Понимание механизмов развития, которые регулируют клетки предшественники, чтобы генерировать органы со специфическими морфологией и функциями является центральным вопросом биологии развития. Конечности позвоночных служат прекрасной системой для таких исследований. В частности, клетки мезенхимных предшественников в зачатках конечностей специфицированы, соотв. расположены и растянуты, чтобы генерировать каждый скелетный элемент с определенной морфологией в каждой определенной позиции, чтобы создавать стереотипическую систему скелета конечности. Аутопод у млекопитающих обладает 5 пальцами d1-d5, в переднезадней последовательности. Количество и качественные особенности пальцев используются в качестве показателей спецификации, формирования паттерна и пролиферативной экспансии клеток предшественников [1].
Sonic Hedgehog (Shh) экспрессируется в зоне поляризующей активности (ZPA), расположенной в задней части мезенхимы зачатка конечности и действует как главная регуляторная молекула развития конечности [1, 2]. Переднезадняя спецификация предшественников пальцев регулируется с помощью концентрации и продолжительности воздействия SHH [3-6]. SHH регулирует также пролиферативную экспансию клеток мезенхимных предшественников, чтобы генерировать достаточное количество клеток для развития хрящевых конденсатов [7, 8]. Соотв., эктопическая экспрессия Shh в передней части ассоциирует с преаксиальной полидактилией, которая характеризуется образованием эктопических пальцев в передней части конечности [9]. Напротив, наиболее передний палец (d1) развивается SHH-независимым способом [10, 11]. Недавнее исследование показало, что передние генетические программы, такие как Irx3-Irx5 и Sall4, необходимы для развития d1, по крайней мере, частично путем исключения передачи сигналов SHH из передней части мезенхимы [12, 13].
С глиомами ассоциированное семейство онкогенных белков (GLI) , являющихся белками, связывающимися с цинковыми пальчиками ДНК, выполняют разнообразные роли в развитии и болезнях животных [14]. Среди трех Gli генов, Gli3 кодирует бифункциональную молекулу, действующую как активатор (GLI3A) и как репрессор (GLI3R), баланс которых зависит от передачи сигналов Hedgehog [14]. В присутствии Hedgehog лигандов, их сигнальная трансдукция в первичных ресничках вызывает подавление протеолитического процессинга GLI3 [15]. Это приводит к накоплению формы активатора полной длины GLI3 (GLI3A) в задней части мезенхимы. Напротив, при отсутствии передачи сигналов Hedgehog, GLI3 подвергается протеолизу, генерируя укороченную репрессорную форму (GLI3R), которая накапливается в передней части мезенхимы. Поскольку GLI1 лишен репрессорного домена, а GLI2 преимущественно действует как активатор [16, 17], то GLI3R является главным GLI репрессором в конечности [18].
В соответствии с важностью функции Gli3 в развитии конечности, его мутации вызывают дефекты развития у мышей и человека [19-21]. В частности, Gli3-/- мыши характеризуются полидактилией [21]. Генетические исследования мышей продемонстрировали, что превалирующей функцией Gli3 является супрессия генов мишеней для передачи сигналов Hedgehog [22, 23]. Более того, было показано, что баланс GLI3A и GLI3R регулирует количество и качественные особенности пальцев [24-26]. Многочисленные исследования показали, что множественные механизмы регулируют функции GLI3 in vitro , такие как пост-трансляционные модификации, деградация, удержание цитоплазмы и обусловленный первичными ресничками процессинг (rev. [14, 27, 28]). Исследования in vivo на мышах продемонстрировали, что Gli3 генетически взаимодействует с Hox генами, Zic3 и Alx4 во время развития конечности [29-31]. Несмотря на эти исследования in vivo контроль функции Gli3 во время собственно развития конечности всё ещё не выяснен.
Сеймейство Gata транскрипционных факторов с цинковыми пальчиками является важным регулятором развития тканей и органов. Семейство Gata подразделяется на подсемейства Gata1/2/3 и Gata4/5/6, которые обнаруживают экспрессию в гематопоэтических клеточных клонах и в мезо-энтодермальных клонах, соотв. [32, 33]. В частности, Gata6, важен для формирования энтодермы, и он участвует также в развитии различных происходящих из мезодермы и энтодермы органов, таких как сердечно-сосудистая система и поджелудочная железа [34-37]. Более того, недавнее исследование подтвердило, что Gata6 действует как негативный регулятор экспрессии Shh в зачатке конечности путем соединения со специфичным для зачатка конечности цис-регуляторным элементом, ZRS [38].
В данном исследовании мы установили, что большая делеция
Gata6 в мезенхимных предшественниках конечности вызывает специфичную для задних конечностей преаксиальную полидактилию, которая ассоциирует с эктопической передачей сигналов SHH в передней части зачатка задних конечностей. Мы установили, что Gata6 и Gli3 генетически взаимодействуют, чтобы регулировать формирование нормального паттерна задней конечности. Более того, мы показали, что прямая ассоциация GATA6 с GLI3R способствует локализации в ядре и репрессирующей активности GLI3R. Наша работа идентифицировала, что генетические и биохимические взаимодействия между
Gata6 и Gli3 действуют как важные механизмы регуляции активности GLI3R для соотв. формирования паттерна аутопод.
Discussion
В данном исследовании мы установили специфичную для задних конечностей преаксиальную полидактилию у мутантов Gata6. Скелетный фенотип Gata6 мутантов ограничен задними конечностями, тогда как передние конечности развиваются нормально. Несколько возможностей могли бы объяснить такие специфические для задних конечностей фенотипические отклонения. Напр., недавнее исследование показало. что Gata4 дифференциально экспрессируется в зачатках передних конечностей (на высоком) и в зачатках задних конечностей (на низком уровне) [38]. Gata4 и Gata6 функционально перекрываются во время развития сердца и целостности сосудистой системы [36, 43]; следовательно, Gata4 может компенсировать потерю Gata6 в зачатках передних конечностей [38]. Др. возможность заключается в том, что различия в чувствительности к передаче сигналов Hedgehog вносит вклад в разные фенотипы передних и задних конечностей. Показано, что уровни передачи сигналов Hedgehog оказываются более высокими в мезенхиме задних конечностей, чем в мезенхиме передних конечностей [12], и что задние конечности более чувствительны к изменениям в уровне передачи сигналов Hedgehog. Более высокий уровень передачи сигналов Hedgehog в комбинации с пониженным GLI3R, может вносить вклад в специфичную для задних конечностей полидактилию у Gata6 cKO. Эта идея согласуется с эктопическим образованием пальцев в Tcre; Gata6+/fl; Gli3+/- передних конечностях, в которых активности GLI3R оказываются ниже, а уровни передачи сигналов SHH оказываются выше, чем в передних конечностях Gli3+/-. Эти два сценария не исключают др. др. и они могут кооперироваться вместе, чтобы гарантировать соотв. передачу сигналов Hedgehog и образование пяти пальцев в конечностях млекопитающих.
Наше исследование предполагает два механизма, с помощью которых Gata6 регулирует соот. формирование паттерна аутопод. Один механизм связан с усилением активности GLI3R, чтобы репрессировать передачу сигналов Hedgehog в передней части мезенхимы, а др. связан с негативной регуляцией экспрессии Shh в передней части мезенхимы.
Генетическое исследование показало, что преаксиальная полидактилия ассоциирует с эктопической экспрессией Shh в передней части мезенхимы [9]. Экспрессия Shh позитивно и негативно регулируется в задней и передней мезенхиме, соотв. Twist1, Alx4, Gli3, Tulp3 и Etv4-Etv5 действуют ка негативные регуляторы, потеря их функции вызывает эктопическую экспрессию Shh [23, 47, 49, 51, 61]. Генетические и биохимические исследования показали, что Hand2 и Hoxd13 позитивно регулируют экспрессию Shh посредством специфичного для зачатка конечности цис-регуляторного элемента, ZRS [44, 62]. Передняя экспрессия Shh может быть вызвана потерей негативных регуляторов или эктопической экспрессией позитивных регуляторов [63]. Учитывая, что эти регуляторы не вызывают достоверных альтераций в зачатках задних конечностей Gata6 cKO, фенотип преаксиальной полидактилии в Gata6 cKO конечностях вряд ли индуцируется с помощью этих генов. Недавнее исследование подтвердило, что Gata6 репрессирует Shh в конечностях посредством соединения с ZRS [38]. Наши данные согласуются с этим сообщением и демонстрируют, что Shh и его мишени эктопически экспрессируются в зачатках задних конечностей Gata6 cKO на ст. E11.5. Восстановление нормального паттерна экспрессии Gli1 и Ptch1 в Gata6 cKO; Shh+/- задних конечностях также подтверждает идею, что Gata6 стоит выше Shh.
Вторая роль заключается в репрессии эктопической передачи сигналов Hedgehog путем усиления репрессирующей функции Gli3. Эктопическая экспрессия Shhна генетическом фоне Gata6 cKO затрагивает данные интерпретации; однако, анализ компаундных мутантных гетерозигот способен разделить эти два механизма и подтвердить второй механизм. Предыдущие исследования показали, что Gli3 генетически взаимодействие с др. генами во время развития конечностей. Изучение Hox генов подтверждает, что Gli3-/- фенотип полидактилии опосредуется с помощью Hoxd9 и Hoxd10 [29, 64]. Кроме того, было показано, что полидактилия Gli3-/- конечностей оказывается менее выраженной на генетическом фоне Alx4-/- или Zic3-/- [30, 31], это подтверждает, что Gli3-/- фенотип полидактилии нуждается в Alx4 или Zic3. В противоположность этим сообщениям. потеря одного аллеля Gata6 усиливает полидактилию в Gli3+/- задних конечностях. Следовательно, в отличие от предыдущего генетического исследования, наша работа идентифицировала Gata6 как негативный фактор для развития полидактилии. Принимая во внимание, что GLI3R предупреждает образование дополнительных пальцев в передней части мезенхимы [55], наши результаты подтверждают, что Gata6 кооперируется с активностью GLI3R.
Считается. что d1 развивается Shh-независимым способом, тогда как развитие d2-d5 нуждается в Shh [5, 6, 10, 11]. Генетические манипуляции с Gli3 у мышей предоставили доказательства, что высокие уровни GLI3R в передней части зачатка конечности необходимы для соотв. развития d1 и гарантии образования 5 пальцев [24, 55, 65]. Паттерн экспрессии Pax9, который нуждается в высоких уровнях GLI3R [56], показывает, что Gata6 вносит вклад в активности GLI3R в передней части зачатков задних конечностей. В частности, Pax9 не обнаруживается в зачатках задних конечностей у Tcre; Gata6+/fl; Gli3+/- мышей, как и в зачатках задних конечностей Gata6 cKO и Gli3-/-. Этот измененный паттерн экспрессии Pax9 коррелирует с конденсацией эктопических пальцев и преаксиальной полидактилией и подкрепляет идею, что Gata6 кооперирует с Gli3 для вызывания соотв. активностей GLI3R в передней части зачатков задних конечностей.
Как Gata6 кооперирует с Gli3? Наши данные подтверждают идею, что GATA6 физически взаимодействует с GLI3R, облегчая ядерную локализацию GLI3R, и усиливая репрессирующие активности GLI3R. Снижение локализации в ядре GLI3R в Gata6 cKO задних конечностях подтверждает идею, что этим взаимодействием обеспечиваемая локализация в ядре GLI3R д. также происходить и in vivo. Недавнее исследование показало, что Gata4, 5 и 6 могут репрессировать Gli-зависимую активацию репортера in vitro [66]. Это исследование подтвердило, что GATA ингибирует SHH-зависимую функцию GLI активатора с помощью белкового взаимодействия в пресомитной мезодерме кур. Базируясь на этом сообщении нашем исследовании, GATA может модулировать как GLI3R (this study), так и SHH-зависимый GLI активатор [66] в зависимости от контекста. Поскольку экспрессия генов Gata описана и в др. Gli3-позитивных развивающихся тканях, таких как бранхиальные дуги, сомиты и ЦНС [16, 67, 68], то Gata регуляция GLI3R может быть общим механизмом во время развития др. органов.
