Посещений: 
РЕТИНОПАТИИ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С CRX
животные модели
|
|
Mechanisms of blindness: Animal models provide insight into distinct CRX-associated retinopathies Nicholas M. Tran and Shiming Chen
 Developmental Dynamics
Volume 243, Issue 10, pages 1153–1166, October 2014
|
The homeodomain transcription factor CRX is a crucial regulator of mammalian photoreceptor gene expression. Mutations in the human CRX gene are associated with dominant inherited retinopathies Retinitis Pigmentosa (RP), Cone-Rod Dystrophy (CoRD), and Leber Congenital Amaurosis (LCA), of varying severity. In vitro and in vivo assessment of mutant CRX proteins have revealed pathogenic mechanisms for several mutations, but no comprehensive mutation-disease correlation has yet been reported. Results:Here we describe four different classes of disease-causing CRX mutations, characterized by mutation type, pathogenetic mechanism, and the molecular activity of the mutant protein: (1) hypomorphic missense mutations with reduced DNA binding, (2) antimorphic missense mutations with variable DNA binding, (3) antimorphic frameshift/nonsense mutations with intact DNA binding, and (4) antimorphic frameshift mutations with reduced DNA binding. Mammalian models representing three of these classes have been characterized. Conclusions: Models carrying Class I mutations display a mild dominant retinal phenotype and recessive LCA, while models carrying Class III and IV mutations display characteristically distinct dominant LCA phenotypes. These animal models also reveal unexpected pathogenic mechanisms underlying CRX-associated retinopathies. The complexity of genotype-phenotype correlation for CRX-associated diseases highlights the value of developing comprehensive "true-to-disease" animal models for understanding pathologic mechanisms and testing novel therapeutic approaches. Developmental Dynamics 243:1153-1166, 2014. © 2014 Wiley Periodicals, Inc.
Рисунки к статье
|
Introduction: CRX-Associated Retinopathies
Генетические основы ретинопатий, приводящих к слепоте, чрезвычайно разнообразны. Болезни сетчатки сцеплены с боле чем 250 генами и картированными локусами (https://sph.uth.edu/retnet/). Подобная генетическая гетерогенность четко определяет основные механизмы болезни для разных нарушений. Большинство ретинопатий на сегодня не лечатся и остаются плохо изученными в основном из-за отсутствия соотв. животных моделей. Наследственные ретинопатии Retinitis Pigmentosa (RP), Cone-Rod Dystrophy (CoRD) и Leber Congenital Amaurosis (LCA) вызывают прогрессивную потерю зрения, каждый с отличающимися клиническими признаками. RP является "rod-centric" болезнью с симптомами, включающими ночную слепоту и потерю периферического зрения, прогрессирующее в туннельное зрение и потерю остроты центрального поля зрения (Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) no. 268000). CoRD является "cone-centric" болезнью с симптомами, включающими потерю цветного зрения и потерю остроты центрального поля зрения и переход в ночную слепоту и потерю периферического зрения (OMIM no. 120970). RP и CoRD варьируют по возрасту начала, скорости прогрессирования и тяжести. LCA - это болезнь с ранним началом с симптомами, включающими потерю зрения, нистагм и тяжелую дисфункцию сетчатки (OMIM no. 204000). RP, CoRD и LCA могут иметь доминантное или рецессивное наследование. Эти ретинопатии оказались сцеплены с мутациями в нескольких разных генах, но Cone-Rod Homeobox (CRX) (accession no. AAH53672.1) является единственным геном, ассоциированым со всеми тремя болезнями (Berger et al., 2010). Мутации в CRX прежде всего ассоциированы с доминантными формами RP, CoRD и LCA с варьирующей тяжестью и возрастом начала (Berger et al., 2010; Dharmaraj et al., 2000; Freund et al., 1997, 1998; Galvin et al., 2005; Hanein et al., 2004; den Hollander et al., 2008; Huang et al., 2012; Jacobson et al., 1998; Jin et al., 2008; Koenekoop et al., 2002; Li et al., 2011; Lotery et al., 2000; Nakamura et al., 1998; Paunescu et al., 2007; Rivolta et al., 2001; Sankila et al., 2000; Sohocki et al., 1998, 2001; Swain et al., 1997; Silva et al., 2000; Swaroop et al., 1999; Tzekov et al., 2000, 2001; Vallespin et al., 2007; Walia et al., 2010; Wang et al., 2007; Zernant et al.,2005; Zhang et al., 2001, 2002). Здесь мы суммируем эффекты разных классов болезнь вызывающих мутаций CRX на функцию CRX белка, исходя из экспериментов in vitro и доступных животных моделей (Fig. 1). Мы продемонстрировали, что животные модели, несущие механистически отличающиеся Crx мутации, обладают разными фенотипами, которые в точности представляют диапазон клинических признаков, описанных у пациентов, и выявляют неожиданные патогенетические механизмы.
Figure 1. Schematic of CRX protein showing locations of co-segregating human mutations and mutations in associated animal models. The CRX protein is represented by a rectangle, conserved domains are shaded. The locations of human mutations that co-segregate with disease are shown above the schematic. Based on mutation type and molecular function, mutations fall into four classes: (I) hypomorphic missense mutations with reduced DNA binding (gold text), (II) antimorphic missense mutations with variable DNA binding (purple text), (III) antimorphic frameshift/nonsense mutations with intact DNA binding (red text), and (IV) antimorphic frameshift mutations with reduced DNA binding (blue text). While both classes of frameshift mutations are predicted to have antimorphic activity, they act through different mechanisms. Currently, there are five mouse models and one cat model carrying mutations in Crx (bottom): (1) the Crx Knock-OUT (KO)mouse (grey text) does not express CRX protein; (2) the R90W Knock-IN (K-IN) mouse (gold text) carries a Class I mutation; (3) the E168d2 K-IN mouse and Rdy cat (red text) both carry Class III mutations; (4) the Rip mouse (blue text) carries a Class IV mutation; (5) the tvrm65 mouse (grey text) carries a nonsense mutation that does not match any reported disease-causing human mutation classes.
Molecular role of CRX within the Transcriptional Regulatory Networks of the Retina and Pineal Gland
CRX является Otd/OTX-like "paired" homeodomain (HD) транскрипционным фактором, которые преимущественно экспрессируется в палочках и колбочках позвоночных, первостепенных клеток, поддерживающих зрение в сетчатке, и в пинеалоцитах, которые регулируют циркадные ритмы в головном мозге (Chen et al., 1997; Furukawa et al., 1997). CRX играет существенную роль в становлении и поддержании экспрессии генов в палочках и колбочках фоторецепторах млекопитающих (Furukawa et al., 1999) и шишковидной железе (Rovsing et al., 2011). Молекулярная функция CRX сильно законсервирована у животных, включая человека, мышей и кошек (Furukawa et al., 1997; Chen et al., 1997; Menotti-Raymond et al., 2010). Паралоги CRX/OTX выполняют сходные роли в фоторецепторах эволюционно отклонившихся позвоночных рыб (Shen and Raymond, 2004) и амфибий (Plouhinec et al., 2003) и беспозвоночных Drosophila (Terrell et al., 2012) и Amphioxus (Vopalensky et al., 2012).
Белок CRX млекопитающих состоит из 299 аминокислот (aa) в длину и содержит несколько консервативных функциональных доменов, включая: HD, glutamine rich (Gln), basic, WSP и OTX-tail мотивы (Fig. 1). HD обеспечивает активность по связыванию ДНК, тогда как C-терминальная порция CRX (от basic до OTX-tail доменов) обеспечивает регуляцию транскрипции (Chau et al., 2000; Chen et al., 1997; Fei and Hughes 2000). Во время развития сетчатки млекопитающих становление CRX транскрипционной регуляторной сети нуждается в функции OTX2 (Accession no. BAJ84003.1), др. члена семейства Otd/OTX. HD's в OTX2 и CRX белках на 86% гомологичные и обнаруживают сходные профили связывания геномной ДНК в нейральной сетчатке (Corbo et al., 2010; Freund et al., 1997; Hennig et al.,2008; Samuel et al., 2014), но выполняют разные роли в регуляции экспрессии генов сетчатки (Chen et al., 1997; Furukawa et al., 1997; Hsiau et al., 2007; Housset et al., 2013; Nishida et al., 2003; Terrell et al., 2012). OTX2 экспрессируется раньше, чем CRX в клетках ретинальных предшественников, дающих фоторецепторы (Baas et al., 2000; Bovolenta et al., 1997; Nishida et al., 2003). В этих клетках OTX2 необходим для активации экспрессии CRX, сопровождаемой специфической для палочек (включая RORβ, NRL и NR2E3 [accession nos. NP_001036819.1, NP_006168.1, and AAH41421.1, соотв.]) или колбочек (включая RORα, TRβ2, RXRγ и COUP-TFs [accessions nos. EDL26161.1, NP_033406.1, AAH58401.1, NP_034281.2, NP_033827.2, соотв.]) транскрипционных факторов (Bovolenta et al., 1997; Nishida et al., 2003). По мере усиления экспрессии CRX в развивающихся фоторецепторах, экспрессия OTX2 снижается в этих клетках, но экспрессия сохраняется во внутреннем ядерном слое и пигментном эпителии сетчатки (Housset et al., 2013; Nishida et al., 2003).
CRX функционирует синергично вместе с транскрипционными факторами палочек и колбочек, чтобы координированно контролировать экспрессию генов фоторецепторов. CRX соединяется с локусами генов мишеней фоторецепторов (Boatright et al., 1997; Bobola et al., 1999; Chau et al., 2000; Chen et al., 2002; Corbo et al., 2010; Fei et al.,1999; Furukawa et al., 1997; Livesey et al., 2000; Peng and Chen, 2005) и может непосредственно активировать промоторы генов мишеней in vitro, включая Rhodopsin (accession no. NP_001014890.1) и свой собственный промотор (Chau et al., 2000; Chen et al., 1997; Kimura et al., 2000; Langmann et al., 2008). CRX, как полагают, в основном действует как активатор транскрипции в фоторецепторах, как показывает определение профиля экспрессии Crx Knock-OUT (KO) мышей (Blackshaw et al., 2001; Furukawa et al., 1999; Hsiau et al., 2007), но может быть ассоциирован с репрессией в определенном геномном контексте (Corbo et al., 2010; Kwasnieski et al., 2012). Функция CRX's по регуляции транскрипции нуждается в специфических взаимодействиях с ко-факторами, включая histone acetyltransferases GCN5, CBP и p300 (accession nos. AAC50641.1, AAC17736.1, NP_001420.2, соотв.) (Hennig et al., 2013; Peng and Chen, 2007), способствующие ацетилированию гистонов промоторов генов мишеней (Hennig et al., 2008; Peng and Chen, 2007) и обеспечивающие энхансер/промотор внутрихромосомные взаимодействия с помощью петель мишеней фоторецепторных генов (Peng and Chen, 2011). Эти события по ремоделированию хроматина и транскрипционной активации последовательно регулируются во время развития сетчатки (Peng and Chen, 2007). CRX также поддерживает специфические взаимодействия с транскрипционными ко-регуляторами, включая специфичные для палочек транскрипционные факторы NRL (Mitton et al., 2000; Nichols et al., 2010) и NR2E3 (Peng et al., 2005; Roduit et al., 2009), чтобы координировано контролировать экспрессию фоторецепторных генов (Mears et al., 2001; Rehemtulla et al., 1996), при этом NR2E3 обладает двойной активирующей и репрессирующей активностью (Chen et al., 2005; Cheng et al., 2004, 2006; Peng et al., 2005; Webber et al., 2008). CRX, NRL и NR2E3 совместно оккупируют промоторы генов мишеней и энхансеры in vivo (Peng and Chen, 2005), и синергично способствуют экспрессии генов палочек (Mitton et al., 2000). Геномное профилирование CRX (Corbo et al., 2010) и NRL (Hao et al., 2012) показало, что высокий процент генов, связываемых с помощью NRL, также связывается с помощью CRX. Мышиный Knock-OUT (KO) Nrl вызывает переключение судьбы палочек на "колбочка-подобное" состояние (Daniele et al., 2005; Yoshida et al., 2004), а двойной нокаут (KO) Crx и Nrl ухудшает транскрипцию генов колбочек в этой сетчатке (Hsiau et al., 2007). В др. месте головного мозга CRX широко регулирует транскрипцию в шишковидной железе (Rovsing et al., 2011), а потеря CRX ослабляет навязывание циркадного ритма у мышей (Furukawa et al., 1999).
Classification of Reported Human CRX Mutations
CRX Mutations Associated With Dominant RP, CoRD, and LCA
Мутации в CRX были описаны приблизительно у 2% с LCA, 5% с CoRD и у 1% с RP (Huang et al., 2012). Кстати, описано 50 разных мутаций, (Chen et al., 2013; Huang et al., 2012; Zou et al., 2013) и 25 из этих мутаций совместно сегрегировали с болезненным фенотипом (Fig. 1, Tables 1, 2). Описанные мутации состоят из missense (39%), nonsense (4%), делеций (37%), инсерций (16%), и indel (комбинация инсерции и делеции) (4%) мутаций, но появление каждой из индивидуальных мутаций редкое (Huang et al., 2012). В целом мутации распределяются случайно по кодирующей последовательности, но co-segregating миссенс мутации ограничиваются HD, тогда как сдвига рамки считывания (делеции, инсерции и indel) и нонсенс мутации всегда обнаруживаются в активационных доменах CRX, C-терминальнее относительно HD (Fig. 1). Некоторые миссенс мутации вне HD (Table 1) и одна ранняя инсерционная мутация (P9i1) (Table 2) были описаны, но не была доказана ко-сегрегация с болезненным фенотипом. Это указывает на то, что миссенс мутации и сдвига рамки/нонсенс мутации могут затрагивать дискретные функциональные домены белка CRX. Миссенс мутации могут влиять на способность CRX's HD соединяться с ДНК или взаимодействовать с ко-факторами (Chen et al., 2002; Mitton et al., 2000; Swaroop et al., 1999). Напротив, рамки сдвига/нонсенс мутации не затрагивают HD, но нарушают C-терминальную порцию белка, которая обеспечивает трансактивационную активность CRX's.
Table 1. Summary of CRX Missense Mutations Associated With Retinopathya
Table 2. Summary of CRX Frameshift and Nonsense Mutations Associated With Retinopathya
Figure 2. Schematic showing the position of out-of-frame stop codons in human CRX mRNA. Human CRX coding sequence (hCRX CDS) and messenger RNA (hCRX mRNA) are shown. Scale below indicates the base pair position in hCRX CDS beginning at the start codon. All out-of-frame stop codons in hCRX mRNA coding region and its 3'UTR up to position 1,109 are shown above the schematic. Nucleotide position and stop codon frame are shown in colored text (matched to Table 2) for all predicted termination sites for reported human mutations; non-utilized out-of-frame stop codons are shown in grey text. The positions of all out-of-frame stop codons are indicated in brackets. [-1] and [-2] indicate whether the stop codon is located 1 or 2 bases 5' of the normal reading frame, respectively.
Two Functional Classes of Missense CRX Mutations
У пациентов с ретинопатиями описано 19 миссенс мутаций, 7 из которых ко-сегрегировали с болезненным фенотипом (Fig.1, Table 1). Совместно сегрегирующие миссенс мутации все были расположены в домене, связывающем ДНК, в CRX. Фенотипический и функциональный анализ типичных представителей мутаций суммирован Tran et al. (2014), он подтвердил, что имеется, по крайней мере, два класса миссенс мутаций, вызывающих болезнь (Class I и II): (I) гипоморфные миссенс мутации, которые снижали связывание с ДНК (Fig. 1, gold text) и (II) антиморфные миссенс мутации или с неизменным или не охарактеризованным связыванием с ДНК (Fig. 1, purple text). Гипоморфные CRX мутации теряют трансактивационную активность из-за снижения активности по связыванию ДНК, но не вмешиваются в функцию WT CRX. Антиморфные CRX мутации вмешиваются в транскрипционную активность WT CRX, или непосредственно через белок/ДНК взаимодействия или косвенно посредством дискретных клеточных механизмов. Мутации: p.R41W, p.R41Q и p.R90W предположительно отнесены к Class I мутациям (Fig. 1; gold text). Эти три мутантных белка имеют пониженное связывание ДНК и сниженную способность трансактивировать промотор хорошо охарактеризованного гена мишени для CRX гена Rhodopsin in vitro и, как полагают, представляют собой гипоморфные мутантные белки (Chen et al., 2002; Nichols et al., 2010; Swaroop et al., 1999; Tran et al., 2014). p.R90W белок не вмешивается в трансактивационную активность WT CRX (Tran et al., 2014). Мутации p.E80A, p.E80Q, p.E80K и p.K88N предположительно относятся к Class II мутациям (Fig. 1, purple text). p.E80A, p.E80Q и p.E80K превращают негативно заряженный glutamate или в нейтральную или позитивно заряженную aa и могут оказывать сходные эффекты на функцию CRX's белка. Хотя p.E80A не обладает пониженными связыванием ДНК или трансактивационной активности (Chen et al., 2002), он обнаруживает антиморфную активность на экспрессию специфичного для фоторецептора гена Rh5 у Drosophila in vivo (Terrell et al., 2012). p.K88N также обнаруживает пониженную трансактивацию и обладает антиморфной активностью на экспрессию NRL in vitro (Nichols et al., 2010). Однако in silico моделирование p.K88N белка предсказывает снижение способности связывания ДНК, подтверждая, что он может действовать посредством разных антиморфных механизмов, хотя это ещё не было показано экспериментально (Nichols et al., 2010). Несмотря на то, что ДНК связывающие свойства и специфические антиморфные механизмы мутаций Class II не были охарактеризованы полностью, эти мутации четко представляют отличающийся класс мутаций от гипоморфного Class I, исходя из молекулярной активности и фенотипа болезни. Class I мутации все ассоциированы с поздно начинающейся CoRD (Chen et al., 2002; Huang et al., 2012; Paunescu et al., 2007; Rivolta et al., 2001; Sohocki et al., 1998; Swain et al., 1997; Swaroop et al., 1999), тогда как Class II мутации ассоциированы с рано начинающимися adCoRD/LCA (den Hollander et al., 2008; Freund et al., 1997; Huang et al., 2012; Nichols et al., 2010; Rivolta et al., 2001; Sankila et al., 2000; Sohocki et al., 1998; Terrell et al., 2012).
Two Functional Classes of Frameshift and Nonsense CRX Mutations
Кстати, 29 сдвига рамки и 3 нонсенс CRX мутаций было описано у пациентов с болезнями сетчатки, 18 из которых, как известно, ко-сегрегируют с болезненным фенотипом (Fig. 1, Table 2). Фенотипический и функциональный анализ характерных мутаций суммирован Tran et al. (2014) и Roger et al. (2014) и указывает, по крайней мере, на два функциональных класса (Class III и IV): (III) антиморфные frameshift/nonsense мутации с неизменным связыванием с ДНК (Fig. 1, red text) и (IV) антиморфные мутации сдвига рамки считывания, которые вмешиваются в связывание ДНК (Fig. 1, blue text). Поскольку все из ко-сегрегирующих мутаций имеют интактный HD, позиция и размер мутаций сдвига рамки считывания определяется тем, какой из out-of-frame стоп кодонов прекращает трансляцию. Этот новый C-конец д. изменять функцию мутантного белка и нарушать нормальную физиологию. Антиморфная активность мутантных белков, которые поддерживают связывания ДНК, д. проистекать из прямой конкуренции мутантного и wild-type (WT) CRX на промоторы генов мишеней, тогда как мутантные белки, которые теряют способность связывать ДНК, скорее всего, действуют посредством др. механизма. Table 2 представляет список всех описанных frameshift мутаций, включая предполагаемую позицию стоп кодона и длину не гомологичного С-терминального хвоста. Figure 2 показывает позицию out-of-frame стоп кодона в мРНК CRX человека с [-1] и [-2], т.е при сдвиге рамки на одну base pair (bp) и 2 bp в 5' направлении от нормальной рамки считывания, соотв. Мутации в Table 2 закодированы цветом, чтобы подобрать соотв. предсказываемый новый стоп кодон, показанный на Figure 2. Большинство ко-сегрегирующих frameshift/nonsense мутаций приводят к преждевременному укорочению белка CRX и несут короткий не гомологичный С-терминальный хвост в пределах от 0 до 55 aa (Fig. 1, red text; Table 2), который д. оказывать минимальное влияние на активность связывания ДНК. Мутации p.E168d1, p.E168d2, p.A196d4, p.G217d1 и возможно некоторые др. frameshift/nonsense мутации являются предположительно мутациями Class III (Fig. 1, red text). Мутантные белки p.E168d1, p.E168d2, p.A196d4 и p.G217d1 все теряют способность трансактивировать промотор Rhodopsin (Chen et al., 2002). Кроме того, p.E168d2 сохраняет активность связывания ДНК и вмешивается в функцию WT CRX (Tran et al., 2014). p.I138fs48 также обнаруживает антиморфную активность на экспрессию гена мишени у Drosophila Rh5 (Terrell et al., 2012). Эти находки подтверждают, что Class III мутантные CRX белки сохраняют связывание ДНК, теряют трансактивационную активность и обладают антиморфной активностью.
Ко-сегрегирующие мутации: p.P237d2, p.P263d1 и p.P272d3i2 предположительно относятся к Class IV мутациям (Fig. 1, blue text, Table 2). Каждая из этих мутаций дает длинное не гомологичное C-терминальное удлинение в пределах 97-133 aa, увеличивая общий размер белка на 70 aa, это д. существенно влиять на функцию белка и связывание ДНК. Это удлинение возникает из-за того, что следует после [-1] стоп кодона в позиции 686 bp, и нет др. [-1] стоп кодона вплоть до 1,109 bp, который находится на 211 bp дальше по сравнению с позицией нормального стоп кодона CRX's (Fig. 2). Следовательно, любая мутация после после позиции 686-bp, которая сдвигает рамку считывания на 1 bp в 5' направлении должна приводить к длинному не гомологичному С-терминальному удлинению. Этот эффект демонстрируется с помощью CrxRip мышей, которые несут спонтанную мутацию p.G255d1, дающую мутантный CRX белок с 133 aa не гомологичным C-терминальным удлинением (Roger et al., 2014). Поскольку нет непосредственной мутации у человека, эквивалентной p.G255d1, мутации p.L237d1, p.S240i23, p.T251d1, p.P263d1 и p.P272d3i2 все имеют сходное не гомологичное C-терминальное удлинение и ассоциируют только с болезнью с ранним началом CoRD/LCA (Table 2; blue text). CRXRIP белок не соединяется с CRX ДНК мишенью, рано укороченный белок CRX 1-254 сохраняет связывание ДНК (Roger et al., 2014). CRXRIP также теряет трансактивационную активность, но не вмешивается в функцию WT CRX in vitro (Roger et al., 2014). Большинство мутаций Class III и IV ассоциировано с начинающейся рано (~0-20 лет) доминантной CoRD/LCA (Chen et al., 2013; Dharmaraj et al., 2000; Freund et al., 1997, 2008; Galvin et al., 2005; Hanein et al., 2004; den Hollander et al., 2008; Huang et al., 2012; Itabashi et al., 2004; Jacobson et al., 1998; Kitiratschky et al., 2008; Koenkoop et al., 2002; Lines et al., 2002; Lotery et al., 2000; Nakamura et al., 1998; Nichols et al., 2010; Paunescu et al., 2007; Perrault et al., 2003; Rivolta et al., 2001; Silva et al., 2000; Sohocki et al., 1998; Tzekov et al., 2001; Walia et al., 2010; Wang et al., 2007; Zhang et al., 2001; Ziviello et al., 2005; Zou et al., 2013). Тяжёлые доминантные фенотипы ассоциируют с мутациями Class IV, подтверждая, что они обладают антиморфной активностью, несмотря на предсказание, что они снижают активность связывания ДНК. Итак, эти находки подтверждают, что мутации Class III и IV функционально различны, хотя обладают антиморфной активностью и ассоциируют с тяжелыми рано возникающими ретинопатиями.
Mechanistically Distinct Animal Models for CRX-Associated Disease
Non-Mammalian Animal Models Identify Functional Roles of CRX
Роль CRX и влияние мутантных белков CRX на развитие сетчатки исследованы на многих животных моделях. Поскольку развитие сетчатки у млекопитающих управляется трио "paired-like" гомеодоменовых транскрипционных факторов OTX1, OTX2 и CRX (Nishida et al., 2003; Furukawa et al., 1997; Chen et al., 1997; Plouhinec et al., 2003), развитие сетчатки у Drosophila управляется с помощью одиночного гомеодоменового транскрипционного фактора, Otd (Ranade et al., 2008; Vandendries et al., 1996). Специфичная для фоторецепторов потеря функции Otd у otd uvi мутантных мух приводит к развитию онтогенетических дефектов и к нечувствительности к УФЛ свету (Terrell et al., 2012; Vandendries et al., 1996). Человеческие CRX и OTX2 восстанавливают разные аспекты фенотипа, нарушенного развития фоторецепторов мух otd uvi, подтверждая различные, но всё ещё перекрывающиеся функции для CRX и OTX2 (Terrell et al., 2012). Кроме того, мутантные CRX белки p.R90W (Class I), p.E80A (Class II) и p.I138fs48 (Class III) обладают частичной и перекрывающейся функцией восстанавливать морфологию фоторецепторов Drosophila и экспрессию генов, тогда как p.K88N (Class II) неспособен восстанавливать фенотип otduvi. Из этих мутантных белков только p.E80A и p.I138fs48 обладают антиморфной активностью у Drosophila, при этом p.I138fs48 обнаруживает самый сильный эффект (Terrell et al., 2012). В др. исследованиях с morpholino нокдауном Zebrafish Crx показано, что CRX является критическим для развития фоторецепторов и биполярных клеток (Shen and Raymond, 2004), а lipofection Otx5b, гомолога Crx у Xenopus laevis заставляет ретинальные предшественники принимать судьбу фоторецепторов (Viczian et al., 2003). Итак, модельные животные не млекопитающие демонстрируют высоко консервативную роль CRX и гомологов гомеодоменового транскрипционного фактора в развитии сетчатки и экспрессии генов фоторецепторов.
Crx Knock-OUT Mouse Elucidates CRX's Role in Mammalian Retinal Development and Serves as a Non-Functioning Photoreceptor Model for Translational Research
Роль Crx в развитии сетчатки млекопитающих впервые была охарактеризована in vivo на модели с потерей функции, i Crx Knock-OUT (KO) мышах (Furukawa et al., 1999). В гомозиготной Crx KO ("-/-") сетчатке мыши фоторецепторы неспособны формировать наружный сегмент, высоко специализированную органеллу, содержащую зрительные пигменты опсины и др. белки, необходимые для фототрансдукции. Как результат, -/- фоторецепторы не функционируют образуют аномальные синапсы и подвергаются прогрессивной дегенерации (Furukawa et al., 1999; Morrow et al., 2005). Изучение профилей генной экспрессии показало, что -/- мыши обнаруживают сильное снижение экспрессии многих, специфичных для фоторецепторов генов (Blackshaw et al.,2001; Hsiau et al., 2007; Livesey et al., 2000). Большинство из этих генов являются непосредственными мишенями для CRX (Corbo et al., 2010).
Поскольку -/- мыши полностью лишены функции палочек и колбочек, они являются превосходной моделью для разработки трансляционных подходов с целью восстановления функции фоторецепторов. Происходящие из эмбриональных стволовых клеток человека ретинальные клетки или развывшиеся из мышиных палочек, трансплантированные в -/- сетчатку, оказались способны интегрироваться в сетчатку, дифференцироваться в типы клеток зрелой сетчатки и восстанавливать до некоторой степени функцию сетчатки (Lamba et al., 2009, Homma et al., 2013). Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-обеспечиваемая генная терапия также была использована для целенаправленной доставки WT CRX в незрелые фоторецепторы -/- мышей. Клетки, экспрессирующие доставленный CRX, активируют нижестоящую транскрипцию и восстанавливают некоторую функцию сетчатки (Watanabe et al., 2013). Эти исследования показали, что подходы, базирующиеся на клетках и генах обладают потенциалом восстанавливать зрение в сетчатке с нефункциональными фоторецепторами.
Мыши Crx -/- демонстрируют центральную роль CRX в развитии фоторецепторов, экспрессии генов и в формировании зрения. Однако, гетерозиготные Crx KO мыши ("+/-") обнаруживают лишь легкую задержку развития фоторецепторов и в основном обнаруживают нормальную морфологию, экспрессию генов и функцию сетчатки у взрослых (Furukawa et al., 1999). Кроме того, отсутствуют ко-сегрегирующие мутации у человека, вызывающие делецию гена CRX. Следовательно, единственная модель Crx KO мышей не предоставляет достаточно доказательств, что аллели потери функции и нулевые аллели вызывают доминантную болезнь у людей и также не воспроизводят тяжелые доминантные формы болезни.
CrxR90W: A Mouse Model for Recessive LCA Caused by a Class I Mutation
CrxR90W Knock-IN (K-IN) мыши ("R90W") несут missense мутацию p.R90W в гомеодомене CRX (Fig. 1, gold text bottom) (Tran et al., 2014). Белок p.R90W плохо соединяется с ДНК и имеет низкую трансактивационную активность, что относит R90W мышей к мутациям Class I (Fig.1; gold text). У человека мутация p.R90W ассоциирует с доминантной, начинающейся достаточно поздно CoRD и рецессивным LCA фенотипом (Swaroop et al., 1999). Сходным образом, R90W мыши (R90W/+) обнаруживают очень умеренный доминантный фенотип в колбочках, тогда как гомозиготные мыши ( R90W/W) полностью слепы (Tran et al., 2014). R90W/+ мыши обладают нормальными морфологией сетчатки и экспрессией генов у взрослых и лишь незначительным функциональным дефицитом в возрасте 6 мес., (ERG). R90W/W сетчатка мыши имеет аномальную морфологию фоторецепторов в виде отсутствия наружных сегментов, сильно нарушенной экспрессии генов и полной слепотой. Гетерозиготные и гомозиготные R90W мыши обнаруживают фенотипы, которые лишь слегка отличаются от мышей, несущих нулевой аллель Crx (Crx KO мыши), подтверждая, что с потерей функции, нулевые и гипоморфные CRX мутанты продуцируют умеренный доминантный ретинальный фенотип и рецессивный LCA.
CrxE168d2: A Mouse Model for Dominant LCA Caused by a Class III Mutation
CrxE168d2 K-IN мыши ("E168d2") несут делецию, вызывающую сдвиг рамки, p.E168d2, которая приводит к раннему укорочению трансактивационных доменов CRX (Fig. 1, red text bottom) (Tran et al., 2014). P.E168d2 белок сохраняет способность соединяться с ДНК мишенью, но неспособен активировать транскрипцию генов мишеней и мешает трансактивационной активности WT CRX in vitro (Tran et al., 2014), это позволяет отнести p.E168d2 к мутациям Class III (Fig. 1, red text bottom). У человека p.E168d2 ассоциирует с доминантной формой LCA (Freund et al., 1998; Jacobson et al., 1998). Гетерозиготные сетчатки E168d2 мыши (E168d2/+) функционально ослаблены, а гомозиготные мыши E168d2 (E168d2/d2) полностью слепы (Tran et al., 2014). E168d2/+ мыши имеют на 67% меньше колбочек, чем WT мыши 1 мес. В этом возрасте, E168d2/+ мыши имеют неизмененные палочки, подтверждая, что дегенерация колбочек происходит перед дегенерацией палочек, но наружные сегменты палочек существенно укорочены. Большинство палочек E168d2/+ мышей теряется к 6 мес. E168d2/+ сетчатка обнаруживает снижение экспрессии некоторых ключевых генов фототрансдукции, как во время развития, так и у взрослых. Фоторецепторы E168d2/d2 мышей не образуют наружные сегменты и у них значительно сильнее нарушена экспрессия генов, чем в фоторецепторах Crx-/- мышей. Наружный ядерный слой в сетчатке E168d2/d2 дегенерирует значительно быстрее, чем у -/- мышей, ещё больше подчеркивая антиморфную функцию белка p.E168d2. В отличие от Crx, KO, или R90W мышей, E168d2 мыши обнаруживают рано возникающий доминантный фенотип LCA, указывая тем самым, что мутации, которые укорачивают домен активации CRX, но сохраняют связывание с ДНК, действуют антиморфным способом и вызывают большие повреждения, чем мутации потери функции и гипоморфные. Мыши Crx E168d2 представляют собой модель CRX-ассоциированного, рано начинающегося LCA, вызываемого антиморфными мутациями сдвига рамки считывания, которые сохраняют активность связывания ДНК.
Доминантный фенотип E168d2 также контрастирует с рецессивным фенотипом др. Crx мутантных мышиных моделей Crxtvrm65 (tvrm65), которые несут нонсенс мутацию в L277 (Won et al., 2011) (Fig. 1, grey text). Укорачивающая мутация у tvrm65 мышей сохраняет активационные домены белка CRX, но удаляет OTX хвостовой домен, подтверждая присутствие или отсутствие активационных доменов может быть критическим детерминантом антиморфных свойств укороченных белков. Поскольку отсутствует эквивалента болезнь-вызывающая мутации tvrm65, то эта модель не будет обсуждаться далее.
The CrxRdy Cat Provides a Parallel Large Animal Model With a Class III Mutation to the E168d2Mouse
CrxRdy (Rdy) кошки, носители мутации сдвига рамки в Crx, p.A182d1, дают укороченный CRX белок лишь в 14 aa на C-конце относительно p.E168d2 мутации (Menotti-Raymond et al., 2010), указывая на то, что она также может быть мутацией Class III (Fig. 1, red text). CrxRdy кошки обнаруживают тяжелые доминантные нарушения функции сетчатки, как показывает ERG, дегенерацию фоторецепторов и аномальную экспрессию Rhodopsin (Chong et al., 1999; Curtis et al., 1987; Leon & Curtis, 1990, 1991; Menotti-Raymond et al., 2010). Все эти находки согласуются с доминантным LCA фенотипом E168d2 мышей. В то время как молекулярная функция белка Rdy ещё полностью не охарактеризована, она, по-видимому, обнаруживает сходную антиморфную активность с мутантным белком p.E168d2. Сходство фенотипов Rdy кошек и E168d2 мышей подтверждает, что они являются хорошо соответствующими моделями крупных и мелких животных. которые, скорее всего, обладают общим механизмом возникновения болезни.
CrxRip: A Mouse Model for Dominant LCA Caused by a Class IV Mutation
CrxRip мыши (Retina with Immature Photoreceptors, "Rip") несут frameshift делецию p.G255d1, которая дает в 133 aa не гомологичное C-терминальное удлинение белка CRX protein (Fig. 1, blue text) (Roger et al., 2014). Rip спонтанная мутация, которая идентифицирована с помощью анализа поперечных сшивок и секвенирования, и exome capture секвенирования (Roger et al., 2014). RIP белок не связывает мишень ДНК, неспособен активировать транскрипцию генов мишеней и не вмешивается в трансактивационную активность WT CRX in vitro (Roger et al., 2014). В отличие от +/-, R90W/+ и E168d2/+ мышей, однако, гетерозиготные Rip мыши (Rip/+) полностью слепы, подтверждая, что RIP белок обладает сильной антиморфной активностью in vivo. Эти находки позволяют отнести Rip к мутациям Class IV. Фоторецепторы Rip/+ мышей не формируют наружные сегменты, и сетчатка взрослых Rip/+ мышей обнаруживает даже более низкую экспрессию некоторых ключевых генов фототрансдукции, чем мыши -/-. Сильный дефицит в палочках и колбочках экспрессии генов, подтверждает, что имеется дефект дифференцировки фоторецепторов у Rip/+ мышей. Несмотря на эти сильные изменения в экспрессии в 18 мес. толщина наружного ядерного слоя в сетчатке Rip/+ мышей грубо сравнима с таковой у 6-мес. E168d2/+ мышей. Подобно -/-, R90W/W и E168d2/d2 мышам, гомозиготные Rip (Rip/Rip) мыши не образуют наружных сегментов и полностью слепы (Roger et al., 2014). Эти находки подтверждают, что RIP белок обладает более сильным антиморфным эффектом на экспрессию и функцию генов фоторецепторов, но менее токсичен, так что фоторецепторы выживают по сравнению с белком p.E168d2. Crx Rip мыши представляют модель CRX-ассоциированного доминантного LCA, вызываемого антиморфной frameshift мутацией с пониженной активностью связывания ДНК.
Discrete Cellular Mechanisms Underlie the Crx E168d2 and Rip Mouse Phenotypes
Crx frameshift мутации p.E168d2 (Class III) и Rip (Class IV) дают мутантные белки с отличающимися молекулярными функциями и дают разные фенотипы сетчатки мышей. Эти контрастирующие фенотипы не просто градации в тяжести болезни, но вызываются разными клеточными механизмами. Оценка экспрессии CRX в сетчатке у гетерозигот и гомозигот R90W (Class I), E168d2 и Rip мышей выявила аллель-специфичную избыточную экспрессию укороченного p.E168d2 белка по сравнению с WT CRX (Fig. 3A) (Tran et al., 2014). Эта избыточная экспрессия не обнаруживается в сетчатке R90W или Rip мышей (Fig. 3A,B) (Roger et al., 2014; Tran et al., 2014). Аллель-специфическая избыточная экспрессия p.E168d2 наблюдалась также на уровне мРНК (Tran et al., 2014), указывая на механизм, зависимый от мРНК. Аллель-специфическая избыточная экспрессия др. прогнозируемой Class III CRX мутации, p.I138d1, была описана in vitro и у Drosophila in vivo экспериментах по восстановлению (Table 3) (Nichols et al., 2010; Terrell et al., 2012), подтвердив возможность консервативного механизма избыточной экспрессии такого типа мутации. В отличие от p.I138d1, мутантные белки: p.R90W (Class I), p.K88N (Class II) и p.E80A (Class II) не обнаруживают избыточную экспрессию in vitro или у Drosophila in vivo (Table 3) (Nichols et al., 2010; Terrell et al., 2012), подтверждая, что аллель-специфическая избыточная экспрессия может быть ограничена мутациями, вызывающими укорочение.
Figure 3. Expression of CRX protein in mutant mouse retinas. A: Immunoblot analyses showing the expression of CRX protein in P10 E168d2, E168d2neo, R90W, and R90Wneo mouse retinas using the rabbit polyclonal CRX 119b-1 antibody and mouse monoclonal anti-?-ACTIN antibody (?-BACT, Sigma-Aldrich) (Tran et al., 2014). Lanes are numbered below for reference. R90Wmice express a normal length ?37kDA mutant CRX protein (lanes 6 and 8),E168d2 mice overexpress a truncated ?27kDA mutant CRX protein (lanes 2 and 4), and the intronic neo cassette results in reduced expression of both the R90W (lanes 7 and 9) and E168d2 (lanes 3 and 5) proteins. B: Immunoblot analyses showing the expression of CRX protein in 1-mo Rip mouse retinas using rabbit polyclonal CRX H-120 antibody (Santa Cruz) and mouse monoclonal anti-?-ACTIN antibody (Actin, Millipore) (Roger et al., 2014). Ripmice express an elongated ?44kDA mutant CRX protein.
Table 3. Mutant CRX Protein Levels in Alternate Expression Systemsa
Поскольку p.E168d2 является антиморфным белком, его избыточная экспрессия д. быть важным генетическим модификатором тяжести болезни. Мыши, несущие E168d2neo ту же самую укороченную мутацию CRX, но сохраняющую интронную neomycin (neo) кассету, которая была удалена из финальной E168d2 линии. Эта neo кассета специфически вмешивается в экспрессию мутантного аллеля, но не влияет на экспрессию WT CRX (Tran et al., 2014), эффективно сдвигает баланс WT: mutant белок к одинаковому соотношению. E168d2neo /+ мыши всё ещё пониженную функцию сетчатки по сравнению с мышами WT, но имеют более высокую функцию, чем мыши E168d2/+ , судя по ERG. Палочки E168d2neo/+ мышей формируют нормальной длины наружные сегменты и интактны в течение первого года жизни, тогда как колбочки медленно теряются в течение этого периода. Экспрессия генов в E168d2neo /+ палочках и колбочках остается сниженной, но выше, чем у мышей E168d2/+. В целом, E168d2neo/+ мыши обнаруживают значительно менее тяжелый фенотип, чем E168d2/+ и служат в качестве модели менее тяжелой CoRD. Итак, эти находки подчеркивают аллель-специфическая избыточная экспрессия укороченного CRX белка p.E168d2 является критическим механизмом болезни, который может быть законсервирован у др. укорачивающих frameshift мутаций.
Crx Rip мыши не обнаруживают избыточную экспрессию мутантного CRX белка (Fig. 3B), всё же они обнаруживают даже более сильные нарушение зрения, чем E168d2 мыши. Кроме того, экспрессия ключевых генов фототрансдукции прогрессивно ухудшается в сетчатке Rip/+ мышей с P2 по P21, тогда как экспрессия тех же самых генов улучшается с P10 по P21 в сетчатке E168d2/+ мышей (Roger et al., 2014, Tran et al., 2014). Фенотип Rip/+ мышей подтверждает, что белок RIP обладает сильной антиморфной активностью. Однако, в отличие от p.E168d2 белка, RIP белок не мешает трансактивационной активности WT CRX in vitro (Roger et al., 2014), подтверждая иной антиморфный механизм. Roger et al., (2014) полагают, что этот механизм использует OTX2, который играет критическую роль в развитии фоторецепторов. OTX2 обнаруживает умеренную избыточную экспрессию (~1.5-2.0 раза) в сетчатке гетерозиготных и гомозиготных Rip, KO, R90W и d E168d2 мышей (Roger et al., 2014; Tran et al., 2014) , а потеря OTX2 в Crx KO фоторецепторах дает более сильное фенотипическое отклонение (Hsiau et al., 2007), подтверждая, что OTX2 может играть компенсаторную роль в этих сетчатках. Поскольку OTX2 экспрессируется у Rip/Rip мышей, он не способен связываться с ДНК мишенью, включая промотор Nrl (Roger et al., 2014). В отличие от сетчатки E168d2/+ мышей, где экспрессия NRL поддерживается, сетчатка Rip/+ мышей первоначально экспрессирует NRL на ст. P6, но прогрессивно теряет экспрессию к ст. P21. Нарушение функции CRX и OTX2, и потеря экспрессии NRL приводят к неполной дифференцировке фоторецепторов и к тяжелым нарушениям экспрессии генов в палочках и колбочках сетчатки Rip/+ мышей. К дальнейшему выяснению этого механизма, электропортация или WT CRX или OTX2 обеспечивает клеточно автономное восстановление экспрессии Rhodopsin в сетчатке Rip/+ мышей, а трансгенная экспрессия NRL под контролем промотора Crx делает возможным частичное восстановление Rip/+ фенотипа (Roger et al., 2014). Дефект дифференцировки фоторецепторов Rip/+ не наблюдается у E168d2/+ мышей, которые экспрессируют специфичные для палочек и колбочек гены, формируя наружные сегменты и устанавливая функции сетчатки, хотя всё ещё не пониженных уровнях по сравнению с WT мышами. Кроме того, сохраняется наружный ядерный слой клеток в течение длительного периода времени у Rip/+ мышей по сравнению с E168d2/+ мышами, подтверждая различающиеся онтогенетические и дегенеративные фенотипы в каждой модели. Итак, сеть транскрипционных факторов фоторецепторов сильно нарушается у Rip/+ мышей, приводя к дефектам в дифференцировке фоторецепторов с отличающейся патологией по сравнению с E168d2/+ мышами. Эти находки подтверждают, что антиморфные активности мутаций Class III и IV CRX различны и дают разные фенотипы.
Future Directions
Caveats and Remaining Gaps in Mammalian Models of CRX-Associated Disease
Мыши Crx KO, R90W, E168d2, Rip и кошки Rdy могут служить в качестве фенотипически отличающихся моделей млекопитающих болезней сетчатки (Table 4). вызываемых CRX мутантными белками с разными молекулярными функциями (Fig. 4). Мы полагаем, что эти линии мышей и кошек служат представительными моделями для разных классов болезнь-вызывающих CRX мутаций, исходя из доступных генетических и молекулярных данных. Дальнейшее исследование болезнь-вызывающих мутаций позволит, скорее всего, выявить дополнительные классы мутаций со специфическими молекулярными дефектами. Редкость каждой индивидуальной болезнь-вызывающей мутации делает непрактичным моделирование каждой. Следовательно, имея пару моделей, несущих сходные мутации, подобно E168d2 мыши и Rdy кошки, может быть чрезвычайно ценным для перекрестной оценки возможных механизмов болезни и тестирования терапии, предназначенной для этого класса мутаций. Сегодня нет подходящей модели млекопитающих для missense мутаций с антиморфной активностью (Class II). Мутантные CRX белки p.E80A и p.K88N обладают различающейся антиморфной активностью (Chen et al., 2002; Nichols et al., 2010; Terrell et al., 2012), но ни одна не охарактеризована у млекопитающих. Кроме того, дополнительные доступные модели не решают фенотипическую вариабельность, наблюдаемую у пациентов со сходным типом CRX мутаций. Напр., мутация p.E168d1 ассоциирует с CoRD фенотипом (Freund et al., 1997), тогда как p.E168d2 ассоциирует с более тяжелым LCA фенотипом (Freund et al.,1998). Неизвестно, как генетический фон или внешне средовые факторы влияют на эти вариабельные фенотипы. Итак, на сегодня доступные Crx мутантные линии животных коллективно служат в качестве представительной модели множественных форм, ассоциированных с CRX болезней, но др. формы всё ещё остаются не представленными.
Table 4. Summary of Rod and Cone Phenotypes in Mammalian Mutant Crx Models
Figure 4. Proposed pathogenic mechanisms of mutant CRX proteins in mammalian models. A: In WT mice, CRX coordinately regulates transcription by interacting with target DNA and co-factors including the rod-specific transcription factor NRL. B: In E168d2/+ mice and possibly Rdy/+ cats, a Class III mutant CRX is overexpressed and directly competes with WT CRX, producing an LCA phenotype. C: In R90W/+ mice, a Class I mutant CRX is expressed and largely does not interfere with WT CRX producing only a mild late-onset CoRD phenotype. D: In Rip/+ mice, a Class IV mutant CRX is expressed and disrupts the photoreceptor transcription factor network including the loss of NRL expression, producing an LCA phenotype with distinct pathology from E168d2/+ and Rdy/+. E-H: Homozygous Crx KO, E168d2, R90W, and Rip mice all produce a LCA phenotype and are completely blind from birth. CRX target gene expression is severely impaired in all homozygous mice with E168d2/d2 and Rip/Rip mice having the strongest changes. This figure was adapted from Tran et al., (2014).
Understanding the Mechanisms of Crx E168d2 and Rip Antimorphic Activity
Мыши Crx E168d2 и Rip обнаруживают разные доминантные фенотипы, вызываемые разными механизмами. Мутантные белки p.E168d2 и RIP обладают антиморфной активностью, но функционально различны (Fig. 4) (Roger et al., 2014; Tran et al., 2014). У E168d2 мышей доминантный фенотип был сцеплен с аллель-специфичной избыточной экспрессией мутантного CRX белка (Tran et al., 2014). Поскольку аллель-специфичная избыточная экспрессия p.E168d2 происходит на уровне мРНК и белка, предполагается, что она вызывается внутренне присущими свойствами p.E168d2 мРНК. В то время как мутации сдвига рамки считывания часто ассоциируют с мутантной деградацией мРНК посредством процесса, наз. nonsense-mediated decay (NMD) (Schweingruber et al., 2013), имеется мало прецедентов таких мутаций, вызывающих избыточную экспрессию мРНК. Механизмы, обеспечивающие избыточную экспрессию p.E168d2 пока неизвестны и могут быть связаны с повышенной транскрипцией p.E168d2, стабильностью мРНК или с комбинацией обоих механизмов. Хотя предварительные доказательства подтверждают, что этот феномен законсервирован для др. Class III мутаций, p.I138d1 (Nichols et al., 2010, Terrell et al., 2012), необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить является ли этот феномен консервативным для всех мутаций Class III и если так, то какой используется клеточный механизм. У мышей Rip доминантный фенотип ассоциирован с потерей функции OTX2 и экспрессии NRL (Roger et al., 2014). RIP белок имеет длинное не гомологичное С-терминальное удлинение, влияющее на структуру и функцию белка. RIP не связывается с ДНК или мешает трансактивации WT CRX in vitro и тем самым, как полагают, не вмешивается непосредственно в экспрессию генов мишеней. Возможно, что белок RIP может взаимодействовать с OTX2, CRX или др. ко-факторами в клетке, предупреждая от рекрутирования их на мишени ДНК, или действует косвенно посредством др. клеточных механизмов. Дальнейшая оценка молекулярной функции белка RIP in vitro необходима, для выяснения этого механизма. Кроме того, клетки фоторецепторов в наружном ядерном слое E168d2 и Rip мышей теряются с разной скоростью. Понимание клеточных механизмов, приводящих к деградации наружного ядерного слоя, может быть критическим для разработки терапии, нацеленной на сохранение жизнеспособными фоторецепторы.
Translating Lessons From Animal Models to Therapeutic Approaches
На сегодня не существует стратегий лечения для болезней, ассоциированных с CRX. Доступность "true-to-disease" животных моделей для определенных форм болезни сможет облегчить развитие и тестирование новых терапевтических стратегий. Мыши Crx KO, R90W, E168d2 и Rip предоставляют репрезентативные модели для разных классов болезнь-вызывающих мутаций, каждый с уникальными молекулярными механизмами и патологией (Fig. 4, Table 4). Потенциальное лечение д. быть протестировано на множественных моделях, чтобы опередить его эффективность для разного типа CRX мутаций. Кроме того, E168d2 мыши и CrxRdy кошки предоставляют одинаковые модели на мелких и крупных животных, пригодные для тестирования эффективности терапии для сходных мутаций во многих системах животных. rAAV-обеспечиваемая генная терапия обладает очень высоким потенциалом по восстановлению функции сетчатки для болезней, ассоциированных с CRX, поскольку фоторецепторы эффективно трансдуцируются с помощью rAAV. Эти подходы могут быть успешно использованы для улучшения функции сетчатки у животных моделей дистрофии сетчатки (Acland et al., 2001; Bennicelli et al., 2008; Boye et al., 2010; Jiang et al., 2011; Mancuso et al., 2009; O'Reilly et al., 2007; Tam et al., 2008), также, как и в испытаниях на безопасность у людей (Cideciyan et al., 2008; Colella and Auricchio, 2012; Maguire et al., 2008). Поскольку дефекты функции сетчатки обнаруживаются раньше дегенерации фоторецепторов у E168d2/+ и Rip/+ мышей, то очевидно, что имеется временное окошко для эффективной генной терапии.
Антиморфные CRX мутантные белки обладают "токсичными" эффектами на функцию WT белка. Теоретически, эти токсичные эффекты могут быть снижены путем сдвига соотношения мутантного к WT белку. Этот эффект наблюдается у E168d2/+ и E168d2neo/+ мышей, у которых снижение уровня мутантного белка приводит к менее тяжелому фенотипу. Соотношение WT: mutant CRX белка может быть сдвинуто несколькими способами: (1) доставкой WT аллея для увеличения общего уровня WT CRX; (2) специфическим нокдауном мутантного аллеля, не влияющего на уровень WT аллея; или (3) их комбинацией. Специфический нокдаун мутантных аллелей трудно достижим, т.к. он предназначен для индивидуальных мутаций, которые редки, а различия в нуклеотидах с WT мРНК могут быть незначительным, до одиночного нуклеотида. Комбинаторный нокдаун и доставка гена могут оказаться более генерализованным подходом. Нокдаун Crx short hairpin RNA (shRNA) подавляя экспрессию Crx (mutant+WT) может быть скомбинирован с доставкой гена shRNA-резистентного рекомбинантного Crx (содержащего synonymous мутации).
Conclusions
The generation and characterization of mechanistically distinct animal models have greatly improved our understanding of CRX-associated disease. The phenotypic variation in human patients is, at least in part, driven by mutant proteins with different molecular properties. We have categorized four distinct classes of CRX mutations based on mutation type, the molecular activity of their mutant protein, and associated phenotype. Currently, there are mammalian models carrying mutations from three of these four classes, all of which accurately reflect their associated human phenotypes. These models provide valuable insight into distinct CRX-associated disease pathologies and identify unexpected underlying disease mechanisms that could be targets for therapy. Additionally, these models demonstrate the importance of having comprehensive animal models to more fully represent the complex phenotypes of human diseases and will improve our ability to effectively test therapeutic strategies.
|