Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser синдром - редкое заболевание (Online Mendelian Inheritance in Man-OMIM #277000) с частотой примерно 1 на 4500 новорожденных девочек. Он характеризуется врожденной аплазией влагалища и матки у женщин с кариотипом 46,XX и нормальной овариальной функцией, приводящей к нормальному развитию вторичных половых признаков. Состояние может быть отнесено к MRKH типу I, которое встречается примерно в 44% случаев и характеризуется изолированными пороками влагалища, шейки и матки, и при MRKH type II, объясняющем около 56% случаев, при которых аномалии гениталий ассоциированы с почечными, скелетными, кардиальными и/или слуховыми дефектами (MURCS, Müllerian Renal Cervical Somite)^1-3. MRKH синдром является вторым по наиболее распространенной причине первичных аменорей после дизгенеза гонад⁴ and it и это препятствует нормальным сексуальным отношениям, приводя к бесплодию и психологическим страданиям^5,6. Консервативное и минимальное инвазивное хирургическое вмешательство для коррекции дефектов влагалища и вагинопластика осуществляются с помощью разных клинических подходов, они позволяют пациенткам исполнять обычные половые функции и возможна репродукция с использованием дополнительной техники^7-10. Т.к. MRKH пациентки обнаруживают нормальную функцию , то суррогатное зачатие, а также трансплантация здоровой матки предоставляют шанс для MRKH женщин иметь биологическое дитя^11-15. Более того, коррегирующие вмешательства на матке с функционирующим эндометрием могут предоставить некоторым пациенткам возможность иметь спонтанную беременность¹⁶. Кстати, нет публикаций, описывающих рождение MRKH девочек от матерей с MRKH, однако, генетическое консультирование предупреждает о возможном репродуктивном риске MRKH у дочерей.

В настоящее время этиология синдрома остается неясной, фенотипическая изменчивость среди пациенток , присутствие как спорадических, так и семейных случаев и дискордантность между монозиготными близнецами подтверждает, что MRKH синдром является сложной болезнью, при которой задействованы генетические, эпигенетические и внешне-средовые факторы^17,18. В семейных случаях, MRKH синдром обнаруживает аутосомно доминантное наследование с неполной пенетрантностью и высокой изменчивостью в проявлениях¹⁹. Геномные перестройки и генные мутации описываются лишь у немногих MRKH женщин, воздействие на матку эпигенетических модификаций и/или внешне-средовых факторов может объяснить болезненные проявления у пациенток в отсутствие каких-либо генетических альтераций. Мутационный анализ генов, связанных с MRKH-ассоциированной патологией (напр. galactosemia) или затрагивающих ранние ст. развития (WT1, PAX2, HOXa9-13, HOXb9-13) или участвующих в copy number variations (CNVs) повторно обнаруживаются у MRKH пациенток (LHX1, HNF1B, TBX6, SHOX), это приводит к неясным результатам относительно предполагаемых причинных мутаций MRKH³. Что касается эпигеномных модификаций, Rall et al.²⁰ продемонстрировали, что метилирование ДНК может играть роль в этиологии синдрома MRKH путем модуляции экспрессии генов, скоррелированных с репродуктивным трактом женщин. Более того, профилирование в геноме микромассива экспрессии генов, осуществленное на ткани преддверия влагалища, показало нарушения уровней регуляции связанных с развитием генов, таких как MUC1, HOXB2, HOXB5, HOXC8, JAG1 и DLL1 у MRKH пациенток по сравнению со здоровыми женщинами²¹.

Copy number variations (CNVs) -это несбалансированные перестройки, крупнее 50 bp и возникающие в результате геномной нестабильности²². Разработка технологии array-based comparative genomic hybridization (array-CGH) существенно улучшила и ускорила обнаружение и характеристику CNVs у MRKH пациенток. Более того, метод Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) был использован для изучения и дальнейшего определения альтераций специфических генов, ассоциированных с синдромом²³. Описаны микроделеции и микродупликации в критических регионах хромосом, соответствующих генам, кодирующим белки, в основном участвующие в развитии женских гениталий и почек. В частности, 5 хромосомных дисбалансов постоянно обнаруживаются у MRKH женщин: 1q21.1del/dup, 16p11.2del, 17q12del, 22q11.21del/dup и Xp22dup^3,24. Помимо CNVs часто наталкиваются у пациенток с MRKH синдромом, на многочисленные хромосомные перестройки новые или особенно редкие, делающими неопределенной их клиническую интерпретацию. Т.к. эти неустойчивости обычно связаны с крупными регионами генома, включая некоторые гены с разными функциями, биоинформационный анализ мог бы помочь в объяснении потенциальной роли наблюдаемых CNVs. В последние годы, системные биологические подходы выступил в качестве мощных инструментов для изучения сложных болезней. В этой области предыдущие знания физических или функциональных взаимодействий между молекулами были использованы для построения сетей взаимодействий, которые демонстрировали соединения между индивидуальными узлами и в то же время проливали свет на более высокий уровень организации клеточных коммуникаций²⁵.

Чтобы идентифицировать присутствие известных и новых геномных нестабильностей в Итальянской группе из 36 неродственных MRKH женщин использовали array-CGH и MLPA методы; а чтобы выявить сети генов, кодирующих белки, расположенных в идентифицированных CNVs и чтобы включить их в потенциально связанные с MRKH пути посредством анализа protein-protein interaction (PPI) .



Figure 3 System biology analysis: aims and significance. Genetic and bioinformatic approaches combined in the study of MRKH syndrome aetiopathogenesis. Patient’s image was taken from a previously published study by our research group.



PPI network analysis. (A) Confidence-based network of protein-protein interactions including protein-coding genes located in the CNVs identified in the present study (purple nodes) and candidate genes from the literature (grey nodes). Nodes and font size are positively related to connectivity degree, which is further underlined by colour gradient for CNVs-related genes. Edges colour gradient is associated with STRING combined score, computed by combining the probabilities from the different evidence channels and corrected for the probability of randomly observing an interaction. (B) Focus on PRKX interactions with its first neighbours, functionally involved in movement of cells or subcellular components and cell migration (GO processes, p?

Discussion

Генетический вклад в синдром MRKH остается в основном неизвестным, несмотря на аутосомно доминантное или мультифакторное наследование, которое наиболее вероятно и специфические генетические альтерации, описанные как детерминанты MRKH фенотипа^3,19,37. В последние годы использование техники array-CGH позволило группам исследователей вскрыть скрытые хромосомные нестабильности на базе разных врожденных пороков развития. Используя этот подход, мы выявили 11 самостоятельных хромосомных перестроек в нашей когорте из 36 MRKH пациенток. Более того, посредством MLPA скрининга далее были найдены альтерации, затрагивающие 4 MRKH гена кандидата. Table 1 суммирует хромосомные перестройки, наблюдаемые в нашем анализе.

Table 1

CNVs found by array-CGH analysis in the whole cohort of MRKH patients.

Хотя были идентифицированы разные CNVs у MRKH пациенток, их значение для этой сложной генетической болезни остается неопределенным из-за отсутствия доказательства их причинности. Сегодня доступность больших количеств биомолекулярной информации позволяет рассматривать имеющиеся данные в биологическом контексте. В частности, PPI анализ сетей позволяет сузить список генов кандидатов теми, чьи продукты известны (или предсказуемы), чтобы взаимодействовать др. с др., увеличивая тем самым потенциальные вклады генов в один и тот же биологический процесс. Предварительное условие для использования такого типа данных по интеграции базируется на предположении, что белки, связанные с одной и той же болезнью или клиническим признаком, стремятся взаимодействовать или тесно расположены в сети. Так построение сети с 61 узлом, позволило нам связать вместе 36 белок-кодирующих генов путем идентификации CNVs и соединить их с путями, ранее связанными с детерминантами MRKH фенотипа. Хотя не все из этих генов принимают индивидуально участие, но, по-видимому, они имеют клиническое значение, их комбинация в компьютерную сеть может стать новой точкой зрения и позволить интерпретацию MRKH синдрома. Действительно, доказательства того, что генные продукты взаимодействуют др. с др., чтобы сформировать сложную сеть, указывают на то, что пертурбации одного из этих компонентов могут быть распространены посредством их взаимодействий, так что будут затрагивать др. гены сети. Значение центрального регуляторного узла связано с тем фактом, что его удаление оказывает наибольшее воздействие на топологию сети. В самом деле, было показано, что биологические сети стремятся быть устойчивыми по отношению к случайным пертурбациям, но разрушение hub часто приводит к системной недостаточности³⁸.

Как сообщалось, array-CGH выявил микроделецию на хромосоме 17q12, это соответствует генам LHX1 и HNF1B, у одной женщины с MRKH из нашей итальянской когорты, подтверждая, что этот регион часто подвержен хромосомным альтерациям, ассоциированными с MRKH синдромом^39-43. LHX1 кодирует транскрипцию фактора, относящегося к LIM гомеодоменовому семейству, а исследования на мышах показали, что этот ген играет важную роль в развитии женского репродуктивного тракта⁴⁴ и морфогенезе почекl^45,46. HNF1B, кодирует POU гомеодомен-содержащий транскрипционный фактор, он экспрессируется на высоком уровне в Müllerian протоках во время эмбриогенеза и способствует экспрессии LHX1, PAX2 и WNT9B, которые, в свою очередь, важны для формирования Müllerian протоков, их элонгации и поддержания^47,48. В самом деле, гаплонедостаточность по HNF1B связана с пороками развития матки и почечной системы у MRKH паци6енток³. Отметим, что в нашей PPI сети LHX1 является центральным узлом кластера, взаимодействующего с WNT4 и WNT5A, которые вместе с PAX2 и WNT9B являются главными регуляторами формирования Müllerian протоков^48,49. Соотв., наши находки подтверждают, что LHX1 и HFN1B являются сильными кандидатами на роль генов синдрома MRKH и толкают в направлении дополнительных функциональных исследований для лучшего понимания их биологической роли при этом синдроме.

Относительно делеции 16p11.2 альтерации в этом регионе хромосомы ранее уже были связаны с MRKH болезнью путем array-CGH исследования⁴². У пациенток с MRKH type II, мы идентифицировали хромосомные делеции, включающие TBX6, ген канидат при синдроме MRKH, уже описанный в литературе, как делетированный в др. 9 случаях этого синдрома^42,43. TBX6 ген кодирует T-Box транскрипционный фактор, играющий критическую роль в формировании мезодермы и спецификации во время эмбрионального развития. Исследования, проведенные на мышиных моделях показали, что отсутствие TBX6 приводит к аномалиям позвонков и ребер вместе с мочеполовыми пороками^50,51, признаки часто встречающиеся при синдроме MRKH. В самом деле, TBX6 является хабом в нашей связанной с CNV сетью PPI и его связью с HOXB2, HOXB5, HOXC8, а также с WNT4, WNT5A, WNT9B и LHX1, все участвуют в морфогенезе органов и развитии эмбрионoв^3,21,48, это подчеркивает важность TBX6 в этиопатогенезе MRKH.

Генетические исследования женщин с MRKH локус-специфичным методом MLPA также выявили присутствие дупликации, затрагивающей ген SHOX у одной пациентки. Гены HOX кодируют сильно законсервированные транскрипционные и эпигенетические факторы, которые являются главными регуляторами эмбрионального развития в разное время и в специфических местах вдоль оси тела; они также поддерживают их экспрессию в ходе постнатального развития^52,53. SHOX ген, расположенный в PAR1 регионе X и Y хромосомы, специфически участвует в развитии скелета. Здесь мы описали новую дупликацию специфического энхансера SHOX (т.e. CNE-2), выявленную с помощью MLPA анализа. Это генетическое нарушение ранее не было описано в литературе. Гетерозиготная дупликация, частично включающая SHOX, была описана ранее при семейных и спорадических случаях MRKH, все они обнаруживали type I-ассоциированные клинические характеристики^35,36. Современные представления полагают, что дупликация с участием SHOX или его энхансера может предопределять эффект избыточности функции, приводящей к широким нарушениям регуляции экспрессии генов на ранних ступенях развития генитального тракта женщин. Интересно отметить, что SHOX является центральным белок-кодирующим геном в одном из кластеров нашей сети, связанной с MRKH, взаимодействующем с PAX2, WNT4, WNT5A и WNT9B, а также с TBX6.

Поиск генетических аномалий с помощью array-CGH выявляет микродупликации в хромосоме Xp22.33. Хотя этот специфический регион уже был описан в перестройках в MRKH случаях⁴¹, часть, которую мы обнаружили, изменена уникально и представляет собой наиболее интригующую находку в данном исследовании. В самом деле, регион Xp22.33 содержит ген PRKX, кодирующий serine/threonine киназу с известной ролью в морфогенезе почечного эпителия^34,54-56, но пока не обнаружено связи с аномалиями Müllerian протоков. Li et al.⁵⁷, путем использования линии клеток, происходящей из нормального плода человека, эпителия почечных канальцев, продемонстрировали, что экспрессия PRKX активирует зависимую от cAMP миграцию клеток почечного эпителия и морфогенез канальцев. Теми же исследователями также было показано, что экспрессия PRKX стимулирует ветвление мочеточникового зачатка и индукцию гломерул в органной культуре эмбриональных почек⁵⁸. Кстати, механизмы с участием белка PRKX в специфическом развитии генитальных структур, не были продемонстрированы in vivo⁵⁹, но мы не можем исключить, что эта serine/threonine киназа может играть роль в морфогенезе Müllerian протоков. В самом деле, формирование разных органов мочевой и половой репродуктивной системы строго взаимосвязано⁶⁰ и многие общие гены участвуют в их морфогенезе^61,62. Примечательно, мы установили, что PRKX является хабом в нашей сети, связанной с MRKH, взаимодействуя с белками, функционально участвующими в перемещения клеток и миграцию, подчеркивая ещё сильнее потенциальную роль этого гена в предопределении синдрома MRKH.

Принимая это во внимание, мы оценивали уровни экспрессии гена PRKX в тканях преддверия влагалища от избранных MRKH женщин из нашей когорты. С 2006 по 2016, в сотрудничестве с группой гинекологов из Dep.t of Maternal, Infantile and Urological Sciences (Policlinico Umberto I, Sapienza University of Rome, Italy), мы осуществили вагинопластику, используя аутологическиеin vitro культивируемые вагинальные ткани у 39 пациенток с MRKH синдромом^10,63-66. В этот период мы оказались способны собрать РНК выборки, которые мы проанализировали с помощью количественной RT-PCR, выявив умеренное, но достоверное увеличение уровней PRKX мРНК у 67% пациентов по сравнению со здоровым контролем (see Supplementary Data). Анализ экспрессии гена PRKX проводили на тканях взрослых. Мы были осведомлены о том факте, что результаты, полученные с помощью такого подхода могут не отражать экспрессию PRKX во время эмбриогенеза. Кроме того, прддверие влагалища не является мезодермального (or Müllerian) происхождения, но оно происходит из эктодермы, которая дает ткани рудиментов матки, поэтому она более подходит для анализа. Во всяком случае, ткань преддверия влагалища, полученная от пациенток во время вагинопластики, по-видимому, является менее инвазивной процедурой. В самом деле, снижение психологических и физических страданий у пациенток MRKH является главной целью наших медицинских и исследовательских подходов. Кроме того, мы подтвердили важность дальнейшего анализа роли PRKX в этиопатогенезе MRKH с использованием базы данных транскриптома при MRKH⁶⁷ (see Supplementary Data).

Принимая во внимание 27 идентифицированных CNV генов, которые были исключены из in silico анализа, мы предполагаем, что они не интегрируются с предполагаемой сетью, принимая во внимание как функциональное перекрывание некоторых кодируемых белков, а также обычную варьирующую природу многих CNVs по всему геному⁶⁸. Необходимо подчеркнуть, что изучение сети генерирует только прогнозы, поэтому при составлении заключения необходима осторожность, и всегда следует проводить оценку in vitro/in vivo.

Итак, наши генетические и биоинформационные результаты предоставили новую информацию в комплексе межгенных взаимодействий и синдроме MRKH. Не в последнюю очередь, раскрытие генетической основы заболевания МРКХ представляет собой важную цель не только в отношении чисто анатомических и репродуктивных вопросов, но и в достижении психологического благополучия пострадавших пациентов и их родственников. В самом деле, диагностика синдрома часто происходит в юности, деликатное время для молодых женщин. Указание на точную генетическую причину этого нарушения поможет MRKH пациентка и их семьям в преодолении первоначального страха и позволит выбрать соотв. клиническое вмешательство и будущие репродуктивные решения, также учитывая риск рецидива заболевания.