В нашем исследовании ADPKD у 19-летней девушки пробанда была диагностирована впервые в возрасте 17 лет, когда случайно были обнаружены увеличенные почки с бесчисленными почечными кистами с двух сторон. Отмечался лишь один эпизод самокупирующейся большой гематурии, но в анамнезе не отмечалось ни гипертензии, уролитиаза, грыжи и болей в боку, спине или животе. Она была нормотензивной, её физическое состояние было нормальным. Blood urea nitrogen (BUN) was 14 mg/dl, serum creatinine 0.6 mg/dl, 24-h urine creatinine clearance 120 ml/min, and protein excretion 152 mg/dl. Magnetic resonance imaging (MRI; Fig. 1a) выявил бесчисленные кисты в обеих почках и печени; total kidney volume (TKV) составлял 964 ml.

Figure 1. Magnetic resonance imaging (MRI) abdomen of the proband (A) and her father (B) with autosomal dominant polycystic kidney disease.

У отца пробанда ADPKD диагностирована примерно в 50 лет. Скрининг на мутации пробанда с использованием long-range polymerase chain reaction (PCR) и Sanger секвенирования (Fig. 2a), выявил характерную мутацию укорочения c.10745dupC (p.Val3584ArgfsX43) в PKD1. Это инсерция одиночного нуклеотида в PKD1 экзоне 36 вызывает сдвиг рамки считывания в кодоне 3584, приводя к преждевременному окончанию вследствие добавления 42 аберрантных аминокислот. Этот аномальный вариант предположительно кодирует укороченную форму PC1 с нулевой функцией, лишенную 7-го трансмембранного и C-терминального доменов. Др. мутации в PKD генах отсутствовали. Исследования ДНК лимфоцитов периферической крови (PBL) отца не выявили каких-либо изменений оснований в PKD1. Это указывает на то, что отец является мозаиком по мутации в соматической или зародышевой линии. Мы проанализировали ДНК, полученную из клеток щёк отца, мочи и спермы и сравнили с таковой от его и от его дочери PBL. Аномальная последовательность выявлена в ДНК PBL пробанд и также обнаружена в низком количестве в ДНК спермиев отца, но не в остальных пробах. Анализ Next generation sequencing (NGS) с использованием long-range PCR (LR-PCR) и Illumina MiSeq системы, определил уровень мутации в отцовских PBL, клетках щек и спермиях равным ~3%, 4.5% и 10%, соотв. (Fig. 3). Во всех выборках PKD1 экзоны были перекрыты на 100%. Тотальное покрытие региона мишени PKD1 варьировало от 276X до 1269X, этого достаточно для эффективного варианта calling (Table 1). Вариант аллеля перекрывает (call) в 5 раз порог, определяемый нашим источником биоинформации [11]. Ложные позитивные ошибки при NGS, происходящие из-за псевдогенов PKD1, обнаруживались при использовании данных низкой четкости (уровень мутантов менее 3% mutant level) [6]; однако этого не наблюдалось при нашем анализе NGS источника гена [11]. Более того, мутация была локализована в регионе с одиночной копией PKD1 и поэтому не была confounded гомологичным геном. Обнаружены неадекватные количества ДНК в выборке мочи для NGS анализа.

Figure 2. Mutation analysis by Sanger sequencing showing heterozygosity for the PKD1 c.10745dupC (p.Val3584ArgfsX43) in peripheral blood lymphocytes (PBL) DNA from the affected daughter (a), while very low traces of the mutation have been detected in the father's sperm (b).

Figure 3. Next generation sequencing (NGS) analysis showing low levels ofPKD1 c.10745dupC (p.Val3584ArgfsX43) mutation in the father's sperm (a), buccal cells (b), and peripheral blood lymphocytes (PBL)

Table 1. Read coverage of PKD1 c.10745dupC mutation identified by deep sequencing

Father's sample        Total coverage        Variant coverage        Mutation frequency (%)
Blood                            276                                9                                    3.3%
Buccal cells                  1269                              59                                  4.6%
Sperm                            727                              73                                10%    

Мутационный анализ гена PKD1 затруднен, поскольку он удвоен на хромосоме 16, сильно гетерогенен, мутации частные и широко распределены по гену, необходимы LR-PCR и прямое секвенирование всего гена [5]. Доля детекции в коммерческой проверочной лаб. (Athena Diagnostics, Inc., Worcester, MA) составляет приблизительно 40-60%, с наивысшей чувствительностью (85-90%), описанной для исследований популяции с ADPKDs [12].

Неспособность обнаруживать патогенные мутации гена PKD приписывается мутациям в генах иных, чем PKD1 или PKD2. Однако повторный анализ этих семей показал, что ошибки в анализе сцепления и ложно положительный диагноз ADPKD у членов семей ведут к неправильной интерпретации данных [1]. В двух семьях отслеживали новые мутации внутри исследуемой родословной [1]: два индивида во втором поколении были диагностированы как имеющие ADPKD и мутацию гена PKD, тогда как родители клинически и генетически были негативны. Был предположен соматический и зародышевой линии мозаицизм, но не был проверен. Считается, что мутации de novo при ADPKD возникают приблизительно в 10% семей с негативным PKD генотипом [1], возможно это объясняет большинство случаев, негативных по мутациям.

Генетический мозаицизм остается нераспознанным частично из-за уровней мутантных аллелей, которые ниже аналитической чувствительности (~10-20%) при Sanger секвенировании - золотой стандарт для анализа мутаций. В нашем исследовании NGS выявило низкие уровни мутации (~3-4.5%) в ДНК PBL и клеток щёк отца пробанда, это ниже уровня возможного определения с помощью Sanger секвенирования. Однако ДНК спермиев отца, проанализированная с помощью Sanger секвенирования выявила следы совпадающих сигнальных последовательностей с таковыми в PBL пробанда, определенные с помощью NGS приблизительно в 10%. Такая вариабельность в уровнях мутантного аллеля ещё больше осложняет генетический анализ, поскольку она не определяется методом Sanger в крови и клетках щек [1].

Мы оказались неспособны подтвердить негативные по мутации результаты у отца в осадке мочи, поскольку было недостаточно ДНК для NGS анализа. Осадок в моче содержит эпителиальные клетки, сбрасываемые почками и может быть обогащен позитивными по мутации клетками. Следовательно, генетическое тестирование выборок мочи в случаях негативных по мутации может улучшить обнаружение мутаций у пациентов с ADPKD, хотя это не может быть адекватно оценено в нашем исследовании.

Мозаицизм или сосуществование мутантных и нормальных клеток обнаруживается в семьях с фенотипически нормальными родителями, но имеющими одного или более потомков, затронутых аутосомно доминантным или Х-сцепленным нарушением. Мозаицизм, возникающий в результате мутации в раннем эмбриональном развитии до детерминации зародышевых клеток вызывает гоносомный мозаицизм (затрагивая соматические ткани и клетки зародышевой линии). Мутации, которые возникают позднее могут затрагивать исключительно зародышевые клетки (мозаицизм зародышевой линии) или соматические клетки (соматический мозаицизм). В нашем исследовании ~6-10% из тканевых выборок отца, включая спермии, обладали мутациями, подтверждая, что мутация PKD1 возникала во время раннего эмбрионального развития.

Демонстрация, что около 10% затронутых спермиев отца содержат мутацию, имеет важное значение для понимания мозаицизма и передачи наследственной болезни. При неврофиброматозе типа 1 мозаицизм ассоциирует с его относительно частой мутацией NF-1 [13]. При ADPKD, высокая доля новых мутаций 1.8 х 10^-5 на гамету, на генерацию описана для PKD1, возможно это объясняет высокий показатель новых случаев [5].

Идентификация мозаицизма при наследуемых нарушениях важна для определения риска затронутых детей при будущих беременностях. Выявление мутаций в гаметах и определение пропорции клеток, несущих болезнь, информирует о риске возникновения болезни у сиблингов пробанда, при этом NGS становится предпочитаемым методом для детекции низкого уровня мозаичных мутаций [14]. Это может также объяснить изменчивый фенотип ADPKD, наблюдаемый в одной и той же семье. ADPKD обычно полностью пенетрантна, но благодаря мозаицизму у родителя, затронутые индивиды могут иметь менее тяжелый фенотип, затрудняющий диагностику. Важность генетического консультирования пациентов с ADPKD подчеркивается относительно высоким показателем спорадических случаев и большим спектром мутаций. Мозаицизм зародышевой линии и соматический мозаицизм подчеркивает генетическую сложность ADPKD.

Итак, мы идентифицировали семью с ADPKD, характеризующуюся совместным мозаицизмом зародышевой линии и соматическим мозаицизмом по PKD1 у отца 19-летней девушки пробанда с мутацией укорочения PKD1. Присутствие этой мутации в нескольких типах ткани, включая спермии, подтверждает гипотезу, что болезнь возникла во время раннего эмбриогенеза отца. Это первое описание комбинированного мозаицизма при ADPKD [15].