В данном исследовании мы осуществили тщательный miRNome-wide скрининг в LUHMES нейронах из пост-митотического среднего мозга человека с умеренными уровнями индуцированной αSyn цитотоксичности. Мы обнаружили достоверную дифференциальную экспрессию 23 miRNAs (P менее 0.01; non-adjusted) при этом 12 miRNAs - без - и 11 miRNAs с известной связью с моделями synucleinopathies или PD. С помощью последующего биоинформационного анализа генов мишеней мы наблюдали обогащение клеточного цикла superpathway и подтвердили достоверные уровни дифференциальной экспрессии 6 генов клеточного цикла в пост-митотических нейронах с избыточной экспрессией SNCA. Путем наблюдения ежедневного участия в усилении транскрипции SNCA между днями DIV3 и DIV8, мы отметили очень сходную кривую экспрессии CCND1 и SNCA, тогда как экспрессия CCND1 не менялась в GFP экспрессирующих контрольных клетках. Мы также оценивали усиление активности SNCA-регулирующей miRNA hsa-miR-34c-5p путем задержки во времени после достижения пика экспрессии SNCA. Замалчивание двух наиболее активируемых генов CCND1 и CCND2, участвующих в инициации G0/G1 клеточного цикла, показало, что siRNA против только CCND1 и комбинации с CCND2 заметно снижает уровни цитотоксичности. Следовательно, накопление внутри клеток на ранней стадии αSyn в пост-митотических нейронах среднего мозга человека (Chakroun et al., 2020) сопровождается изменением экспрессии miRNAs, приводящему к обогащению генов клеточного цикла G0/G1. Среди них, CCND1, по-видимому, функционально участвует в обусловленной αSyn клеточной гибели, на что указывает siRNA-обусловленная интервенция.

В нашей модели αSyn-обусловленной патологии мы установили, что уровни 23 miRNAs существенно изменены. Из этих 23 miRNAs, 12 не участвовали в патогенезе synucleinopathies и родственных моделях. Интересно, что 11 miRNAs (hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-let-7e-5p, hsa-miR-184, hsa-mir-320c-1, hsa-mir-320c-2, hsa-miR-320d-1, hsa-miR-1224-5p; hsa-miR-92b-3p; и hsa-miR-887-3p) уже были описаны, как подвергающиеся нарушению регуляции у PD пациентов и связаны или с мишенью SNCA или с патофизиологическими механизмами PD (Minones-Moyano et al., 2011; Sibley et al., 2012; Soreq et al., 2013; Briggs et al., 2015; Kabaria et al., 2015; Prajapati et al., 2015; Hoss et al., 2016; Shamsuzzama et al., 2017) (see Supplementary Table 1). Наши данные в основном подтверждены дельнейшими исследованиями, полученными на др. моделях PD. Напр., в dopaminergic нейронах PD пациентов усиление активности hsa-miR-27a и hsa-miR-184 было описано в связи с избыточной экспрессией SNCA в нашей PD модели (Briggs et al., 2015). В лейкоцитах PD пациентов, hsa-mir-320c и hsa-miR-92b-3p были найдены подавленными сходным образом (Soreq et al., 2013). Кроме того, мы установили подавление hsa-miR-1224-5p и hsa-miR-887-3p, которые, как известно, подавляются в префронтальной коре у PD пациентов (Sibley et al., 2012; Hoss et al., 2016). Однако, некоторые из наших находок не согласуются с предыдущими данными. Мы сообщили об усилении активности, hsa-miR-34a-5p и hsa-miR-34c-5p, которые, как известно, прямо модулируют экспрессию SNCA в др. клеточной модели PD (Kabaria et al., 2015). Путем мониторинга экспрессии SNCA и hsa-miR-34c-5p между DIV3 и DIV8, мы не только оценили усиление активации miRNA, но и также показали, что hsa-miRNA-34c-5p достоверно активируется после максимальной экспрессии SNCA , достигаемой на DIV4. Т.к. экспрессия SNCA монотонно убывает после этого, то hsa-miRNA-34c-5p остается активной вплоть до DIV8. Поскольку hsa-miR-34c может подавлять экспрессию SNCA путем целенаправленного воздействия на его 3'-UTR (Kabaria et al., 2015), то усиление активности hsa-miR-34c в нашем исследовании может быть это контр-регуляторной мерой клеток для снижения повышенного уровня αSyn. В ткани головного мозга погибших PD пациентов на поздней ст. болезни hsa-miR-34c оказывается подавленной (Minones-Moyano et al., 2011). Эта противоречивая находка может быть объяснена тем фактом, что мы использовали клеточную модель ранней перегрузки αSyn. Следовательно, можно предполагать, что любые уровни экспрессии miR-34c могут изменять зависимость от стадии болезни и/или испытывать влияние со стороны не нейрональной популяции, как и ткани головного мозга умерших (включая глиальные клетки) были использованы для анализа ткани. Более того, hsa-let-7 miRNA, как было установлено, усиливает свою активность после оксидативного стресса в др. клеточных моделях PD (Prajapati et al., 2015; Shamsuzzama et al., 2017), тогда как мы наблюдали снижение активности в нашей модели. Это противоречащая находка может быть объяснена тем фактом, что сложный профиль экспрессии miRNA варьирует в зависимости от индуцируемого стресса, продолжительности и вида в разных PD моделях, таких как человеческие SHSY-5Y клетки и dopaminergic нейроны C. elegans. Уровни др. ассоциированных PD miRNA, таких как miR-7, miR-153 или miR-133b, не обнаруживали достоверных отличий в экспрессии в нашей модели избыточной экспрессии SNCA. Поскольку мы моделировали ранней стадии обусловленную αSyn патологию в dopaminergic нейронах, такие miRNAs могли или участвовать и на др. стадиях или в др. типах клеток, имеющих отношение к болезни или могли быть характерными для модели.

Отдельные miRNA могут затрагивать несколько разных mRNAs, кодирующих определенные гены мишени с ткане-специфическим профилем экспрессии (Halushka et al., 2018). Поэтому исследования и интерпретации взаимодействий miRNA-mRNA остаются очень затруднительными. В нашей модели избыточной экспрессии SNCA мы идентифицировали избыточно представленные процессы клеточного цикла и пролиферации. αSyn является ключевым белком в патогенезе PD, но его физиологическая функция всё ещё понятна не до конца. Помимо его присутствия в синапсах αSyn, как было установлено, локализуется в ядрах (Goncalves and Outeiro, 2013). Благодаря своему свойству связывания ДНК, была предположена важная роль его в транскрипции (Martins et al., 2011), что могло приводить к альтерациям экспрессии miRNA и генов, наблюдаемым в нашей модели. Более того, в соответствии с нашими находками, обнаруживается массив доказательств связи PD и αSyn с процессами клеточного цикла (Lee et al., 2003; Hцglinger et al., 2007; Ma et al., 2014; Paiva et al., 2017; Sampaio-Marques et al., 2019). Повышенные количества белков, ассоциированных с синтезом ДНК и повторным вступлением в клеточный цикл, описано в dopaminergic нейронах тканей головного мозга умерших с PD (Hцglinger et al., 2007). Сходные наблюдения были сделаны на клеточных и животных моделях PD (Lee et al., 2003; Paiva et al., 2017). Атипичное повторное вступление пост-митотических dopaminergic нейронов в клеточный цикл, как полагают, приводит к апоптозу (Sampaio-Marques et al., 2019), как при накоплении αSyn в ядрах клеток PC12 (Ma et al., 2014). Оба эти эффекта, как было установлено, способствуют нейротоксичности посредством активации клеточного цикла (Ma et al., 2014). Следовательно, наши находки альтераций генов клеточного цикла и повышенной цитотоксичности после перегрузки αSyn согласуются с сообщениями по PD пациентам и др. моделям PD. Пока точный механизм, приводящий к вредной активации клеточного цикла, остается неизвестным.

Контроль пролиферации клеток с помощью разных miRNAs преимущественно описывается при раке (Lin and Gregory, 2015). Гены, связанные с клеточным циклом, регулируются несколькими miRNAs, которые также присутствовали в нашей модели пост-митотических нервных клеток. Из 23 достоверно изменившихся miRNAs, обнаруженных в нашем исследовании, 8 miRNAs (hsa-let-7e-5p, hsa-miR-184, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-92b-3p, hsa-miR-1246, hsa-miR-143-3p и hsa-miR-663a) уже экспериментально были оценены как регулирующие гены, связанные с клеточным циклом (Hermeking, 2010; Mitra et al., 2011; Wu et al., 2013; Zhang et al., 2013; Zhen et al., 2013; Chai et al., 2016; Cho et al., 2016). Интересно, что 5 из них (hsa-let-7e-5p, hsa-miR-184, hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-34c-5p и hsa-miR-92b-3p) уже были описаны, как участвующие в возникновении synucleinopathies (Soreq et al., 2013; Briggs et al., 2015; Kabaria et al., 2015; Prajapati et al., 2015; Shamsuzzama et al., 2017). Остальные miRNAs представлены в списке на Рис. 3A , не были описаны в контексте synucleinopathies. Напр., при разных типах рака семейство let-7 miRNA в отдельности модулирует концентрацию CCND1, CDK4 , а также MYC (Mitra et al., 2011; Fairchild et al., 2019). MYC был также описан как участник регуляции экспрессии ряда miRNAs, напр., hsa-let-7 и hsa-miR-34a (Bueno and Malumbres, 2011). Сложность этой miRNA-mRNA сети создает затруднения интерпретации наших результатов. Т.о., можно предположить, что описанный паттерн дифференциальной экспрессии miRNA может не только возникать в ответ на альтерации вызываемые αSyn в клеточном цикле, но и также вносить вклад в эти альтерации. Однако, hsa-miR-34a-5p и hsa-miR-34c-5p не только целенаправленно воздействуют на SNCA (Kabaria et al., 2015), но и также на CCND1 (Sun et al., 2008; Achari et al., 2014), усиление активности обеих miRNAs может быть ответом на репрессию обеих. Снижение уровней экспрессии SNCA и CCND1 после усиления активности регулирующих их miRNA hsa-miR-34c-5p между DIV5 и DIV8, подчеркивает counter-regulatory роль этой специфической miRNA в нашей модели. Более того, благодаря разнообразию ролей miRNAs в клеточных процессах, биологических механизмах помимо активации клеточного цикла, таких как положительная регуляция сигнальной трансдукции и/или фосфорилирования белков д. безусловно учитываться. В самом деле, оба процесса были также обнаружены как заметно обогащенные при нашем miRNome-wide скрининге. Т.к. это исследование не изучало непосредственный эффект дифференциально регулируемых miRNAs на экспрессию CCND1 и SNCA, то необходимы дополнительные исследования miRNAs, напр., hsa-miR-34a-5p, hsa-miR-34c-5p и hsa-let-7e-5p, чтобы выяснить их роль в αSyn-обусловленных альтерациях клеточного цикла и цитотоксичности.

Однако, т.к. наши результаты были получены на пост-митотических нейронах, то дополнительные функции, такие как индукция вызванного стрессом клеточного цикла, необходимо учитывать. После клеточного стресса активация транскрипционного фактора p53, как было установлено, изменяет экспрессию некоторых генов, кодирующих miRNAs (Olejniczak et al., 2018). Напр., miRNAs hsa-miR-34a-5p и hsa-miR-34c-5p, которые были активированы в нашей модели, оказались регулируемыми с помощью p53в клетках рака молочных желез (Javeri et al., 2013). Вполне возможно, что внутриклеточное накопление αSyn и последующая агрегация могут привести к клеточным стрессам и p53-обусловленному изменению уровней miRNA.

Активация клеточного цикла зависит от деликатного баланса митогенных факторов. Факторы роста стимулируют экспрессию критических для G1 фазы генов, таких как CCND1, CCND2, CDK4, активность которых усиливалась в нашей модели, тогда как ингибитор клеточного цикла p57/Kip2 (CDKN1C) был подавлен. DВо время фазы G1 белок cyclin D соединяется с cyclin-dependent kinases 4 или 6 (CDK4/6) и посредством нейтрализации retinoblastoma (Rb) белка активирует транскрипционный фактор E2F, который в свою очередь, инициирует прогрессию клеточного цикла путем регуляции транскрипции генов S-фазы (Figure 4; Aktas et al., 1997; Choi and Anders, 2014). В нейронах с избыточной экспрессией SNCA мы обнаружили повышенную экспрессию CDK4 а также одного из генов семейства E2F (E2F3; Table 1). Прохождение разных КПП (checkpoints) клеточного цикла обычно предупреждает неконтролируемую активацию аппарата клеточного цикла. Однако, дисфункция может быть компенсирована с помощью индукции апоптоза (Pardee, 1974). В развивающемся головном мозге баланс между клеточной пролиферацией и запрограммированной клеточной гибелью является критическим для становления функциональной нервной сети. Оба процесса сильно законсервированы и обладают общими медиаторами (Pucci et al., 2000). Во время созревания клетки больше не подвергаются митозам, становятся пост-митотическими и окончательно дифференцированными. Следовательно, наша находка, что избыточная экспрессия SNCA в пост-митотических нейронах, приводящая к измененной экспрессии генов, ответственна за активацию клеточного цикла, что стало неожиданным. Т.к. экспрессия CCND1 в нейронах человека с избыточной экспрессией SNCA со временем становится сходной с уровнями SNCA и успешно замалчивает CCND1, снижая гибель нервных клеток, а корреляция между аномальным вступлением в клеточный цикл и αSyn-индуцированной нейродегенерацией может хорошо отслеживаться в нашей модели. Нижестоящие эффекты активации аберрантного клеточного цикла в пост-митотических нейронах приводят к клеточной гибели, что уде было установлено многими исследованиями (Freeman et al., 1994; Padmanabhan et al., 1999; Ino and Chiba, 2001; Jordan-Sciutto et al., 2003; Sumrejkanchanakij et al., 2003; Herrup and Yang, 2007; Hцglinger et al., 2007; Pinho et al., 2019; Sampaio-Marques et al., 2019). Наши находки подтверждают, что нарушение регуляции miRNA, проявляющееся в виде избыточная экспрессия SNCA может быть результатом механизма очень вышестоящей активации повторного вступления в клеточный цикл в пост-митотических нейронах. Для установления функциональной роли описанных измененных miRNAs в активации или counter-regulation аппарата клеточного цикла, необходимы дальнейшие исследования с целенаправленным нокдауном специфических miRNAs.

Помимо своей регуляторной функции клеточного цикла некоторые и др. роли cyclin D необходимо учитывать. Cyclin D1, как было установлено, подавляет метаболизм митохондрий (Sakamaki et al., 2006). Дисфункция митохондрий сегодня считается центральным фактором патогенеза PD (Franco-Iborra et al., 2016). Кроме того, cyclin D, как было установлено, играет критическую роль в ремоделировании хромосом (Hulit et al., 2004), др. эпигенетическом механизме, ассоциированным с патофизиологией PD (Labbe et al., 2016). Высокие уровни ацетилирования гистонов были обнаружены у PD пациентов (Park et al., 2016), а подавление гистоновых ацетилаз, как было установлено, защищает от индуцированной с помощью αSyn токсичности (Kontopoulos et al., 2006). Нейрозащитный эффект замалчивания CCND1, который мы обнаружили может быть опосредован его ролью на ремоделирование хроматина. Т.к. cyclin D управляет разными ролями в цитоплазме и ядрах, то необходимы дальнейшие исследования и необходимо установить точный механизм, лежащий в основе взаимодействия между cyclin D и обусловленной αSyn патологией.

Итак, miRNome-wide скрининг в ранней временной точке избыточной экспрессии SNCA в пост-митотических нейронах человека выявил 23 дифференциально регулируемых miRNAs, включая 13 новых miRNAsв контексте PD. Анализ генов мишеней соотв. miRNAs выявил усиление активации клеточного цикла G0/G1, что подтверждено qPCR анализом. Замалчивание CCND1 в условиях избыточной экспрессии SNCA подтвердило защитную роль и достоверное снижение нейротоксичности. Хотя наши находки показали, что целенаправленная регуляция с помощью miRNA пути клеточного цикла в пост-митотических нейронах делает возможным жизнеспособный терапевтический подход при PD и в конечном счете при др. synucleinopathies. Несмотря на это, необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить точные пути и механизмы, участвующие в повторном вступлении в аномальный клеточный цикл и чтобы подтвердить CCND1 и регулирующие его miRNAs в качестве новых мишеней для модуляции патофизиологии при PD.

Fig.5 Functional siRNA analysis. (A) Experimental treatment scheme. LUHMES neurons were transduced with adenoviral (AV) vectors of SNCA or GFP (control virus) and treated with or without siRNAs against CCND1 and/or CCND2. LDH release as measure for cytotoxicity was determined in control 6 days after transduction. DIV, days in vitro; DPT, days post transduction. (B–D) Quantification of cytotoxicity upon treatment with siCCND1 (B), siCCND2 (C), and siCCND1 + siCCND2 (D). Experiments in panels (B–D) included lipofectamine controls (LC), non-coding siRNA controls (NC) in parallel to the coding siRNA treatment. Data was normalized to LC in control cells. Results are presented as mean ± SEM from seven biological repeats. Statistical analysis in panels (B–D) was performed by a two-way ANOVA with Bonferroni’s correction for multiple testing and, if significant, pairwise comparisons were evaluated by an unpaired t-test. **P < 0.01, ***P < 0.001; ns, not significant.