CHD возникают в результате аномалий в развитии сердца во время эмбриогенеза. Эти аномалии, как известно, тесно связаны с изменениями в кардиогенными транскрипционными факторами и др. онтогенетическими путями, которые координируют развитие сердца, на что указывает все возрастающее количество CHDs, идентифицированных в ассоциации с мутациями или генетическими вариантами в кодирующих регионах генов, связанных с развитием сердца (Schott et al., 1998; Garg et al., 2003; Bruneau, 2008; Lopes et al., 2011; Zaidi and Brueckner, 2017). Однако, эти примеры могут объяснить только небольшое число случаев CHD. Сегодня считается, что CHD вызываются взаимодействиями между генетическими вариантами и множественными факторами чувствительности.

Одновременная оценка всего экзома пациента и идентификация вариантов причинных генов становится возможной благодаря успехам технологии секвенирования ДНК. Однако, основным ограничением этого подхода является то, что область мутационных исследований ограничивается только 1-2% всего генома, кодирующего белки (Bamshad et al., 2011). Влияние генетической изменчивости в не-кодирующих последовательностях на этиологию сложных болезней известно. Genome-wide association studies (GWASs) показали, что большое количество не-кодирующих вариантов объясняет увеличение риска разных распространенных болезней, обычно за счет нарушений cis-regulatory elements (CREs), которые влияют на уровни экспрессии соседних генов (Visel et al., 2009; Musunuru et al., 2010; Harismendy et al., 2011; Sakabe et al., 2012). Некодирующие варианты могут объяснить некоторые врожденные аномалии, включая CHD. Мутации укорочения мРНК или модификации структуры или аминокислотного состава транскрипционных факторов могут вызывать тяжелые морфологические фенотипы, подобны тем, что встречаются при CHD. Однако, неясно, действительно ли мутации в CREs таких онтогенетических генов могут приводить к вредным эффектам. Предыдущие исследования обнаруживали вариации в CREs, которые затрагивали развитие CHD. Некодирующие мутации в TBX5 кардиальных энхансерах были обнаружены в качестве причины большого количества CHDs, ассоциированных с дисфункцией TBX5, эффективно разделяющих фенотипы сердца и рук при синдроме Holt-Oram (Smemo et al., 2012). В др. исследовании было обнаружено, что пациенты двух семей с CHD несут очень сходную делецию ~1 Mb выше SOX9; деструкция кардиальных энхансеров выше SOX9 , следовательно, отвечть за CHD у людей (Sanchez-Castro et al., 2013).

В нашем исследовании мы установили мутации в промоторе HES1 в семье с CHD. Почти все пробанды (93.75%) несли эту мутацию, указывая, что этот вариант может быть связан с возникновением CHD. При анализе подгруппы мы установили, что гомозиготный вариант достоверно ассоциирован с увеличением CHD. Raetzman et al. отметили, что HES1 играет центральную роль в пролиферации и дифференцировке серии типов клеток и что это существенно для поддержания клеток предшественников в недифференцированном состоянии (Raetzman et al., 2007). Rochais et al. установили, что Hes1 мутантные эмбрионы на день эмбриогенеза 15.5 обнаруживают дефекты расположения элементов тракта оттока, включая дефекты межжелудочковой перегородки и расположенной над ней аорты (Rochais et al., 2009). На более ранних ст. развития, пролиферация SHF и ряд клеток кардиального нервного гребня были репрессированы и тракт оттока не мог полностью сформироваться (extended), это указывает на то, что HES1 необходим для развития кардиальных артерий. Исследование van Bueren et al. показало, что Hes1 мутантные мыши обладают рядом частично пенетрантных дефектов, подобных 22q11DS, включая артерии фарингеальных дуг (pharyngeal arch artery (PAA)), тракт оттока, черепно-лицевые и тимуса аномалии (van Bueren et al., 2010). Эти находки подтверждают, что HES1 тесно связан с развитием кардиального тракта оттока. CHD является структурной аномалией, вызываемой уродствами или аномалиями развития сердца и крупных кровеносных сосудов во время эмбрионального развития, так что вполне возможно, что HES1 тесно связан с возникновением CHD.

Многие исследования сообщают, что аномальная экспрессия HES1 также тесно связана с возникновением CHD. В одном исследовании было продемонстрировано, что избыточная экспрессия HES1 может увеличивать апоптоз и подавлять пролиферацию клеток и что miR-182 оказывает защитный эффект путем супрессии HES1 в кардиомиоцитах, подвергнутых гипоксии (Zhang et al., 2018). Wu K et al. установили, что экспрессия HES1 повышена у мышей, моделирующих CHD, и что активация пути передачи сигналов NOTCH может приводить к CHD (Wu et al., 2018).

В нашем исследовании мы продолжили исследования уровней белка и мРНК HES1 в RVOT от пациентов с CHD с разными генотипами и в контроле. Мы установили, что экспрессия HES1 у пациентов с гомозиготными мутациями была достоверно выше, чем у дикого типа CHD пациентов и нормальной в контроле. Результаты др. исследователей согласуются с нашими наблюдениями. Поскольку этот вариант расположен в промоторе HES1, то мы предположили, что он может увеличивать экспрессию HES1, путем воздействия на транскрипцию этого гена, активируя тем самым путь передачи сигналов NOTCH, чтобы нарушить нормальный рост и развитие кардиального тракта оттока.

Чтобы протестировать данную гипотезу, мы осуществили серию экспериментов с клетками и показали, что активность мутантного энхансера достоверно выше, чем энхансера дикого типа. Эффект этого варианта HES1 промотора на активность фрагмента был подтвержден прямо. Кроме того, чтобы наблюдать, действительно ли вариант HES1 промотора непосредственно влияет на экспрессию эндогенного HES1, мы использовали CRISPR-Cas9 систему, чтобы сконструировать линию мутантных клеток из варианта knock-in HeLa клеток. Эти результаты показали, что уровни мРНК и белка HES1 были достоверно выше в мутантной линии клеток, чем в линии клеток дикого типа. Это показало, что вариант HES1 промотора может в самом деле активировать экспрессию эндогенного HES1.

Мы также осуществили эксперименты с luciferaseс рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагменты дикого типа и мутантного HES1 промотора. Мы установили. что дикого типа фрагменты обладают активностью, усиливающей транскрипцию с рекомбинантной плазмиды. Тем самым мы подтвердили эффект варианта на транскрипционную активность промотора in vitro на клеточном уровне. Для дальнейшего исследования эффекта варианта на транскрипционную активность промотора у животных, мы сконструировали рекомбинантные плазмиды для управления экспрессией GFP под контролем дикого типа и мутантного фрагментов HES1 промотора и вводили эту конструкцию эмбрионам рыбок данио. Затем определяли место экспрессии и интенсивность экспрессии (luminescence ratio) GFP, под управлением рекомбинантных плазмид у рыбок данио, в частности, определяли эффект энхансера этого фрагмента, может ли он управлять экспрессией GFP в сердце и может ли вариант влиять на этот эффект. Мы наблюдали экспрессию GFP в сердце спустя 72 h, на стадии, на которой происходит развитие сердца и начинается дифференцировка и пролиферация (Stainier, 2001; Ackermann and Paw, 2003). У некоторых эмбрионов рыбок данио, GFP экспрессировался также в переднем мозге, хорде и крови. Однако, конструкция с мутантными фрагментами увеличивала пропорцию рыбок данио, экспрессирующих GFP в сердце, подтверждая, что этот вариант HES1 промотора может усиливать специфичную для сердца экспрессию этого фрагмента.

Retinoid X receptors (RXRs) являются ядерными рецепторами, которые действуют как транскрипционные факторы путем соединения со специфическими последовательностями промоторов генов мишеней, участвуя тем самым в обеспечиваемой ретиноидом активации гена, чтобы обеспечить биологические эффекты ретиноидов (Evans and Mangelsdorf, 2014; Piskunov et al., 2014). Путь передачи сигналов retinoic acid (RA), как было установлено, играет важную роль во многих аспектах кардиального развития, включая развитие тракта оттока, подтверждая важную роль RXRA в кардиальном развитии (Cresci et al., 1999; Merki et al., 2005; Xavier-Neto et al., 2015; Stefanovic and Zaffran, 2017). Shantae et al. наблюдали задержку эпикардиального роста у RXRA мутантных эмбрионов, приводящего к эпикардиальным аномалиям и в конечном итоге к порокам сердца. В соответствии с in silico предсказаниями, транскрипционный фактор RXRA может соединяться с этим сайтом (Jenkins et al., 2005; Mascrez et al., 2009). Т.о., HES1 может быть нижестоящей мишенью для гена RXRA. Принимая во внимание важную роль пути передачи сигналов RA в развитии сердца, мы полагаем, что эффект чувствительности варианта промотора HES1, идентифицированный нами, может быть объяснен ослаблением регуляции со стороны RXRA. С помощью luciferase и EMSA мы установили. что этот вариант промотора HES1 может менять взаимодействие между транскрипционным фактором RXRA и последовательностью элементов в промоторе HES1, устраняя ингибирующий эффект RXRA на активность энхансера. Кроме того, мы также прямо подтвердили, что RXRA концентрируется вблизи места варианта промотора HES1 с помощью ChIP-qPCR. Все эти результаты подтверждают нашу гипотезу, что RXRA непосредственно ингибирует экспрессию Fgf8 путем рекрутирования гистонового маркера ингибирования H3K27me3 и polycomb inhibitor complex 2 (PRC2) и что рекрутирование этих факторов зависит от RXRA (Kumar and Duester, 2014). Поэтому мы полагаем, что этот механизм ответственен за RXRA-обеспечиваемое подавление активности энхансера HES1.

Мы установили, что частота основного аллеля энхансера HES1 в нормальной популяции составляет 70.62%, тогда как частота минорного аллеля составляет 29.38%. Следовательно, в соотв. с правилом генетического баланса теоретическая частота гомозиготности, продуцируемая гетерозиготными носителями этого SNP в популяции д. составлять 8.63%. Действительная частота гомозиготности в популяции составляет 9.91%. Тест на Hardy-Weinberg баланс был проведен и оказался P = 0.516, указывая, что контроль в популяции находится в равновесии.

Наше исследование впервые показало, что RXRA ингибирует HES1 энхансер и что функциональная генетическая изменчивость в HES1 энхансере ассоциирует CHD. Однако, это исследование имеет определенные ограничения. Во-первых, размер выборки популяции довольно мал, особенно в отношении количества семей. В будущем, размер выборки необходимо расширить для подтверждения мутационного риска. Более того, количество тканевых выборок также довольно мало и пока невозможно однозначно подтвердить, что экспрессия HES1 достоверно увеличена в тканях сердца пациентов с гомозиготными вариантами. Поэтому также необходимо увеличить выборку, чтобы подтвердить данный вывод. Хотя наше исследование подтвердило, что вариант промотора HES1 ассоциирует с повышенным числом CHD, трудно использовать животные модели для подтверждения прямой корреляции между вариантом и аномальным кардиальным фенотипом, в основном из-за различий в геномике и тонко контролируемых механизмах развития у др. видов. Поэтому патогенетические механизмы д. быть исследованы в будущем с помощью анализа iPSC.