X-linked juvenile retinoschisis (XLRS) является широко распространенной наследственной макулярной дегенерацией, затрагивающей зрение у юных мальчиков с частотой 1 на 5000 до 1 на 25000 [1,2]. Клинические признаки XLRS включают раннюю потерю зрения, связанную с билатеральным возникновением ямки и расщеплением внутреннего слоя сетчатки, отслойкой сетчатки и кровоизлияниями в стекловидное тело [3]. RS1, это ген, ассоциированный с XLRS, содержит 6 экзонов и кодирует белок в 224 аминокислоты [4]. Описано более сотни мутаций RS1, ассоциированных с возникновением XLRS и это также указывает на высокую степень клинической изменчивости (http://www.dmd.nl/rs).
Структура белка RS1 состоит из N-терминальной секреторной лидирующей последовательности и домена discoidin C-терминальной области, которая очень консервативна у разных видов [5,6]. Домен discoidin обнаруживается у ряда секретируемых и связанных с мембраной белков, известно, что он участвует в клеточной адгезии и межклеточных взаимодействиях [7]. Большинство мутаций в гене RS1 являются missense мутациями, хотя обнаруживаются также нонсенс мутации, делеции, инсерции и мутации сплайс-сайтов [8,9]. Предыдущие исследования показали, что пациенты с миссенс RS1 мутациями Asp145His, Arg102Gln, Arg209His и Arg213Gln обусловливают тяжелые характеристики ретиношизиса в клинике [10,11]. Missense мутации в белке RS1 вызывают неправильную укладку и могут вызывать накопление внутриклеточных и внеклеточных белков, приводящее в конечном счете к образованию кистозных и schisis структур в сетчатке [12]. RS1 экспрессируется и секретируется фоторецепторами наружной части сетчатки и биполярными клетками внутренней части сетчатки, как это обнаруживается у мышей [13]. Дальнейшие исследования показали, что RS1 прикрепляется к поверхности клеток сетчатки после синтеза и секреции фоторецепторными клетками, биполярными клетками и Müller cells, способствуя тем самым поддержанию структурной целостности сетчатки [14].
Nanodiamond (ND) является базирующимся на углероде наноматериалом, который может быть использован для переноса биомолекул или химических соединений [15-17]. С этой целью было разработано несколько техник, способствующих конъюгации химических веществ на поверхности, путем внесения carboxyl, hydroxyl и thiol групп. Многие исследования сообщали, что NDs может быть также использован в качестве системы доставки биомолекул, таких как ДНК [18,19], белки[20,21] и низкомолекулярные лекарства [22,23]. Поскольку вирусные векторы на сегодня наиболее широко исследованы в качестве vectorization агентов для генотерапии, из использование затруднено рядом недостатков, включая ограниченную способность упаковки ДНК [24], относительную трудность их производства [25], а также безопасность, связанную с иммуногенностью [26], канцерогенностью [27], широким тропизмом [28]. С др. стороны, биосовместимость и отсутствие токсичности делают ND's довольно безопасным наноматериалом для биомедицинского использования [29]. Эти преимущества NDs делают его выдающимся переносчиком терапевтических агентов для лечения наследственных болезней сетчатки.
Использование NDs для лечения болезней человека является многообещающим, но U.S. Food and Drug Administration (FDA) всё ещё требует, чтобы агенты, вводимые в тело не накапливались в течение длительного периода времени [30]. Хотя флуоресцентно меченные NDs имеют преимущества в качестве стабильного флуоресцентного сигнала, с крупным диаметром частицы д. сохранять флуоресцентную чувствительность [31]. Эксперименты на животных установили, что крупного размера частицы могут накапливаться в органах, даже не имея заметной токсичности [32,33]. Оборот наночастиц является важным вопросом для клинического использования. Продукция мочи почками является важным способом выведения их [34]. Порогом для неорганических наночастиц для фильтрации их стенками капилляров гломерул является примерно 5.5 nm. Следовательно, размер NDs может влиять на эффективность очистки почками [35].
Ранее мы сообщали о конъюгации 5 nm в диаметре carboxylated NDs на флуоресцентных белках для продукции безопасных, эффективных и отслеживаемых наноносителей [20]. Здесь мы использовали 3 nm carboxylated NDs в качестве носителей системы редактирования генома CRISPR-Cas9, предназначенной для введения XLRS-специфичной мутации RS1 c.625 C>T. С этой целью флуоресцентный mCherry белок был ковалентно соединен с NDs и с ДНК, кодирующей CRISPR-Cas9 элементы, ковалентно сцепленной с mCherry.
В данном исследовании попытались объективно оценить возможность использования NDs в отношении безопасности и биосовместимости материала для доставки ДНК in vitro и in vivo. В качестве первоначальной ступени мы тестировали эффективность NDs на клеточной линии in vitro. Затем NDs были использованы in vivo путем введения в стекловидное тело модельным мышам. Мы показали, что такие NDs могут успешно интернализоваться в induced pluripotent stem cells (hiPSCs) человека и клетки сетчатки мыши и могут вносить мутации в ген RS1. Редактирование гена RS1 в сетчатке мышей приводило к тяжелым патологическим нарушениям типа XLRS в виде аберрантных структур фоторецепторов. Мы полагаем, что наша базирующаяся на ND система доставки CRISPR-Cas9 может быть использована в качестве инструмента для создания модели болезни XLRS.
Итак, доставка ND частицами приводила к внесению RS1 c.625C>T мутации в iPSCs человека и сетчатку мыши, вызывая типичные для XLRS признаки.