не коллагеновых белков fibronectin, thrombospondin-4, lactadherin и epipycan; а также измененную экспрессию компонентов оси TGF-β (Brachvogel et al., 2013). Эти результаты идентифицируют новые белки и сигнальные пути, которые обычно взаимодействуют с типа IX коллагеном, а также предоставляют доказательства потенциальных компенсаторных реакций на потерю типа IX коллагена (Brachvogel et al., 2013). В лр. исследовании сравнение протеома хряща трансгенных мышей с болезнью, вызываемой мутациями в Matrilin-3 или COMP, выявили общие и отличающиеся белковые сигнатуры, которые участвуют в изменениях экстрагируемости др. белков хряща, включая коллагены, matrilins, COMP и tenascin, и также подтвердило потенциальные изменения передачи сигналов вдоль оси TGF-β (Bell et al., 2013). Эти изменения указывают на то, что ассоциации между критическими составляющими хрящевого матрикса изменяются при этих хондродисплазиях, нарушения организации хряща и, следовательно, потенциальное нарушение функции самих хондроцитов (Bell et al., 2013).

Данные об относительной роли нарушений композиции матрикса и молекулярных механизмах, вытекающие из продукции мутантных белков, являются обнадеживающими предположениями. Недавно, чтобы разрешить этот вопрос разработана мышиная модель, в которой индуктор UPR thyroglobulin экспрессируется под контролем промтора типа II коллагена (Gualeni et al., 2013). Эта модель позволяет оценить непосредственный вклад индукции UPR в хондроцитах, экспрессирующих типа II коллаген, который составляет большую часть ростовой пластинки. Экспрессия thyroglobulin в этой модели увеличивает уровни белков ER шаперонов, включая BiP, PDI, и др.; но неожиданно не меняет активности транскрипции панели более чем из 150 UPR-характеризующих генов, включая маркеры UPR, ERAD и деградации (Gualeni et al., 2013). Этот неожиданный результат подтверждает индукцию ER стресса, возникающего без последующей активации UPR. Поскольку thyroglobulin не секретируется, то композиция ECM ростовой пластини не затрагивается. Конечности мышей укорочены, а пролиферация в ростовой пластинке снижена, но апоптоз не усилен. Т.о., эта модель продуцирует хондродисплазию путем индукции внутриклеточного ER стресса и нарушенной пролиферации, но без активации классической UPR, индукции клеточной гибели или крупных изменений в хрящевом матриксе. Это исследование подчеркивает утонченную чувствительность хондроцитов к ER стрессу и подтверждает, что клеточная пролиферация в ростовой пластинке может быть ключевым поведенческим следствием реакции на ER стресс. Однако относительный вклад нарушений пролиферации, апоптоза и нарушений дифференцировки в хондродисплазию поддерживается (confounded) относительно небольшим количеством пролиферирующих клеток в гипертрофической зоне. ER стресс, индуцируемый белками, экспрессируемыми специфически в этой зоне, будет оказывать минимальное влияние на величину пролиферации в основном из-за общего низкого уровня пролиферации. Это подчеркивается в исследовании Rajpar с колл. (2009) , показавшими, что индукция ER стресса специфически в гипертрофической области оказывает небольшой или не оказывает эффекта на пролиферацию.

В конечном итоге клеточные последствия ER стресса, скорее всего, будут отражать активности клеток внутри затронутой зоны, это может в свою очередь быть связано с клиническими проявлениями последующей хондродисплазии (Fig. 2). Напр., ER стресс в хондроцитах, обусловленный мутациями в ECM белках, которые многочисленны в этом регионе (напр., типа II коллаген, Matrilin-3 и COMP), как следовало ожидать будет нарушать в первую очередь клеточную пролиферацию и будет проявляться прежде всего в фенотипических отклонениях в эпифизе (как при MED, PSACH, так и SEDC). Напротив, ER стресс в хондроцитах метафизов, обусловленный мутациями в типа X коллагене, экспрессируемом гипертрофическими хондроцитами, как следует ожидать, будет в первую очередь нарушать дифференцировку клеток и будет сказываться на метафизарном фенотипе, как в случае MCDS.

Normal Functions for ER Stress Pathways in Cartilage

Поскольку ясно, что несоответствующая индукция ER стресса и активация UPR являются вредными для физиологии ростовой пластинки, то исследования показали, что базовый уровень ER стресса и пути передачи сигналов UPR и поведения действительно необходимы для нормальной хондрогенной дифференцировки и/или созревания гипертрофических хондроцитов. Напр., исследования in vitro подтвердили участие компонентов ER стресса в нормальной хондрогенной дифференцировке, поскольку активация путей IRE1 и ATF6 происходит в созревших хондроцитах, а сплайс-продукт XBP1 (XBP1s) действует как кофактор для Runx2, чтобы способствовать гипертрофии хондроцитов (Liu et al., 2012). Более того, нокдаун XBP1s в зрелых хондроцитах снижает дифференцировку гипертрофических хондроцитов и уровни Ihh и PTHrP, а нокдаун IRE1 вызывает экспрессию caspase3, CHOP и JNK и усиливает апоптоз (Han et al., 2013).

В частности исследования подчеркивают роль аутофагии как важного способа для переживания хондроцитами гипоксических, стресс-вызывающих условий в ростовой платинке. Зрелые хондроциты обнаруживают аутофагию и регуляция этой функции зависит от HIF, mTOR и AMP киназы (Srinivas et al., 2009). Более того, нарушения аутофагии в хондроцитах ростовой пластинки мышей, лишенных белка клеточного матрикса connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) приводит к тяжелой хондродисплазии, ассоциированной с характеристиками ER стресса и активации UPR, включая присутствие увеличенного ER и усиление апоптоза, сопровождаемых снижением уровней NF-Kappaβ и усилением экспрессии BiP и CHOP, это привело к предположению, что CTGF/CCN2 может нормально функционировать, чтобы защищать хондроциты от стресса путем усиления экспрессии способствующих выживанию NF-Kappaβ и путей аутофагии (Hall-Glenn et al., 2013). Поскольку определенный уровень аутофагии является частью нормального гомеостаза ростовой пластинки, то избыточная активация аутофагии сама может вызывать хондродисплазию, т.к. мыши с нулевой мутацией sulfatase-modifying factor-1 (Sumf1), белка, необходимого сульфатирования протеогликанов, обнаруживают мелкоклеточность ростовой пластинки, вызванную аномальной индукцией аутофагии, что определяется по присутствию клеток с повышенным содержанием LC3-содержащих фаголизосом (Settembre et al., 2008).

Важность UPR путей в поддержании нормальной физиологии хондроцитов подчеркивается появлением хондродисплазии у ответ на активацию UPR , обусловленную потерей или мутациями компонентов аппарата преобразования клеток. Напр., у мышей с потерей ATF-родственного ER мембранного белка BBF2H7, уровни Sec23a (белка, участвующего в транспорте белков из ER) снижены и приводят к тяжелой хондродисплазии из-за ненужного внутриклеточного накопления типа II коллагена и COMP хондроцитами ростовой пластинки (Izumi et al., 2012). Кроме того, ER стресс приводит к процессингу BF2H7, чтобы дать отличающиеся по N- и C-концу формы, выполняющие разные функции по регуляции пролиферации и дифференцировке хондроцитов (Saito et al., 2014). Др. пример необходимость в аппарате UPR для клеточного гомеостаза, это site-1 protease, которая необходима для активации ATF6 и чьё отсутствие вызывает тяжелую хондродисплазию у мышей, сопровождаемую признаками ER стресса в хондроцитах (Patra et al., 2007). У человека achondrogenesis type IA является тяжелой неонатальной летальной дисплазией, вызываемой мутациями в Гольджи белке GMAP-210. ER хондроцитов от мышей, лишенных GMAP210, раздут и уровни ER стрессового шаперона BiP повышены, подтверждая участие ER стресса и UPR в этиологии ахондрогенеза (Smits et al., 2010) .

Интересно исследование, подтвердившее, что хондроциты могут быть особенно чувствительны к ER стрессу (Price et al., 2010). Напр., воздействие на хондроциты in vitro ER-стресса путем внесения агента thapsigargin, приводит к быстрому усилению активности CHOP и BiP; и существенному снижению клеточной жизнеспособности, который необходим в 100 раз более высокой концентрации, чтобы достичь в линии клеток фибробластов того же эффекта (Price et al.,2010). Чувствительность хондроцитов к индукции ER стресса может быть связана с бессосудистой природой хряща и, следовательно, с его гипоксическими и бедными питаельными веществами микроусловиями (Price et al., 2010); и/или может быть связана с присущей природой хондроцитов как строгих секреторных клеток (Boot-Handford and Briggs, 2010).

Chondrodysplasia, ER Stress, and Osteoarthritis

Пациенты с хондродисплазией, вызываемой мутациями компонентов ECM, таких как MED, PSACH и SEDC, часто обнаруживают преждевременные остеоартриты (Treble et al., 1990; Eyre et al., 1991; Williams et al., 1993; Ritvaniemi et al., 1995; Mier et al., 2001; Briggs and Chapman,2002; Sahlman et al., 2004; Otten et al., 2005), подтверждая механистические связи между патофизиологией ростовой пластинкой и суставного хряща в этих условиях (Kannu et al., 2009). Поскольку пути адаптивного стресса, такие как аутофагия, были подтверждены как необходимые для поддержания соотв. гомеостаза суставного хряща соединений (Lotz and Carames, 2011; Chang t al., 2013), то избыточная активация ER стресса и UPR реакции в суставном хряще коррелирует с деградацией суставного хряща. Напр., усиление активности мРНК BiP и фосфорилирования eIF2α наблюдаются в суставном хряще у модельных Sedc и Dmm мышей, которые подобно пациентам с SEDC также обнаруживают остеоартриты с ранним началом (Holt et al., 2012; Macdonald et al., 2013; Ricks et al., 2013). BiP и/или др. маркеры ER стресса и активации UPR, такие как фосфорилированные PERK/JNK; CHOP и/или XBP1s также усиливают свою активность в суставном хряще пациентов с остеоартритами (Nugent et al., 2009; Takada et al., 2011; Guo et al., 2013). Усиление активности XBP1s может быть защитной реакцией в остеоартритном хряще, как показало недавнее исследование по блокированию XBP1s в эксплантах суставного хряща от пациентов с остеоартритическим хрящом, оно усиливает деградацию матрикса и апоптоз (Guo et al., 2013).

Взаимодействие между хондродисплазией, ER стрессом и остеоартритом , скорее всего, связано с реакцией хондроцитов на механические силы, переносимые суставами . Напр., циклические механические нагрузки активируют чувствительность к ER стрессу eIF2α и PERK, и вызывают арест трансляции в эксплантах суставного хряща in vitro (Lomas et al., 2011). Более того, сжимающие нагрузки на хрящ нижней челюсти у модельных животных индуцирует маркеры ER стресса/UPR, включая BiP, CHOP, PDI, и активирует eIF2α, и ингибирует пролиферацию хондроцитов, в то же время способствуя апоптозу (Li et al., 2013). Интересно, что механическая нагрузка в этой модели вызывает в хондроцитах растягивание ER, согласующееся с индукцией классической реакции на неправильно упакованный белок. Нагрузка вызывает также истончение нижнечелюстного хряща, этому препятствует воздействие in vivo у животных salubrinal, селективного ингибитора ER стресса (Li et al., 2013). Недавнее исследование также показало, что нагрузка на сустав посредством упражнений усиливает воспалительную реакцию суставных хондроцитов у мышей, моделирующих PSACH, несущих болезнь-вызывающую мутацию D469del-COMP, у которых возникаю остеоартриты с ранним началом (Posey et al., 2013).

Помимо сильных клеточных эффектов ER стресса на гомеостаз суставных хондроцитов, может также участвовать механизм ускоренного развития остеоартрита у пациентов с хондродисплазией, при этом используется нарушение структуры матрикса суставного хряща, это, скорее всего, снижает способность суставного хряща противостоять механическим нагрузкам и сжимающим силам. Напр., трансфекция хондроцитов доминантно-негативной конструкцией Matrilin, которая приводит к истощению Matrilin из околоклеточного матрикса, также устраняет обычную пролиферативную реакцию и дифференцировку хондроцитов в ответ на экспериментальные механические нагрузки (Kanbe et al., 2007). Развитие остеоартрита как результата мутаций ECM белков часто ассоциирует с частичной или полной секрецией мутантного белка, который преимущественно нарушает матричную организацию суставного хряща и вызывает предрасположенность к изнашиванию суставов. Напр., продукт мутации Matrilin-3, который вызывает остеоартриты рук пациентов, но не хондродисплазию, не сохраняется в ER, а скорее секретируется из клетки и инкорпорируется в околоклеточный матрикс, подтверждая, что развитие остеоартрита у этих пациентов может быть связано с нарушениями матрикса суставного хряща (Otten et al., 2005, 2010). Сходным образом, мутантный COMP преимущественно секретируется, чем сохраняется, как было установлено, вызывает остеоартриты у модельных мышей (Pirog-Garcia et al., 2007). Более того, у пациентов с семейным остеоартритом, вызываемым с помощью мутации R519C в тройном спиральном домене типа II коллагена, приблизительно четверть типа II коллагеновых цепочек присутствует в матриксе суставного хряща, содержащего мутацию, подтверждая его секрецию и инкорпорацию в матрикс суставного хряща (Eyre et al., 1991). В соответствии с этим трансгенная модель с мутацией R519C типа II коллагена также вызывает генерализованный преждевременный остеоартрит и лишь слабую хондродисплазию (Sahlman et al., 2004). Состав и ультраструктура суставного хряща модельных мышей sedc и Dmm также нарушены в результате мутации типа II коллагена, скорее всего, ускоряет деградацию суставного хряща и приводит к остеоартриту с ранним началом, наблюаемому у этих моделей (Bomsta et al., 2006; Macdonald et al., 2013; Ricks et al., 2013).

Therapeutic Approaches

Поскольку хондродисплазии находятся в группе наиболее распространнеых скелетных дисплазий (Warman et al., 2011), а средства лечения детей чрезвычайно ограничены и связаны со спорными хирургическими вмешательствами, такими как удлинение конечностей (Correll, 1991; Kanazawa et al.,2003; Lie and Chow, 2009), разработка фармакологических вмешательств при хондродисплазиях, связанных с ER стрессами, считается клинической потребностью. Кроме того, выявление связи между ER стрессом и активацией UPR при остеоартритах (Nugent et al., 2009; Takada et al., 2011; Guo et al., 2013) подчеркивает важность понимания ER стрессовых механизмов в нормальном и больном хряще и расширяет потенциальное приложение терапии, базирующейся на ER стрессе на более чем 27 миллионов индивидов, затронутых остеоартритами во всем мире.

Большое колиество человеческих нарушений характеризуется накоплением неправильно упакованных белков и активацией путей ER стресса/UPR, включая болезни Алцгеймера, Паркинсона и Гентингтона; дегенерации сетчатки; типа II диабета; нервных повреждений посредством инсультов и ишемии головного мозга; кистозного фиброза; и сердечно-сосудистых, желудочно-кишечных и воспалительных заболеваний (Groenendyk et al., 2010; Hasnain et al.,2012; Papa, 2012; Ribeiro and O'Neal, 2012; Cao and Kaufman, 2013; Cornejo and Hetz, 2013; Gorbatyuk and Gorbatyuk, 2013a; Iwawaki and Oikawa, 2013; Kaser et al., 2013; Osorio et al., 2013). Соотв., воздействие на ER стрессы и UPR является многообещающим путем для разработки терапии и исследований, подтверждающих ингибирование ER стрессовых реакций, стимулирование шаперонами обеспечиваемой укладки белка и/или улучшение деградации неправильно упакованных белков, всё это обещает скорректировать фенотип болезни (Rochet, 2007; Kim et al., 2008). Блокирование пути ER сресса может возможно использовать небольшие молекулы ингибиторов eIF2α (Joshi et al., 2013), PERK (Moreno et al., 2013) или IREI (Tomasio et al., 2013). Стимулирование активности шаперонов посредством активации эндогенного BiP с помощью фармакологического воздействия с помощью BiPX (BiP protein inducer), экспрессии с помощью аденовирусного вектора BiP или воздействия химического шаперона 4-phenyl-butyrate (PBA) также может оказаться полезным для клиники (Rochet, 2007; Gorbatyuk and Gorbatyuk, 2013b). Усиление активности PDI, как полагают, является потенциально пригодным для коррекции агрегатов неправильно упакованных белков из-за образования несоответствующих дисульфидных мостиков (Apostolou et al., 2008; Yu et al., 2010; Galligan and Petersen, 2012). Подходы к восстановлению нормального гомеостаза могут также включать усиление реакции деградации белка, особенно аутофагии (Rubinsztein et al., 2012; Suh et al., 2012; Bachar-Wikstrom et al., 2013). Супрессия апоптоза также может быть пригодной терапевтической стратегией; в этой связи, недавнее исследование показало, что избыточная экспрессия XBP1s в хрящевых эксплантах от пациентов с остеоартритом блокирует цитокинами обусловленную клеточную гибель хондроцитов (Guo et al., 2013).

Недавно исследования тестировали потенциальную эффективность стимуляции малыми молекулами адаптивных ER стрессовых реакций у животных моделей хондродисплазии, вызываемой мутациями белка ECM (Nundlall et al., 2010; Posey et al., 2013). В одном исследовании (Nundlall et al., 2010), трансгенные мыши, обладающие болезнь-вызывающей мутацией в Matrilin-3, и дающие модель MED (Leighton et al., 2007), находились на диете, содержащей химический шаперон sodium butyrate (Nundlall et al., 2010). После 3 недель уровни белков маркеров UPR BiP, Grp94 и ERp72 (PDI4) снижались в хряще леченных мышей, хотя уровни мРНК UPR маркеров оставались неизменными. Имеется также тенденция к уменьшению апоптоза и усилению пролиферации в ростовой пластинке. Однако внутриклеточное распределение Matrilin-3 не менялось после воздействия и при проверке в возрасте 9 недель, фенотип мышей в терминах веса тела и длины костей не улучшался (Nundlall et al., 2010). Сходное воздействие на модельных мышей MCDS также не улучшало проявления хондродисплазии (Nundlall et al., 2010). В др. исследовании (Posey et al., 2013), трансгенные мыши, обладающие мутациями D469del COMP (модель PSACH) (Posey et al., 2009, 2012), подвергались воздействию леекарст, снижающих ER-стресс, lithium, valproate или phenylbutyric acid (PBA), применяемых в 28-дн. промежуток, считающийся наиболее эффективным для снижения признаков болезни (Posey et al., 2013). Однако, хотя лекарства снижали удержание мутантного белка и уменьшали апоптоз в ростовой пластинке, жизнеспособность и/или фенотипические условия животных ухудшались, подтверждая эффекты лекарственного лечения, не попадающего по цели (Posey et al., 2013). Несмотря на то, что ER стрессовые реакции в хондроцитах in vivo могут быть модулированы с помощью небольших молекул, агенты подтверждают, что данное дополнительное механистическое исследование, сможет однажды сгенерировать "designer drugs" для лечения хондродисплазии, которое нацелено на механизмы, минимизирующие нежелательные побочные эффекты. В самом деле имеется прецедент по коррекции хондродисплазии с использованием терапии малыми молекулами мышиной модели Achondroplasia (Lorget et al., 2012). Как результат этого успеха, идут клинические испытания лечения малыми молекулами пациентов с Achondroplasia и появилась надежда на сходное получение в будущем лекарства для лечения для др. хондродисплазий.

Возможно, что путем определения механистических различий или общности между хондродисплазиями, вызываемыми мутациями в разных молекулах ECM, могут быть определены болезнь-специфичные терапевтические подходы. Напр., т.к. образование дисульфидными мостиками связанных ER белковых агрегатов участвует в этиологии MCDS, MED и SEDC (Wilson et al., 2005; Chung et al., 2009; Hartley et al., 2013), поэтому терапевтические подходы к этим нарушениям смогут предупреждать неестественное связывание дисульфидными мостиками matrilin-3, типа X или типа II коллагены посредством малых молекул ингибиторов PDI (Blais et al., 2010; Yu et al., 2012). Однако парадоксально усиление активности PDI также было подтвеждено как потенциальный терапевтический подход для хондродисплазии (Apostolou et al., 2008; Yu et al.,2010; Galligan and Petersen, 2012). Напротив, было подтверждено, что взаимодействия COMP могут не использовать связывание дисульфидными мостиками, что делает этот механизм менее значимым для лечения PSACH (Hartley et al., 2013). Химическое усиление термостабильности мутантного типа II коллагена ускоряет in vitro секрецию и улучает жизнеспособность клеток (Gawron et al., 2010), подтверждая потенциальную пригодность этого подхода для лечения SEDC. Экспериментальная индукция способствующих выживанию ER стрессовых реакций, таких как аутофагия, может быть более универсальным подходом для лечения клеточных стрессов в хряще. Исследования на мышей, моделирующих остеоартриты подтвердило возможную пользу rapamycin, клинического иммунодепрессанта и мощного индуктора аутофагии (Hale et al., 2013) для уменьшения признаков остеоартрита, обусловленного клеточным стрессом суставного хряща (Carames et al., 2012). пригодность rapamycin для лечения хондродисплазии осложнена его антипролиферативными и антиангиогенными эффектами на ростовую пластинку, которые нарушают продольный рост кости (Alvarez-Garcia et al., 2007); однако, эти эффекты могут быть уменьшены одновременным лечением ростовым гормоном (Alvarez-Garcia et al., 2012). Генерализованные блокаторы ER пути, такие как salubrinal, ингибитор активности eIF2α, может также иметь потенциал использования для лечения хондродисплазии, т.к. salubrinal, как было установлено, снижает связанное с ER стрессом фосфорилирование eIF2α и экспрессию ATF4 в хондроцитах человека in vitro (Hamamura et al., 2013). Интересно, что недавнее исследование выявило неожиданную роль воспаления в этиологии связанных с ER-стрессом хондродисплазий (Posey et al., 2013). Маркеры воспаления повышены в ростовой пластинке и суставных хондроцитах мышиной PSACH модели D469del (Posey et al., 2013), и с потерей CHOP, который восстанавливает секрецию мутантного COMP в этой модели (Posey et al.,2012), а также снижается экспрессия связанных с воспалением маркеров (Posey et al., 2013). Это новое наблюдение подтверждает, что дальнейшие исследования воспалительной реакции при др., связанных с ER-стрессах родственных хондродисплазиях может быть информативным и более того модулирование воспаления может открыть новый подход к лечению с ER-стрессом ассоциированных хондродисплазий.

Future Directions

It is evident that there the etiology of is chondrodysplasia phenotypes caused by ECM mutations is complex, and that there may be heterogeneity regarding association of ER stress and UPR activation in these disorders. Factors influencing whether or not ER stress and UPR responses are induced in the diseased chondrocytes may relate to the nature of the mutant molecule itself, as well as to the specific biochemical effect of the disease-causing mutation on protein biochemistry including thermostability, folding, or disulfide bonding. These biochemical changes affect the degree to which the mutant protein is retained intracellularly, potentiating ER stress responses that lead to changes in chondrocyte proliferation, differentiation or survival and alter the rate or process of chondrocyte maturation necessary for proper long bone growth. At the same time, failure of the mutant protein to be secreted into the matrix leads quantitative and/or qualitative changes in the composition of the cartilage matrix which affect chondrocyte behavior independent of ER stress responses. That chondrocytes may be particularly sensitive to induction of ER stress (Price et al., 2010) emphasizes the need to understand ER stress and UPR pathway signaling in chondrocytes during development, homeostasis, and disease to identify ways to manipulate these responses towards novel therapeutic approaches.

A factor that has hampered development of treatments for chondrodysplasia is the general unavailability of patient cartilage cells in which to study disease mechanisms, and test potential therapeutics. As discussed here, many models of chondrodysplasias caused by mutations in ECM molecules such as MCDS, MED, PSACH, and SEDC have been proposed, including mouse models with transgenic or spontaneous genetic mutation, and various types of cells transfected in vitro with mutant ECM protein constructs. These models have provided valuable and important insights into disease mechanisms, and as discussed above, have led to novel avenues for future pursuit in terms of therapies. However, disadvantages of these models exist, including in some cases, inability to recapitulate the appropriate 1:1 ratio of normal vs. mutant alleles, and/or inability to provide the appropriate cell type- or species-specific intracellular milieu in which the disease is manifest (Posey et al., 2008). Accordingly, to develop targeted therapies, potentially based on specific mechanisms unique to each disease, or optimally even to each person, an understanding of the precise effects of a given specific genetic mutation in chondrocytes from individual patients will likely be needed.

In this regard, the utility of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) for modeling human disease is attracting considerable attention (Laustriat et al., 2010; Egashira et al., 2013). In addition to providing mechanistic insights, iPSC-based models may offer a means to rapidly screen the efficacy of potential therapeutics, facilitating development of novel treatments (Csete, 2010; Kiskinis and Eggan, 2010; Laustriat et al., 2010; Yi et al., 2012; Xu and Zhong, 2013). iPSC-based models have been established for Parkinson's, Alzheimer's, and Huntington's disease; Prader-Willi and Angelman syndromes; muscular dystrophy; Down syndrome; diabetes, and others (Nsair and MacLellan, 2011; Yagi et al., 2011; Mou et al., 2012; Hua et al., 2013; Kaye and Finkbeiner, 2013; O'Neill and Ricardo, 2013; Sanchez-Danes et al., 2013; Xu and Zhong, 2013; Luo et al., 2014). Notably, iPSC models have recently been developed for the human genetic skeletal dysplasias craniometaphyseal dysplasia and osteogenesis imperfecta (Deyle et al., 2012; Chen et al., 2013), as well as for a form of metatropic dysplasia caused by mutation in the calcium channel gene TRPV4 (Saitta et al., 2014).

As iPSCs are generated from readily available patient sources such as skin (Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007), peripheral blood (Okita et al., 2013), or even urine (Zhou et al., 2012), they offer a new cell source for modeling human chondrodysplasias that avoids the need for rarely obtainable patient cartilage tissue. Exploiting the power of iPSC for modeling chondrodysplasia will require efficient methods to direct the differentiation of the cells into the chondrogenic lineage. In this regard, in vitro methods have been developed for generating chondrocytes from human pluripotent stem cells (hESC and iPSC) which use chondrogenic differentiation in micromass culture (Gong et al., 2010; Ferrari et al., 2011; Diekman et al., 2012; Sternberg et al., 2012; Guzzo et al., 2013), a system which recapitulates signals and conditions used by the embryo to induce chondrogenic differentiation (Gay and Kosher, 1984; Daniels et al., 1996). Micromass culture methods that achieve direct differentiation of pluripotent cells without use of an embryoid-body intermediate (which can introduce contaminating nonchondrogenic cells) (Gong et al., 2010; Ferrari et al., 2011), may offer particular promise. The existence of established methods for directing pluripotent cells into chondrocytes, combined with the well-established utility of in vitro chondrocyte culture for studying chondrodysplasia disease mechanisms, suggests iPSC-based chondrocyte culture systems will be important new models for chondrodysplasia study. Potentially, the utility of an in vitro iPSC model could even be extended by means of an in vivo implantation system to enable modeling of at least some aspects of the temporal and spatial relationships that occur within the growth plate (Scotti et al., 2010, 2013). Importantly, an in vitro iPSC-based system could also offer a means for screening and identifying individualized therapeutics for patients with chondrodyplasias. In this regard, a high-throughput chondrogenic screening platform has recently been developed using human iPSCs (Yang et al., 2010, 2012).

Recently, in vitro chondrogenic differentiation by iPSCs derived from patients with a form of skeletal dysplasia caused by mutation in the calcium channel gene TRPV4 has recently been studied using a micromass culture system (Saitta et al., 2014). In comparison to normal iPSC lines, iPSCs derived from patient fibroblasts displayed signs of impaired and/or abnormal chondrogenic differentiation and also displayed abnormal growth factor signaling responses (Saitta et al., 2014). Importantly, the mutant iPSCs recapitulated an abnormal cartilage matrix staining pattern which was also observed in intact cartilage taken from the donor patient (Saitta et al., 2014). This study emphasizes the exciting potential utility of iPSC-based systems in providing new in vitro models for understanding skeletal dysplasia phenotypes, including chondrodysplasias.

Differences in genetic backgrounds; epigenetic modifications related to the donor tissue; and potential variability in lineage differentiation capacity among iPSC lines can confound comparisons made between disease-specific iPSCs obtained from patients with genetic disorders and "normal" iPSC lines from unmatched, presumed healthy individuals (Laustriat et al., 2010; Egashira et al., 2013). This disadvantage may soon be overcome using new technologies in genome editing in pluripotent cells which have recently become available, and which enable production of isogenic or heterogenic cell lines that provide optimal comparators to patient-specific disease iPSCs (Hockemeyer et al., 2011; Ding et al., 2013; MaLi et al., 2013). Through these gene editing approaches, it will be possible to develop new iPSC-based disease models to enable precise assignment of specific phenotypic effects to specific genetic change. For example, an iPSC-based chondrodysplasia model using iPSC-derived chondrocytes from chondrodysplasia patients and compared with genome edited isogenic or heterogenic pluripotent cell lines would enable direct assessment of the consequences of specific genetic change on chondrocyte differentiation and/or physiology; irrespective of differences in genetic background likely responsible for the wide phenotypic variations seen in many chondrodysplasias, which would facilitate identification of disease-specific and/or patient-specific mechanisms for translation into potential therapies.

Mechanisms and models of endoplasmic reticulum stress in chondrodysplasia Sara E. Patterson and Caroline N. Dealy Developmental Dynamics Volume 243, Issue 7, pages 875-893, July 2014

Mechanisms and models of endoplasmic reticulum stress in chondrodysplasia
Sara E. Patterson and Caroline N. Dealy
Developmental Dynamics Volume 243, Issue 7, pages 875-893, July 2014