Гены Msx кодируют транскрипционные факторы, которые обладают гомологией с muscle segment homeobox (msh) генами дрозофилы. Как семейство генов, они экспрессируются в разных тканях в ходе эмбриогенеза, хотя наиболее охарактеризованной является их роль в клетках краниального нервного гребня, а значит и в черепно-лицевом развитии [55,56]. Существует три идентифицированных члена этого семейства, Msx1, Msx2 и Msx3, обнаруживающих функциональное перекрывание, т.к. разрушение индивидуального гена приводит к скромным дефектам, тогда как разрушения множественных Msx генов вызывает тяжелые аномалии края нервной пластинки и спецификации нервного гребня [57-61]. Msx1 и Msx2 постоянно необходимы во время спецификации пре-миграторных клеток нервного гребня, т.к. активируют Arl6ip и далее нижестоящие мишени Snai1/2, Foxd3, Ets1 и Zeb2 (Figure 2) [58]. Этот путь приводит к подавлению экспрессии Е-Cadherin, что является существенным для запуска EMT [62]. Помимо этих ранних ролей, Msx1 кроме того, экспрессируется в пери-окулярной мезенхиме эмбрионов мышей и кур, тогда как Msx2 обнаруживается позднее в развитии при формировании из поверхностной эктодермы эпителия роговицы и хрусталика и происходящей из нейрального эпителия сетчатки [63,64]. Однако, нокдаун Msx1 и Msx2 приводит к образованию уродливого и увеличенного глазного бокала у мышей и к микрофталмии у рыбок данио [65]. Такая фенотипическая изменчивость может быть обусловлена межвидовыми различиями в роли Msx генов в развитии переднего мозга и клеток нервного гребня. Необходимо идентифицировать специфические мишени для генов Msx внутри глазного пузырька. Аномалии глазного бокала и колобомы обычно обнаруживаются у мышей и рыбок данио, у которых экспрессия генов, важных для спецификации нервного гребня, генетически нарушена [6,12-14]. Механизмы, лежащие в основе этих взаимодействий с нижестоящими мишенями внутри глазного пузырька будут рассмотрены далее.

Члены семейства Zic (zinc finger of the cerebellum) являются важными регуляторами развития нейроэктодермы и нервного гребня. Существует пять гомологов у кур, мышей и людей и семь в рыбок данио, Zic1, Zic2 и Zic3 изучены наиболее хорошо [66-68]. Zic1 и Zic3 работают вместе в индукции нейральной эктодермы, которая необходима для приобретения клетками нейральной и нервного гребня судьбы [69,70,71]. Однако, их главной ролью является участие в развитии переднего мозга скорее, чем тканей, происходящих из нервного гребня [72-75]. В противоположность Zic1 и Zic3, Zic2 является непосредственной мишенью для передачи сигналов Wnt внутри передней части нервной пластинки в средине гаструляции и инициирует спецификацию края нервной пластинки [76,77]. У мышей эти регулируемая с помощью Zic2 ступень необходима для генерации соотв. количества клеток нервного гребня [78,79]. В дальнейшем у мышей и рыбок данио Zic2 ингибирует E-Cadherin посредством Nlz1/2 и Snai1/2 , чтобы запустить EMT и выход из нервной трубки (Figure 2).

У рыбок данио экспрессия zic2b сохраняется в клетках нервного гребня, тогда как zic2a экспрессируется в ограниченном домене дистальной части глазного стебля [76-80]. Хотя комбинированный нокаут zic2a и zic2b приводит к колобоме с около-глазными кровоизлияниями и отеками, основным дайвером этого фенотипического отклонения является потеря zic2b [79]. Потеря Zic2b приводит к снижению экспрессии alx1 и в меньшей степени в клетках нервного гребня внутри около-глазной мезенхимы, включая клетки нервного гребня, негативные по crestin в области, соседствующей с глазной щелью [79]. Кроме того, zic2b ограничивает передачу сигналов hedgehog (hh) в нейральном эпителии, происходящем из pre-optic части диенцефалона, в глазном стебле и вентральной части сетчатки (Figure 4) [79]. Сходным образом, у рыбок данио, sox4 и sox11 действуют, ограничивая экспрессию hh в вентральной части переднего мозга, рядом с глазным пузырьком. Более того, нокдаун Sox4 или Sox11 приводит к колобомам у рыбок данио [81,82].В то время как оба эти SoxC транскрипционные экспрессируются в переднем мозге, sox4 экспрессируется также в клетках нервного гребня в около-глазой мезенхиме и вместе с zic2b могут оказывать не автономные эффекты на развитие глазного бокала [82]. Подавление zic2b, sox4 или sox11 вызывает неправильное расположение pax2a, vsx1, и vsx2, которые необходимы для дорсального и вентрального паттерна сетчатки и последующего закрытия глазной щели [79,81,82]. Однако, позднее в ходе развития во время дифференцировки клеток ретинальных ганглиев, zic2 противодействует экспрессии sox4 и sox11 при формировании проекций аксонов, не выявлено однако, взаимодействие zic2 и sox4 в нервном гребне [83].

Tfap2 гены кодируют транскрипционный фактор член семейства белков AP-2, который также экспрессируется как в не нейральной эктодерме, так и в клетках нервного гребня во время эмбриогенеза [84,85]. Три гена, Tfap2a, Tfap2b, и Tfap2c, обнаруживают перекрывающуюся, но не идентичную экспрессию в клетках нервного гребня Xenopus и мышей, тогда как только tfap2a и tfap2c экспрессируются у рыбок данио в клетках нервного гребня, демонстрируя специфические отличия в функции генов [84-88]. Из трех генов ген Tfap2a является наиболее критическим для клеток нервного гребня и черепно-лицевого развития. Это подчеркивается Branchio-Oculo-Facial Syndrome у человека, который ассоциирует с мутациями TFAP2A и характеризуется черепно-лицевыми (расщепление губы, расщепление нёба, уродства ушей) и аномалиями глазs (анофталмия, микрофталмия, катаракта и колобома) [89,90]. На границе нервной пластинки, передача сигналов Bmp индуцирует экспрессию Tfap2a и Tfap2c [91]. В то время как Tfap2a является ключевым регулятором Foxd3 в спецификации нервного гребня, экспрессия Tfap2c является кратковременной и перекрывается с Tfap2a [17,85]. В пре-миграторных клетках нервного гребня, экспрессия Tfap2a не зависит от Foxd3. Однако, в ранних миграторных клетках, экспрессия Tfap2a становится синергичной с и зависит от Foxd3 и Sox10 [85,92,93] (Figure 2). Позднее во время миграции, экспрессия Tfap2a и Foxd3 подразделяется на самостоятельные популяции, объясняющие отличия в экспрессии нижестоящих маркеров нервного гребня и мутантных фенотипов [92,93]. По завершении миграции клеток нервного гребня у людей, мышей и рыбок данио, Tfap2a экспрессируется в носовых отростках и зачатках зубов [94]. Подобно Zic2b, Tfap2a также экспрессируется в около-глазной мезенхиме, которая окружает ранний глазной пузырёк у мышей и рыбок данио (Figure 4) [94,95]. Поскольку Tfap2a экспрессируется у рыбок данио и мышей в эпителии роговицы и хрусталика, то это происходит после завершения морфогенеза глазного бокала, включая и закрытие глазной щели. Как и у людей, Tfap2a у мутантных рыбок данио и мышей вызывает микрофталмию и колобому, указывая, что специфичная для нервного гребня экспрессия оказывает клеточно неавтономные эффекты на глазной бокал [94,95]. Однако, остается неясным, действительно ли Tfap2a функцияонирует посредством того же самого обеспечиваемого hedgehog пути Zic2.

С синдромом CHARGE ассоциированные гены регулируют эпигенетические механизмы, чтобы управлять правильным отсоединением премиграторных клеток нервного гребня от края нервной трубки [96]. Chd7, который является центральным в этом сигнальном каскаде, является helicase ДНК-связывающим белком. У людей аутосомно доминантные мутации CHD7 ассоциированы с синдромом CHARGE, сочетанием врожденных аномалий, включая колобому, дефекты сердца, атрезию хоан, задержку роста и развития, гипоплазию гениталий и аномалии ушей [97-99]. У мышей и Xenopus, Chd7 экспрессируется в пре-миграторных и мигрирующих клетках нервного гребня и экспрессия является чувствительной к дозе гена. Мыши, гетерозиготные по мутации Chd7, или Xenopus, у которых белок подвергся нокауту с помощью morpholino олигонуклеотидов, обнаруживают дезорганизацию и уменьшение количества клеток нервного гребня [48,100]. В клетказ нервного гребня, Chd7 активирует Sox9, Twist, и Snai1/2 , чтобы и дальше управлять миграцией (Figure 3). Кроме того, Chd7 работает совместно с комплексом BAF (SWI/SNF), который ответственен за ремоделирование хроматина. В комплексе BAF complex, Brg1 (Smarca4a) кодирует стержневую ATPase, а нокаут этого гена подавляет активность Tfap2a, Foxd3, и Snai1/2 [100]. Кроме того, у рыбок данио chd7 регулирует sema3e, который экспрессируется в заднем мозге, а избыточная экспрессия sema3e устраняет нокаутный chd7 фенотип [101]. В соответствии с этим мутации в SEMA3E были обнаружены у пациентов с синдромом CHARGE, а нокаут sema3e у рыбок данио фенокопирует нокаутный фенотип chd7.

Колобомы являются приметным признаком синдрома CHARGE, однако, остается неясным, действительно ли этот дефект глаз обусловлен нарушениями формирования глазного бокала, происходящего из нейральной эктодермы, и/или дефектами нервного гребня [102,103]. Помимо его роли в клетках нервного гребня, экспрессия Chd7 в нервной эктодерме необходима для развития глазного бокала и его ножки [103]. Необходимы дальнейшие исследования Chd7 в нервной эктодерме и клетках нервного гребня для развития глаз.

Более того, модификации состояния метилирования с помощью H3 lysine 4 (H3K4) метилазы (кодируемой геном Kmt2d) и X-сцепленной histone H3 lysine 27 (H3K27) деметилазы (кодируемой геном Kmd6a/Utx) также важны для регуляции отсоединения клеток нервного гребня и последующей миграции [104-106]. Мутации KMT2D или KMD6Aассоциированы с Kabuki Syndrome, которые обнаруживают общие характеристики с синдромом CHARGE, включая микрофталмию и колобому [107-109]. У Xenopus, мутации потери функции Kmt2d воспроизводят синдром Kabuki и показывают, что эта метилаза необходима для дисперсии мигрирующих клеток нервного гребня [105]. Более того, нокдаун Kmt2d в клетках нервного гребня ведет к снижению экспрессии sema3F в бранхиальных дугах, так что избыточная экспрессия sema3F устраняет нокдаун. Однако, этот эффект , скорее всего, косвенный, т.к. sema3F экспрессируется в соседних клетках не нервного гребня и действует как секретируемый лиганд для рецептора Neuropilin2 (Npn2), который экспрессируется в нервном гребне (Figure 3). [105,110,111]. Сходным образом, специфичный для нервного гребня conditional нокаут Kmd6a у мышей воспроизводит синдром Kabuki. Однако, лишь небольшой набор мишеней в этих клетках связан с деметилированием гистонов [104]. Наиболее заметно в клетках нервного гребня то, что Kmd6a регулирует экспрессию Chd7 и является мишенью передачи сигналов Notch, Wnt/β-Catenin пути и p53-based targets [112]. В то время как Notch и Wnt/β-Catenin выполняют хорошо известные роли в формировании границы ранней нервной пластинки и в последующей спецификации нервного гребня, может существовать перекрестная регуляция между p53 и Kmd6a в качестве варианта p53 аллеля, модифицируя фенотипическую тяжесть мутаций Kmd6a [112]. В отличие от Chd7, который играет роль как в нервной эктодрме, так и в клетках нервного гребня, Kmt2d и Kmd6a, по-видимому, обладают специфическими для нервного гребня функциями. Т.о., глазной фенотип при синдроме Kabuki , скорее всего, обусловлен клеточно не автономными эффектами клеток нервного гребня на глазной бокал, однако, специфический механизм, лежащий в основе действия этих генов, пока не установлен.

Инициация EMT является ключевой ступенью в спецификации пре-миграторных клеток нервного гребня [23]. Ограничение межклеточных взаимодействий и, в частности, деконструкция плотных и слипчивых соединений между эпителиальными клетками запускает морфологические изменения. При распаде слипчивых соединений, белок E-Cadherin отщепляется от плазматической мембраны и деградирует, тогда как транскрипция E-Cadherin мРНК подавляется. В таком состоянии высвобождается β-Catenin из плазматической мембраны, позволяя ему накапливаться в ядре и активировать транскрипцию в ответ на передачу сигналов Wnt [47,113].

Транскрипционный фактор, Zeb2 (Zinc Finger E-Box Binding Homeobox 2) является важным ингибитором инициации с помощью E-Cadherin EMT в клетках нервного гребня. Экспрессия Zeb2 может регулироваться с помощью Msx1 посредством Arl6ip1 и Ets1 [114,115]. Arl6ip1 кодирует ADP ribosylation factor-like 6 interacting protein, который взаимодействует с Arl6, чтобы регулировать внутриклеточный трафик [116]. Интересно, что мутации ARL6 у людей ассоциируют с синдромом Bardet–Biedel, характеризующимся дегенерацией сетчатки, но не дефектами нервного гребня [117,118]. Однако, у рыбок данио нокдаун Arl6ip1 снижает экспрессию foxd3, snai1b, sox10, и crestin и подавляет спецификацию субклонов нервного гребня [119]. Ets1 кодирует E26 специфичный для трансформации транскрипционный фактор, который нацелен на Zeb2 в пре-миграторных клетках нервного гребня (Figure 3) [120]. Ets1 в клетках не нервного гребня, как было установлено, взаимодействует с Maf, basic leucine zipper транскрипционным фактором, мутации которого вызывают Ayme-Gripp Syndrome [121,122]. Этот синдром характеризуется черепно-лицевыми аномалиями, нейросенсорной потерей слуха, низким ростом, задержкой развития и аномалиями глаз, включая врожденные катаракты и колобомы [122,123]. У мышей, Mafb экспрессируется в клетках нервного гребня и может соединяться с промотором Sox9 [124]. Т.о., Maf также, скорее всего, активен в клетках нервного грбеня и может действовать совместно с Ets1, чтобы регулировать Zeb2 во время спецификации нервного гребня.

Однако, Zeb2 экспрессируется как в нервной трубке, так и в пре-миграторных клетках нервного гребня. У эмбрионов кур, нокдаун Zeb2 вызывает длительное поддержание E-Cadherin в мигрирующих клетках нервного гребня. Это нарушает отсоединение, вызывая агрегацию слипчивых клеток нервного гребня по краю нервной трубки [17,125]. Сходным образом, у мышей и рыбок данио нокаут Zeb2 вызывает дефекты миграции клеток нервного гребня и фенотип, сходный с соотв. гаплонедостаточностью ZEB2 у людей, с синдромом Mowat–Wilson [126]. Это врожденное заболевание характеризуется аномалиями нервного гребня (черепно-лицевыми и аномалиями сердца и болезнью Hirschsprung) , а также нейральными дефектами (эпилепсией, возникновения corpus callosum, и задержкой развития) [127,128]. Поскольку аномалии галаз, включая колобому, также присутствуют, то остается неясным, действительно ли они обусловлены дефектами развития нейральных и/или клеток нервного гребня.

Snai1/2 кодирует транскрипционный фактор цинковые пальчики, который подавляет экспрессию cadherin и запускает EMT. Внутри пре-миграторных клеток нервного гребня экспрессия Snai1 вызывается с помощью передачи сигналов Wnt и Zic1/2, и вместе с Foxd3, Sox10 и Ets1 является ранним спецификатором клеток нервного гребня [45,119,129-131]. Передача сигналов Wnt регулирует экспрессию Snai1 посредством гена Tcof1 (Treacle ribosome biogenesis factor 1), который экспрессируется в пре-миграторных и мигрирующиих клетках нервного гребня и кодирует белок Treacle (Figure 3) [131]. Белок Treacle находится внутри ядра и участвует в транскрипции рибосомальной ДНК. Аутосомно доминантные мутации в TCOF1 приводят к возникновению Treacher Collins Syndrome, который характеризуется тяжелыми черепно-лицевыми аномалиями (микогнатия, микротия, гипоплазия средины лица, гипоплазия скул) и глазные аномалии, включая колобому [132,133]. У мышей Tcof1 экспрессируется в фронто-назальных отростках и в верхнечелюстной и нижнечелюстной мезенхиме, и его гаплонедостаточность вызывает меньшее количество мигрирующих клеток нервного грабня и воспроизводит болезнь человека [134]. В дополнение к передаче сигналов Wnt, Snai1/2 также регулируется с помощью Zic1/2 посредством генов Nlz1/2, которые кодируют NET семейства цинковые пальчики репрессоры транскрипции [130]. Nlz1 экспрессируется на стороне нейральной эктодермы по отношению к краю нервной пластинки и, по-видимому, демаркирует линию отсоединения клеток от нервного гребня [135,136]. Благодаря этому действию, Nlz1 косвенно передает сигналы посредством Snai1/2 в пре-мигратоные клетки нервного гребня, которые д. подвергнуться EMT [135].

Snai1 репрессирует E-cadherin внутри пре-миграторных клеток и продолжает экспрессироваться в мигрирующих клетках, включая около-глазную мезенхиму [137]. Snai2 индуцируется с помощью передачи сигналов Wnt после спецификации края нервной пластинки и репрессирует Cadherin 6b в пре-миграторных клетках нервного гребня вдоль дорсальной стороны нервной трубки (Figure 3) [138]. Cadherin 6b, подобно E-Cadherin, д. быть подавлен, чтобы инициировать временную и пространственную эмиграцию клеток нервного гребня с края нервной трубки [139]. Snai1 мутанты имеют клобому, а специфические эффекты этого гена в регуляции EMT указывают что его действие в клетках нервного гребня косвенно затрагивает закрытие глазной щели [140]. Напротив, Snai2 мутанты, по-видимому, не обнаруживают глазных аномалий [141]. Это может быть связано или с отсутствием экспрессии Snai2 в около-глазной мезенхиме или компенсацией функции за счет Snai1.

Несмотря на приобретение свойств мезенхимных клеток и в конечном итоге способность к миграции, клетки нервного гребня должны оставаться в плюрипотентном состоянии, а также быть детерминированы в направлении специфической клеточной судьбы. В то время как спецификаторы края нервной пластинки обнаруживают продолжающуюся экспрессию, дополнительные факторы, включая Sox10, Foxd3, Snai1/2 и Ets1 активируются на этой стадии, чтобы поддерживать качества стволовых клеток в пре-миграторных клетках нервного гребня [53,142]. Однако, во время миграции и после миграции эти транскрипционные факторы направляют расхождение на субклоны и в конечном итоге потерю экспрессии триггеров терминальной дифференцировки.

Sox10 кодирует SRY-related HMG box транскрипционный фактор, который, как челнок переносит белки между цитоплазмой и ядром, чтобы регулировать клеточные судьбы [143,144]. Во время миграции Sox10 является одним из самых ранних специфических маркеров не дифференцированных клеток нервного гребня, однако, в клетках завершивших миграцию, Sox10 направляет клетки в направллении дифференцировки меланоцитов или глии [143-146]. У рыбок данио и мышей в черепно-лицевой области Sox10 экспрессируется внутри фарингеальных дуг и около-глазной мезенхиме [145,147-150]. У рыбок данио sox10 продолжает экспрессироваться в хрящах верхней и нижней челюсти во время ранней личиночной стадии, но отсутствует у молоди [11]. В то время как позитивные по sox10 клетки проникают в развивающийся глаз, его экспрессия оказывается коротко живущей и оказывается неясным, в какую из глазных тканей вносят вклад эти клетки нервного гребня [11,32]. У людей аутосомно доминантные nonsense и frame shift мутации в SOX10, ассоциируют с синдромом Waardenburg, который прежде всего характеризуется аномалиями пигментации и дезморфизмом средины лица [151,152]. Сходным образом, colorless мутанты рыбок данио, полученные с помощью ENU мутагенеза, обладали разными точковыми мутациями в аллеле sox10, приводящими к аномалиям пигментации. Однако, мутантные рыбки обнаруживали нормальное черепно-лицевое и глазное развитие и доживали до взрослого возраста [147]. Нпротив, morpholino олигонуклеотидами вызываемый нокдаун Sox10 у рыбок данио нарушал раннюю спецификацию нервного гребня, приводя к достоверно меньшей миграции клеток. Некоторые затронутые животные имели тяжелые черепно-лицевые аномалии, микрофталмию с колобомами и не выживали после вылупления (unpublished data, personal observation). Более того, гомозиготы по мутации Sox10 у мышей оказывались летальными в эмбриональной и на ранней постнатальной стадии [153,154]. Подобная фенотипическая изменчивость может быть обусловлена эффектами дозы гена и количеством остаточной активности у гетерозигот по сравнению с гомозиготами. Необходимы дополнительные исследования для выяснения роли Sox10 в развитии клеток нервного гребня и глазного пузыря.

Foxd3 кодирует forkhead winged-helix транскрипционный фактор, который участвует в изменении стволовых клеток от нативного состояния до четкого плюрипотентного состояния. Foxd3 действует путем модификации структуры хроматина, чтобы или понизить привлечение или репрессировать активацию энхансеров [38]. Подобно Sox10, Foxd3 является ранним маркером клеток нервного гребня, но направляет пост-миграторную дифференцировку в направлении приобретения судьбы нейронов, костей и хряща [155,156]. Foxd3 экспрессируется также внутри фарингеальных дуг и в около-глазной мезенхиме [30,92]. У рыбок данио foxd3-позитивные клетки проникают в развивающийся глаз позднее, чем очень маленькая популяция sox10-позитивных клеток. Во время эмбриогенеза и на ранних личиночных стадиях foxd3-позитивные клетки проникают в радужку и роговицу, однако, экспрессия подавляется на средней личиночной стадии [11]. Вариант аллеля человеческого FOXD3 оказался ассоциированным с аномалиями пигментации (vitiligo). Однако, эта мутация, расположеная в промоторном регионе, как было установлено, увеличивает транскрипционную активность in vitro и может также участвовать в аутоиммунные процессы, таких как Hashimoto’s thyroiditis [157]. Кстати, не выявлено мутаций гаплонедостаточности для FOXD3 при болезнях человека. Это коррелирует с нокаутом Foxd3 у животных и нокдауном у моделей, которые обнаруживают тяжелые дефекты нервного гребня, особенно с участием периферической нервной системы и хрящей, которые оказываются несовместимыми с жизнью. У рыбок данио с помощью morpholino олигонуклеотидов нокдаун Foxd3 вызывает микрофталмию с нарушениями миграции клеток нервного гребня в глаза [158-161]. Интересно, что в одном клиническом исследовании было установлено, что вариант FOXD3 с неизвестной патогенной значимостью выявлен у пациентов с аниридией и Peters Anomaly [162]. Необходимы дальнейшие исследования для определения роли Foxd3 ы развитии глаз и особенно в регуляции взаимодействий клеток нервного гребня с глазным бокалом.

Семейство генов Alx кодирует paired-class homeobox транскрипционные факторы и все три члена, Alx1, Alx3 и Alx4 выполняют разные роли в развитии нервного гребня [163]. Alx1 регулирует совместно Sox10 и Foxd3 во время ранней спецификации клеток нервного гребня и продолжает экспрессироваться в ходе всей миграции. Кроме того, Alx1 экспрессируется в около-глазной мезенхиме [164]. У людей мутации ALX1 приводят к фронто-назальной дисплазии и аномалиям глаз, включая микрофтламию и анофтралмию [165,166]. Соотв., нокаут alx1 у рыбок данио также вызывает микрофталмию и колобому. Напротив, alx3 и alx4 играют свои роли позднее в пост-миграторных клетках нервного гребня и экспрессируются только вограниченных областях окологлазной мезенхимы и глаз [164]. Соотв., мутации людей в ALX3 или ALX4 вызывают умеренную фронто-назальную дисплазию, но без глазных аномалий [167,168]. Т.о., ранние осуществление спецификации клеток нервного гребня и поддержания плюрипотентности с помощью Alx1 необходимо для нормального развития глазного бокала и закрытия глазной щели. Этот эффект Alx1, скорее всего, обусловлен не автономными эффектами на глазной бокал, обеспечиваемыми клетками нервного грабня. Однако, нижестоящие мишени и молекулярные события нуждаются в дальнейших исследованиях.

После отсоединения от края нервной трубки клетки нервного гребня следуют по определенным путям по всему телу. Краниальные клетки нервного грабня, возникают между diencephalon и rhombencephalon, чтобы в конечном итоге внести вклад в большую часть черепно-лицевого скелета (frontal, nasal, mandible, maxillary, zygomatic), и многочисленные структуры глаз (строма роговицы, эпителий роговицы, трабекулярная сеть, склеры, строма радужки, uveal меланоциты, мышцы цилиарного тела) [6,34,169-171]. Клетки краниального нервного грабня, возникающие в районе диэнцефалона и передней части mesencephalon, мигрируют в виде потоков дорсально и вентрально к глазу, чтобы занять окологлазную мезенхиму и фронто-назальные отростки [11]. Клетки от задней части mesencephalon и rhombencephalon последовательно мигрируют в фарингеальные дуги [11,172]. Веутри этих потоков клетки краниального нервного грабня по молекулярным маркерам уже отличимы в соотв. субпопуляциях. Crestin, хорошо известный маркер мигрирующих клеток нервного гребня экспрессируется в дорсальной. не не в внетральной части окологлазной мезенхимы [173]. У рыбок данио имеется инициальная экспрессия sox10 и foxd3 во время ранней миграции в фарингеальные дуги и около-глазную мезенхиму, а время подавления этих транскрипционных факторов варьирует в зависимости от запуска окончательной дифференцировки [11,174]. Во время этого процесса экспрессия дополнительных транскрипционных факторов, включая pitx2, foxc1, eya2 и lmx1b, усиливается в клетках нервного гребня, чтобы регулировать миграцию в окончательны места предназначения и дифференцировки (Figure 4) [174].

Pitx2 кодирует paired-like homeodomain транскрипционный фактор, в первые обнаруженный в гипофизе в качестве регулятора prolactin. Однако, более поздние исследования продемоснстрировали, что Pitx2 является критическим для становления лево-правосторонней оси и последующего асимметричного развития сердца, легких и желудочно-кишеной системы [175-177]. Т.о., полный нокаут Pitx2 у мышей оказался гибельным для эмбрионов из-за тяжелых аномалий сердца. Тем не менее, эти м утанты обнаруживали и тяжелые аномалии глаз, включая микрофталмию и колобому [175,176]. Тканеспецифичный нокаут продемонстрировал, что эти глазные дефекты обусловлены клеточно неавтономными эффектами Pitx2 внутри клеток нервного гребня на развитие глазного бокала [178]. У людей автономно доминантные мутации в PITX2 очень широко ассоциируют с Axenfeld–Rieger Syndrome, который характеризуется определенным набором системных, черепно-лицевых и глазных аномалий, возникающих в результате нарушений миграции и дифференцировки клеток нервного гребня. Системные аномалии включают болезнь Hirschsprungs (отсутствие энтерической иннервации сегментов кишечника) и аномалии тракта оттока сердцп, вместе с гипоплазией средины лица с oligo/microdontia. Кроме того, обнаруживаются аномалии внешних глазных мышц и век, ассоциированные с Axenfeld–Rieger Syndrome [179,180]. В глазу обнаруживаются нити перекрытий, которые соединяют радужку с передней частью Schwalbe’s линии, которая демаркирует наружный край эндотелия роговицы. Кроме того, радужка гипопластична в результате corectopia (irregular pupil) и pseudopolycoria (multiple pupils) [181-184]. Интересно, что у небольшого количества пациентов присутствуют аномалии зрительного нерва, включая колобому и вид вьюнка (morning glory) (unpublished data, personal observation). Значительным источником болезненности является потеря зрения из-за глаукомы, которая затрагивает приблизитольно 50–75% пациентов и часто устойчивость к медицинскому лечению [185]. Реже мутации PITX2 ассоциируют с Peters Anomaly, которая характеризуется центральной непрозрачностью роговицы из-за неполного отсоединения хрусталикового пузырька от эпителия роговицы и неспособностью клеток нервного гребня мигрировать в передний сегмент глаза [186].

Pitx2 сначала экспрессируется в клетках нервного гребня после инициации миграции и вместе с морфогеном, retinoic acid (RA), управляет миграцией клеток нервного гребня вдоль разных потоков в фарингеальные дуги и около-глазную мезенхиму [176,187]. Нокдаун Pitx2 у рыбок данио не изменяет количество отсоединяемых клеток нервного гребня, но нарушает миграторные пути в черепно-лицевом регионе, приводя к апоптозу этих клеток [10]. Это приводит к уродствам верхней и нижней челюстей, а также к дисгенезу переднего сегмента глаз, колобоме и микрофталмии [10,176]. Нокдаун Pitx2 мыши и мыши, у которых RA неспособна обеспечивать экспрессию Pitx2 (т.e., нокаут множественных рецепторов RA), дает более тяжелые нарушения глаз, включая анофталмию, микрофталмию и дефекты зрительного нерва, такие как присоединение глаз непосредственно к вентральной части гипоталямуса [175,178,188]. Кондиционный нокаут Pitx2 нервного гребня дает сходный фенотип, указывая, что эти глазные дефекты обусловлены клеточно неавтономоной функцией Pitx2 в клетках нервного гребня [178]. Экспрессия Pitx2 в около-глазной мезенхиме активирует сигналы, которые вызывают морфогенетическое расширение глазного стебля, такие как нарушения этой ступени, приводящие к foreshortened глазного стебля и микрофталмии/анофталмии. Впоследствии экспрессия Pitx2 преимущественно сохраняется в околглазной мезенхиме, где она необходима для дифференцировки роговицы [178]. У мышей нокаут Pitx2 может вызывать некомпетентногсть глазных клеток нервного гребня формировать эндотелий и строму роговицы, приводя к уродствам и утолщениям роговицы. [176,178,189]. Важно, что Pitx2 интегрирует сигналы от RA и передачи сигналов Wnt, чтобы запускать миграцию и дифференцировку глазных клеток нервного гребня (Figure 4) [176,187]. RA, которая продуцируется дорсальной и вентральной частями сетчатки, воздействует целенаправленно на около-глазную мезенхиму посредством RA рецепторов (RAR) α и γ [34,176,190-192]. Внутри этих окологлазных клеток нервного гребня RA непосредственно активирует экспрессию Pitx2 посредством связывания реагирующих на RA элементов. Более того, поскольку Wnt путь не инициирует активацию, то сигнальные компоненты, β-catenin, и Lef1, соединяются с промотором Pitx2 и поэтому необходимы для поддержания экспрессии Pitx2. Однако, Pitx2 целенаправленно воздействует на Dkk2, внеклеточный антагонист, который сдерживает сигнальную активность Wnt, чтобы сформировать регуляторную петлю обратной связи в около-глазных клетках нервного гребня [187,193,194].

В дополнение к нижестоящим мишеням Pitx2 воздействует на Lmx1b, LIM-гомеодоменовый транскрипционный фактор, который экспрессируется в около-глазной мезенхиме и позднее концентрируется в презумптивных структурах переднего сегмента (радужка, роговица, трабекулярная сетчатая структура), глазной щели и hyaloid сосудистой сети (Figure 5) [195]. Lmx1b регулирует миграцию и жизнеспособность клеток нервного гребня в переднем сегменте, а Lmx1b мутантные мыши имеют микрофталмию с гипоплазией радужки и цилиарного тела [195]. У людей аутосомно доминантные мутации в LMX1B вызывают Nail–Patella Syndrome, который строго ассоциирует с open-angle glaucoma [196]. Однако, в отличие от Axenfeld–Rieger синдрома, затрагивающего индивидов, обладающих врожденными аномалиями глаз, которые подтверждают изначальную потребность в гене LMX1B для постнатального поддержания структуры и функции трабекулярной сети и склеры. Интересно, что как и в случае Pitx2, нокдаун с помощью morpholino олигонуклеотидов Lmx1b у рыбок данио вызывает колобомы, указывая на клеточно неавтономную роль этих двух факторов в развития глазного бокала [197]. Др. мишенью для Pitx2 в клетках нервного гребня является Tfap2b (Figure 5). В противоположность Tfap2a, который важен для индукции нейрального края, Tfap2b экспрессируется в около-глазной мезенхиме у мышей и играет независимую от Lmx1b роль в развития передней камеры [198]. Специфичный для нервного гребня нокаут Tfap2b у мышей приводит к аномальному развитию радужки, роговицы, табекулярной сети и цилиарного тела, приводя к закрытой angle-configuration. Потеря экспрессии Tfap2b вызывает отсутствие N-Cadherin в эндотелии роговицы и дезорганизации соединительных комплексов и к отеку роговицы. Более того, эти мутанты Tfap2b также обнаруживают снижение экспрессии специфичного для роговицы коллагена, Col8a2, и маркера эндотелия роговицы, Zp4, приводящего к снижению клеточной пролиферации [199]. Lmx1b и Tfap2b были идентифицированы как мишени для Pitx2, необходимы дальнейшие исследования по идентификации дополнительных нижестоящих факторов в переднем сегменте.

Хотя косоглазие и blepharophimosis редко описываются при синдроме Axenfeld–Rieger, у модельных животных около-глазные клетки нервного гребня вносят существенный вклад в формирование и организацию около-глазных мышц [179,180,200]. RA и Pitx2 регулируют экспрессию специфичного для мышц транскрипционных факторов, таких как Myf5, Myog и Myod1, которые необходимы для миогенеза и жизнеспособности около-глазных мышц [201,202]. Более того, Foxl2 в около-глазных клетках нервного гребня активирует экспрессию гладкомышечного alpha актина (кодируемого геном Acta2) в окологлазных мышцах мышей, а мутации в FOXL2 у людей ассоциированы с синдромом blepharophimosis. В то время как Myf5, Myog и Myod1 индуцируют дифференцировку миобластов и в конечном итоге экспрессию Acta2, прямая связь на молекулярном уровне между Pitx2 и Foxl2 в около-глазной мезенхиме не была установлена. Напротив, нокдаун Pitx2 у рыбок данио затрагивает мускулатуру челюстей, но не влияет на экспрессию myod ни на организацию около-глазных мышц. Однако, фенотипические отклонения глаз у нокаутных pitx2 мышей проявляются в виде анофталмии или тяжелой микрофталмии, более тяжелых, чем у рыбок данио и людей. Глаза сами по себе, как известно, важны для регуляции развития окологлазных мышц, т.к. генетические, токсические или хирургические вмешательства, ведущие к потре глазного пузырька приводят к дезорганизации, а в некоторых случаях и к агенезу окологлазных мышц [200,203]. Т.о., фенотип около-глазных мышц, наблюдаемый у pitx2 нокаутных мышей может быть прямо или косвенно связан с передачей сигналов клеток нервного гребня.

FoxC1 кодирует forkhead транскрипционный фактор, который влияет на черепно-лецевую и глазную миграцию клеток нервного гребня и дифференцировку [204]. Подобно Pitx2, Foxc1 не обязателен для отсоединения, но является критическим для жизнеспособности и миграции клеток нервного гребня [205]. Foxc1 затем экспрессируется в клетках нервного гребня из около-глазной мезенхимы и позднее в презумптивных структурах переднего сегмента [204]. Более того, аутосомно доминантные мутации FOXC1 также прежде всего вызывают синдром Axenfeld–Rieger [9,206]. У Foxc1 нокаутных мышей роговица утолщена и дезорганизована и часто хрусталик не отсоединен от роговицы, это сильно напоминает Peters Anomaly [207]. Нокдаун у рыбок данио гомолога Foxc1a также приводит к неправильному развитию роговицы и радужки и гипоплазию и колобому зрительного нерва. Кроме того, у рыбок данио обнаруживаются кровоизлияния в головной мозг, указывающие на отдельную роль Foxc1a в обеспечении целостности кровеносных сосудов. Соотв., пациенты с мутациями FOXC1 были также обнаруживают болезнь сосудов головного мозга с ранним началом [205].

Foxc1, подобно Pitx2, регулируется с помощью RA в около-глазной мезенхиме. Более того, Foxc1 и Pitx2 экспрессируются совместно в клетках нервного гребня и регулируют экспрессию др. др. Кроме того, регулятор транскрипции белок Pawr (PRKC apoptosis Wilm’s tumor 1 regulator) модулирует способность Pitx2 и Foxc1 активировать гены мишени [193]. Tgfβ2 передача сигналов от хрусталика, которая нацелена на его рецепторы (Tgfbr2) в около-глазной мезенхиме также регулирует экспрессию Foxc1 и Pitx2 и нокаутные Tgfβ2 мыши обнаруживают подобный Peters Anomaly фенотип, подобный таковому у Foxc1 нокаутных мышей [208-210]. Однако, основной эффект передачи сигналов Tgfβ2 заключается, скорее всего, в пост-миграторном контроле Foxc1 и Pitx2 позитивных клеток, направляя их дифференцировку в направлении эндотелия и стромы роговицы.

В клетках нервного гребня Foxc1, как было установлено, воздействует на гены мишени, включая Eya2, Ffg19, Foxo1a, Foxc2 и Galnt4 (Figure 5). Eya2 является транскрипционным фактором, экспрессирующимся в около-глазной мезенхиме и глазной щели у мышей и рыбок данио. Экспрессия Eya2, которая увеличивается за счет foxc1a, RA и nlx1, способствует ремоделированию около-глазной мезенхимы за счет индукции апоптоза клеток нервного гребня [211-213]. В презумптивной глазной ткани Foxc1 соединяется с промотором Fgf19, активируя транскрипцию генов, которые управляют развитием и поддержанием структур переднего сегмента с помощью передачи сигналов ERK1/2 [214]. Foxc1 также регулирует forkhead транскрипционный фактор Foxo1a. У рыбок данио и в культивируемых клетках трабекулярной сети человека, снижение Foxc1 ведет к снижению экспрессии Foxo1a, это нарушает реакцию на оксидативные стрессы и в конечном счетк сниеат жизнеспособность [215]. В около-глазной мезенхиме мышей Foxc1 вместе с Pitx2 и передачей сигналов Wnt взаимодействует с Foxc2, чтобы совместно регулировать раннее развитие роговицы. Foxc2 необходим в клетках нервного гребня, чтобы способствовать приобретению качественных особенностей роговицы и склер [216]. Однако, пока неизвестно, действительно ли Foxc2 выполняет ту же самую роль в развитии глаз людей. Galnt4 кодирует фермент, который инициирует сцепленное сmucin-type O гликозилирование и в конечном счете изменения гель-подобных свойств эпителиальных клеток, секретирующих муцин [212]. Хотя специфическая функция Galnt4 в клетках нервного гребня неизвестна, участие glycosylases в изменениях внеклеточного матрикса и обеспечении адгезии, подтверждает его роль в миграции. Итак, Foxc1 имеет разные мишени в клетках нервного гребня и глазах.

Развитие нервного гребня является сложным процессом, который протекает в несколько ступеней и использует многочисленные сети регуляторных генов [15,17,24,39]. Генетические нарушения могут запускать каскад нижестоящих эффекторов, который может приводить к распространенным системным, черепно-лицевым и глазным аномалиям. Развитие глаз особенно чувствительно к собственно развитию клеток нервного гребня.

Т.к. микрофталмия, анофталмия и колобома обычно ассоциированы с нарушениями функции генов нервного эпителия в развитии переднего мозга и глазного бокала, то болезни у людей и животных моделей демонстрируют, что пертурбации спецификации или миграции клеток нервного гребня часто приводят к сходному фенотипу [6,12-14]. Такой общий фенотип с микрофталмией и колобомой указывает на генетические нарушения генов границы нервной пластинки (Msx1/2, Zic2, и Tfap2) или генов спецификации клеток нервного гребня [59,65,160]. Т.к. эти нарушения глаз происходят внутри происходящего из нервного эпителия глазного бокала, то очевидно, что клетки нервного гребня внутри около-глазной мезенхимы оказывают клеточно неавтономные эффекты на глазной бокал. Клетки нервного гребня ограничивают передачу сигналовt hedgehog в оптическом стебле и бокале, это является критическим для соотв. формирования паттерна сетчатки [81,82,217]. Невозможность устанавливать дорсо-вентральную ось сетчатки нарушает нормальный рост глазного бокала и предупреждает закрытие глазной щели.

Кроме того, генетические нарушения позднее миграции и дифференцировки клеток нервного гребня могут оказывать существенны эффекты на развития глаз. Гены Pitx2 и Foxc1 изучены лучше всего на примере аутосомно доминантных мутаций, часто ассоциированных с Axenfeld–Rieger Syndrome и менее распространенной Peters Anomaly [9,184,206]. Хотя в редких случаях эти болезни могут сопровождаться аномалиями зрительного нерва, такими как Morning Glory Disc и колобомы, в большинстве случаев аномалии касаются переднего сегмента. Однако, нокаут и нокдаун гена у модельных животных вызывают аномалии глазного бокала. Это расхождение может быть объяснено большей чувствительностью эффектов к дозе гена для формирования паттерна в глазном бокале по сравнению с миграцией и дифференцировкой клеток нервного гребня. Несмотря на это, Pitx2 и Foxc1 являются ключевыми регуляторами развития глаз и дальнецшие исследования необходимы для выявления нижестоящих мишеней в глазном бокале и клетках нервного гребня.

Поскольку врожденные аномалии глаз возникают довольно редко с частотой 1:5000 - 1:10000 живорожденных, понимание генетической регуляции развития клеток нервного гребня и патогенеза болезней важно [218].