Посещений:
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ БОЛЕЗНИ



Сложности выявления, лечения

The complexity of epigenetic diseases
Ailbhe Jane Brazel, Douglas Vernimmen
The Journal of Pathology. Volume 238, Issue 2 January 2016 Pages 333–344 Pages 370–377

Over the past 30 years, a plethora of pathogenic mutations affecting enhancer regions and epigenetic regulators have been identified. Coupled with more recent genome-wide association studies (GWAS) and epigenome-wide association studies (EWAS) implicating major roles for regulatory mutations in disease, it is clear that epigenetic mechanisms represent important biomarkers for disease development and perhaps even therapeutic targets. Here, we discuss the diversity of disease-causing mutations in enhancers and epigenetic regulators, with a particular focus on cancer
Крупный ученый Conrad H Waddington (1905-1975) впервые предложил термин 'epigenetics' для описания наследственных изменений в экспрессии генов, не вызываемые изменениями в последовательности ДНК [1]. Сегодня известно, что ДНК собрана в хромосомы в ядре каждой клетки и что упаковывающие белки, наз. гистонами, ассоциируют с ДНК , чтобы сформировать хроматин. Нуклеосомы являются основными единицами хроматина и образуются с помощью октамеров из гистонов (две копии тетрамера; H2A, H2B, H3 иH4). Если ДНК хорошо упакована в этих нуклеосомах (конденсированный хроматин), то гены д. быть выключены, тогда как если ДНК непокрыта, как в деконденсированном хроматине, то она более доступна для транскрипционных факторов (TFs), гены легче включаются. Уровень компактизации этих нуклеосом испытывает влияние со стороны химических меток (tags) или 'эпигенетических модификаций', которые ассоциируют с гистонами или непосредственно с ДНК. В то время как каждый организм имеет свою собственную уникальную последовательность, каждый тип клеток на каждой стадии развития имеет отличающийся профиль эпигенетических модификаций. Как таковые, клеточная детерминация или дифференцировка являются по определению эпигенетическим феноменом [2]. Присутствие этих эпигенетических модификаций может быть ассоциировано с внешними воздействиями (напр., диета, стрессы, курение и т.д.).
Генетические болезни вызываются разнообразными мутациями, затрагивающими гены или регуляторные регионы (промоторы, энхансеры и т.д.), контролирующие экспрессию этих генов, а также повреждения хромосом, такие как транслокации или анеуплоидия. Энхансеры являются регуляторными регионами, усиливающими скорость или вероятность транскрипции генов мишеней. Энхансер может быть расположен в отдалении, выше или ниже гена, который он регулирует, или может располагаться в интроне этого гена мишени [3, 4]. Мутации энхансерных последовательностей и белковые факторы, регулирующие функцию энхансера, вносят вклад во всё увеличивающий класс 'enhanceropathies' [5]. α- и β-талассемия - это ключевой пример моногенной болезни, которая может быть вызвана делецией удаленного энхансера у некоторых пациентов [6].
Эпигенетические альтерации, включая метилирование ДНК и пост-трансляционные модификации гистонов катализируются семейством эпигенетических регуляторов, таких как ДНК и гистоновые метилтрансферазы. Идентифицировано только 5 модификаций ДНК у эукариот, тогда как описано приблизительно 130 специфических модификаций гистонов, сгруппированных в 16 классов [7-9]. Эти модификации гистонов используют множество разных аминокислот в каждом гистоновом белке и выполняют специфические функции [7, 8]. Эпигенетические модификации м. генерироваться с помощью 'записывающих' энзимов и удаляться с помощью 'стирающих' энзимов. Специализированные 'записывающие' белки содержат уникальные домены, которые специфически распознают эти модификации и используют их затем в качестве мест присоединения [10]. Некоторые эпигенетические регуляторы необходимы для регуляции транскрипции, репарации ДНК, клеточного цикла и дифференцировки - поэтому они выполняют важную роль во многих раковых опухолях.
Мультигенные заболевания (напр., рак) возникают в результате накопления мутаций в генах, таких онкогены (мутации избыточности функции) и/или генах супрессоров опухолей (мутации потери функции). Это вызывает потерю координации между пролиферацией и дифференцировкой клеток предшественников. Болезни в результате мутаций эпигенетических регуляторов были недавно описаны при разнообразных солидных опухолях и злокачественных болезнях крови [8].
Мы обсудим сложность патогенных мутаций и полиморфизмов одиночных нуклеотидов (SNPs), затрагивающих активность энхансеров, роль мутаций эпигенетических регуляторов при болезнях и взаимодействий этих генетических мутаций с чисто эпигенетическими мутациями.

The molecular basis of aberrant gene expression


Эффекты мутаций потери и избыточности функции могут быть количественными и качественными (Figure 1). Природа мутации, вызывающей болезнь, существенно влияет на тип теста, необходимого для диагностики и терапевтического вмешательства. Количественные изменения непосредственно вызывают увеличение или уменьшение финального продукта гена. Количественные изменения экспрессии обнаруживаются относительно легко с помощью классических низко-затратных технологий, таких как immunohistochemistry (IHC), fluorescence in situ hybridization (FISH), colorimetric in situ hybridization (CISH) и real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) [11]. Качественные изменения могут изменять функцию мутантного гена. Их обнаружение может потребность более сложное и дорого стоящее секвенирование, такое как целенаправленное секвенирование экзома или целого генома (которые сегодня можно осуществлять на уровне одиночной клетки) [12-14]. Однако, когда качественные мутации возникают в главном регуляторе, то это часто влияет на уровни транскрипции нижестоящих генов мишеней, которые могут быть измерены количественными методами. Напр., при acute lymphoblastic leukaemia (ALL) пациенты с MLL перестройками (discussed below) имеют характерный профиль экспрессии генов, который отличает их от др. ALL пациентов и от пациентов с acute myeloid leukaemia (AML) [15].

Figure 1. Molecular basis of genetic diseases. Effects of loss- and gain-of-function mutations affecting gene expression are quantitative and/or qualitative. (A) A missense mutation or a small insertion/deletion mutation (frameshift) in a coding sequence or at a PolyA signal often leads to abortive translation or RNA decay [162]. (B) Reduction of chromosomal looping between the enhancer and the promoter might be due to (1) natural variant or mutation at the enhancer [163], (2) the presence of a new SNP forming a new enhancer/promoter region which titrates the remote enhancer activity [43], or (3) promoter or enhancer hypermethylation [164]. (C) Deletion of the gene [165]. (D) Deletion of the remote enhancer [166]. (E) Deletion of the PolyA signal of a downstream and convergent gene, leading to the production of antisense RNA [167]. (F) Nonsense mutation adding a new premature stop codon producing a truncated protein [168]. Note that truncated proteins may also have a gain-of-function activity [169]. (G) Missense mutation affecting the non-enzymatic activity or abolishing the catalytic domain of an enzyme [104]. (H) Normal rate of transcription, but increased accumulation of final gene product due to the presence of an RNA [170] or a protein [171] stabilizing molecule. (I) Increased enhancer activity due to (1) enhancer mutation [25], (2) overexpression of a transcription factor [172], or (3) promoter hypomethylation [173]. (J) An increase in gene copy number, including regulatory regions [174]. (K) Large genomic deletion bringing a strong (but irrelevant) enhancer closer [175]. (L) Translocation with a heterologous chromosome (red) creating a fusion locus with a new strong enhancer regulating an illegitimate gene [176]. (M) Translocation with a heterologous chromosome (red) producing a fusion gene, with increased biological activity [96]. (N) Missense mutation improving enzymatic activity [81]. E, enhancer; P, promoter; C, coding region; TF, transcription factor; CD, catalytic domain; MS, missense mutation; NS, nonsense mutation; FS, frameshift mutation. Dashed curved arrows represent impaired enhancer-promoter interaction (looping); thin curved arrows, normal looping; and thick curved arrows, strong looping. Wavy red lines indicate mRNA.

Transcriptional enhancers and diseases


Loss-of-function enhancer mutations


30 лет назад были идентифицированы функциональные удаленные регуляторные элементы у пациентов с α- и β-талассемией (rev. 6). В большинстве случаев делеция, удаляющая ген глобина, вызывала подавление его функции (Figure 1C). Однако, в редких случаях гены (включая их промоторы) оставались неизменными, но делеция одного (или нескольких) удаленных энхансеров (s) вызывала его подавление (Figure 1D). Имеется множество др. примеров, когда делеции в энхансерах вызывали патологии. Делеции в энхансерах FOXL2 [16], POU3F4 [17], SOST [18, 19] и SOX10 [20, 21] оказались связанными с синдромом блефарофимоза, X-сцепленной глухотой типа 3, болезнью van Buchem и синдромом Waardenburg типа 4, соотв.
Делеции являются не единственными мутациями, затрагивающими функцию энхансера. Хотя точный механизм патогенеза сегодня неясен, разнообразные SNPs могут влиять на активность энхансера путем изменения связывающего сродства и/или специфичности к TF (Figures 1B и 1I). Hirschsprung disease (HSCR), мультигенное, наследственное нарушение, затрагивающее клетки ганглиев толстого кишечника или ЖКТ. У менее 30% пациентов с HSCR были идентифицированы мутации в кодирующей последовательности генов кандидатов, таких как RET (encoding a tyrosine kinase receptor), но были идентифицированы SNPs внутри энхансеров или SOX10 (транскрипционный фактор, регулирующий экспрессию RET ) или RET генов у ряда пациентов [20-22]. SNPs в энхансерах для SOX10 были выделены у пациентов с HSCR и Waardenburg синдромом типа 4 (редкое нарушение, характеризующееся глухотой и аномалиями пигментации), как было установлено, существенно снижают экспрессию Sox10, приводя также к подавлению экспрессии RET [20, 21]. Изменение одиночной пары оснований в одном из энхансеров RET также избыточно присутствует в затронутых популяциях [22]. Такие SNP снижают активность энхансера при методе гена репортера по сравнению с нормальным аллелем, возможно за счет нарушения сайта связывания с SOX10, что в конечном счете и снижает экспрессию RET [23].

Gain-of-function enhancer mutations


Один пример патогенной мутации с избыточной функцией выявлен в последовательности энхансера у пациентов с преаксиальной полидактилией [24, 25]. Точковые мутации в расположенном на большом расстоянии в специфичном для конечностей энхансере для sonic hedgehog (SHH) могут вызывать эктопическую экспрессию этого гена, приводя к образованию дополнительных пальцев у человека и животных [26].
Сравнительно недавно технология высокопроизводительного секвенирования позволила GWAS идентифицировать большое количество SNPs, ассоциированных с болезнями [27, 28]. Ряд независимых GWAS идентифицировали отличающиеся регионы риска рака груди, простаты и толстого кишечника на участке 8q24, каждый обогащен гистоновыми модификациями, которые характеризуют энхансеры [29]. Внутри этих энхансерных регионов были идентифицированы различные SNPs, которые предрасполагали к определенному типу рака. Напр., аллель риска rs11986220 для рака простаты обнаруживает более сильное связывание с TF forkhead box protein A1 (FOXA1) [30]. Это усиление связывания FOXA1 может облегчать рекрутирование зависимого от FOXA1 андрогенного рецептора, который ассоциирует с плохим прогнозом при раке простаты [31].
Используя chromatin conformation capture (3C) технологию [32], было установлено, что ряд регионов риска на участке 8q24 формируют крупные, хромосомные петли на промотор онкогена MYC [29, 30, 33-36]. Однако, ни в одном из этих исследований не была успешно продемонстрирована корреляция между появлением этих SNPs и усилением экспрессии нижестоящего MYC . Экспрессия MYC может быть усилена с помощью этих SNPs, но только в специфическое время во время туморогенеза или только в определенном субнаборе клеток (напр., в раковых стволовых клетках). Локус риска в 8q24 для рака простаты также формирует контакты с многими др. геномными локусами, иногда зависимым от типа клеток образом, подтверждая, что патогенные механизмы выявляемой чувствительности аллелей могут быть независимыми MYC [37]. Безусловно, ряд аллелей чувствительности в регионе 8q24, как было установлено, увеличивает экспрессию онкогена PVT1 [35].
В клетках того же самого типа, но от др. индивидов, SNPs ассоциированы с болезнью (quantitative trait loci; QTL), влияющей на вариабельность связывания TF и, следовательно, могущей приводить к изменениям в ассоциированном состоянии хроматина. Это д. вызывать локальную эпигенетическую изменчивость между индивидами. Недавно Waszak et al и Grubert et al установили, что такие локальные изменения хроматина, обусловленные определенной генетической вариабельностью в сайтах связывания TF, также влияют на состояние др. регуляторных элементов (локальных, но удаленных на сотни kilobases), и тем самым влияют на крупные геномные компартменты, формируя регуляторные единицы, наз. variable chromatin modules (VCMs) [38]. Вариабельность внутри каждого из этих VCMs обеспечивается с помощью пространственных взаимодействий хроматина [39], которые могут влиять на экспрессию нескольких генов. Это позволяет также предположить, что очень немногие очевидные 'epi-mutations' могут быть в целом отличимые от изменений последовательностей ДНК.

Epigenetic signatures of disease


Настоящие epi-mutations (т.е. эпигенетические модификации, дифференциально представленные при болезни и у здоровых) являются важными биомаркерами [40], которые могут быть использованы для подразделения пациентов [41, 42], идентификации путей кандидатов при болезни [43, 44], и в качестве потенциальных мишеней для новой эпигенетической редактирующей терапии [45]. Специфические для болезней ДНК метиломы были идентифицированы у пациентов с активным раком яичников [46], при разных формах AML [47], колоректальном раке [48] и др. болезнях. Тысячи локусов, как было установлено, дифференциально обогащены эпигенетическими сигнатурами, маркирующими энхансеры (монометилирование лизина 4 гистона H3) в данной выборке клеток колоректального рака по сравнению с нормальными клетками крипт [49].
EWAS пытаются сегодня идентифицировать epi-мутации, ассоциированные с болезнями [50]. Эти исследования сфокусированы в основном на изменениях метилирования ДНК (methylation quantitative trait loci - methQTLs), т.к. это вполне осуществимо, чем анализ модификаций гистонов. EWAS уже идентифицировали дифференциально метилированные регионы генома, которые обусловливают эпигенетический риск ревматоидного артрита [51] и которые могут быть индуцированы с помощью постоянного курения [52, 53]. Внутренне присущие затруднения в эпигенетическом анализе, включая эпигенетическую изменчивость между разными типами клеток и разными стадиями развития. Разрабатываются новые исследовательские подходы и техники анализа, чтобы преодолеть эти затруднения [54, 55]. Однако, эпигенетическая изменчивость между одиночными клетками одного и того же типа и стадии развития также могут вызывать затруднения в отделении настоящих сигналов от шумов [50, 56].

Epigenetic regulation in disease


Regulators of DNA modifications


Описаны 5 разных модификаций ДНК у эукариот. Метилирование number 5 углерода по остаткам цитозина (5mC) в CpG динуклеотидах было первой описанной ковалентной модификацией ДНК [57]. 5mC оксидативные промежуточные образования, такие как 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxylcytosine (5caC) являются др. метаболитами, обнаруживаемыми в CpGs [8]. Недавно описана новая модификация эукариотической ДНК, N6-methyladenine [9].
У позвоночных регионы ДНК с высокой плотностью динуклеотидов CpG образуют CpG островки. Это короткие (~1000 bp) с вкраплениями множества CpG и с преимущественно не метилированными последовательностями ДНК [58]. Они обнаруживаются во всех генах домашнего хозяйства и у части ткане-специфических и онтогенетических регуляторных генов. Хотя метилирование ДНК хорошо задокументировано у позвоночных, менее известно о нем у др. организмов. Фактически, у большинства изученных модельных беспозвоночных животных, таких как мухи Drosophila melanogaster и черви Caenorhabditis elegans, а также у грибов Saccharomyces cereviceae отсутствует метилирование ДНК [58]. Однако, у некоторых насекомых, таких как Hymenoptera медоносная пчела (Apis mellifera), метилирование ДНК происходит, но прежде всего обнаруживается в телах генов, подверженных сплайсингу повсеместно экспрессируемых генов [59]. У млекопитающих, однако, метилирование ДНК происходит в межгенных регионах, где оно может, напр., затруднять связывание TF с промоторными регионами [58] (Figure 1B).

DNA modifications and disease


Метилированные CpG динуклеотиды более чувствительны к мутациям с помощью деаминирования в TpG или CpA [60], и поэтому представляют ключевой пример, когда эпи-мутации могут генерировать генетические мутации. Ранние исследования установили, что CpG островки недостаточно представлены у грызунов по сравнению с геномом человека, т.е. они были разрушены во время эволюции [61, 62]. Эти исследования подтвердили, что CpG динуклеотиды в CpG островках мышей метилируются случайно и мутируют в TpG или CpA во время эволюции. Это может иметь драматические последствия, если изучается мышиная модель, где интересующий ген может регулироваться по-другому по сравнению с его ортологом у человека. Напр., у человека ген α-globin регулируется с помощью Polycomb group репрессивных комплексов во время дифференцировки, тогда как мышиный α-globin ген нет [6]. Это привело к разработке гуманизированной мышиной модели для изучения in vivo регуляции экспрессии гена α-globin человека [63].
Цитозин метилируется с помощью семейства энзимов, наз. de novo (DNMT1) and maintenance (DNMT3) ДНК метилтрансфераз. Одна из DNMTs, DNMT3A, инактивируется в связи гематологическим озлокачествлением [64], как при myelodysplastic синдроме (MDS) [65] и AML [66]. Приблизительно 30% случаев MDS прогрессируют в acute myeloid leukaemia (AML) [67]. Интересно, что мутации потери функции DNMT3A не затрагивают ей каталитический домен, нарушая образование тетрамеров с др. белком, DNMT3L [68, 69]. Эти мутации оказывают доминантный негативный эффект, который не позволяет белку дикого типа функционировать нормально [68, 69]. Семейство белков ten-eleven translocation (TET 1-3) являются у млекопитающих DNA hydroxylases, ответственными за каталитическое превращение 5mC в 5hmC [70]. Потеря функции TET2 и DNMT3A, по-видимому, является первичным событием во время leukaemogenesis [71]. Нарушение паттерна нормального метилирования в клетках колоректального рака коррелирует с недостаточной экспрессией генов, супрессоров опухолей (Figure 1B) избыточной экспрессией онкогенов (Figure 1I) [48].

Regulators of histone modifications


Противоположные эффекты Polycomb group (PcG, ассоциированной с репрессией генов) и Trithorax group (ассоциированной с активацией генов) ремоделирующих белков регулируют многие клеточные решения в биологии стволовых клеток, в развитии и раковых опухолях. Гистон H3 триметилированный по лизину 27 (H3K27me3) генерируется с помощью Polycomb репрессивного комплекса 2 (PRC2) и использует 'считывающий', EED, который распознает предсуществующий модифицированный гистон (H3K27me3), и 'записывающая', метилтрансфераза EZH2, которая модифицирует близлежащие гистоны [72]. Метилирование гистона H3K27 удаляется с помощью 'стирателя', это предупреждает поддержание и распространение этой модификации. Три гистоновые деметилазы, UTX (KDM2A), UTY и JMJD3 (KDM2B), как полагают, удаляют H3K27me3 [73, 74]. Вызывающие болезни мутации могут затрагивать сами гистоновые гены или энзимы (считывающие, записывающие и стирающие), регулирующие пост-трансляционные модификации их продуктов.
В противоположность метилированию ДНК, некоторые гистоновые модификации и их функции законсервированы от дрожжей до человека (напр., H3K4me3), но семейства энзимов, катализирующих добавление или удаление этих модификаций расширились во время эволюции. Напр., один единственный белок катализирует отложение H3K4me3 у дрожжей (Set1, часть комплекса COMPASS), тогда как у млекопитающих их 6 (SET1B, SET1B, MLL1, MLL2, MLL3 и MLL4) [75]. Эта экспансия сопровождается сдвигом от одноклеточных к многоклеточным организмам, хотя экспрессия каждого из энзимов не обязательно ткане-специфична, это объясняет почему часто наблюдается избыточность. PcGs, участвующая в отложении гистоновых меток (H2AK118ub для PRC1 и H3K27me3 для PRC2), ассоциирует с репрессией транскрипции, впервые выявленной у Drosophila melanogaster [76]. Механизм рекрутирования PcG у Drosophila отличен, т.к. они рекрутируются посредством специфических ДНК последовательностей, наз. polycomb репрессивные элементы [76], тогда как у млекопитающих эти комплексы рекрутируются с помощью CpG островков [77, 78].

Histone modification regulators in disease


EZH2 является наиболее часто мутирующим компонентом PRC2 при раке. Однако, мутации избыточности функции [79] и потери функции [80-83] обнаруживаются при лимфомах и лейкемии, соотв. (rev. 84 and 85). Определенные доказательства подтверждают, что геномная потеря или гипоксией вызванное подавление microRNA-101 (miR-101) является причиной избыточной экспрессии EZH2 во многих солидных опухолях [86-89].
Поскольку эпигенетические регуляторы воздействуют на огромное количество генов, влияя на скорость их транскрипции, неудивительно, что и инактивация и гиперактивация этих энзимов может приводить к болезням, в зависимости от типа ткани и стадии развития. Др. гены, участвующие в раковых опухолях, также обнаруживают противоположные роли в разных тканях. Это характерно для случая NOTCH1, кодирующего трансмембранный рецептор, который был описан как онкоген при лейкемии [90] и как ген опухолевого супрессора в солидных опухолях [91, 92]. Мутации, затрагивающие межбелковые взаимодействия, могут объяснить эти противоположные эффекты. Напр., определенные миссенс мутации опухолевого супрессора p53 (TP53) могут обладать онкогенной активностью с доминантным негативным эффектом, достигаемым с помощью олигомеризации мутантного и дикого типа белков [93, 94].
Хромосомные транслокации, первоначально идентифицированные в лейкемических клетках, могут также влиять на эпигенетические регуляторы путем создания новых слитых белков с разными функциями по сравнению с белком дикого типа (Figure 1 M). Почти все лейкемии и лимфомы, обладают транслокациями (rev. 95). Хромосомные перестройки, затрагивающие из Trithorax group ген MLL, возникают у более 70% детей с лейкемией [96]. Возникающие в результате слитые белки вызывают избыточную экспрессию ряда разных генов мишеней, несмотря на тот факт, что большинство этих перестроек вызываются делециями каталитического SET домена MLL [96, 97]. Одним из механизмов этой девиантной активации генов с помощью MLL слитых белков является аномальное рекрутирование DOT1L, H3K79 гистоновой метилтрансферазы, ассоциированной с транскрипционной элонгацией [96, 98-101].
Консервация последовательностей высокая в Jumonji C (JmjC) каталитическом домене среди гистоновых H3K27 деметилаз, UTX (KDM2A), UTY и JMJD3 (KDM2B) (Figure 2) [102, 103]. Др. домены, участвующие в межбелковых взаимодействиях, могут быть важны для субстратной специфичности и сегрегации функций или целенаправленного наведения этих энзимов. Напр., в T-ALL, UTX функционирует как опухолевый супрессор, тогда как JMJD3 работает как онкопротеин, несмотря на их общую ферментативную активность [104]. Гистоновые H3K27 деметилазы выполняют несколько функций помимо своей ферментативной активности, такие как истощение нуклеосом [105] или транскрипционная элонгация [106]. Мутации, наблюдаемые при раке, могут вызывать количественные изменения общей экспрессии или качественные изменения, усиливающие или репрессирующие функции специфических доменов. Figure 2 представляет ген UTX и его инактивирующие мутации, обнаруженные при T- и B-клеточной острой лимфобластной лейкемии (T-ALL and B-ALL), а также при chronic myelomonocytic leukaemia (CMML) [107]. Из этих диаграм неясно, зависит ли активность супрессии опухолей UTX от его деметилазной активности, т.к. некоторые мутации (затрагивающие домен TRP) оставляют каталитический домен интактным. Также консервация последовательностей в этом семействе энзимов затрудняет создание специфических ингибиторов против каждой индивидуальной H3K27 деметилазы (напр., перекрестная реактивность GSK-J3/GSK-J4 для JMJD3 и UTX) [108]. Более того, эпигенетические регуляторы воздействуют не только на гистоны, но и др. белки также [109].

Figure 2. Mutations of the UTX gene in leukaemia.
Ген UTX (ubiquitously transcribed X chromosome tetratricopeptide repeat protein) содержит 29 экзонов (black boxes), которые кодируют белок в 1401-аминокислоту (aa) с м.в. 154 kDa. N-терминальный регион обнаруживает 6 tetratricopeptide repeat (TRP) доменов (indicated in orange) и один домен JmjC domain (aa 1095 по 1258), который содержит каталитический гистидин (His1146) (indicated in red). Голубые кружки означают мутации сдвига рамки считывания (FS) в JmjC домене педиатрической T-ALL [177], а белые кружки означают делецию in-frame, мутацию сплайст акцепторного сайта и миссенс мутации во взрослой T-ALL [104]. Кроме того, у T-ALL пациентов были идентифицированы мутации (коричнивые кружки) в тех же самых горячих точках домена JmjC [120]. These include three frameshift (Val1113-FS) and two in-frame insertions/deletions. Other mutations have been found in paediatric B-ALL (green circles), with one frameshift, two missense, and one nonsense mutations in the JmjC domain, and an additional missense mutation between the TRP and JmjC domains [178]. Other mutations have been found in CMML (purple circles) [107, 179] and AML (black circle) patients. A deletion was also detected in a patient with MDS [180]. In patients with an inactivated catalytic domain, the mutant protein may have a dominant-negative activity as the protein-interacting TRP domain at the N-terminus is preserved. This may allow the mutant protein to still interact with other proteins, and thus compete with the wild-type protein (UTX for female and UTY for male) expressed by the other chromosome. Note that this gene also produces many splice variants.

Histone variants in disease


Как было описано выше гистоны являются строительными блоками нуклеосом, которые участвуют в упаковке хроматина. Существует множество гистоновых вариантов, расширяющих традиционные роли гистонов, включая механизмы, такие как репарация ДНК и поддержание геномной стабильности [110]. Гистон H3.3 является одним из таких вариантов, который важен для развития мыши, геномной стабильности и нормальной функциями гетерохроматина [111]. Первые мутации, связывающие болезни человека с гистоновыми вариантами, были идентифицированы в генах H3F3A и HIST1H3B, кодирующих H3.3 и канонический H3.1, соотв. [112, 113]. Эти периодические мутации с избыточностью функции, затрагивали остатки в тесной близи к позиции, где возникает H3K27me3, они были найдены приблизительно в 50% педиатрических высокой степени глиом [112, 113]. Одна из таких мутаций, K27M в H3.3, является доминантно негативным ингибитором отложения H3K27me2/3, понижающая глобальный H3K27me2/3 в дикого типа H3.1 и H3.3 гистонах [114-117]. H3.3-K27M предупреждает отложение H3K27me2/3 путем непосредственного взаимодействия с и ингибирования компонентов PRC2 [115, 116]. Глобальное снижение H3K27me3 одновременно изменяет паттерны метилирования ДНК, на специфичные для опухолей у H3.3-K27M пациентов, приводя к разным изменениям в экспрессии генов [115].

Conclusion


Кстати, открыты 125 генов с пусковыми (driver) мутациями для рака и почти половина из них кодирует эпигенетические регуляторы [118]. Высокая частота этих мутаций отражает критическую роль эпигенетики в заболеваниях. Специфичные для болезни эпигеномные сигнатуры подтверждают, что эпигенетика играет важную роль даже в раковых опухолях, где эпигенетические регуляторы не были мутированы [49]. Эти изменения в эпигенетическом ландшафте строго коррелируют с транскрипционными изменениями при раке пусковых (driver) генов [48]. Важно, что потенция этих эпигенетических регуляторов делает их выдающимися терапевтическими мишенями; модуляция их активности с использованием ингибиторов, может потенциально преобразовать эпигеном в 'нормальное' состояние. Напр., ингибиторы ДНК метилтрансфераз, такие как azacitidine (5-azacytidine) и decitabine (5-aza-deoxycytidine; DAC) приводят к гипометилированию ДНК и обнаруживают многообещающие результаты в лечении MDS [119]. Даже если ген опухолевого супрессора отсутствует, то целенаправленное ингибирование антагониста может в принципе устранить эпигенетический дисбаланс и обеспечить благоприятную реакцию [120]. Кстати, потеря функции H3K27 деметилазы создает несбалансированный перевес H3K27me3 модификаций в клетке. Эти эффекты д. минимизироваться за счет использования большого количества многообещающих EZH2 ингибиторов (DZNep [121], EI1 [122], GSK126 [123, 124], GSK926 [125], GSK343 [124], EPZ005687 [126], CPI-169 [127], UNC1999 [128, 129] и др. [130]). На сегодня список ингибиторов разрабатывается для всех эпигенетических регуляторов, но все современные терапевтические вмешательства и их связь с лейкемией описываются в др. месте [131]. Мы д. также учитывать, что во время прогрессирования рака клетки накапливают мутации, которые генерируют генетически и/или эпигенетически различающиеся субклоны, обладающие как генотипической, так и фенотипической гетерогенностью [132]. Такая гетерогенность представляет ещё одно затруднение для лечения.
Всё ещё остаются вопросы: всегда ли необходимы генетические мутации или они просто являются чистыми эпи-мутациями, достаточными, чтобы вызывать болезнь? Исследования среди множества видов показали, как внешне-средовые факторы могут непосредственно влиять на фенотипы посредством эпигенетических механизмов. Напр., королева медоносных пчел питается маточным молочком в течение всей своей жизни, при этом эффекты с участием метилирования ДНК изменяются [133], экспрессия генов изменяется [134], и возникают фенотипические отличия, включая увеличение в размере и продолжительности жизни [135], если сравнивать с сиблингами рабочими пчелами (rev.136). Интересно, что маточное молочко содержит ингибитор гистоновой деацетилазы [137, 138], это существенно увеличивает продолжительность жизни Drosophila [135]. У людей изучение монозиготных близнецов (генетически идентичных индивидов) с дискордантными заболеваниями представляет собой превосходную систему для идентификации внешнесредовых причин эпи-мутаций, поскольку confounders (genetic factors, age, gender, maternal effects, cohort effects, etc) могут быть контролируемыми [139]. Напр., изучение монозиготных близнецов показало, что эпигенетические различия возникают во время всей их жизни [140], и что близнецы редко обнаруживают одни и те же болезни [141, 142]. Хотя разные соматические мутации могут накапливаться, со временем, у этих индивидов, внешне-средовые факторы, вызывающие эпигенетические изменения, могут быть важными для болезней. Недавнее исследование пары идентичных близнецов, дискордантных по common variable immunodeficiency (CVID), показало, что различия в метилировании ДНК связаны с нарушениями регуляции генов, участвующих в созревании В-клеток, но без учета потенциальных соматических мутаций, которые могут возникать во время взрослой жизни [143]. В целом изучение наиболее дискордантных монозиготных близнецов показало их отличия по аутоиммунным, психиатрическим и нейрологическим болезням, а также по разным типам рака [139]. Важность окружающей среды во время взрослой жизни показано недавно при EWAS, когда были идентифицированы дифференциально метилированные CpGs у курящих по сравнению с не курящими, что в принципе может быть связано в повышенным риском возникновения рака груди [53].
Эпигенетические модификации также варьируют во время жизненного периода и между разными тканями, делая вызывающие болезнь эпи-мутации трудно отделимыми от нормальной изменчивости. Поэтому важно гарантировать, что возрастное и тканевое типирование рассматриваемых эпигеномов доступно для сравнения. В некоторых случаях эпи-мутации могут наследоваться через зародышевую линию, подтверждая возможность чисто эпигенетически передаваемых болезней. Эпигенетическое наследование через поколения было описано у растений [144], беспозвоночных [145] и млекопитающих [146, 147], обычно используются изменения условий питания в качестве модели (rev. 148 and 149). Однако, эти исследования в основном описательны и нуждаются в дополнительной информации [150].
SNPs в энхансерах и эпи-мутации обнаруживали строгую корреляцию с риском болезни во многих случаях [51, 53, 151, 152]. Однако, корреляция не адекватна причинности. Хотя эффекты мутаций в кодирующих последовательностях исследовать довольно легко, SNPs, располагающиеся в энхансерных последовательностях, и ассоциированные с болезнями оценить довольно трудно. Напр., ранее с помощью GWAS идентифицированные SNPs у тучных пациентов оказались расположенными в первом интроне гена FTO. Smemo et al недавно установили, что этот интрон действует как энхансер, но не для гена FTO , а для др. гена, IRX3, расположенного на удалении в 500 kb, это подтверждает роль IRX3 (a не FTO) в ожирении [153]. Многие замечательные исследования, упомянутые здесь и в др. местах имеют целью выявить механизм, с помощью которого энхансерные SNP или делеции могут приводить к болезням, но настоящая техника 'золотого стандарта' д. реплицировать мутации in vivo и исследовать результаты. Классическая техника генного таргетинга достигает этого в некоторых случаях [154], но недавно описанные инструменты генетического редактирования д. сделать неукоснительную характеризацию этих мутаций более широко доступной [155]. Сходным образом, использование техники целенаправленного эпигенетического редактирования [156, 157] позволит расширить возможности эпигенетиков по изучению фенотипов эпи-мутаций.
Недавно описанные техники геномного и эпигеномного редактирования, могут быть использованы в клинике, чтобы полностью устанавливать мутации, вызывающие болезнь, у пациентов. Определено многие исследования уже ведутся с использованием техники генетического редактирования при лечении болезней, таких как acquired immune deficiency syndrome (AIDS) [158] и X-linked severe combined immunodeficiency (SCID-XI) [159] (rev. 160). Эпигенетическое редактирование хотя и в начальной стадии, оказывается чрезвычайно эффективным и может потенциально использоваться как способ лечения болезней [45, 157]. Однако, особенно при лечении рака, где мутационный груз может досигать сотен в определенных опухолях [118], будет чрезвычайно трудно скорректировать каждую driver мутацию в каждой клетке. Между тем продолжаются споры об этичности использования техники генетического редактирования для лечения болезней человека [161]. Использование ингибирующих лекарств в клинической практике для целенаправленного воздействия на эти мутации всё ещё остается более реалистичным для лечения многих раковых опухолей. Некоторые из белков, подвергаемые воздействию этих лекарств могут иметь противоположный эффект (онкогенный в противовес супрессии опухоли) в клетках из одной и той же ткани, поэтому важно понять биологию мутаций и функцию этих белков в каждом клоне, чтобы идентифицировать туморогенные пути, которые они могут регулировать.