Graphical Abstract

Миотонические дистрофии (DMs) - это аутосомно доминантные нарушения, связанные с экспансией нуклеотидных повторов, вызывающие миотонию и слабость скелетных мышц, а также аритмии в сердце и сердечную недостаточность (1-3). Type 1 (DM1) вызывается экспансией CTG тринуклеотидов в 3' нетранслируемом регионе гена DMPK на хромосоме 19 (4-6), тогда как type 2 (DM2) возникает в результате экспансии CCTG тетрануклеотидов в интроне 1 CNBP (ранее известного как ZNF9) гена (7, 8) на хромосоме 3. При DM1 существует корреляция между количеством повторов и возрастом начала болезни. Имеющие 50-1000 повторов обычно начинаются у взрослых, имеющие больше 1000 повторов часто начинаются рано и обнаруживают более системные и выраженные клинически признаки DM1 (3, 9). DM2 характеризуется в среднем длиной повторов в 5000 (8) и не обнаруживает корреляции количества повторов с началом болезни (9, 10). DM2 рассматривается как заболевание, начинающееся у взрослых (10).

Основным механизмом, лежащим в основе DM, является токсичность избыточной функции РНК. РНК, экспрессирующая избыточные нуклеотидные повторы, связана с присутствием агрегатов РНК, обнаруживаемых в ядрах в виде ribonuclear очагов (11, 12). Более того, эти очаги секвестрируют факторы сплайсинга, такие как muscleblind-like 1 (MBNL1) (12-15). Секвестрация MBNL1 и функциональное истощение белков связаны с неправильным сплайсингом нижестоящих генов, таких как INSR и CLCN1, которые, как полагают, объясняют резистентность к инсулину и мышечную миотонию при DM1, соотв. (16-18). Кроме того, секвестрация MBNL , как полагают, приводит к усилению активности РНК связывающих белков, таких как CUGBP1, подтверждая, что многие белки, регулирующие РНК, участвуют в патогенезе DM (19). Признаки миотонии наиболее очевидны при DM1, а частота DM1 в целом превышает таковую DM2 (3). Недавнее исследование подтвердило, что DM2 может превалировать в специфических популяциях (20). Хотя DM1 и DM2 базируются на общем основании в виде экспансии нуклеотидных повторов и на некоторых общих клинических проявлениях, существуют четкие клинические различия. Так, DM2 обычно начинается поздно несмотря на присутствие значительно большего количества избыточных нуклеотидных повторов (2). Существует значительное перекрывание среди клинических находок при DM1 и DM2 , такие как прогрессирующая слабость скелетных мышц и сердечные осложнения (21-24). Дефекты проводимости в сердце и аритмии возникают при DM1 и DM2 (10, 23, 25). Неправильный сплайсинг кардиального troponin T, TNNT2, участвует в кардиальной дисфункции при DM (26). Неправильный сплайсинг SCN5A, кодирующего основной натриевый канал в сердце, связан с возникновением аритмий при DM (27).

Получение животных, моделирующих DM, было затруднено из-за нестабильности экспансии нуклеотидных повторов, особенно при DM2 с их очень крупными избыточными повторами тетранукелеотидов. The Mbnl1^Δ3/Δ3 модель воспроизводит истощение MBNL1, тогда как экспрессия CTG повторов в ткани специфичной или даже условного формата (conditional format) воспроизводит миотонию, слабость и в некоторых случаях дисфункцию сердца (19, 28-30). Для изучения патогенеза DM в контексте клеток человека мы создали человеческие модели DM, используя 2 независимых подхода, чтобы исследовать фенотипы скелетных и сердечных мышц. Мы cгенерировали подобную скелетным мышцам модель, используя индуцибельный MyoD в клетках, получаемых из мочи. Эти данные подтвердили ранее описанные свойства DM1, но показали, что DM2 возникает за счет альтернативных патологических механизмов. Мы получили induced pluripotent stem cells (iPSCs) от пациентов с DM1 и DM2 и вызывали их дифференцировку в кардиомиоциты (iPSC-CMs). Мы установили, что DM1 мышечные трубки и iPSC-CMs способны обнаруживать внутриядерные кластеры MBNL1, тогда как DM2 мышечные трубки обнаруживали очень немного или не обнаруживали кластеры MBNL1 как в скелетномышечных, так и кардиальных моделях. Соотв., DM1 скелетные мышцы и кардиальные модели воспроизводили известные патогенетические паттерны альтернативного сплайсинга, тогда как DM2 клетки имели отличающиеся паттерны. DM1 и DM2 iPSC-CMs обладали самостоятельными calcium-handling дефектами по сравнению с контрольными клетками, потенциально объясняя кардиальные осложнения при этих нарушениях. RNA sequencing (RNA-seq) DM1 и DM2 iPSC-CMs выявило аномальный сплайсинг и профили генной экспансии, подчеркивающие уникальность патогенетических механизмов при DM1 и DM2.

Итак, мы использовали регулируемую экспрессию MyoD, чтобы репрограммировать получаемые из мочи клетки в мышечные трубки. В таких миогенных клеточных моделях мы установили нарушенную экспрессию dystrophin, в присутствии muscleblind-like 1 (MBNL1) очагов и аномальный сплайсинг при DM1, но не в клетках DM2. Мы получали iPSC от здоровых и DM1 и DM2 субъектов, которые дифференцировались в кардиомиоциты. DM1 и DM2 клетки обнаруживали увеличение очагов RNA по ходу клеточной дифференцировки. Происходящие из iPSC кардиомиоциты от DM1, но не DM2 обнаруживали аберрантный сплайсинг известных генов мишеней и секвестрирование MBNL. Выявлена тонкая ассоциация между кластерами MBNL и очагами РНК при DM1. Переходы Ca2+ различались в DM1- и DM2 iPSC-происходящих кардиомиоцитах и каждый отличался от здорового контроля. Секвенирование РНК в iPSC-происходящих кардиомиоцитах выявило разные нарушения в экспрессии генов, а также разные паттерны аномального сплайсинга. Следовательно, DM1 и DM2 имеют разные патологические сигнатуры.