Головной мозг позвоночных образуется вокруг полости, заполненной жидкостью, наз. спинно-мозговой жидкостью (CSF), которая подвергается динамическим морфологическим изменениям во время развития. Стенка нервной трубки состоит из псевдостратифицированнного эпителия, представленного удлиненными клетками предшественниками, наз. radial glial cells (RGCs), которые постоянно генерируют прямо или косвенно все нейроны и все глиальные клетки. Система желудочков головном мозге играет критичпские роли в развитии, функционировании и гомеостазе головного мозга и приводит к тяжелым нейрологическим нарушениям в случае дефектов (Lehtinen and Walsh, 2011; Lowery and Sive, 2009). Расшифровка механизмов, которые регулируют морфогенез желудочков головного мозга важен для понимания гистогенеза неокортекса и идентификации новых терапевтических мишеней для этих распространенных патологий.

Кора головного мозга происходит из дорсальной части телэнцефалона и состоит из 6 слоёв, каждый представлен отличающимися классами нейронов. Кортикальные нейроны и глия формируются благодаря асимметичным делениям RGCs, которые являются биполярными клетками, которые перемещаются вглубь эпителия, при этом базальный домен на поверхности мягкой мозговой оболочки и контакт на апикальной поверхности с ресничками. Первичная ресничка это базируюшееся на микротрубочках выпячивание мембраны клетки, аксонема которой нуклеирована с помощью базального тельца, модифицированно материнской центриоли. Её динамика интимно связана с ходом клеточного цикла; она растет во время фазы G1 и резорбируется перед митозом (Nigg and Stearns, 2011). Первичная ресничка является важной сиогнальной огрганеллой на всех стадиях развития и, как было установлено, является критической для морфогенетических процессов, таких как формировани паттерна головного мозга и тканевой гомеостаз (Eggenschwiler and Anderson, 2007; Willaredt et al., 2008). Первичная ресничка воспринимает химические вещества и определяет разнообразные сигнальные молекулы, которые важны для развития (напр.. Shh, Wnt, Pdgf) (Guemez-Gamboa et al., 2014). В почках они действуют также как механосенсоры, которые определяют сдирающий (shear) стресс, приводя к подавлению mTOR пути, необходимого для контроля за собственно размером клеток (Boehlke et al., 2010;Orhon et al., 2016). Спинно-мозговая жидкость, секретируемая хороидным сплетением, предоставляет диффузные сигналы, существенные для раннего развития RGC (Lehtinen et al., 2011; Chau et al., 2015;Higginbotham et al., 2013). Апикальное расположение первичной реснички является оптимальным для детекции химических и механо-сенсорных сигналов от CSF, и тем самым участвует в морфогенезе головного мозга путем регуляции физиологии RGC (Lehtinen and Walsh, 2011).

Цилиопатии - это группа генетических болезней с нарушением функции ресничек. Распространенной патологией у пациентов с цилиопатией являются нейрокогниптивные нарушения, эпилепсия и гидроцефалия. Гидроцефалия это сложное мултифакториальное нарушение головного мозга, приводящее к снижению толщины коры и к увеличению полостей желудочков из-за накопления CSF в желудочках на постнатальных стадиях. Это один из наиболее распространенных дефектов головного мозга (Zhang et al., 2006) и оно коррелирует с широким кругом нейроонтогнетических нарушений, включая шизофрению (Shenton et al., 2001). Аномальное увеличение размера желудочков головного мозга развивается на ранних постнатальных стадиях в результате дефекта эпендимных ресничек (Ibanez-Tallon et al., 2003) or the choroid plexus (Banizs et al., 2005; Del Bigio, 2010). Было также показано, что постнатальная гидроцефалия может возникать в результате повышенного апоптоза и нарушения пролиферации лишенных ресничек NG2+ и PDGFR-α+ нейральных предшественников (Carter et al., 2012). В данном исследовании ventriculomegaly и hydrocephalus определяли, когда увеличение желудочков головного мозга происходило на эмбриональной или постнатальной стадиях, соотв. Кстати механизм ventriculomegaly остается рнеизвестным.

Используя кондиционных мышиных мутантов, было показано, что истощение первичных ресничек на RGCs, начиная со ст. E10.5, приводит к прогрессивному увеличению боковых желудочков (ventriculomegaly) , не затрагивая формирование паттерна головного мозга. Этот фенотип ассоциирует с прогрессивным увеличением области поверхности RGC апикального endfeet, вызванное аномальным усиление активности пути mTORC1. Кроме того, мы показали. что истощение ресничек приводит к неправильной ориентациии митотического веретена в RGC, это ассоциировало с увеличением числа базальных предшественников в соматосенсорной коре. Размер апикального endfeet, повышение количества базальных предшественников и увеличение желудочков, всё это устранялось воздействием rapamycin. Эти результаты указывают на то, что путь mTORC1, контролируемый первичными ресничками, регулирует морфогенез желудочков и кортикогенез и тем самым представляет собой новую потенциальную мишень для лечения гидроцефалии. DISCUSSION В даннном исследовании мы генетически устраняли первичныереснички из RGCs, используя Ift88 или Kif3a кондиционных мутантных мышей и наблюдали прогрессивное увеличение размера их вентроикулярных апикальых доменов посредством усилени активности пути mTORC1. эти дефекты были ассоциированы со сходными пертурбациями ориентации их митотического веретена, избыточной продукцией базальных митотических предшественников на ст. E14.5, снижением количества кортикальных нейронов на бьолее поздних стадиях и прогрессивным увеличением боковых желудочков (ventriculomegaly). Интересно, что все эти дефекты приписываются аномальну увеличению активности пути mTORC1, т.к. они устранялись после одной или нескольких инъекций mTORC1 ингибитора rapamycin. Хотя это исследование впервые показало, что первичные ресничики в RGCs регулируют морфогенез желудочков путем контроля размера их вентрикулярных контактов, действуя как тормоз на путь передачи сигналов mTORC1.

Здесь мы использовали кондиционные нокаутные гены ресничек (Ift88 and Kif3a) у Nestin-Cre мышей, чтобы лишить RGCs их первичных ресничек, устраняя их роль в формировании паттерна головного мозга и полярности нейроэпителиальных клеток (Benadiba et al., 2012; Besse et al., 2011; Higginbotham et al., 2013; Willaredt et al., 2008; Wilson et al., 2011). Хотя экспрессия Nestin-Cre начинается приблизительно на ст. E10.5 в переднем мозге, устранение ресничек в VZ завершается только на ст. E14.5, как было показано ранее (Liang et al., 2012; Fig. S1A-E). Фенотипы, наблюдаемые на ст. E12.5, могут быть частично обусловлены неэффективностью рекомбинации до ст. E12.5. Более того, Nestin широко экспрессируется на более поздних ст. развития, подтверждая, что некоторые фенотипы, наблюдаемые у ресничатых мутантов , по крайней мере, частично обусловлены клеточно не автономными эффектами.

Во время их развития из RGCs (Spassky et al., 2005), усножаемые эпендимные клетки увеличивают свой апикальный домен (Mirzadeh et al., 2010). Т.о., возможно, что увеличение у цилиарных мутантов в крупные апкальные домены на данной ст. развития соответствует преждевременной эпендимной дифференцировке. Однако, количества вентрикулярных CD24+/centrin-2 (Cetn2)-GFP+ клеток на ст. E18.5 было одинаковым с контролем и цилиарные мутанты, исключают эту гипотезу (Fig. S4D). Др. возможность заключается в том, что устранение ресничек ведет к дефектам цитоскелета и слипчивых соединений, приводя в результате к увеличению расслоения вентрикулярных клеток и доступности пространства на вентрикулярной поверхности и в конечном итоге к увеличению апикального домена. Однако, не выявлено дефектов ни слипчивых соединений, ни актинового цитоскелета при иммуноокрашивании кортикальной вентрикулярной поверхности во время кортикогенеза у мутантных RGC (Fig. S4C). Хотя эти наблюдения подтверждают, что увеличение объема желудочков обусловлено увеличением апикальных доменов RGC перед их дифференцировкой в эпендимные клетки, исключается вклад дисфункции эпендимных клеток во время эмбриогенеза. Пренатальное увеличение желудочков, описанное здесь предшествует и может вносить вклад в инициацию гидроцефалии, наблюдаемую на постнатальных стадиях (this study and Tong et al., 2014). Постнатальная гидроцефалия может таким образом вызываться разными факторами, включая дефекты морфогенеза желудочков (this study), нарушения тока спинно-мозговой жидкости (СSF), обусловленное нарушениями функции эпендимных клеток, избыточную продукцию CSF хороидным сплетением (Del Bigio, 2010) или комбинацию этих факторов.

У контрольных эмьрионов апикальные домены RGC чрезвычайно разнообраны в размерах на данной ст. развития. Размеры увеличиваются в ходе развития, приводя к существенному разнообразию размеров на поздних стадиях (Nishizawa et al., 2007; this study). Увеличение наблюдается также у цилиарных мутантов и оно более значительное, чем у контрольных эмбрионов. Дальнйшие исследования д. определить эффекты морфологии апикальных доменов, способа деления и долговременного потенциала на механические ограничения, осуществляемые с помощью RGCs на морфогенез желудочков головного мозга. Мы показали, что увеличение апикального домена в RGC обусловленно чувствительным к rapamycin контролем локального роста клеток с помощью первичных ресничек. Передача сигналов mTORC1, мишеней, концентрирующиеся в апикальном домене RGCs, как известно, контролирует рост клеток путем усиления белкового синтеза (Fig. 4A). Возникает вопрос, действительно ли локальный белковый синтез участвует в апикальном увеличени клеток. Хотя размер апикальных доменов RGC не был изучен, микроцефалия и увеличение желудочков были описаны у мышиных мутантов, у которых активность пути mTOR была соотв. дефектна или аномально повышена (Cloetta et al., 2013; Way et al., 2009; Magri et al., 2011). Механосенсорные белки polycystic kidney disease 1 (Pkd1) и Pkd2 экспрессируются в первичных ресничках RGCs, а их устанение приводит к постнатальной гидроцефалии и дефектам планарной клеточной полярности в вентрикулярном эпителии мышей (Wodarczyk et al., 2009; Ohata et al., 2015). Более того, было установлено, что Pkd1 может ингибировать путь mTOR и регулировать размер клеток в почках (Distefano et al., 2009). Поэтому мы тестировали, вносит ли вклад Pkd1 в контроль пути mTOR и размер клеток в RGCs путем измерения размера апикальных доменов у Nestin-Cre кондиционных нокаутов floxed Pkd1. Однако, не выявлены различия в поверхностной области апикальных доменов RGC на ст. E14.5 (Fig. S6), указывая, что первичные реснички не регулируют размер RGCs посредством механосенсорного белка Pkd1 пути mTOR. Интересно, что недавно установлено, что зависимая от первичных ресничек аутофагия регулирует размер почечных эпителиальных клеток посредством пути передачи сигналов LKB1-AMPK-mTOR в ответ на ток жидкости (Orhon et al., 2016). Скоординированы ли путь mTOR и путь механических стрессов в контроле размера RGC в первичном зависимым от первичных ресничек пути аутофагии, является привлекательной гипотезой, которая нуждается в изучении. Дальнейшие исследования необходимы, чтобы идентифицировать вышестояшие сингналы пути mTOR в этих клетках. Всё же наши результаты проливают свет на новую роль первичных ресничек в локальном контроле клеточного роста и морфогенезе желудочков во время развития головного мозга.