Посещений: 
ПРОЦЕССЫ СТАРЕНИЯ И СТАРЧЕСКИЕ БОЛЕЗНИ
Роль гена GIT2
GIT2—A keystone in ageing and age-related disease Jaanavan Gastel,JanBoddaert,AretaJushaj et al.  Ageing Research Reviews
Volume 43, May 2018, Pages 46-63
|
Since its discovery, G protein-coupled receptor kinase-interacting protein 2, GIT2, and its family member, GIT1, have received considerable interest concerning their potential key roles in regulating multiple inter-connected physiological and pathophysiological processes. GIT2 was first identified as a multifunctional protein that is recruited to G protein-coupled receptors (GPCRs) during the process of receptor internalization. Recent findings have demonstrated that perhaps one of the most important effects of GIT2 in physiology concerns its role in controlling multiple aspects of the complex ageing process. Ageing can be considered the most prevalent pathophysiological condition in humans, affecting all tissue systems and acting as a driving force for many common and intractable disorders. The ageing process involves a complex interplay among various deleterious activities that profoundly disrupt the body's ability to cope with damage, thus increasing susceptibility to pathophysiologies such as neurodegeneration, central obesity, osteoporosis, type 2 diabetes mellitus and atherosclerosis. The biological systems that control ageing appear to function as a series of interconnected complex networks. The inter-communication among multiple lower-complexity signaling systems within the global ageing networks is likely coordinated internally by keystones or hubs, which regulate responses to dynamic molecular events through protein-protein interactions with multiple distinct partners. Multiple lines of research have suggested that GIT2 may act as one of these network coordinators in the ageing process. Identifying and targeting keystones, such as GIT2, is thus an important approach in our understanding of, and eventual ability to, medically ameliorate or interdict age-related progressive cellular and tissue damage.
|
GIT1 млекопитающих был идентифицирован как партнер по связыванию для G protein-coupled receptor kinases (GRKs), и поэтому был назван как GRK-interacting protein 1 (GIT1) (Premont et al., 1998). GIT1 и GIT2 представляют семейство белков GIT, которое обладает общими ферментативными функциями как GTPase-activating proteins (GAPs) для ADP-ribosylation factor (Arf) малых GTP-связывающих белков (Premont et al., 1998, Vitale et al., 2000). Функция GIT белков ограничивает активность Arf белков, членов большого семейства ArfGAPs (Kahn et al., 2008). Arf белки не обладают прирожденной GTPase активностью и поэтому нуждаются в GAPs, чтобы превращать GTP, связанные с активным Arf, в GDP, вызывая деактивацию (Randazzo et al., 1994). Оба GIT белка были первоначально идентифицированы как регуляторы интернализации GPCR посредством влияния, которое они осуществляют на Arf GTP-связанные белки (Claing et al., 2000, Premont et al., 1998, Vitale et al., 2000). Очищенные GIT белки сцеплены функционально с белком плазматической мембраны Arf6 (Claing et al., 2000, Di Cesare et al., 2000, Jones et al., 2009, Meyer et al., 2006, Miura et al., 2009), но инактивируют все подтипы Arf белков (Vitale et al., 2000).
GIT белки и их первичные партнеры по взаимодействию, PIX (PAK (p21-activated kinase)-interacting exchange factor) белки, могут действовать совместно, как сигнальные каркасные белки с их многочисленными доменами связи со многими белковыми партнерами (Zhou et al., 2016). Наиболее хорошо изученными партнёрами GIT белков являются p21-activated kinase-interacting exchange factors α-PIX и β-PIX (Bagrodia et al., 1998, Premont et al., 2000, Premont et al., 2004, Zhao et al., 2000). GIT белки действуют как часть этого каркасного комплекса, чтобы связывать сигнальные молекулы с определенными местами действия в клетке и внутри множества самостоятельных сигнальных сетей. Свыше 100 GIT-ассоциированных белков и десятки прямых взаимодействий, многие из которых были впервые идентифицированы в головном мозге, представлены в Table S1, включая liprin-α, piccolo и huntingtin (Hoefen and Berk, 2006, Zhou et al., 2016). GIT белки участвуют в регуляции когнитивной способности, при этом потеря GIT1 приводит к тяжелым нарушениям обучения и памяти у трех разных нокаутных моделей мышей (Hong and Mah, 2015, Menon et al., 2010, Schmalzigaug et al., 2009a, Won et al., 2011), и к микроцефалии, обусловленной уменьшением размеров нейронов (Hong and Mah, 2015), тогда как GIT2-KO мыши обнаруживают тревожное поведение и ускоренное старение (Lu et al., 2015, Schmalzigaug et al., 2009b).
Белки GIT участвуют во множественных клеточных процессах, включая миграцию клеток (Zhao et al., 2000), образование дендритных шипов (Zhang et al., 2003, Zhang et al., 2005), активацию Т клеток (Phee et al., 2005), агрегацию huntingtin (Goehler et al., 2004) и динамику центросом (Zhao et al., 2005). Ткани головного мозга от пациентов с болезнью Гентингтона, как было установлено, обнаруживают накопление C-терминальных протеолитических фрагментов GIT1 (Goehler et al., 2004). GIT1 обнаруживается в пре- и пост-синаптических окончаниях нейронов гиппокампа (Zhang et al., 2003), а подавление или неправильная локализация GIT1 приводит к разрушению дендритных шипов и формированию синапсов (Zhang et al., 2003, Zhang et al., 2005). Кроме того, GIT1 облегчает целенаправленное воздействие AMPA рецептора (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) в первичных нейронах гиппокампа (Ko et al., 2003) и обеспечивает передачу сигналов ephrin B во время формирования шипов (Segura et al., 2007). Напротив, менее известно о функционировании в нейронах GIT2, несмотря на значительное перекрывание экспрессии GIT1 и GIT2 во всем головном мозге (Schmalzigaug et al., 2007b).
Млекопитающие экспрессируют GIT1 и GIT2, тогда как рыбок данио экспрессируют три GIT белка, поскольку они имеют два GIT2 гена (git2a and git2b) (Yu et al., 2011). В то время как GIT1 имеет только два сплайс-варианта у человека и мыши, GIT2 подвергается значительному альтернативному сплайсингу (Premont et al., 2000). GIT1 и GIT2 обладают общим законсервированным архитектурным доменом, включая N-terminal zinc finger ArfGAP домен, три Ankyrin повтора, Spa2-homology domain/Src homology 2 domain-containing transforming protein D (SHD), coiled-coil (CC) домен, слабо законсервированный линкерный регион и focal adhesion targeting (FAT) домен (Fig. 1A&B) (Zhou et al., 2016). α-PIX и β-PIX партнеры по взаимодействию соединяются с SHD доменом. Coiled-coil домен делает возможной димеризацию GIT белков путем образования параллельных coiled-coil (Premont et al., 2004, Schlenker and Rittinger, 2009). Домен FAT действует как сайт связывания для адапторного белка paxillin фокальных адгезий (Schmalzigaug et al., 2007a, Zhang et al., 2008). GIT2-short является укороченным вариантом GIT2, в котором отсутствует FAT домен (Fig. 1C) и экспрессируется на высоком уровне в иммунных клетках. Важность сплайсинга GIT2 остается неясной, хотя GIT2-short обнаруживает неспособность связывать paxillin тем же самым способом, что и GIT2 (Premont et al., 2000) , оба GIT1 и GIT2 способны регулировать Arf6-зависимое секвестрирование GPCR. Прямое сравнение GIT1 и GIT2 подтвердило, что GIT2 соединяется с paxillin со значительно меньшим сродством, чем GIT1 (Premont et al., 2000). Др. различие заключается в том, что фосфорилирование тирозина GIT1 не зависит от клеточной адгезии, тогда как GIT2 временно фосфорилируется во время прикрепления (Shikata et al., 2003). Высокая гомология наблюдается между GIT1 и GIT2, как в отношении структуры, так и функции, а также наличие сильной гомо- и гетеродимеризации этих белков подтверждает присутствие некоторой избыточности in vivo, указывая, что они выполняют разные функции. Чтобы проанализировать индивидуальные GIT белки в клеточном контексте, Schmalzigaug et al. исследовали паттерны ткане- и клеточной специфичности (Schmalzigaug et al., 2007b). В то время как их исследование на мышах подтвердило широкое распределение двух GIT генов, присутствующих у человека и крыс, оно также выявило лежащие в основе паттерны экспрессии. GIT2 экспрессируется почти повсеместно, тогда как экспрессия GIT1 более ограничена. GIT1 и GIT2 совместно экспрессируются в большей части головного мозга, за исключением мозжечка, где обнаружен только GIT2 в гранулярных клетках. Поскольку экспрессия GIT1 ограничена в основном сосудистой системой печени и легких, а GIT2 экспрессируется в большинстве типов клеток (Schmalzigaug et al., 2007b). Более того, гены GIT1 и GIT2 регулируются в клетках зависимым от созревания способом в семенниках, где экспрессия GIT2 включается в клетках сперматогоний на ранних стадиях, но выключается, когда эти клетки созревают; экспрессия GIT1 обнаруживает противоположный паттерн. Это подтверждает онтогенетический сдвиг экспрессии между двумя изоформами. Несмотря на значительную экспрессию GIT1 и GIT2 в семенниках, дефицит этих генов не вызывает бесплодия у самцов, указывая тем самым, что ни один из GIT генов не является абсолютно необходимым для нормального развития м функционирования спермиев (Schmalzigaug et al., 2007b). Итак, функции, осуществляемые в головном мозге, это участие GIT1 главным образом в развитии головного мозга и значительное участие GIT2 в нейродегенерации, обусловленной старением (Goehler et al., 2004, Hong Mah, 2015, Lu et al., 2015). and
Fig. 1.
Domain-based structure of GIT family proteins. GIT1 (A) and GIT2 (B) share a common amino-terminal (N) ArfGAP (ADP ribosylation factor (Arf) GTPase-activating protein) domain, three ankyrin repeats (3x Ank), and the Spa homology domain (SHD) - indicated with two Spa2-like repeats - a coiled-coil (CC) dimerization domain and a C-terminal focal adhesion-targeting (FAT) domain. The ArfGAP domains facilitate the GTP hydrolysis on Arf1 and Arf6; Ankyrin repeats promote the integration and stabilization of multiple transmembrane proteins; the SHD regions mediates PIX, FAK, MEK, Piccolo binding; the CC domain is likely associated with regulating transcriptional functions; the FAT domain mediates localized targeting to plasma membrane-bound integrin complexes. In contrast to GIT1, GIT2 has been shown to exist as multiple isoforms, which are produced due to alternative splicing of five internal in-frame regions (indicated with A, B, C, D, E). Additionally, a distinct exon (D') exists which leads to GIT2-short (C), a truncated isoform where the FAT domain is absent. For GIT1, alternative splicing of a single exon can occur at the start of the SHD. Prominent post-translational modification phosphorylationsites (tyrosine - Y) are shown in red.
1.1. Molecular mechanisms of ageing
Старение это один из наиболее сложных и взаимосвязанных биологических процессов, характеризующийся прогрессирующей потерей физиологической целостности, приводящей к нарушению функциональности и повышению уязвимости к болезням и в конечном итоге к гибели (Lopez-Otin et al., 2013). Этот процесс представляет собой также один из самых наивысших факторов риска для огромного большинства нарушений у человека, т.e. нейродегенерации, остеопороза и Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) (Lopez-Otin et al., 2013). В то время как процесс старения не рассматривается как болезнь, оно является состоянием, которое облегчает или даже индуцирует появление болезней у многих стариков (Rattan, 2014) и в качестве такового может рассматриваться как фактор риска для возникновения большинства связанных с возрастом болезней (Collier et al., 2011, Niccoli and Partridge, 2012).
Причины нарушений часто заложены в геноме. Некоторые гены были идентифицированы как важные для регуляции продолжительности жизни у модельных животных, у которые генетические манипуляции с рядом генов, участвующих в оси гормоны роста/insulin-like ростовой фактор 1, сильно влияют на продолжительность жизни (de Magalhaes, 2011). На молекулярном сигнальном/функциональном уровне, однако, имеются три главные характеристики, участвующие в предопределении способности к выживанию и тем самым продолжительности жизни: i) контроль тканевых/клеточных повреждений; ii) стрессовые реакции и iii) соотв. молекулярное ремоделирование и адаптация. Существует прогрессирующее уменьшение таких соматических репараций и адаптационных способностей, которые определяют скорость процессов старения (Rattan, 2014). Каждый из этих противодействующих и продуктивных процессов нуждается в в эффективном энергетическом метаболизме. Имеющиеся данные демонстрируют, что оптимальная регуляция энергии, используемая как в ЦНС, так и ПНС, способствует здоровому старению (Cai et al., 2012, de la Monte, 2014, de la Monte et al., 2017, Janssens et al., 2014). Гипоталамус является одним из ключевых органов тела, отвечающих за поддержание эффективного взаимодействия между энергетическим балансом и нейрологической активностью. Он поэтому является жизненно важным регионом головного мозга для процесса старения, т.к. он трофически координирует центральные и периферические функции (Cong et al., 2012, Stranahan et al., 2012a, Wang et al., 2010, Zhang et al., 2013). Сложные физиологические системы, базирующиеся как на нервных, так и эндокринологических способностях (modalities), сдерживаются с помощью сложных и взаимозависимых сетей из генов и белков скорее, чем с помощью какого-либо одного унитарных факторов (Chadwick et al., 2012) - так как чрезмерная сложность, однако, практически может быть сведена к небольшой группе трофических регуляторных факторов, помогающих поддерживать целостность сети и способность к быстрой адаптации к пертурбациям.
1.2. Molecular networks and keystones
Становится всё яснее, что биологические системы функционируют как сложные интегрированные сети скорее, чем простейшие линейные молекулярные каскады (Barabasi and Oltvai, 2004). Функциональные биологические сети на наиболее базовом уровне состоят из кластеров само-упорачивающихся межбелковых взаимодействий. Эти сети из белков могут затем регулировать сигнальные каскады, транскрипционные реакции и системы межклеточных коммуникаций, чтобы контролировать процессы от одиночной клетки до уровня всего организма (Fraser, 2005). Наивысшая степень взаимосвязанности белков в таких сетях, может рассматриваться как биологически наиболее важная (Albert et al., 2000, Jeong et al., 2001).
Такие сильно взаимосвязанные белки называются 'краеугольными' белками или ступицами ('hubs') (Han et al., 2004, Schadt, 2009, Schadt et al., 2009). Присутствие таких краеугольных камней позволяет сети становиться высоко устойчивой к случайным отказам (периферических) узлов, тем самым создется устойчивость сети. Кроме того, эти keystone факторы делают возможными ответы и адаптации к изменениям внешних и внутренних состояний, без потери нормальной функциональности и целостности сети (Wolfson et al., 2009). Крепко связанные ступицы или хабы (keystones) особенно важны для многоклеточных/многотканевых процессов, таких как старение, т.к. они существенно улучшают эффективность коммуникаций внутри этих мульти-тканевых сверх-сложных систем (Watts and Strogatz, 1998). Во время стресса, когда мульти-тканевые скоординированные реакция являются жизненно важными, может быть необходим дополнительный уровень физиологической координации, т.е. коммуникации между хабами (keystone-keystone). Взаимодействия между разными хабами могут быть поэтому важны, чтобы координировать сохраняющие жизнь стрессовые реакции и, скорее всего, ответственны за связи между разными классами клеточных путей, напр., связи метаболической целостности с репарацией ДНК. При нормальных физиологических функциях эти взаимодействия domain-crossing complex из механизмов трофического контроля делают возможными адаптации к внезапным нуждам и беспрецедентным изменениям (Lipsitz and Goldberger, 1992). Современные данные подтверждают, что в глобальном смысле существует прогрессирующая потеря этих сложных взаимодействий, обеспечивающих целостность и гибкость сети во время процессов старения (Balasubramanian and Nagaraj, 2016, Lipsitz and Goldberger, 1992, Morrison and Newell, 2012, Sleimen-Malkoun et al., 2014), вызывает потерю динамического диапазона в физиологической функции и тем самым снижает способность адаптации к стрессам. Это наблюдается во многих процессах, таких как : 1) сердечно-сосудистый контроль; 2) пульсирующее высвобождение гормонов; и 3) электро-энцефало-графические потенциалы (Lipsitz and Goldberger, 1992).
Поддержание сложных взаимодействий, которое происходит между разными биологическими системами посредством хабов функциональности, может быть многообещающим подходом для уменьшения тяжести связанных с возрастом нарушений. Следовательно, целенаправленное воздействие на хабы функциональности/экспрессии может существенно контролировать процессы старения минимально-инвазивным и само-поддерживающим способом, т.е. за счет модуляции самих хабов (keystone) может создаваться исправляющие синергичные пульсации ('ripples') в желательных физиологических сетях. Исправляющая регуляция факторов хабов может порождать тонкие, но очень эффективные, терапевтические реакции, т.к. ни одна одиночная сигнальная система не получит непосредственного воздействия, которое снижало бы благоприятную возможность для быстрого рефлексивного tachyphylaxis на уровне одиночного пути, т.е. десенсибилизацию. Большинство на сегодня используемых лекарств разумно предписывается с целью индукции их терапевтической эффективности посредством регуляции только небольшого количества факторов/белков в сигнальном каскаде. Однако, эти небольшие локальные эффекты могут затем наталкиваться на противодействие со стороны др. дистальных компонентов этой 'болезненной' сети; напротив, эффективный контроль хаб-факторов может, скорее всего, вызвать эффект, который распространится по сети с помощью само-усиливающегося способа.
Одним из таких белков мишеней в такой сложной сети старения является GIT2 (Chadwick et al., 2012). GIT2 был идентифицирован как важный белок, связывающий некоторые аспекты сложного процесса старения, включая энергетический метаболизм и нейрофизиологическую регуляцию. Используя беспристрастный Latent Semantic Indexing (LSI) подход, было установлено, что GIT2 крепко связан с огромным количеством функциональных аспектов белковых сетей в стареющем гипоталамусе. GIT2 потенциально играет многоразмерную роль в связывании нейрональной и регулирующей энергию функций при старении (Chadwick et al., 2012). В подтверждение keystone роли GIT2, Chadwick et al. (2012), показали сильное увеличение экспрессии GIT2по мере увеличения возраста в широком круге тканей ЦНС (гипоталамусе, своле головного мозга, мозжечке, коре и гипофизе), а также во многих периферических тканях, ассоциированных с соматическим метаболизмом энергии (поджелудочная железа, печень, скелетные мышцы и жировая ткань). Это связанное в возрастом увеличение экспрессии GIT2 подтверждает фундаментальную роль в процессе старения и регуляции энергии этого каркасного белка (Chadwick et al., 2012). Дальнейшие исследования каркасного белка GIT2, показали, что он взаимодействует со многими белками, участвующими в многочисленных 'самостоятельных' сигнальных путях (Fig. 2and Table S1) (Zhou et al., 2016). Многие из этих партнеров физических взаимодействий участвуют в связанных с возрастом нарушениях, включая Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM), ассоциированный с репарацией ДНК Breast cancer type 1 susceptibility protein (BRCA1), опухоли супрессирующий белок p53 (p53), инсулиновый рецептор и insulin receptor substrate 2 (Lu et al., 2015, Martin et al., 2015). Белок GIT2 может т.о. играть жизненно важную роль в организации сложных молекулярных сигнальных сетей, благодаря своей способности осуществлять контроль над передачей сигналов на многие трофические уровни (Han et al., 2004, Mirzarezaee et al., 2010).
Fig. 2.
The functional spectrum of curated GIT2 interactors. GIT2 in-part acts as a vital scaffolding protein as well as a, ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein (ArfGAP). As protein scaffolding has been shown in recent years to be a vital component of intracellular signaling cascades, e.g. the assembly of mitogen-activated protein kinase pathways by adapters such as ?-arrestin, the interactomic profile of proteins such as GIT2 are likely to be a strong indicator of the eventual functionality of the specific protein in a cellular system. The radial diagram centered upon GIT2 indicates a comprehensive assessment of GIT2 published interacting proteins identified to date. The presented information is based upon literature and data from Zhou et al. (2016), and Lu et al. (2015). All of the known and validated GIT2-interacting proteins are rationally grouped (via color matching with the groups radially indicated) based on their biological functions - thus facilitating an indication of the potential interactomic ramifications of GIT2 protein-protein binding activity. Red rings around the specific interacting proteins are used to identify GIT2-interacting proteins belonging to more than one functional signaling group, e.g. SRC (Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src) interaction with GIT2 demonstrates the role of this molecular interaction with immune responsivity regulation, cell cycle regulation and osteogenesis. The most commonly found and interconnected GIT2 interactors are indicated via enlarged protein identification text, i.e. ATM (ataxia telangiectasia mutated), SRC (Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src), TP53 (tumor protein p53) and GIT1 (ARF GTPase-activating protein GIT1). With further interactomics-based research the complexity and connectivity of these associated scaffolding factors - and how they eventually regulate GIT2-associated biology - will be further elucidated, allowing the potential for therapeutic interventions based on these reactions. All previously identified GIT2 interactors can be found in Supplementary Table S1.
2. GIT2 and the HALLMARKS OF AGEING
Хотя молекулярные сложности процесса старения являются уникальными для каждого индивида, имеется несколько общих знаменателей старения, наз. отличительными признаками (Fig. 3).
Fig. 3.
Parallel effects of the major ageing hallmarks during lifespan. The complex multifactorial process of ageing is likely both initiated and controlled by the potential simultaneous interaction between several pathological domains. The generation, potentially in early middle-age, i.e. 30-35, of an individual's ageing trajectory is likely an index of both the degree and temporal co-occurrence of multiple pro-aging molecular pathologies. In this simplistic model we propose that initial metabolic dysfunctions that interfere with optimal glucose usage as the primary energy source will likely force the individual to enhance the usage of lipid-based metabolism for supplementary energy generation. This switch will likely require increased storage of lipids in tissues to act as an energy reserve - this abnormal/premature lipid infiltration and storage in tissues may then induce a greater pro-inflammatory state in the individual. The combination therefore of reduced energy generation efficiency and enhanced inflammatory markers is likely to be coincident with an increased oxidative radical burden (due to the move away from efficient oxidative phosphorylation) which in turn will increase the risk for cellular protein, lipid and nucleic acid damage. It is highly likely however that many of these events will occur in most individuals during the aging process but the relative magnitude of each event and their temporal relationships will likely vary, resulting in an individualistic aging trajectory in each person.
2.1. GIT2 controls DNA damage response factors
Постоянные воздействия внешней среды, а также внутренних метаболических/эндокринных стрессов, соматических и митохондриальных генетических повреждений возникают естественным образом в течение всей жизни (Moskalev et al., 2013). В основе старения лежат важные повреждения ДНК, прототипические преждевременные старческие нарушения, такие как синдромы Werner, Bloom and Hutchinson-Gilford прогерия, вызываемые усилением накопления повреждений ДНК (Burtner and Kennedy, 2010). Стабильность и целостность ДНК постоянно подвергаются воздействию экзогенных и эндогенных угроз, таких как ошибки репликации ДНК и реактивные виды кислорода (ROS) (Hoeijmakers, 2009). Для укрепления противостояния этим воздействиям организмы разработали сложную сеть механизмов репарации ДНК, которые коллективно способны справиться с большинством типов повреждений ДНК (Lord and Ashworth, 2012). Реакция на повреждения ДНК (DDR) включает распознавание повреждений ДНК, репарацию ДНК и репрограммирование транскрипции. Интересно, что современные доказательства подтверждают, что эти реакции контролируются механизмами циркадных часов (Sancar et al., 2010). Эти часы являются молекулярной системой, которая обеспечивает ежедневные ритмы физиологических функций (Hastings et al., 2003, Reppert and Weaver, 2002, Sancar, 2004, Takahashi et al., 2008), позволяя организму выживать (Uchida et al., 2010). Основные компоненты циркадных часов участвуют в клеточных циклах и регуляции DDR. Более того, многие внутриклеточные сигнальные каскады, важные для клеточного цикла и DDR, важны также и для регуляции часов (Uchida et al., 2010).
GIT2, по-видимому, способствует репарации ДНК посредством множественных механизмов; напр., стабилизации BRCA1, активации белков репарации, а также регуляции активности poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Первым указанием на роль GIT2 в репарации ДНК стало усиление экспрессии GIT2 в ядре после индукции разрывов двойной нити ДНК (DSB) в клетках нейробластомы (Lu et al., 2015). Эктопическая избыточная экспрессия GIT2 способствует репарации повреждений ДНК и повышению уровней экспрессии белков, ассоциированных с DDR, тогда как замалчивание GIT2 с помощью siRNA вызывает противоположный эффект. GIT2, как было установлено, крайне синергичен с экспрессией многих связанных с DDR факторов, напр., HMGB1 (High mobility group protein B1), MDC1 (Mediator of DNA damage checkpoint protein 1), and FANCI (Fanconi anemia group I protein) (Lu et al., 2015). Дальнейшие исследования продемонстрировали, что GIT2 также функционально связан со многими белками комплекса DDR, такими как γ-H2AX (маркер для сайтов DSB ДНК), MDC1, p53 binding protein 1 (p53BP1), сам p53 опухолевый супрессор и ATM после воздействия агентов, повреждающих ДНК, подтверждая, что GIT2 может формировать часть чувствительного к контексту мульти-белкового комплекса, состоящего из белков, связанных с DDR (Lu et al., 2015). Как упоминалось ранее, GIT2, по-видимому, способствует активности белков, участвующих в реакции на повреждения ДНК; PARP1 and -2. Эктопическая экспрессия GIT2 способствует синтезу Poly-ADP ribose (PADR) с помощью PARP1 и PARP2, в клетках, подвергшихся радиационной ионизации, указывая, что GIT2 может влиять на репарацию ДНК путем облегчения активности PADR полимеразы. Более того, геномная делеция GIT2 приводит к накоплению повреждений в ЦНС и к ускорению старения (Lu et al., 2015). Наконец, иммуногистохим. окрашивание срезов коры, полученных от GIT2KO мышей, продемонстрировало присутствие достоверно большего количества фокусов γ-H2AX в ядрах клеток молодых GIT2KO мышей, чем у старых дикого типа (WT) мышей, указывая на продвинутый старческий фенотип, потенциально обусловленный снижением способности к репарации ДНК (Lu et al., 2015). В дополнение к этой строго роли GIT2 в поддержании физических компонентов DDR, последние данные также подтверждают, что геномная делеция GIT2 может менять клеточные функции, связанные с циркадным ритмом, такие как дневной/ночной метаболические сдвиги (Martin et al., 2015) и активность иммунных клеток (Siddiqui et al., 2017).
Механизмы клеточных часов могут не только регулировать хронологическое старение клеточных тканей, но и эти механизмы могут также строго регулировать скорость и степень метаболических нарушений, стабильность теломер и повреждения ДНК во время процесса старения (Collis and Boulton, 2007, Kagawa, 2012, Khapre et al., 2010). Неудивительно поэтому, что функциональность клеточных часов теперь связывают со многими обусловленными возрастом нарушениями, включая деменцию (Musiek et al., 2013), glycemic/adiposity нарушения, такие как Metabolic Syndrome (Bruce et al., 2016, Vieira et al., 2014) и преждевременное патофизиологическое старение, ассоциированное с ослаблением репарации поврежденной ДНК (Kowalska et al., 2013, Vaziri et al., 1997). Интересно отметить, что была предположена сильная эволюционная синергия между генами часов и белками, участвующими в процессах DDR (Uchida et al., 2010). Многочисленные внутриклеточные сигнальные белки, функционально связанные с GIT2, напр. ATM, p53 и BRCA1, участвуют в чувствительных к стрессам каскадах и играют важные роли как в контроле клеточного цикла и DDR, так и в регуляции циркадных часов (Gery et al., 2006, Kowalska et al., 2013, Miki et al., 2013, Storcelova et al., 2013, Vieira et al., 2014). Siddiqui et al. (2017) недавно продемонстрировали, что посредством множественных иммунологических тканей геномная делеция GIT2 приводит к значительной совместной редукции множественных связанных с часами транскриптов мРНК, что также ассоциирует с преждевременным старением и функциями DDR (Siddiqui et al., 2017). GIT2 поэтому может служить в качестве функционального моста между клеточным старением, регуляцией часов и повреждениями ДНК и тем самым может обладать потенциальной способностью менять накопление связанных с возрастом клеточных повреждений. Поскольку накопления связанных с возрастом повреждений и метаболических дисфункций ДНК, по-видимому, действуют синергично, чтобы ускорять начало связанных с возрастом повреждений, то интересно отметить, что терапия, нацеленная на механизмы регуляции часов, сегодня кажется многообещающей для воздействия на связанные с возрастом болезни (Blackburn et al., 2015, Dankel et al., 2014, He et al., 2016).
2.2. GIT2 expression is modulated by oxidative stress
Низкие уровни оксидативных стрессов за счет ROS безусловно выгодны организмам, т.к. это может удлинять продолжительность жизни у дрожжей и C. Elegans (Doonan et al., 2008, Mesquita et al., 2010), подтверждая, что ROS могут играть роль в запуске клеточной пролиферации и жизнеспособности в ответ на нормальные физиологические сигналы и в условиях стрессов (Sena and Chandel, 2012). Однако, по мере продолжения старения клеточные стрессы и повреждения возрастают по мере увеличения уровней ROS, подавляя системы реакций на оксидативные стрессы, приводя к усилению оксидативных стрессов и ассоциированных с возрастом повреждений (Hekimi et al., 2011). Теория свободных радикалов в старении указывает, что прогрессирующая дисфункция митохондрий с увеличением возраста приводит к усилению продукции ROS, это в свою очередь вызывает глобальные клеточные оксидативные повреждения (Harman, 1965). Долговременное воздействие на нервные клетки человека не-цитотоксических уровней радикалов кислорода может реплицировать множественные вредные эффекты для нейрофизиологии в результате процессов старения клеток, напр., снижение чувствительности к neurotrophin, нарушение системы буфера клеточного кальция и ослабление потребления и утилизации глюкозы. Такая долговременная экспозиция поэтому эффективно воспроизводит низкие уровни постоянных стрессов, переживаемых нормально стареющими клетками, или ранние стадии нейродегенеративных нарушений (Chadwick et al., 2010b). Chadwick et al. обнаружили существенное повышение lamin A (связанного с progeric laminopathy, e.g. Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome) и GIT2 в этой клеточной модели старения ЦНС
(Chadwick et al., 2010b). Когда эти исследования на клетках были применены к действительно стареющей ткани ЦНС, то наблюдалось выраженное увеличение экспрессии GIT2 в ЦНС мышей, крыс, не-человекообразных приматов (Rhesus Macaque) и человека по мере увеличения возраста (Chadwick et al., 2010b). Учитывая роль GIT2 в регуляции повреждений ДНК, то становится очень возможным, что это зависимое от возраста увеличение отражает рефлекторную клеточную защиту, нацеленную на ослабление потенциальных вызываемых ROS повреждений ДНК и др. клеточных стрессовых агентов.
2.3. GIT2 controls metabolic functionality
Давно было установлено, что метаболизм глюкозы постепенно нарушается по мере старения (Davidson, 1979). Роль пути инсулина и insulin growth factor-1 (IGF1) в регуляции продолжительности жизни вообще-то один из наиболее изученных сценариев молекулярного старения (у многих организмов) кстати (Lopez-Otin et al., 2013, Piper et al., 2008). 40% белков пути Ins/IGF1 идентифицировано в качестве белков, связанных с продолжительностью жизни (Wolfson et al., 2009). В соответствии с этим, ограничение калорий - вызывает исправление связанной с Ins/IGF1 дисгликемии и увеличивает продолжительность жизни или "healthspan" (т.e. период жизни, в котором отсутствуют существенные болезненные патологии) у всех изученных видов эукариот (Colman et al., 2009, Fontana et al., 2010, Mattison et al., 2012, Speakman and Mitchell, 2011). Более того, фармакологические манипуляции, воспроизводящие состояние ограниченной доступности питательных средств, напр. rapamycin или resveratrol, как было установлено, увеличивают продолжительность жизни и/или healthspan у мышей и не-челоовекообразных приматов (Harrison et al., 2009). Как упоминалось ранее, с возрастом снижается способность всех систем организма улаживать стрессы и это частично обусловлено снижением эффективности, прежде всего, гликемическую энергию-генерирующей метаболической системы (Barzilai et al., 2012, Daum et al., 2013, Terman, 2006). Первичный синтез энергии посредством классического митохондриального оксидативного фосфорилирования представляет собой наиболее эффективный механизм продукции аденозин трифосфата (ATP), использующий катаболизм глюкозы, а альтернативные генерирующие энергию механизмы, напр., посредством утилизации липидов или белков, оказывают более значительные физиологические стрессы, чем оксидативное фосфорилирование и генерируют меньше АТФ на единицу использованного катаболита. Изменения в использовании первичных энергию генерирующих катаболитов может быть количественно оценено с использованием respiratory exchange ratio (RER), т.e. соотношения потребления кислорода к продукции углекислого газа. Высокий RER (~0.9 - 1) показывает, что преимущественно используются углеводы, тогда как более низкое RER указывает на окисление липидов (~0.8) или деградацию (~0.7 - 0.8) (Pendergast et al., 2000, Simonson and DeFronzo, 1990). Недавний эпидемиологический анализ продемонстрировал, что скорость старения человека может быть сильно связана с с характерными для ранней жизни метаболическими 'траекториями' , которые могут быть измерены с использованием классического метаболического анализа (Belsky et al., 2015).
Обусловленное постепенным снижением метаболической эффективности с возрастом, делает тело всё более чувствительным к множественным патофизиологическим изменениям, связанными с недостаточностью энергии (Chadwick et al., 2012), включая нейродегенерацию, устойчивость к инсулину и метаболические нарушения. такие как T2DM, а также хроническое воспаление (Chadwick et al., 2012, Ford et al., 2002, Morley, 2008). Эта связанная с возрастом чувствительность может быть в основном ассоциирована с: i) повышенной продукцией ROS на синтезированный АТФ, ii) уменьшение активности по деградации не-существенных белков, приводящее к избыточной агрегации белков, и iii) снижение способности процессов репарации клеточных повреждений. Следовательно, скорее всего, healthspan млекопитающих крепко связан со способностью организма сохранять пик метаболической эффективности. Использование менее эффективных генерирующих энергию катаболических процессов поэтому будет удобным показателем имманентного связанного с возрастом снижения. В соответствии с этим было продемонстрировано, что довольно молодые (4-6 мес.) GIT2KO мыши обнаруживают достоверно сниженное respiratory exchange ratio по сравнению с WT мышами, указывая на переключение в направлении катаболизма жира (и возможно белков), чтобы генерировать энергию вместо глюкозы (Martin et al., 2015). Это снижение соматической энергии, как было установлено, управляется с помощью присутствия сильной гипоталамической молекулярной сигнатуры, способствующей связанной с возрастом дисфункцией метаболизма. Подчеркивая системный уровень функциональности GIT2, было также установлено, что потеря GIT2 существенно влияет на структуру и активность панкреатических островков, приводя к снижению способности продукции инсулина, к потере массы β-клеток и к инволюции α-клеток островков (Martin et al., 2015). Эти структурные патологии поджелудочной железы у GIT2KO мышей были ассоциированы с достоверно более высокими уровнями глюкозы в плазме в условиях голодания, снижением инсулина в плазме и устойчивостью к инсулину по сравнению с контролем того же возраста. Наглядная связь между старением организма и метаболическим статусом, также демонстрирует, что GIT2 может служить в качестве биомаркера старения, эта функция предопределяется с помощью преобладающего метаболического состояния организма. Так, db/db мыши, моделирующие диабет и ожирение, демонстрируют преждевременное повышение уровней экспрессии GIT2 (Martin et al., 2015). Наблюдается соответствие эффектов метаболических нарушений на траектории старения человека (Sancar, 2004). Очевидно, что пересечение между системой Ins/IGF1 и GIT2 осуществляется на уровне физической ассоциации и формирования каркаса, посредством физической ассоциации GIT2 с Insulin Receptor и с Insulin receptor substrate 2. Более того, ассоциация GIT2 с этими двумя компонентами системы Ins/IGF1 нарушается в поджелудочной железе db/db мышей, подтверждая метаболическую регуляцию этих взаимодействий (Martin et al., 2015).
2.4. GIT2 functionality is associated with T-cell activity and immune response capacity
Во время процесса старения наблюдается прогрессирующая дисфункция многих рецепторных сигнальных систем, среди которых резистентность инсулиновых рецепторов изучена наиболее тщательно. Помимо прогрессирующего метаболического нарушения, альтерации в рецепторной сигнальной системе, связанные с воспалением приводят к прогрессивному увеличению хронического воспаления низкого уровня. Этот феномен недавно был определен как 'inflammaging' (Franceschi et al., 2000, Franceschi and Campisi, 2014, Franceschi et al., 2007, Frasca and Blomberg, 2016, Monti et al., 2017, Stranahan et al., 2012b). Распространяющееся повсюду воспаление у человека происходит прежде всего в отсутствие явной экзогенной инфекции (Franceschi et al., 2000, Frasca and Blomberg, 2016). Воспаление связано с повышенными уровнями воспалительных биомаркеров, таких как C-реактивный белок и interleukin (IL)-6. Повышение этих факторов порождают дальнейшие вредные изменения в составе тела, в продукции и использовании энергии, метаболическом гомеостазе, ожирении, иммунном старении, атеросклерозе и здоровье нервов (Barzilai et al., 2012, Tabas, 2010). Воспаление, ассоциированное с процессом старения, может иметь множественные причины: i) накопление тканевых повреждений вызывают воспаление, ii) неспособность иммунной системы, приводящая к неспособности эффективно избавляться от патогенов и дисфункции клеток хозяина, iii) стремление стареющих клеток секретировать про-воспалительные цитокины, iv) усиление активации транскрипции связанного с возрастом транскрипционного фактора Nuclear factor-κB (NF-κB) и v) дефекты реакции аутофагии (Salminen et al., 2012).
Молекулярные последствия воспаления сказываются на врожденных и приобретенных иммунных реакциях (Deeks, 2011). Старение иммунной системы, скорее всего, усугубляет фенотип соматического старения из-за неспособности иммунной системы эффективно устранять инфекционные агенты, инфицированные клетки и клетки, подвергшиеся злокачественному перерождению (Lopez-Otin et al., 2013). Мультифункциональный характер GIT2 распространяется и на участие в адаптивном иммунитете, в котором этот белок необходим для позитивного отбора тимоцитов, процесс важный для созревания тимоцитов и детерминации их или в CD4+ , или CD8+ T клеточные клоны (Hogquist et al., 2015, Klein et al., 2014, Phee et al., 2010). Миграция тимоцитов у GIT2KO дефектна in vivo у GIT2KO мышей, которая, как полагают, обусловлена некорректными реакциями на градиенты локальных цитокинов, из-за этого происходит остановка тимоцитов вблизи и это мешает обнаружению тимусных эпителиальных клеток во время позитивной селекции (Phee et al., 2010). Более того, функция регуляторных Т клеток контролируется, по крайней мере, частично с помощью GIT2-αPIX-PAK комплекса, который располагается в комплексах фокальных адгезий (Kong et al., 2014). Интересно, что уровни GIT2 снижаются у α-PIX дефицитных лимфоцитов, подтверждая, что GIT2 нестабилен в отсутствие PIX партнера. Эти α-PIX и GIT2-дефицитные B- и T-лимфоциты обнаруживают снижение пролиферации, стимулируемой антигенами (Missy et al., 2008), этот дефект обнаруживается и при старении. Большое количество исследований показало роль GIT2 в создании затора в системе иммунного старения, такой как функция нейтрофилов, продукция про-воспалительных цитокинов, селекция и регуляция тимоцитов (Mazaki et al., 2006). Активность Т клеток и иммунные реакции также ассоциируют с функциональностью GIT2, т.к. созревание T клеток существенно нарушено из-за преждевременной инволюции тимуса у GIT2KO мышей (Siddiqui et al., 2017).
2.5. GIT2 regulates fat deposition
Adipose tissue (AT) состоит преимущественно из адипоцитов и может действовать как соединительная ткань, депо для сохранения энергии, теплоизолятор и механические подушки (Snyder et al., 1975). Жир, с др. стороны, в основном состоит из липидов в форме триглицеридов (Wang et al., 1992). По мере старения, AT становится нефункциональной из-за нарушений дифференцировки пре-адипоцитов в зрелые адипоциты. Это приводит к генерации нефункциональных адипоцитов, которые неспособны хранить жир, который а результате перераспределяется аберрантно в эктопических местах (Pararasa et al., 2015). Во время старения увеличивается в теле жир, висцеральная AT и отложения эктопического жира. Это изменение в отложениях жира строго связаны с уменьшением здоровья у стариков и также связаны с метаболическими дисфункциями (Pararasa et al., 2015, Zamboni et al., 2014). Увеличение тотального ожирения, которое происходит при нормальном старении может не зависеть от изменений в весе тела, что обусловлено одновременным уменьшением мышечной массы с возрастом, это связанное с возрастом нарушение, наз. sarcopenia (Prentice and Jebb, 2001). Альтерации в распределении и качестве AT коррелируют с более высоким риском возникновения диабета, гипертензии, дислипидемии и сердечно-сосудистых заболеваний в старости (Zamboni et al., 2005).
Экспрессия GIT2,как было установлено, повышается с возрастом в органах, участвующих в энергетическом метаболизме, т.е. поджелудочной железе, печени, скелетных мышцах и AT (Chadwick et al., 2012). Происходит усиление этой ассоциации GIT2 с аномальной активностью AT, делеция GIT2 в геноме вызывает дисфункцию фенотипа скелетных костей, связанную с изменениями в отложении жира (Wang et al., 2012). Этот фенотип ассоциирует с паттерном дифференцировки мезенхимных стволовых клеток в направлении адипоцитов скорее, чем остеобластного клона и при этом в костном мозге накапливается AT (Wang et al., 2012). Дальнейшие исследования GIT2KO мышей также подтвердили, что делеция GIT2 ослабляет степень накопления подкожного и висцерального жира по сравнению с контрольными мышами того же возраста, которым скармливали диету с высоким содержанием жира - тем самым возникает более сильная резистентность к ожирению, вызываемому высоким содержанием жира. Кроме того, GIT2KO мыши обнаруживают повышенный расход энергии, и повышенную экспрессию генных транскриптов, участвующих в окислении жирных кислот и термогенезе (unpublished data).
3. GIT2 and age-related pathophysiology
3.1. GIT2 interactors BRCA1 and ATM are involved in development of neurodegenerative disorders
Нейродегенеративные нарушения и патофизиологическое старение вызываются функциональными взаимодействиями между большим числом разнообразных биологических систем, включая нейрологическую, сенсорную, эндокринную и метаболическую активности (Chadwick et al., 2010a, Chadwick et al., 2012, Chadwick et al., 2011, Chadwick et al., 2010b, Lu et al., 2015, Martin et al., 2008a, Martin et al., 2008b), многие из которых функционально интегрированы в одном критическом органе ЦНС - гипоталамусе (Moheet et al., 2015). Гипоталамус действует как трофический мастер-контролер эндокринной системы и обладает нейрональными проекциями к нескольким автономным высшим центрам головного мозга. Таким способом он осуществляет жизненно важные соединения между старением и связанными с возрастом нарушениями, такими как деменция (Janssens et al., 2014).
Процесс нейродегенерации сопровождается прогрессирующей потерей структуры и функции нейронов, вызывая нарушения скоординированной функции нервов (Fig. 4). Главным нейродегенеративными заболеваниями нашей популяции являются Alzheimer's disease (AD) и Parkinson's disease, характеризующиеся многими признаками старения, такими как повреждения ДНК, оксидативные стрессы, метаболические дисфункции и воспаление (Cannon and Greenamyre, 2011). Головной мозг млекопитающих потребляет 1/5 от общего количества потребления кислорода, приводя к воздействию на нейроны побочных продуктов ROS (Barja, 2004, Hirano et al., 1996, Kaneko et al., 1996, Nakae et al., 2000). Головной мозг, как полагают, также снижает соотношение между анти-оксидантными и про-оксидантными ферментами (Canugovi et al., 2013). Когда анти-оксиданты истощаются в головном мозге из-за физических стрессов или метаболических дисфункций, то нейроны становятся более чувствительными к индуцируемым ROS повреждениям ДНК (Barja, 2004, Hirano et al., 1996, Kaneko et al., 1996, Nakae et al., 2000). ROS сами по себе обладают способностью генерировать более 100 различных оксидативных модификаций оснований ДНК и эти альтерации обладают высоким мутагенным потенциалом (Iyama and Wilson, 2013). Эти оксидативные повреждения нейрональных клеток могут участвовать в возникновении нейродегенеративных нарушений, это подтверждается наблюдениями, показавшими, что система base excision repair (BER) используется для устранения таких оксидативных добавок, что важно для предотвращения нейродегенерации (Bosshard et al., 2012, Lillenes et al., 2013, Sheng et al., 2012). Накопление повреждений ДНК может быть особенно распространенным в ЦНС благодаря низкой способности DDR в этой ткани (Maynard et al., 2015). Уязвимость пост-митотических нейронов к повреждениям ДНК связана с постепенным снижением активности механизмов DDR, еоторое может приводить к накоплению повреждений ДНК с возрастом, внося вклад в старение головного мозга и нейродегенерацию (Madabhushi et al., 2014). Нарушения репарации ДНК оказались связаны с зависимой от возраста нейродегенерацией, такой как AD, болезнь Паркиснсона и амиотрофический боковой склероз (Madabhushi et al., 2014). DDR, как было установлено, важна как во время развития нейронов, так и в зрелых нейронах. Мутации основных факторов DDR или несовместимы с жизнью или проявляются в виде тяжелых нарушений нейрального развития. Примером такого DDR белка является BRCA1, который участвует в развитии AD (Suberbielle et al., 2015). Кроме того, ряд DSBs повышен при таких нарушениях как AD и амиотрофический боковой склероз (Adamec et al., 1999, Martin, 2001, Mullaart et al., 1990), и в некоторых мышиных моделях нейродегенерации (Dobbin et al., 2013, Kim et al., 2008, Suberbielle et al., 2013).
Fig. 4.
The multitude of GIT2 functions in age-related disorders. GIT2 represents a multiple domain, multiply-spliced multidimensional functional scaffold that possesses an ability to interact with G protein-coupled receptors and vesicular trafficking proteins. Taking together this highly versatile profile it is unsurprising that the functional activities of GIT2 are associated with a broad spectrum of functional and pathophysiological processes. From our data and that of other researchers this highly-connected nature of GIT2 suggests that it could be considered one of the factors that interconnects multiple domain-based activities, enabling the systems-wide coordination of both biological functions and also pathological ones, e.g. deleterious aging-related diseases. It is therefore highly likely that GIT2 potentially has the role of keystone protein in ageing and age-related disorders. To illustrate the multidimensional role of GIT2 in such a complex process, we have selected several GIT2-interacting partners and functions associated with ageing-related disease. Our posit of the keystone status of GIT2 is reinforced by its evidential ability to coordinate and regulate profound domains of related pathophysiology, e.g. inflammation (NF-?B, TLR), DNA damage response (BRCA1, ATM, p53) and Type 2 Diabetes Mellitus (InsR, Irs2, Ins). These global pathological domain activities can then promote the development of age-related disorders such as neurodegeneration (e.g. Alzheimer's disease: associated with GIT2 via DDR/BRCA1, InsR interactions), atherosclerosis (associated with GIT2 links to ROS sensitivity and DDR processes), osteoporosis (associated with GIT2 via its role in osteoblast function and fat deposition), central obesity, cancer, and sarcopenia. For each pathology box indicated in the radial diagram (excl. chronic inflammation and cancer) the normal condition (left) is compared to the pathology (right). Adipocyte level (adipocyte); DNA damage response (DDR); inflammation (Inf); insulin (Ins); Insulin receptor (InsR); Insulin receptor substrate 2 (Irs2); metabolic syndrome (MetS); osteoblast level (OB); Reactive oxygen species (i.e.oxidative stress) (ROS). GIT2KO мыши показали возможную роль GIT2 в нейроповеденческих и нейробиологических функциях (Caffrey et al., 2011, Lu et al., 2015). Lu et al. продемонстрировали, что кортикальные нейроны GIT2KO мышей содержат больше повреждений ДНК по сравнению WT мышами того же возраста, подтвердив критическую роль GIT2 в повреждениях ДНК в ЦНС in vivo. Они также идентифицировали in silico потенциал ATM-обеспечиваемого фосфорилирования у GIT2, и подтвердили, что GIT2 ассоциирует с активными ATM в местах DSB (Lu et al., 2015). ATM киназа является критической для инициации сигнальных путей после повреждений ДНК и DSBs, делая возможной их репарацию (Banin et al., 1998). Кроме того, Lu et al. также показали, что GIT2 контролирует временную стабильность BRCA1 (Fig. 4), DDR белка, участвующего в возникновении AD, внутри динамических DSB комплексов (Lu et al., 2015, Suberbielle et al., 2015). Истощение GIT2 с помощью siRNA предупреждает собственно рекрутирование BRCA1 на DSBs. Помимо стабилизации DDR комплексов, GIT2 оказался также критическим для регуляции связанного с DSB PARP1, который помогает в создании и стабилизации компонентов инициальных DDR комплексов (Lu et al., 2015).
В дополнение к недавней связи DDR с прогрессирующей нейродегенерацией, стало ясно, что метаболические дисфункции (особенно, связанные с генерацией энергии митохондриями) сильно способствуют нейродегенеративным болезням (Lu et al., 2015). Metabolic Syndrome (MetS), абдоминальное ожирение, непереносимость глюкозы, гипертензия, гиперинсулинемия и повышение глюкозы в плазме голодающих, все они являются факторами риска AD (Accardi et al., 2012, Razay et al., 2007, Vanhanen et al., 2006). По мере старения альтерации метаболизма глюкозы/энергии в головном мозге обнаруживаются постоянно (Hoyer, 1998). В 2003, Watson et al. установили ассоциацию между AD и гипергликемией, которая позднее подтверждена Razay et al. in 2007, которые установили ассоциацию при AD, гипергликемии и резистентности к инсулину (Razay et al., 2007, Watson and Craft, 2003) (Fig. 4). Martin et al. продемонстрировали, что GIT2KO мыши обладают метаболической дисфункцией, эти мыши обнаруживали повышенные уровни глюкозы в сыворотке при голодании и резистентность к инсулину (Martin et al., 2015). Следовательно, GIT2 может служить защитным фактором против T2DM, который теперь рассматривается один из самых сильных факторов риска AD. Более того, GIT2 ассоциирует с Metabolic Syndrome, при этом GIT2KO мыши обладают пол-специфической защитой от диеты с высоким содержание жира, вызываяющего ожирение, по сравнению с WT мышами в тех же самых условиях.
Вместе с повсеместной связью с метаболической дисфункцией развивается высоко атипичная прирожденная иммунная реакция при старении, при этом в головном мозге она преимущественно обеспечивается активированной микроглией, резидентными тканевыми макрофагами (Dheen et al., 2007). Эта врожденная иммунная реакция запускается с помощью неправильно упакованных и агрегированных белков, типичных для AD, которые соединяются с паттерн распознающими рецепторами на микроглии и астроглие (Heneka et al., 2015, Lunnon et al., 2011) , чтобы повлиять на высвобождение медиаторов воспаления, которые вносят вклад в прогрессирование и тяжесть AD (Heneka et al., 2015). Wei et al. (2014) показали, что GIT2KO мыши обнаруживают существенное увеличение способствующих воспалению цитокинов и что GIT2 является критическим терминатором передачи сигналов Toll-like рецепторов (Wei et al., 2014) (Fig. 4), указывая на критическую роль GIT2 в системе врожденного иммунитета во время старения и для возникновения нейродегенеративных нарушений.
3.2. GIT2's role in DNA damage response and obesity suggest involvement in atherosclerosis development
Атеросклероз крупных сосудов так же известен как связанная с возрастом патофизиология, при которой склеротические и стенозирующие отложения липидов формируются внутри интимного слоя сосудов в местах разветвлений и с завихрениями кровотока и в конечном счете возникновение способствующих воспалению атеросклеротических бляшек (Ross, 1999). Дисфункция эндотелия приводит к хроническому дефициту биодоступности nitric oxide, это, как полагают, первая ступень в возникновении атеросклероза (Libby, 2002, Penn et al., 1986, Ross, 1999). Хроническое воспаление, ('inflammaging'), как теперь хорошо известно способствует атеросклерозу благодаря его склонности повреждать ДНК путем образования ROS (Fig. 4) и реактивных видов азота (Libby, 2002). Атерогенные повреждения могут быть инициированы мутационными событиями как в случае доброкачественных опухолей (Penn et al., 1986, Trosko and Chang, 1980) и растут доказательства, показывающие, что происходит накопление повреждений ДНК в сосудистых гладкомышечных клетках и воспалительных клетках внутри атеросклеротических бляшек, гладкомыечных клетках и макрофагов внутри бляшек, экспрессирующих маркеры повреждений ДНК, включая фосфорилированные формы ATM и γ-H2AX, которые возрастают по мере утяжеления болезни (Gray and Bennett, 2011). Интересно, что окисленный низкой плотности липопротеин также подавляет энзимы, участвующие в эксцизионной репарации оснований (Chen et al., 2000). Прогрессирование атеросклероза также, по-видимому, испытывает сильное влияние со стороны образовавшихся кластеров несбалансированных метаболических процессов в самой сосудистой сети. Недавно, регуляция гомеостаза клеточной энергии выступила в качестве многообещающего подхода в сердечно-сосудистой фармакологии (Wang and Lopaschuk, 2007), поскольку гипергликемия была идентифицирована в качестве зачинщика атеросклероза (Aronson and Rayfield, 2002). Более того, было установлено, что воздействие Mildronate подавляет γ-butyrobetaine hydroxylase, которая катализирует формирование важного кофактора для импорта в митохондрии и окисления длинно-цепочечных жирных кислот, снижает образование атеросклеротических бляшек, поддерживая роль регуляции энергетического метаболизма при лечении атеросклероза (Vilskersts et al., 2009). Поскольку на сегодня нет сообщений о существовании недвухсмысленной связи GIT2 и атеросклероза, его роль в иммунных клетках с 'воспалительной' активностью, в оксидативных стрессах и DDR указывает всё же на роль GIT2 возникновении атеросклероза (Fig. 4) (Chadwick et al., 2010b, Lu et al., 2015). Во многих линиях клеток, в которых может действовать GIT2 как молекулярный сенсор оксидативных стрессов (Chadwick et al., 2010b) , а также как строгий фактор, способствующий выживанию, во время периодов стрессов, при которых накапливаются повреждения ДНК (Lu et al., 2015). Связь GIT2 с DDR комплексами, скорее всего, также контролируется с помощью его физических взаимодействий с ATM и γ-H2AX (Fig. 4) (Lu et al., 2015). Эти два белка, как было установлено, присутствуют в атеросклеротических бляшках и влияют на тяжесть болезни (Penn et al., 1986), тем самым выявляется возможная связь между GIT2 и возникновением атеросклеротических бляшек. Более того, как упоминалось ранее, геномная делеция GIT2 у мышей может быть защитной от ожирения (unpublished data), которое является одним из самых серьезных факторов риска возникновения сердечно-сосудистых нарушений, таких как атеросклероз (Roever et al., 2016). Поскольку GIT2 пока не был прямо ассоциирован с атеросклерозом, GIT1, как было установлено, активирует активирует в эндотелиальных клетках nitric oxide synthetase, энзим, который продуцирует NO в эндотелиальных клетках. GIT1 был идентифицирован в качестве молекулярного каркаса, облегчающего продукцию NO, благодаря ассоциации с nitric oxide synthetase эндотелиальных клеток, которая регулируется активностью Src и Akt киназ (Liu et al., 2014).
3.3. GIT2KO mice show decreased bone mineral density and bone volume
Остеопороз довольно широко распространенное метаболическое заболевание костей, характеризующееся уменьшением костной массы и минеральной плотности кости (Rachner et al., 2011) и очень часто ассоциирует со значительным возрастом (Cheung et al., 2010). В 2005, Yalin et al. выявили негативную корреляцию между superoxide dismutase (SOD) и уровнем минеральной плотностью поясничных костей у мужчин с остеопорозом (Yalin et al., 2005). Эти данные подтвердили, что оксидативные стрессы играют важную роль в патофизиологии первичного остепороза у мужчин (Yalin et al., 2005). У женщин, однако, одной из наиболее интригующих гипотез стало предположение о способности половых гормонов, т.e. эстрогена, защищать кости от оксидативных стрессов путем действия антиоксидантов (Cervellati et al., 2013, Di Gregorio et al., 2001, Lean et al., 2003), и это впоследствии было подтверждено in vitro и in vivo (Lean et al., 2003). Потеря эстрогена после менапаузы изменяет генерацию ROS и антиоксидантную защиту клеток (Fig. 4) (Lean et al., 2003). Это приводит к накоплению видов оксидантов, что, в сою очередь, позволяет стимулировать формирование и резорбцию остеокластов, в результате увеличивается тяжесть болезни (Cervellati et al., 2013, Hodge et al., 2011, Lean et al., 2004). Причиной повреждений ДНК при остеопорозе и др. дефектах скелета, как полагают, являются мутации генов, кодирующих DDR белки, которые могут приводить к нарушениям развития костей и/или дерегуляции костей (Chen et al., 2013). Chen et al. показали, что knocking out DDR белка Excision Repair Core Complementary group-1 (ERCC1) у мышей приводит к сохранению повреждений ДНК, к преждевременному клеточному старению и снижению пролиферации остеобластов. Такие мыши демонстрируют неспособность к репарации повреждений ДНК и страдают от ускоренного старения и спонтанно развивающегося остеопороза (Chen et al., 2013). Более того, ATM-дефицитные мыши (ATMKO) воспроизводят остеопороз. ATMKO мыши обладают снижением костной массы, особенно в губчатых костях и это сопровождается снижением скорости образования кости и дефектами дифференцировки остеобластов. Однако, количества предшественников костей и остеобластов остаются неизменными у ATMKO мышей. ATMKO мыши также демонстрируют заметное повышение продукции остеокластов и резорбции костей, хотя ATM , по-видимому, не оказывает клеточно-автономных эффектов на дифференцировку остеокластов и резорбцию (Rasheed et al., 2006).
Остеопороз длительное время связывали с hyperparathyroidism, при котором избыток паратироидного гормона (PTH) удалял слишком много кальция из костей, делая их тонкими и ломкими. Hyperparathyroidism нарушает также нормальный метаболизм глюкозы (Chiu et al., 2000, Procopio et al., 2002) и ассоциирует с гипергликемией и гиперлипидемией (Ring et al., 2012, Silverberg et al., 2009, Walker et al., 2012, Walker and Silverberg, 2008). Гипергликемия, которая может быть вызвана экспериментально, индукцией делеции GIT2, может индуцировать остеопороз и переломы костей за счет негативной регуляции нормального функционирования остеобластов и одновременно за счет позитивной регуляции функции остеокластов (Lampropoulos et al., 2012). Недавние доказательства, полученные на людях, страдающих от этой болезни, такие как остеопороз после менопаузы, указывают на взаимосвязь между иммунной системой и костями. Было подтверждено, что потеря кости, индуцируемая снижением эстрогена в менопаузе, является сложным эффектом множества путей и цитокинов, которые кооперируются, чтобы регулировать продукцию остеобластов и остеокластов. Среди этих цитокинов рецепторный активатор лиганда NF-κB и Tumor necrosis factor-alpha (TNFα), по-видимому, играют особенно важные роли в индукции образования и активности остеокластов. Кроме того, IL-17 может способствовать потере кости, вызывая предпочтение к образованию остеокластов и подавляя дифференцировку остеобластов (Faienza et al., 2013). Остеокласты сами по себе являются членами семейства моноцит-макрофаги и происходят из слияния происходящих из костного мозга одноядерных фагоцитов, т.e. предшественников остеокластов, которые дифференцируются под влиянием macrophage colony stimulating factor и лиганда RANK (Massey and Flanagan, 1999). RANK лиганд сам по себе продуцируется остеобластами и соединяется со своим рецептором RANK (receptor activator of nuclear factor kappa B) на остеокластах (Pacifici, 1996). Эти факторы усиливают резорбьцию кости путем увеличения количества пре-остеокластов в костном мозге, индуцируя тем самым остеопороз (Satpathy et al., 2015). Ожирение увеличивает экспрессию нескольких химических мессенджеров, которые осуществляют свои эффекты путем модуляции сигнальных путей в костях и мышцах. Эти мессенджеры (напр. TNFα, IL-6, лептины, advanced glycation end products(AGE)) модулируются в результате ожирения и, как было установлено, действуют как негативные регуляторы остеобластов и остеоцитов, в то же время действуя как позитивные регуляторы остеокластов, тем самым в конечном итоге увеличивая риск остеопороза (Roy et al., 2016).
Динамическая реорганизация цитоскелета играет важную роль в дифференцировке остеобластов и поддержании полярности остеокластов во время резорбции кости, а GIT2 , как полагают, играет роль в возникновении остеопороза посредством регуляции цитоскелета (Wang et al., 2012). Взрослые GIT2KO мыши обнаруживают снижение минеральной плотности костей и объема костей как в губчатом, так и кортикальном компартментах, это ассоциирует с дефектами созревания остеобластов. Интересно, что эти мыши обнаруживают увеличение экспрессии мРНК RANK, указывая на компенсаторную реакцию на это снижение активности остеобластов. В отсутствие GIT2, дифференцировка мезенхимных стволовых клеток способствует возникновению клонов адипоцитов в противовес клонам остеобластов, приводя к редукции количества и функции остеобластов (Fig. 4) (Wang et al., 2012). Как GIT2 участвует в развитии подобных остеопорозу симптомов, остается неясным. Однако, можно предположить, это возможно посредством ассоциации с ATM (Fig. 4) (Lu et al., 2015). ATMKO мыши были предложены в качестве модели остеопороза, обнаруживают снижение костной массы, скорости формирования кости и дефектную дифференцировку остеобластов (Rasheed et al., 2006). Взаимодействие GIT2-ATM может объяснить ассоциацию между GIT2 и возникновением остепороза, но необходимы дальнецшие исследования.
3.4. GIT2 expression increases in aged skeletal muscle reminiscent of sarcopenia
Саркопения - это потеря мышечной массы и функции, которая наиболее часто связана с возрастом. Патогенез саркопении многофакторный и зависит от стиля жизни, системных факторов (напр. хронического воспаления и гормональных отклонений), локальных пертурбаций в окружении (напр. сосудистая дисфункция), и специфичные внутримышечные процессы (Marzetti et al., 2013). В старой мышечной ткани, увеличивается присутствие оксидативных повреждающих adducts (Fulle et al., 2004, Ji, 2001, Mecocci et al., 1999). Избыточная продукция ROS вызывает оксидативные повреждения, активацию внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в саркопении (Bonetto et al., 2009) и нарушает баланс, что делает возможной постоянную деградацию и повторный синтез белков скелетных мышц (Koopman and van Loon, 2009). Исследование Super Oxide Dismutase 1 (SOD1) KO мышей выявило саркопению, подтвердив роль дисфункции митохондрий и оксидативных стрессов в возникновении и прогрессировании саркопении (Jang et al., 2010). Оксидативные стрессы, как было установлено, также индуцируют повышение уровней хронического низкой степени воспаления, которое является вредным для скелетных мышц у человека (Howard et al., 2007) и животных моделей (Siu et al., 2008). Более того, ROS, по-видимому, функционируют как вторичные мессенджеры для TNFα в скелетных мышцах, непосредственно или косвенно активируя redox-чувствительные транскрипционный фактор, Nuclear factor NF-kappa-B (Reid and Li, 2001). Этот фактор может индуцировать воспаление и вызывать связанные с возрастом активации IL-6 и TNFα (Meng and Yu, 2010) и это является критическим для гомеостаза костей и мышц (Huang et al., 2014). Комбинация увеличения оксидативных стрессов и воспаления при саркопении, по-видимому, являются причиной индукции NF-κB (Kim et al., 2007). Путь NF-κB наиболее важен для утраты скелетных мышц при нормальном и патологическом старении (Li et al., 2008). Этот путь важен для пролиферации миобластов и поддержания их в недифференцированном состоянии (Guttridge et al., 1999, Mitin et al., 2001). Активация NF-κB, p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) и p53 путей участвуют в атрофии скелетных мышц (Guttridge, 2004).
Более того, было подтверждено, что мутации и делеции митохондриальных ДНК также могут вносить вклад в возникновение саркопении (Kujoth et al., 2005). Мутации митохондриальной ДНК, как было установлено, вызывают саркопению путем воздействия на сборку и функцию комплексов цепочек переноса электронов. Hiona et al. продемонстрировали, что отсутствие этих комплексов вызывает снижение оксидативного фосфорилирования, в отсутствие оксидативных стрессов, вызывая в конечном итоге апоптоз мышц и саркопению (Hiona et al., 2010). Наконец, саркопения и ожирение обладают общими патофизиологическими механизмами и коллективно названы саркопеническое ожирение (Choi, 2016). Сложное взаимодействие общих патофизиологических механизмов, таких как увеличение цитокинов, способствующих воспалению, оксидативные стрессы, резистентность к инсулину и понижение физической активности лежат в основе тесного взаимоотношения между саркопенией и ожирением. Это вызывает порочный круг между накоплением эктопического жира и потерей массы скелетных мышц, это реципрокное влияние др. на др. (Kim and Choi, 2015). Саркопения приводит к снижению физической активности, это же приводит увеличению риска ожирения (Zamboni et al., 2008), тогда как ожирение индуцирует воспаление, которое вносит вклад в развитие саркопении (Gregor and Hotamisligil, 2011, Lutz and Quinn, 2012). В этом контексте поэтому вполне возможно, что благодаря способности соединять чувствительность к ROS и процессы DDR (Fig. 4), GIT2, скорее всего, играет роль в связанной с возрастом дегенерацией мышц. Подтверждением этому является потенциальное компенсаторное связанное с возрастом увеличение GIT2, наблюдаемое в скелетных мышцах мышей дикого типа (Chadwick et al., 2012, Martin et al., 2015). Как упоминалось ранее, увеличение оксидативных повреждений в мышцах может наблюдаться по мере развития саркопении и с возрастом, это может быть связано с усилением экспрессии GIT2 при оксидативных стрессах и ROS (Chadwick et al., 2010b). Более того, как упоминалось выше, саркопения и воспаление ассоциированы (Lutz and Quinn, 2012), указывая тем самым на возможную связь с функцией GIT2 (Siddiqui et al., 2017). GIT2 , как было установлено, ранее был идентифицирован как негативный регулятор передачи сигналов NF-κB серез посредство контроля Toll-like receptor (TLR) (Wei et al., 2014) и посредством взаимодействия с несколькими др. белками. регулирующими NF-κB (Fig. 4) (Wang et al., 2011). Наконец, GIT2, как было установлено, участвует в возникновении центрального ожирения (unpublished data), и воспаление и ожирение, как было установлено, работают совместно, внося вклад в возникновение саркопении (Gregor and Hotamisligil, 2011, Lutz and Quinn, 2012).
3.5. GIT2KO mice show a metabolic decline reminiscent of type 2 diabetes mellitus
T2DM возникает в результате неполноценности панкреатических островковых β-клеток, неспособных секретировать инсулин в ответ на поступление глюкозы, в результате в плазме повышается уровень глюкозы, способствующий ещё большей резистентности к инсулину и ожирению (Pandey et al., 2015). Оксидативные стрессы уже давно идентифицированы как главный игрок в патогенезе и осложнениях диабета (Matough et al., 2012). В этом контексте избыточная продукция митохондриями ROS,как было установлено, является одним из наиболее важных вышестоящих событий в этом патологическом процессе (Giacco and Brownlee, 2010). T2DM пациенты обнаруживают дисбаланс между окислительной и антиоксидантной системами, усиливается приток глюкозы, увеличивает продукцию оксидантов и нарушает защиту анти-оксидантами (Jakus, 2000). Было предположено, что высокие уровни в сыворотке глюкозы широко распространены у пациентов с диабетом, они повышают внутриклеточные уровни глюкозы и тем самым индуцируют повышение скорости гликолиза. Это затем приводит к повышению доставки субстрата в митохондрии и к увеличению накопления ROS (Fig. 4) (Ola et al., 2006). Исследование Aouacheri et al. подтвердило, что гипергликемия при T2DM может приводить к подавлению анти-оксидантной активности, это может приводить к большему количеству оксидативных стрессов, снижению чувствительности инсулина и нарушению секреторной реакции, усиливающей нарушения (Aouacheri et al., 2015, Kocic et al., 2007). Оксидативные стрессы могут также в таком случае приводить к повреждениям ДНК и это является одним из механизмов, участвующего в патогенезе осложнений диабета (Pacal et al., 2011, Prasad et al., 2015, Shin et al., 2001, Slatter et al., 2000). Prasad et al. показали, что частота повреждений ДНК достоверно выше у пациентов с T2DM по сравнению с контролем (Prasad et al., 2015); механизм однако, пока неизвестен.
T2DM пациенты, кроме того, обнаруживают способствующие воспалению фенотипы, характеризующиеся присутствием цитокинов, апоптических клеток, инфильтрацией иммунных клеток, отложениями амилоида и фиброзом. Воспаление является проявлением болезни, которая может обострять T2DM за счет деструкции тканей, вызываемой медиаторами воспаления и ROS (Donath et al., 2008). Активированный врожденный иммунитет и воспаление являются важными факторами в патогенезе диабета. IL-1β, способствующий воспалению цитокин, обнаруживает повышенную экспрессию мРНК у T2DM пациентов (Donath et al., 2008, Navarro and Mora, 2006). Более того, C-реактивный белок, TNFα, и IL-6 оказываются позитивно скоррелированными со значениями резистентности к инсулину (Festa et al., 2000, Muller et al., 2002, Temelkova-Kurktschiev et al., 2002). TNFα, IL-1 и IL-6 ассоциированы с массой жирового тела и могут быть синтезированы и высвобождены жировыми клетками (Navarro and Mora, 2006). Значительная ассоциация между повышением массы телесного жира, ожирением и риском T2DM уже установлена (Abdullah et al., 2010, Carey et al., 1997, Hu et al., 2001, Wang et al., 2015). Адипоциты секретируют adipocyte гормоны и adipokines, которые могут повышать риск диабета несколькими способами, напр., за счет резистентности к инсулину (Bray, 2004).
GIT2KO мыши демонстрируют достоверное снижение RER, указывая на сдвиг прочь от утилизации глюкозы, чтобы генерировать необходимую энергию, а в направлении использования жира и потенциально белков. GIT2 экспрессируется как в панкреатических α- и β-островковых клетках (Martin et al., 2015). Геномная делеция GIT2 приводит к нарушению относительного распределения этого типа клеток внутри островков способом, сходным с таковым в др. экспериментальных моделях диабета, когда мыши обнаруживают достоверное уменьшение области островков и % β-клеток, при этом достоверно увеличивается % α-клеток. Имеются также доказательства инволюции α-клеток в массу β-клеток - грань характерная для диабетической патологии у мышей (Chen et al., 2012, Martin et al., 2015). Более того, GIT2 был обнаружен преимущественно (в смысле старения) активированным у диабетических db/db мышей по сравнению с WT контрольными мышами, как в гипоталамусе, так и в поджелудочной железе. Наконец, физическая ассоциация была обнаружена между GIT2 и множественными белками, жизненно важными для глюкозной метаболической/insulin-регуляторной системы в тканях поджелудочной железы, т.e. инсулиновых рецепторов и insulin receptor substrate 2 (Fig. 4). Взаимодействие между GIT2 и этими белками были специфически нарушены при db/db патологическом состоянии (Martin et al., 2015). Следовательно, очень вероятно, что наблюдаемое зависимое от возраста увеличение экспрессии GIT2 может представлять механизм реакции, чтобы контролировать оксидативные клеточные повреждения, репарацию ДНК и функцию β-клеток островков, а также физическую целостность рецепторов системы Ins/IGF1 (Fig. 4).
3.6. GIT2 expression is associated with a progressive increase in body weight, possibly leading to central obesity
Центральное ожирение, т.e. увеличение отложения жира вокруг главных висцеральных органов, является кардинальным и обязательным компонентом Metabolic синдрома и патологического старения (Mathieu et al., 2010). AT обладает относительно высокими уровнями ферментов антиоксидантной защиты с тем, чтобы, справляться с возникающей высокой продукцией ROS с накоплением пептидов и добавлением свободных жирных кислот (Matsuda and Shimomura, 2013). Повышенное накопление жиров в целом ассоциирует с повышенным риском возникновения метаболических нарушений. По сравнению с подкожным жиром, накоплеие висцерального жира , как известно, высвобождает множество факторов, способствующих воспалению, приводящих к резистентности к инсулину и оксидативным стрессам (Funahashi and Matsuzawa, 2007, Nikolopoulou and Kadoglou, 2012). Demirbag et al. установили, что имеется увеличение повреждений ДНК у субъектов с ожирением по сравнению с субъектами нормально веса (Demirbag et al., 2006), и связь этих изменений с метаболическими аномалиями, возникающими при ожирении (De Lorenzo et al., 2007, Demirbag et al., 2006, Di Renzo et al., 2010, Khan et al., 2006, Vassalle et al., 2009).
Matsuzawa et al. продемонстрировали, что существенная пропорция адипоцитокинов участвует в стимуляции воспаления и реакции на него, противодействуя или способствуя воспалению (Matsuzawa et al., 2004). TNFα известен как важный адипоцитокин, а уровни TNFα в плазме и жировой ткани увеличиваются у людей с ожирением (Ho et al., 2005). Кроме того, IL-1β также секретируется из AT и связан с воспалением (Ouchi et al., 2003).
Исследования показали, что GIT2 действует как keystone белок в связанны с возрастом нарушениях метаболизма, при которых наблюдается связанное с возрастом увеличение экспрессии GIT2 в органах, ассоциированных с энергетическим метаболизмом, что связано с прогрессирующим увеличением веса тела и уровней лептинов (Fig. 4), одновременно со снижением циркулирующего в крови adiponectin (Chadwick et al., 2012, Martin et al., 2015). Было также показано, что GIT2KO мыши формируют ассоциированную с полом защиту от ожирения, вызываемого диетой с высоким содержанием жира. Мыши GIT2KO обнаруживают пониженное накопление жира, повышенную скорость метаболизма, повышенный расход энергии, низкий уовень глюкозы при голодании и низкие уровни инсулина и здоровые профили липидов плазмы (unpublished data). В подтверждение роли GIT2 в контроле механизмов, связанных с ожирением, GIT2 был идентифицирован как GWAS аллель риска, выявляемый при скрининге Metabolic syndrome (Fig. 4) (Zabaneh and Balding, 2010).
3.7. GIT2 disruption is associated with premature thymic dysfunction
Старение иммунной системы и 'inflammaging' вызывают выраженную зависимую от возраста дисрегуляцию иммунной системы (Deleidi et al., 2015). Старение иммунной системы означает вызывающую вред потерю эффективности иммунных архитектуры и путей в ходе старения (Pera et al., 2015), это характеризуется различными аномалиями, таким как обратное соотношение CD4/CD8, потеря эффективности миграции B и T клеток во вторичные иммунные ткани (Montecino-Rodriguez et al., 2013) и снижение частоты хорошо функционирующих клеток натуральных киллеров (Albright and Albright, 1985). Старение иммунной системы обычно сопровождается 'inflammaging', при котором обнаруживается тяжелое накопление медиаторов воспаления в некоторых тканях (Coppe et al., 2010).
Оксидативные стрессы распознаются как главный игрок в предопределении и поддержании низкого уровня воспаления, наблюдаемого при старении и при связанных с возрастом нарушениях ('inflammaging') (De la Fuente and Miquel, 2009). Недавно установлена тесная причинно-следственная связь между оксидативным стрессом и воспалением, когда оксидативный стресс, как было установлено, влияет на врожденный и приобретенный иммунитет (Cannizzo et al., 2011). Оксидативный взрыв, ассоциированный с врожденной иммунной реакцией, активирует формирование ROS и общую оксидативную стрессовую реакцию, снижая антиоксидантную способность клеток. Свободные радикалы, которые избыточно продуцируются, будут реагировать с мембранными липидами и белками, нарушая из функцию и создавая циркулярную петлю TLRs и Nalp3 активации inflammosome (Gill et al., 2010). Повышенная воспалительная реакция обнаруживается с возрастом, сопровождается также повреждениями ДНК и DDR. DDRs, как было установлено, является важным в продукции медиаторов воспаления, сопровождаемым клеточным старением (Rodier et al., 2009).
GIT2 участвует во многих разнообразных иммунных функциях, таких как выбор позиции для тимоцитов, клеточная подвижность и избирательное восприятие нейтрофилов посредством регуляции малых GTP-связывающих белков ARF и Rac1 (Wei et al., 2014). В относительно молодом возрасте (12 мес.), GIT2KO мыши имеют преждевременно расстроенную структуру тимуса и дисфункцию T клеток (Fig. 4), по сравнению с мышами WT того же возраста (Siddiqui et al., 2017). Характерная дисфункция тимуса считается одной из наиболее консервативной у многих видов особенностью старения (Brelinska, 2003, Brelinska et al., 2008, Fabris et al., 1982). GIT2KO мыши демонстрируют временно благоприятное снижение уровней предшественников T клеток (в 3 мес. возрасте GITKO сходны с 12-мес. WT мышами), а в продвинутом возрасте снижение double positive/CD4+/CD8+ клеток (Fig. 4), и в целом дефицит в структуре тимуса и в ключевых функциональных регуляторах (Siddiqui et al., 2017). Такие мыши также более чувствительны к колитам, вызываемым dextran sodium sulfate, инфекцией Escherichia coli или endotoxin-shock challenge, и у них драматически повышаются способствующие воспалению цитокины, наблюдаемые у GIT2KO мышей, и их макрофаги. Недавно GIT2 был идентифицирован как негативный регулятор TLR-индуцированной передачи сигналов NF-κB (Fig. 4), завершающий передачу сигналов TLR-индуцированного NF-κB и MAPK путем рекрутирования фермента деубиквитилирования cylindromatosis, чтобы подавить убиквитилирование TNF receptor associated factor 6 (TRAF6) (Wei et al., 2014). Убиквитилирование TRAF6 является критическим для активации NF-κB. Чувствительность GIT2KO мышей к dextran sodium sulfate, вызывающему колит, как было установлено, зависит от передачи сигналов TLR. Т.о., GIT2 был идентифицирован как важный терминатор передачи сигналов TLR, а потеря GIT2 может приводить к неконтролируемому воспалению и тяжелым повреждениям органов (Wei et al., 2014).
3.8. GIT2 interacts with RUSC2 in lung cancer cells
Первой ступенью в канцерогенезе является характерная модификация генетического материала, вызываемая ионизирующей радиацией, мутагенными соединениями или оксидативными повреждениями. Дисбаланс redox, возникающий в различных раковых клетках, вызывается оксидативными стрессами и приводит к гипотезе, что оксидативные стрессы могут быть связаны с онкогенной стимуляцией. Повышенные уровни оксидативных повреждений ДНК были отмечены в разных опухолях. Во время канцерогенеза уровень ROS в раковых клетках увеличивается, тогда как антиоксиданты истощены (Gao et al., 2003, Hwang and Bowen, 2007). Продукция ROS может далее сопровождать прогрессирование опухоли путем стимуляции hypoxia-inducible factor-1α (HIF1-α) и сигнальных белков, таких как vascular endothelial growth factor (EGF), который поддерживает ангиогенез, делая возможным рост опухоли. ROS изменяют экспрессию p53 супрессорного гена - ключевого игрока в апоптозе (Barrera, 2012, Matsuzawa and Ichijo, 2008, Nguyen et al., 2009, Wiemer, 2011).
ДНК повреждения обусловливаются или средовыми факторами или нормальными метаболическими процессами внутри клеток, они могут нарушать способность клеток выполнять свои обычные функции (Bartkova et al., 2005, Hanahan and Weinberg, 2000, Lengauer et al., 1998). DDR, как было установлено, является критическим для защиты от рака, при этом растет количество исследований, сообщающих, что рак возникает при участии мутаций зародышевой линии в генах DDR (Hoeijmakers, 2001, Wyman and Kanaar, 2006). Относительно активации DDR белков, повышенное аутофосфорилирование ATM, как известно, обнаруживается в опухолях на ранней стадии, указывая тем самым, что DDR может выступать в качестве барьера прогрессированию опухоли (Bartkova et al., 2005, Gorgoulis et al., 2005). Более того, избыточная экспрессия белков, реагирующих на повреждения ДНК, BRCA1, PARP1, и Excision Repair Core Complementary group-1 также обнаруживаются в разных раковых опухолях (Fig. 4) (Klauke et al., 2012, Squires et al., 2013, Taron et al., 2004). BRCA1 играет важную роль в репарции DSBs, мутации в BRCA1 приводят к более высокой чувствительности к канцерогенам (Taron et al., 2004), тогда как избыточная экспрессия снижает повреждения ДНК и усиливает механизмы репарации ДНК (Feng et al., 2015). Excision Repair Core Complementary group-1 является ключевым компонентом путей эксцизионнной репарации нуклеотидов , удаления DNA adducts, которые могут препятствовать репликации клеток (Squires et al., 2013). PARP1 является ключевым сенсором для репарации разрывов одиночной нити ДНК, подавление чего приводит к накоплению разрывов одиночных нитей и к последующему возникновению DSBs после клеточного деления (Klauke et al., 2012). Один из главных посредников GIT2, p53, является наиболее часто мутируемым геном в спорадических раках у людей (Fig. 2) (Hosoya and Miyagawa, 2014, Lu et al., 2015).
Воспаление может иметь несколько лежащих в основе источников, которые, в свою очередь, могут вызывать рак; 1) инфекция, напр., Helicobacter pylori вызывает карциному желудка у людей (De Falco et al., 2015), 2) аутоиммунитет, напр., при воспалительной болезни толстого кишечника вызывает рак толстой кишки (Francescone et al., 2015) ил 3) внешняя среда, подобная задымлению (Cohen and Pope, 1995). Микроокружение при хроническом воспалительном заболевании или опухоли имеет множество сходств, подтверждающих роль воспаления в прогрессировании опухолей (Raposo et al., 2015). Как только опухоль укореняется, то хроническое воспаление усиливается микроокружением опухоли (Hanahan and Weinberg, 2011). Это также связано с оксидативными стрессами и повреждениями ДНК, первые возникают в результате воспаления клеток, усиливаемого мутациями ratein клеток и усилением геномной нестабильности, путем индукции повреждений ДНК (Waris and Ahsan, 2006).
GIT1 млекопитающих был идентифицирован как партнер по связыванию для G protein-coupled receptor kinases (GRKs), и поэтому был назван как GRK-interacting protein 1 (GIT1) (Premont et al., 1998). GIT1 и GIT2 представляют семейство белков GIT, которое обладает общими ферментативными функциями как GTPase-activating proteins (GAPs) для ADP-ribosylation factor (Arf) малых GTP-связывающих белков (Premont et al., 1998, Vitale et al., 2000). Функция GIT белков ограничивает активность Arf белков, членов большого семейства ArfGAPs (Kahn et al., 2008). Arf белки не обладают прирожденной GTPase активностью и поэтому нуждаются в GAPs, чтобы превращать GTP, связанные с активным Arf, в GDP, вызывая деактивацию (Randazzo et al., 1994). Оба GIT белка были первоначально идентифицированы как регуляторы интернализации GPCR посредством влияния, которое они осуществляют на Arf GTP-связанные белки (Claing et al., 2000, Premont et al., 1998, Vitale et al., 2000). Очищенные GIT белки сцеплены функционально с белком плазматической мембраны Arf6 (Claing et al., 2000, Di Cesare et al., 2000, Jones et al., 2009, Meyer et al., 2006, Miura et al., 2009), но инактивируют все подтипы Arf белков (Vitale et al., 2000).
GIT белки и их первичные партнеры по взаимодействию, PIX (PAK (p21-activated kinase)-interacting exchange factor) белки, могут действовать совместно, как сигнальные каркасные белки с их многочисленными доменами связи со многими белковыми партнерами (Zhou et al., 2016). Наиболее хорошо изученными партнёрами GIT белков являются p21-activated kinase-interacting exchange factors α-PIX и β-PIX (Bagrodia et al., 1998, Premont et al., 2000, Premont et al., 2004, Zhao et al., 2000). GIT белки действуют как часть этого каркасного комплекса, чтобы связывать сигнальные молекулы с определенными местами действия в клетке и внутри множества самостоятельных сигнальных сетей. Свыше 100 GIT-ассоциированных белков и десятки прямых взаимодействий, многие из которых были впервые идентифицированы в головном мозге, представлены в Table S1, включая liprin-α, piccolo и huntingtin (Hoefen and Berk, 2006, Zhou et al., 2016). GIT белки участвуют в регуляции когнитивной способности, при этом потеря GIT1 приводит к тяжелым нарушениям обучения и памяти у трех разных нокаутных моделей мышей (Hong and Mah, 2015, Menon et al., 2010, Schmalzigaug et al., 2009a, Won et al., 2011), и к микроцефалии, обусловленной уменьшением размеров нейронов (Hong and Mah, 2015), тогда как GIT2-KO мыши обнаруживают тревожное поведение и ускоренное старение (Lu et al., 2015, Schmalzigaug et al., 2009b).
Белки GIT участвуют во множественных клеточных процессах, включая миграцию клеток (Zhao et al., 2000), образование дендритных шипов (Zhang et al., 2003, Zhang et al., 2005), активацию Т клеток (Phee et al., 2005), агрегацию huntingtin (Goehler et al., 2004) и динамику центросом (Zhao et al., 2005). Ткани головного мозга от пациентов с болезнью Гентингтона, как было установлено, обнаруживают накопление C-терминальных протеолитических фрагментов GIT1 (Goehler et al., 2004). GIT1 обнаруживается в пре- и пост-синаптических окончаниях нейронов гиппокампа (Zhang et al., 2003), а подавление или неправильная локализация GIT1 приводит к разрушению дендритных шипов и формированию синапсов (Zhang et al., 2003, Zhang et al., 2005). Кроме того, GIT1 облегчает целенаправленное воздействие AMPA рецептора (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) в первичных нейронах гиппокампа (Ko et al., 2003) и обеспечивает передачу сигналов ephrin B во время формирования шипов (Segura et al., 2007). Напротив, менее известно о функционировании в нейронах GIT2, несмотря на значительное перекрывание экспрессии GIT1 и GIT2 во всем головном мозге (Schmalzigaug et al., 2007b).
Млекопитающие экспрессируют GIT1 и GIT2, тогда как рыбок данио экспрессируют три GIT белка, поскольку они имеют два GIT2 гена (git2a and git2b) (Yu et al., 2011). В то время как GIT1 имеет только два сплайс-варианта у человека и мыши, GIT2 подвергается значительному альтернативному сплайсингу (Premont et al., 2000). GIT1 и GIT2 обладают общим законсервированным архитектурным доменом, включая N-terminal zinc finger ArfGAP домен, три Ankyrin повтора, Spa2-homology domain/Src homology 2 domain-containing transforming protein D (SHD), coiled-coil (CC) домен, слабо законсервированный линкерный регион и focal adhesion targeting (FAT) домен (Fig. 1A&B) (Zhou et al., 2016). α-PIX и β-PIX партнеры по взаимодействию соединяются с SHD доменом. Coiled-coil домен делает возможной димеризацию GIT белков путем образования параллельных coiled-coil (Premont et al., 2004, Schlenker and Rittinger, 2009). Домен FAT действует как сайт связывания для адапторного белка paxillin фокальных адгезий (Schmalzigaug et al., 2007a, Zhang et al., 2008). GIT2-short является укороченным вариантом GIT2, в котором отсутствует FAT домен (Fig. 1C) и экспрессируется на высоком уровне в иммунных клетках. Важность сплайсинга GIT2 остается неясной, хотя GIT2-short обнаруживает неспособность связывать paxillin тем же самым способом, что и GIT2 (Premont et al., 2000) , оба GIT1 и GIT2 способны регулировать Arf6-зависимое секвестрирование GPCR. Прямое сравнение GIT1 и GIT2 подтвердило, что GIT2 соединяется с paxillin со значительно меньшим сродством, чем GIT1 (Premont et al., 2000). Др. различие заключается в том, что фосфорилирование тирозина GIT1 не зависит от клеточной адгезии, тогда как GIT2 временно фосфорилируется во время прикрепления (Shikata et al., 2003). Высокая гомология наблюдается между GIT1 и GIT2, как в отношении структуры, так и функции, а также наличие сильной гомо- и гетеродимеризации этих белков подтверждает присутствие некоторой избыточности in vivo, указывая, что они выполняют разные функции. Чтобы проанализировать индивидуальные GIT белки в клеточном контексте, Schmalzigaug et al. исследовали паттерны ткане- и клеточной специфичности (Schmalzigaug et al., 2007b). В то время как их исследование на мышах подтвердило широкое распределение двух GIT генов, присутствующих у человека и крыс, оно также выявило лежащие в основе паттерны экспрессии. GIT2 экспрессируется почти повсеместно, тогда как экспрессия GIT1 более ограничена. GIT1 и GIT2 совместно экспрессируются в большей части головного мозга, за исключением мозжечка, где обнаружен только GIT2 в гранулярных клетках. Поскольку экспрессия GIT1 ограничена в основном сосудистой системой печени и легких, а GIT2 экспрессируется в большинстве типов клеток (Schmalzigaug et al., 2007b). Более того, гены GIT1 и GIT2 регулируются в клетках зависимым от созревания способом в семенниках, где экспрессия GIT2 включается в клетках сперматогоний на ранних стадиях, но выключается, когда эти клетки созревают; экспрессия GIT1 обнаруживает противоположный паттерн. Это подтверждает онтогенетический сдвиг экспрессии между двумя изоформами. Несмотря на значительную экспрессию GIT1 и GIT2 в семенниках, дефицит этих генов не вызывает бесплодия у самцов, указывая тем самым, что ни один из GIT генов не является абсолютно необходимым для нормального развития м функционирования спермиев (Schmalzigaug et al., 2007b). Итак, функции, осуществляемые в головном мозге, это участие GIT1 главным образом в развитии головного мозга и значительное участие GIT2 в нейродегенерации, обусловленной старением (Goehler et al., 2004, Hong Mah, 2015, Lu et al., 2015). and
Fig. 1.
Domain-based structure of GIT family proteins. GIT1 (A) and GIT2 (B) share a common amino-terminal (N) ArfGAP (ADP ribosylation factor (Arf) GTPase-activating protein) domain, three ankyrin repeats (3x Ank), and the Spa homology domain (SHD) - indicated with two Spa2-like repeats - a coiled-coil (CC) dimerization domain and a C-terminal focal adhesion-targeting (FAT) domain. The ArfGAP domains facilitate the GTP hydrolysis on Arf1 and Arf6; Ankyrin repeats promote the integration and stabilization of multiple transmembrane proteins; the SHD regions mediates PIX, FAK, MEK, Piccolo binding; the CC domain is likely associated with regulating transcriptional functions; the FAT domain mediates localized targeting to plasma membrane-bound integrin complexes. In contrast to GIT1, GIT2 has been shown to exist as multiple isoforms, which are produced due to alternative splicing of five internal in-frame regions (indicated with A, B, C, D, E). Additionally, a distinct exon (D') exists which leads to GIT2-short (C), a truncated isoform where the FAT domain is absent. For GIT1, alternative splicing of a single exon can occur at the start of the SHD. Prominent post-translational modification phosphorylationsites (tyrosine - Y) are shown in red.
1.1. Molecular mechanisms of ageing
Старение это один из наиболее сложных и взаимосвязанных биологических процессов, характеризующийся прогрессирующей потерей физиологической целостности, приводящей к нарушению функциональности и повышению уязвимости к болезням и в конечном итоге к гибели (Lopez-Otin et al., 2013). Этот процесс представляет собой также один из самых наивысших факторов риска для огромного большинства нарушений у человека, т.e. нейродегенерации, остеопороза и Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) (Lopez-Otin et al., 2013). В то время как процесс старения не рассматривается как болезнь, оно является состоянием, которое облегчает или даже индуцирует появление болезней у многих стариков (Rattan, 2014) и в качестве такового может рассматриваться как фактор риска для возникновения большинства связанных с возрастом болезней (Collier et al., 2011, Niccoli and Partridge, 2012).
Причины нарушений часто заложены в геноме. Некоторые гены были идентифицированы как важные для регуляции продолжительности жизни у модельных животных, у которые генетические манипуляции с рядом генов, участвующих в оси гормоны роста/insulin-like ростовой фактор 1, сильно влияют на продолжительность жизни (de Magalhaes, 2011). На молекулярном сигнальном/функциональном уровне, однако, имеются три главные характеристики, участвующие в предопределении способности к выживанию и тем самым продолжительности жизни: i) контроль тканевых/клеточных повреждений; ii) стрессовые реакции и iii) соотв. молекулярное ремоделирование и адаптация. Существует прогрессирующее уменьшение таких соматических репараций и адаптационных способностей, которые определяют скорость процессов старения (Rattan, 2014). Каждый из этих противодействующих и продуктивных процессов нуждается в в эффективном энергетическом метаболизме. Имеющиеся данные демонстрируют, что оптимальная регуляция энергии, используемая как в ЦНС, так и ПНС, способствует здоровому старению (Cai et al., 2012, de la Monte, 2014, de la Monte et al., 2017, Janssens et al., 2014). Гипоталамус является одним из ключевых органов тела, отвечающих за поддержание эффективного взаимодействия между энергетическим балансом и нейрологической активностью. Он поэтому является жизненно важным регионом головного мозга для процесса старения, т.к. он трофически координирует центральные и периферические функции (Cong et al., 2012, Stranahan et al., 2012a, Wang et al., 2010, Zhang et al., 2013). Сложные физиологические системы, базирующиеся как на нервных, так и эндокринологических способностях (modalities), сдерживаются с помощью сложных и взаимозависимых сетей из генов и белков скорее, чем с помощью какого-либо одного унитарных факторов (Chadwick et al., 2012) - так как чрезмерная сложность, однако, практически может быть сведена к небольшой группе трофических регуляторных факторов, помогающих поддерживать целостность сети и способность к быстрой адаптации к пертурбациям.
1.2. Molecular networks and keystones
Становится всё яснее, что биологические системы функционируют как сложные интегрированные сети скорее, чем простейшие линейные молекулярные каскады (Barabasi and Oltvai, 2004). Функциональные биологические сети на наиболее базовом уровне состоят из кластеров само-упорачивающихся межбелковых взаимодействий. Эти сети из белков могут затем регулировать сигнальные каскады, транскрипционные реакции и системы межклеточных коммуникаций, чтобы контролировать процессы от одиночной клетки до уровня всего организма (Fraser, 2005). Наивысшая степень взаимосвязанности белков в таких сетях, может рассматриваться как биологически наиболее важная (Albert et al., 2000, Jeong et al., 2001).
Такие сильно взаимосвязанные белки называются 'краеугольными' белками или ступицами ('hubs') (Han et al., 2004, Schadt, 2009, Schadt et al., 2009). Присутствие таких краеугольных камней позволяет сети становиться высоко устойчивой к случайным отказам (периферических) узлов, тем самым создется устойчивость сети. Кроме того, эти keystone факторы делают возможными ответы и адаптации к изменениям внешних и внутренних состояний, без потери нормальной функциональности и целостности сети (Wolfson et al., 2009). Крепко связанные ступицы или хабы (keystones) особенно важны для многоклеточных/многотканевых процессов, таких как старение, т.к. они существенно улучшают эффективность коммуникаций внутри этих мульти-тканевых сверх-сложных систем (Watts and Strogatz, 1998). Во время стресса, когда мульти-тканевые скоординированные реакция являются жизненно важными, может быть необходим дополнительный уровень физиологической координации, т.е. коммуникации между хабами (keystone-keystone). Взаимодействия между разными хабами могут быть поэтому важны, чтобы координировать сохраняющие жизнь стрессовые реакции и, скорее всего, ответственны за связи между разными классами клеточных путей, напр., связи метаболической целостности с репарацией ДНК. При нормальных физиологических функциях эти взаимодействия domain-crossing complex из механизмов трофического контроля делают возможными адаптации к внезапным нуждам и беспрецедентным изменениям (Lipsitz and Goldberger, 1992). Современные данные подтверждают, что в глобальном смысле существует прогрессирующая потеря этих сложных взаимодействий, обеспечивающих целостность и гибкость сети во время процессов старения (Balasubramanian and Nagaraj, 2016, Lipsitz and Goldberger, 1992, Morrison and Newell, 2012, Sleimen-Malkoun et al., 2014), вызывает потерю динамического диапазона в физиологической функции и тем самым снижает способность адаптации к стрессам. Это наблюдается во многих процессах, таких как : 1) сердечно-сосудистый контроль; 2) пульсирующее высвобождение гормонов; и 3) электро-энцефало-графические потенциалы (Lipsitz and Goldberger, 1992).
Поддержание сложных взаимодействий, которое происходит между разными биологическими системами посредством хабов функциональности, может быть многообещающим подходом для уменьшения тяжести связанных с возрастом нарушений. Следовательно, целенаправленное воздействие на хабы функциональности/экспрессии может существенно контролировать процессы старения минимально-инвазивным и само-поддерживающим способом, т.е. за счет модуляции самих хабов (keystone) может создаваться исправляющие синергичные пульсации ('ripples') в желательных физиологических сетях. Исправляющая регуляция факторов хабов может порождать тонкие, но очень эффективные, терапевтические реакции, т.к. ни одна одиночная сигнальная система не получит непосредственного воздействия, которое снижало бы благоприятную возможность для быстрого рефлексивного tachyphylaxis на уровне одиночного пути, т.е. десенсибилизацию. Большинство на сегодня используемых лекарств разумно предписывается с целью индукции их терапевтической эффективности посредством регуляции только небольшого количества факторов/белков в сигнальном каскаде. Однако, эти небольшие локальные эффекты могут затем наталкиваться на противодействие со стороны др. дистальных компонентов этой 'болезненной' сети; напротив, эффективный контроль хаб-факторов может, скорее всего, вызвать эффект, который распространится по сети с помощью само-усиливающегося способа.
Одним из таких белков мишеней в такой сложной сети старения является GIT2 (Chadwick et al., 2012). GIT2 был идентифицирован как важный белок, связывающий некоторые аспекты сложного процесса старения, включая энергетический метаболизм и нейрофизиологическую регуляцию. Используя беспристрастный Latent Semantic Indexing (LSI) подход, было установлено, что GIT2 крепко связан с огромным количеством функциональных аспектов белковых сетей в стареющем гипоталамусе. GIT2 потенциально играет многоразмерную роль в связывании нейрональной и регулирующей энергию функций при старении (Chadwick et al., 2012). В подтверждение keystone роли GIT2, Chadwick et al. (2012), показали сильное увеличение экспрессии GIT2по мере увеличения возраста в широком круге тканей ЦНС (гипоталамусе, своле головного мозга, мозжечке, коре и гипофизе), а также во многих периферических тканях, ассоциированных с соматическим метаболизмом энергии (поджелудочная железа, печень, скелетные мышцы и жировая ткань). Это связанное в возрастом увеличение экспрессии GIT2 подтверждает фундаментальную роль в процессе старения и регуляции энергии этого каркасного белка (Chadwick et al., 2012). Дальнейшие исследования каркасного белка GIT2, показали, что он взаимодействует со многими белками, участвующими в многочисленных 'самостоятельных' сигнальных путях (Fig. 2and Table S1) (Zhou et al., 2016). Многие из этих партнеров физических взаимодействий участвуют в связанных с возрастом нарушениях, включая Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM), ассоциированный с репарацией ДНК Breast cancer type 1 susceptibility protein (BRCA1), опухоли супрессирующий белок p53 (p53), инсулиновый рецептор и insulin receptor substrate 2 (Lu et al., 2015, Martin et al., 2015). Белок GIT2 может т.о. играть жизненно важную роль в организации сложных молекулярных сигнальных сетей, благодаря своей способности осуществлять контроль над передачей сигналов на многие трофические уровни (Han et al., 2004, Mirzarezaee et al., 2010).
Fig. 2.
The functional spectrum of curated GIT2 interactors. GIT2 in-part acts as a vital scaffolding protein as well as a, ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein (ArfGAP). As protein scaffolding has been shown in recent years to be a vital component of intracellular signaling cascades, e.g. the assembly of mitogen-activated protein kinase pathways by adapters such as ?-arrestin, the interactomic profile of proteins such as GIT2 are likely to be a strong indicator of the eventual functionality of the specific protein in a cellular system. The radial diagram centered upon GIT2 indicates a comprehensive assessment of GIT2 published interacting proteins identified to date. The presented information is based upon literature and data from Zhou et al. (2016), and Lu et al. (2015). All of the known and validated GIT2-interacting proteins are rationally grouped (via color matching with the groups radially indicated) based on their biological functions - thus facilitating an indication of the potential interactomic ramifications of GIT2 protein-protein binding activity. Red rings around the specific interacting proteins are used to identify GIT2-interacting proteins belonging to more than one functional signaling group, e.g. SRC (Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src) interaction with GIT2 demonstrates the role of this molecular interaction with immune responsivity regulation, cell cycle regulation and osteogenesis. The most commonly found and interconnected GIT2 interactors are indicated via enlarged protein identification text, i.e. ATM (ataxia telangiectasia mutated), SRC (Proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src), TP53 (tumor protein p53) and GIT1 (ARF GTPase-activating protein GIT1). With further interactomics-based research the complexity and connectivity of these associated scaffolding factors - and how they eventually regulate GIT2-associated biology - will be further elucidated, allowing the potential for therapeutic interventions based on these reactions. All previously identified GIT2 interactors can be found in Supplementary Table S1.
2. GIT2 and the HALLMARKS OF AGEING
Хотя молекулярные сложности процесса старения являются уникальными для каждого индивида, имеется несколько общих знаменателей старения, наз. отличительными признаками (Fig. 3).
Fig. 3.
Parallel effects of the major ageing hallmarks during lifespan. The complex multifactorial process of ageing is likely both initiated and controlled by the potential simultaneous interaction between several pathological domains. The generation, potentially in early middle-age, i.e. 30-35, of an individual's ageing trajectory is likely an index of both the degree and temporal co-occurrence of multiple pro-aging molecular pathologies. In this simplistic model we propose that initial metabolic dysfunctions that interfere with optimal glucose usage as the primary energy source will likely force the individual to enhance the usage of lipid-based metabolism for supplementary energy generation. This switch will likely require increased storage of lipids in tissues to act as an energy reserve - this abnormal/premature lipid infiltration and storage in tissues may then induce a greater pro-inflammatory state in the individual. The combination therefore of reduced energy generation efficiency and enhanced inflammatory markers is likely to be coincident with an increased oxidative radical burden (due to the move away from efficient oxidative phosphorylation) which in turn will increase the risk for cellular protein, lipid and nucleic acid damage. It is highly likely however that many of these events will occur in most individuals during the aging process but the relative magnitude of each event and their temporal relationships will likely vary, resulting in an individualistic aging trajectory in each person.
2.1. GIT2 controls DNA damage response factors
Постоянные воздействия внешней среды, а также внутренних метаболических/эндокринных стрессов, соматических и митохондриальных генетических повреждений возникают естественным образом в течение всей жизни (Moskalev et al., 2013). В основе старения лежат важные повреждения ДНК, прототипические преждевременные старческие нарушения, такие как синдромы Werner, Bloom and Hutchinson-Gilford прогерия, вызываемые усилением накопления повреждений ДНК (Burtner and Kennedy, 2010). Стабильность и целостность ДНК постоянно подвергаются воздействию экзогенных и эндогенных угроз, таких как ошибки репликации ДНК и реактивные виды кислорода (ROS) (Hoeijmakers, 2009). Для укрепления противостояния этим воздействиям организмы разработали сложную сеть механизмов репарации ДНК, которые коллективно способны справиться с большинством типов повреждений ДНК (Lord and Ashworth, 2012). Реакция на повреждения ДНК (DDR) включает распознавание повреждений ДНК, репарацию ДНК и репрограммирование транскрипции. Интересно, что современные доказательства подтверждают, что эти реакции контролируются механизмами циркадных часов (Sancar et al., 2010). Эти часы являются молекулярной системой, которая обеспечивает ежедневные ритмы физиологических функций (Hastings et al., 2003, Reppert and Weaver, 2002, Sancar, 2004, Takahashi et al., 2008), позволяя организму выживать (Uchida et al., 2010). Основные компоненты циркадных часов участвуют в клеточных циклах и регуляции DDR. Более того, многие внутриклеточные сигнальные каскады, важные для клеточного цикла и DDR, важны также и для регуляции часов (Uchida et al., 2010).
GIT2, по-видимому, способствует репарации ДНК посредством множественных механизмов; напр., стабилизации BRCA1, активации белков репарации, а также регуляции активности poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Первым указанием на роль GIT2 в репарации ДНК стало усиление экспрессии GIT2 в ядре после индукции разрывов двойной нити ДНК (DSB) в клетках нейробластомы (Lu et al., 2015). Эктопическая избыточная экспрессия GIT2 способствует репарации повреждений ДНК и повышению уровней экспрессии белков, ассоциированных с DDR, тогда как замалчивание GIT2 с помощью siRNA вызывает противоположный эффект. GIT2, как было установлено, крайне синергичен с экспрессией многих связанных с DDR факторов, напр., HMGB1 (High mobility group protein B1), MDC1 (Mediator of DNA damage checkpoint protein 1), and FANCI (Fanconi anemia group I protein) (Lu et al., 2015). Дальнейшие исследования продемонстрировали, что GIT2 также функционально связан со многими белками комплекса DDR, такими как γ-H2AX (маркер для сайтов DSB ДНК), MDC1, p53 binding protein 1 (p53BP1), сам p53 опухолевый супрессор и ATM после воздействия агентов, повреждающих ДНК, подтверждая, что GIT2 может формировать часть чувствительного к контексту мульти-белкового комплекса, состоящего из белков, связанных с DDR (Lu et al., 2015). Как упоминалось ранее, GIT2, по-видимому, способствует активности белков, участвующих в реакции на повреждения ДНК; PARP1 and -2. Эктопическая экспрессия GIT2 способствует синтезу Poly-ADP ribose (PADR) с помощью PARP1 и PARP2, в клетках, подвергшихся радиационной ионизации, указывая, что GIT2 может влиять на репарацию ДНК путем облегчения активности PADR полимеразы. Более того, геномная делеция GIT2 приводит к накоплению повреждений в ЦНС и к ускорению старения (Lu et al., 2015). Наконец, иммуногистохим. окрашивание срезов коры, полученных от GIT2KO мышей, продемонстрировало присутствие достоверно большего количества фокусов γ-H2AX в ядрах клеток молодых GIT2KO мышей, чем у старых дикого типа (WT) мышей, указывая на продвинутый старческий фенотип, потенциально обусловленный снижением способности к репарации ДНК (Lu et al., 2015). В дополнение к этой строго роли GIT2 в поддержании физических компонентов DDR, последние данные также подтверждают, что геномная делеция GIT2 может менять клеточные функции, связанные с циркадным ритмом, такие как дневной/ночной метаболические сдвиги (Martin et al., 2015) и активность иммунных клеток (Siddiqui et al., 2017).
Механизмы клеточных часов могут не только регулировать хронологическое старение клеточных тканей, но и эти механизмы могут также строго регулировать скорость и степень метаболических нарушений, стабильность теломер и повреждения ДНК во время процесса старения (Collis and Boulton, 2007, Kagawa, 2012, Khapre et al., 2010). Неудивительно поэтому, что функциональность клеточных часов теперь связывают со многими обусловленными возрастом нарушениями, включая деменцию (Musiek et al., 2013), glycemic/adiposity нарушения, такие как Metabolic Syndrome (Bruce et al., 2016, Vieira et al., 2014) и преждевременное патофизиологическое старение, ассоциированное с ослаблением репарации поврежденной ДНК (Kowalska et al., 2013, Vaziri et al., 1997). Интересно отметить, что была предположена сильная эволюционная синергия между генами часов и белками, участвующими в процессах DDR (Uchida et al., 2010). Многочисленные внутриклеточные сигнальные белки, функционально связанные с GIT2, напр. ATM, p53 и BRCA1, участвуют в чувствительных к стрессам каскадах и играют важные роли как в контроле клеточного цикла и DDR, так и в регуляции циркадных часов (Gery et al., 2006, Kowalska et al., 2013, Miki et al., 2013, Storcelova et al., 2013, Vieira et al., 2014). Siddiqui et al. (2017) недавно продемонстрировали, что посредством множественных иммунологических тканей геномная делеция GIT2 приводит к значительной совместной редукции множественных связанных с часами транскриптов мРНК, что также ассоциирует с преждевременным старением и функциями DDR (Siddiqui et al., 2017). GIT2 поэтому может служить в качестве функционального моста между клеточным старением, регуляцией часов и повреждениями ДНК и тем самым может обладать потенциальной способностью менять накопление связанных с возрастом клеточных повреждений. Поскольку накопления связанных с возрастом повреждений и метаболических дисфункций ДНК, по-видимому, действуют синергично, чтобы ускорять начало связанных с возрастом повреждений, то интересно отметить, что терапия, нацеленная на механизмы регуляции часов, сегодня кажется многообещающей для воздействия на связанные с возрастом болезни (Blackburn et al., 2015, Dankel et al., 2014, He et al., 2016).
2.2. GIT2 expression is modulated by oxidative stress
Низкие уровни оксидативных стрессов за счет ROS безусловно выгодны организмам, т.к. это может удлинять продолжительность жизни у дрожжей и C. Elegans (Doonan et al., 2008, Mesquita et al., 2010), подтверждая, что ROS могут играть роль в запуске клеточной пролиферации и жизнеспособности в ответ на нормальные физиологические сигналы и в условиях стрессов (Sena and Chandel, 2012). Однако, по мере продолжения старения клеточные стрессы и повреждения возрастают по мере увеличения уровней ROS, подавляя системы реакций на оксидативные стрессы, приводя к усилению оксидативных стрессов и ассоциированных с возрастом повреждений (Hekimi et al., 2011). Теория свободных радикалов в старении указывает, что прогрессирующая дисфункция митохондрий с увеличением возраста приводит к усилению продукции ROS, это в свою очередь вызывает глобальные клеточные оксидативные повреждения (Harman, 1965). Долговременное воздействие на нервные клетки человека не-цитотоксических уровней радикалов кислорода может реплицировать множественные вредные эффекты для нейрофизиологии в результате процессов старения клеток, напр., снижение чувствительности к neurotrophin, нарушение системы буфера клеточного кальция и ослабление потребления и утилизации глюкозы. Такая долговременная экспозиция поэтому эффективно воспроизводит низкие уровни постоянных стрессов, переживаемых нормально стареющими клетками, или ранние стадии нейродегенеративных нарушений (Chadwick et al., 2010b). Chadwick et al. обнаружили существенное повышение lamin A (связанного с progeric laminopathy, e.g. Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome) и GIT2 в этой клеточной модели старения ЦНС
(Chadwick et al., 2010b). Когда эти исследования на клетках были применены к действительно стареющей ткани ЦНС, то наблюдалось выраженное увеличение экспрессии GIT2 в ЦНС мышей, крыс, не-человекообразных приматов (Rhesus Macaque) и человека по мере увеличения возраста (Chadwick et al., 2010b). Учитывая роль GIT2 в регуляции повреждений ДНК, то становится очень возможным, что это зависимое от возраста увеличение отражает рефлекторную клеточную защиту, нацеленную на ослабление потенциальных вызываемых ROS повреждений ДНК и др. клеточных стрессовых агентов.
2.3. GIT2 controls metabolic functionality
Давно было установлено, что метаболизм глюкозы постепенно нарушается по мере старения (Davidson, 1979). Роль пути инсулина и insulin growth factor-1 (IGF1) в регуляции продолжительности жизни вообще-то один из наиболее изученных сценариев молекулярного старения (у многих организмов) кстати (Lopez-Otin et al., 2013, Piper et al., 2008). 40% белков пути Ins/IGF1 идентифицировано в качестве белков, связанных с продолжительностью жизни (Wolfson et al., 2009). В соответствии с этим, ограничение калорий - вызывает исправление связанной с Ins/IGF1 дисгликемии и увеличивает продолжительность жизни или "healthspan" (т.e. период жизни, в котором отсутствуют существенные болезненные патологии) у всех изученных видов эукариот (Colman et al., 2009, Fontana et al., 2010, Mattison et al., 2012, Speakman and Mitchell, 2011). Более того, фармакологические манипуляции, воспроизводящие состояние ограниченной доступности питательных средств, напр. rapamycin или resveratrol, как было установлено, увеличивают продолжительность жизни и/или healthspan у мышей и не-челоовекообразных приматов (Harrison et al., 2009). Как упоминалось ранее, с возрастом снижается способность всех систем организма улаживать стрессы и это частично обусловлено снижением эффективности, прежде всего, гликемическую энергию-генерирующей метаболической системы (Barzilai et al., 2012, Daum et al., 2013, Terman, 2006). Первичный синтез энергии посредством классического митохондриального оксидативного фосфорилирования представляет собой наиболее эффективный механизм продукции аденозин трифосфата (ATP), использующий катаболизм глюкозы, а альтернативные генерирующие энергию механизмы, напр., посредством утилизации липидов или белков, оказывают более значительные физиологические стрессы, чем оксидативное фосфорилирование и генерируют меньше АТФ на единицу использованного катаболита. Изменения в использовании первичных энергию генерирующих катаболитов может быть количественно оценено с использованием respiratory exchange ratio (RER), т.e. соотношения потребления кислорода к продукции углекислого газа. Высокий RER (~0.9 - 1) показывает, что преимущественно используются углеводы, тогда как более низкое RER указывает на окисление липидов (~0.8) или деградацию (~0.7 - 0.8) (Pendergast et al., 2000, Simonson and DeFronzo, 1990). Недавний эпидемиологический анализ продемонстрировал, что скорость старения человека может быть сильно связана с с характерными для ранней жизни метаболическими 'траекториями' , которые могут быть измерены с использованием классического метаболического анализа (Belsky et al., 2015).
Обусловленное постепенным снижением метаболической эффективности с возрастом, делает тело всё более чувствительным к множественным патофизиологическим изменениям, связанными с недостаточностью энергии (Chadwick et al., 2012), включая нейродегенерацию, устойчивость к инсулину и метаболические нарушения. такие как T2DM, а также хроническое воспаление (Chadwick et al., 2012, Ford et al., 2002, Morley, 2008). Эта связанная с возрастом чувствительность может быть в основном ассоциирована с: i) повышенной продукцией ROS на синтезированный АТФ, ii) уменьшение активности по деградации не-существенных белков, приводящее к избыточной агрегации белков, и iii) снижение способности процессов репарации клеточных повреждений. Следовательно, скорее всего, healthspan млекопитающих крепко связан со способностью организма сохранять пик метаболической эффективности. Использование менее эффективных генерирующих энергию катаболических процессов поэтому будет удобным показателем имманентного связанного с возрастом снижения. В соответствии с этим было продемонстрировано, что довольно молодые (4-6 мес.) GIT2KO мыши обнаруживают достоверно сниженное respiratory exchange ratio по сравнению с WT мышами, указывая на переключение в направлении катаболизма жира (и возможно белков), чтобы генерировать энергию вместо глюкозы (Martin et al., 2015). Это снижение соматической энергии, как было установлено, управляется с помощью присутствия сильной гипоталамической молекулярной сигнатуры, способствующей связанной с возрастом дисфункцией метаболизма. Подчеркивая системный уровень функциональности GIT2, было также установлено, что потеря GIT2 существенно влияет на структуру и активность панкреатических островков, приводя к снижению способности продукции инсулина, к потере массы β-клеток и к инволюции α-клеток островков (Martin et al., 2015). Эти структурные патологии поджелудочной железы у GIT2KO мышей были ассоциированы с достоверно более высокими уровнями глюкозы в плазме в условиях голодания, снижением инсулина в плазме и устойчивостью к инсулину по сравнению с контролем того же возраста. Наглядная связь между старением организма и метаболическим статусом, также демонстрирует, что GIT2 может служить в качестве биомаркера старения, эта функция предопределяется с помощью преобладающего метаболического состояния организма. Так, db/db мыши, моделирующие диабет и ожирение, демонстрируют преждевременное повышение уровней экспрессии GIT2 (Martin et al., 2015). Наблюдается соответствие эффектов метаболических нарушений на траектории старения человека (Sancar, 2004). Очевидно, что пересечение между системой Ins/IGF1 и GIT2 осуществляется на уровне физической ассоциации и формирования каркаса, посредством физической ассоциации GIT2 с Insulin Receptor и с Insulin receptor substrate 2. Более того, ассоциация GIT2 с этими двумя компонентами системы Ins/IGF1 нарушается в поджелудочной железе db/db мышей, подтверждая метаболическую регуляцию этих взаимодействий (Martin et al., 2015).
2.4. GIT2 functionality is associated with T-cell activity and immune response capacity
Во время процесса старения наблюдается прогрессирующая дисфункция многих рецепторных сигнальных систем, среди которых резистентность инсулиновых рецепторов изучена наиболее тщательно. Помимо прогрессирующего метаболического нарушения, альтерации в рецепторной сигнальной системе, связанные с воспалением приводят к прогрессивному увеличению хронического воспаления низкого уровня. Этот феномен недавно был определен как 'inflammaging' (Franceschi et al., 2000, Franceschi and Campisi, 2014, Franceschi et al., 2007, Frasca and Blomberg, 2016, Monti et al., 2017, Stranahan et al., 2012b). Распространяющееся повсюду воспаление у человека происходит прежде всего в отсутствие явной экзогенной инфекции (Franceschi et al., 2000, Frasca and Blomberg, 2016). Воспаление связано с повышенными уровнями воспалительных биомаркеров, таких как C-реактивный белок и interleukin (IL)-6. Повышение этих факторов порождают дальнейшие вредные изменения в составе тела, в продукции и использовании энергии, метаболическом гомеостазе, ожирении, иммунном старении, атеросклерозе и здоровье нервов (Barzilai et al., 2012, Tabas, 2010). Воспаление, ассоциированное с процессом старения, может иметь множественные причины: i) накопление тканевых повреждений вызывают воспаление, ii) неспособность иммунной системы, приводящая к неспособности эффективно избавляться от патогенов и дисфункции клеток хозяина, iii) стремление стареющих клеток секретировать про-воспалительные цитокины, iv) усиление активации транскрипции связанного с возрастом транскрипционного фактора Nuclear factor-κB (NF-κB) и v) дефекты реакции аутофагии (Salminen et al., 2012).
Молекулярные последствия воспаления сказываются на врожденных и приобретенных иммунных реакциях (Deeks, 2011). Старение иммунной системы, скорее всего, усугубляет фенотип соматического старения из-за неспособности иммунной системы эффективно устранять инфекционные агенты, инфицированные клетки и клетки, подвергшиеся злокачественному перерождению (Lopez-Otin et al., 2013). Мультифункциональный характер GIT2 распространяется и на участие в адаптивном иммунитете, в котором этот белок необходим для позитивного отбора тимоцитов, процесс важный для созревания тимоцитов и детерминации их или в CD4+ , или CD8+ T клеточные клоны (Hogquist et al., 2015, Klein et al., 2014, Phee et al., 2010). Миграция тимоцитов у GIT2KO дефектна in vivo у GIT2KO мышей, которая, как полагают, обусловлена некорректными реакциями на градиенты локальных цитокинов, из-за этого происходит остановка тимоцитов вблизи и это мешает обнаружению тимусных эпителиальных клеток во время позитивной селекции (Phee et al., 2010). Более того, функция регуляторных Т клеток контролируется, по крайней мере, частично с помощью GIT2-αPIX-PAK комплекса, который располагается в комплексах фокальных адгезий (Kong et al., 2014). Интересно, что уровни GIT2 снижаются у α-PIX дефицитных лимфоцитов, подтверждая, что GIT2 нестабилен в отсутствие PIX партнера. Эти α-PIX и GIT2-дефицитные B- и T-лимфоциты обнаруживают снижение пролиферации, стимулируемой антигенами (Missy et al., 2008), этот дефект обнаруживается и при старении. Большое количество исследований показало роль GIT2 в создании затора в системе иммунного старения, такой как функция нейтрофилов, продукция про-воспалительных цитокинов, селекция и регуляция тимоцитов (Mazaki et al., 2006). Активность Т клеток и иммунные реакции также ассоциируют с функциональностью GIT2, т.к. созревание T клеток существенно нарушено из-за преждевременной инволюции тимуса у GIT2KO мышей (Siddiqui et al., 2017).
2.5. GIT2 regulates fat deposition
Adipose tissue (AT) состоит преимущественно из адипоцитов и может действовать как соединительная ткань, депо для сохранения энергии, теплоизолятор и механические подушки (Snyder et al., 1975). Жир, с др. стороны, в основном состоит из липидов в форме триглицеридов (Wang et al., 1992). По мере старения, AT становится нефункциональной из-за нарушений дифференцировки пре-адипоцитов в зрелые адипоциты. Это приводит к генерации нефункциональных адипоцитов, которые неспособны хранить жир, который а результате перераспределяется аберрантно в эктопических местах (Pararasa et al., 2015). Во время старения увеличивается в теле жир, висцеральная AT и отложения эктопического жира. Это изменение в отложениях жира строго связаны с уменьшением здоровья у стариков и также связаны с метаболическими дисфункциями (Pararasa et al., 2015, Zamboni et al., 2014). Увеличение тотального ожирения, которое происходит при нормальном старении может не зависеть от изменений в весе тела, что обусловлено одновременным уменьшением мышечной массы с возрастом, это связанное с возрастом нарушение, наз. sarcopenia (Prentice and Jebb, 2001). Альтерации в распределении и качестве AT коррелируют с более высоким риском возникновения диабета, гипертензии, дислипидемии и сердечно-сосудистых заболеваний в старости (Zamboni et al., 2005).
Экспрессия GIT2,как было установлено, повышается с возрастом в органах, участвующих в энергетическом метаболизме, т.е. поджелудочной железе, печени, скелетных мышцах и AT (Chadwick et al., 2012). Происходит усиление этой ассоциации GIT2 с аномальной активностью AT, делеция GIT2 в геноме вызывает дисфункцию фенотипа скелетных костей, связанную с изменениями в отложении жира (Wang et al., 2012). Этот фенотип ассоциирует с паттерном дифференцировки мезенхимных стволовых клеток в направлении адипоцитов скорее, чем остеобластного клона и при этом в костном мозге накапливается AT (Wang et al., 2012). Дальнейшие исследования GIT2KO мышей также подтвердили, что делеция GIT2 ослабляет степень накопления подкожного и висцерального жира по сравнению с контрольными мышами того же возраста, которым скармливали диету с высоким содержанием жира - тем самым возникает более сильная резистентность к ожирению, вызываемому высоким содержанием жира. Кроме того, GIT2KO мыши обнаруживают повышенный расход энергии, и повышенную экспрессию генных транскриптов, участвующих в окислении жирных кислот и термогенезе (unpublished data).
3. GIT2 and age-related pathophysiology
3.1. GIT2 interactors BRCA1 and ATM are involved in development of neurodegenerative disorders
Нейродегенеративные нарушения и патофизиологическое старение вызываются функциональными взаимодействиями между большим числом разнообразных биологических систем, включая нейрологическую, сенсорную, эндокринную и метаболическую активности (Chadwick et al., 2010a, Chadwick et al., 2012, Chadwick et al., 2011, Chadwick et al., 2010b, Lu et al., 2015, Martin et al., 2008a, Martin et al., 2008b), многие из которых функционально интегрированы в одном критическом органе ЦНС - гипоталамусе (Moheet et al., 2015). Гипоталамус действует как трофический мастер-контролер эндокринной системы и обладает нейрональными проекциями к нескольким автономным высшим центрам головного мозга. Таким способом он осуществляет жизненно важные соединения между старением и связанными с возрастом нарушениями, такими как деменция (Janssens et al., 2014).
Процесс нейродегенерации сопровождается прогрессирующей потерей структуры и функции нейронов, вызывая нарушения скоординированной функции нервов (Fig. 4). Главным нейродегенеративными заболеваниями нашей популяции являются Alzheimer's disease (AD) и Parkinson's disease, характеризующиеся многими признаками старения, такими как повреждения ДНК, оксидативные стрессы, метаболические дисфункции и воспаление (Cannon and Greenamyre, 2011). Головной мозг млекопитающих потребляет 1/5 от общего количества потребления кислорода, приводя к воздействию на нейроны побочных продуктов ROS (Barja, 2004, Hirano et al., 1996, Kaneko et al., 1996, Nakae et al., 2000). Головной мозг, как полагают, также снижает соотношение между анти-оксидантными и про-оксидантными ферментами (Canugovi et al., 2013). Когда анти-оксиданты истощаются в головном мозге из-за физических стрессов или метаболических дисфункций, то нейроны становятся более чувствительными к индуцируемым ROS повреждениям ДНК (Barja, 2004, Hirano et al., 1996, Kaneko et al., 1996, Nakae et al., 2000). ROS сами по себе обладают способностью генерировать более 100 различных оксидативных модификаций оснований ДНК и эти альтерации обладают высоким мутагенным потенциалом (Iyama and Wilson, 2013). Эти оксидативные повреждения нейрональных клеток могут участвовать в возникновении нейродегенеративных нарушений, это подтверждается наблюдениями, показавшими, что система base excision repair (BER) используется для устранения таких оксидативных добавок, что важно для предотвращения нейродегенерации (Bosshard et al., 2012, Lillenes et al., 2013, Sheng et al., 2012). Накопление повреждений ДНК может быть особенно распространенным в ЦНС благодаря низкой способности DDR в этой ткани (Maynard et al., 2015). Уязвимость пост-митотических нейронов к повреждениям ДНК связана с постепенным снижением активности механизмов DDR, еоторое может приводить к накоплению повреждений ДНК с возрастом, внося вклад в старение головного мозга и нейродегенерацию (Madabhushi et al., 2014). Нарушения репарации ДНК оказались связаны с зависимой от возраста нейродегенерацией, такой как AD, болезнь Паркиснсона и амиотрофический боковой склероз (Madabhushi et al., 2014). DDR, как было установлено, важна как во время развития нейронов, так и в зрелых нейронах. Мутации основных факторов DDR или несовместимы с жизнью или проявляются в виде тяжелых нарушений нейрального развития. Примером такого DDR белка является BRCA1, который участвует в развитии AD (Suberbielle et al., 2015). Кроме того, ряд DSBs повышен при таких нарушениях как AD и амиотрофический боковой склероз (Adamec et al., 1999, Martin, 2001, Mullaart et al., 1990), и в некоторых мышиных моделях нейродегенерации (Dobbin et al., 2013, Kim et al., 2008, Suberbielle et al., 2013).
Fig. 4.
The multitude of GIT2 functions in age-related disorders. GIT2 represents a multiple domain, multiply-spliced multidimensional functional scaffold that possesses an ability to interact with G protein-coupled receptors and vesicular trafficking proteins. Taking together this highly versatile profile it is unsurprising that the functional activities of GIT2 are associated with a broad spectrum of functional and pathophysiological processes. From our data and that of other researchers this highly-connected nature of GIT2 suggests that it could be considered one of the factors that interconnects multiple domain-based activities, enabling the systems-wide coordination of both biological functions and also pathological ones, e.g. deleterious aging-related diseases. It is therefore highly likely that GIT2 potentially has the role of keystone protein in ageing and age-related disorders. To illustrate the multidimensional role of GIT2 in such a complex process, we have selected several GIT2-interacting partners and functions associated with ageing-related disease. Our posit of the keystone status of GIT2 is reinforced by its evidential ability to coordinate and regulate profound domains of related pathophysiology, e.g. inflammation (NF-?B, TLR), DNA damage response (BRCA1, ATM, p53) and Type 2 Diabetes Mellitus (InsR, Irs2, Ins). These global pathological domain activities can then promote the development of age-related disorders such as neurodegeneration (e.g. Alzheimer's disease: associated with GIT2 via DDR/BRCA1, InsR interactions), atherosclerosis (associated with GIT2 links to ROS sensitivity and DDR processes), osteoporosis (associated with GIT2 via its role in osteoblast function and fat deposition), central obesity, cancer, and sarcopenia. For each pathology box indicated in the radial diagram (excl. chronic inflammation and cancer) the normal condition (left) is compared to the pathology (right). Adipocyte level (adipocyte); DNA damage response (DDR); inflammation (Inf); insulin (Ins); Insulin receptor (InsR); Insulin receptor substrate 2 (Irs2); metabolic syndrome (MetS); osteoblast level (OB); Reactive oxygen species (i.e.oxidative stress) (ROS). GIT2KO мыши показали возможную роль GIT2 в нейроповеденческих и нейробиологических функциях (Caffrey et al., 2011, Lu et al., 2015). Lu et al. продемонстрировали, что кортикальные нейроны GIT2KO мышей содержат больше повреждений ДНК по сравнению WT мышами того же возраста, подтвердив критическую роль GIT2 в повреждениях ДНК в ЦНС in vivo. Они также идентифицировали in silico потенциал ATM-обеспечиваемого фосфорилирования у GIT2, и подтвердили, что GIT2 ассоциирует с активными ATM в местах DSB (Lu et al., 2015). ATM киназа является критической для инициации сигнальных путей после повреждений ДНК и DSBs, делая возможной их репарацию (Banin et al., 1998). Кроме того, Lu et al. также показали, что GIT2 контролирует временную стабильность BRCA1 (Fig. 4), DDR белка, участвующего в возникновении AD, внутри динамических DSB комплексов (Lu et al., 2015, Suberbielle et al., 2015). Истощение GIT2 с помощью siRNA предупреждает собственно рекрутирование BRCA1 на DSBs. Помимо стабилизации DDR комплексов, GIT2 оказался также критическим для регуляции связанного с DSB PARP1, который помогает в создании и стабилизации компонентов инициальных DDR комплексов (Lu et al., 2015).
В дополнение к недавней связи DDR с прогрессирующей нейродегенерацией, стало ясно, что метаболические дисфункции (особенно, связанные с генерацией энергии митохондриями) сильно способствуют нейродегенеративным болезням (Lu et al., 2015). Metabolic Syndrome (MetS), абдоминальное ожирение, непереносимость глюкозы, гипертензия, гиперинсулинемия и повышение глюкозы в плазме голодающих, все они являются факторами риска AD (Accardi et al., 2012, Razay et al., 2007, Vanhanen et al., 2006). По мере старения альтерации метаболизма глюкозы/энергии в головном мозге обнаруживаются постоянно (Hoyer, 1998). В 2003, Watson et al. установили ассоциацию между AD и гипергликемией, которая позднее подтверждена Razay et al. in 2007, которые установили ассоциацию при AD, гипергликемии и резистентности к инсулину (Razay et al., 2007, Watson and Craft, 2003) (Fig. 4). Martin et al. продемонстрировали, что GIT2KO мыши обладают метаболической дисфункцией, эти мыши обнаруживали повышенные уровни глюкозы в сыворотке при голодании и резистентность к инсулину (Martin et al., 2015). Следовательно, GIT2 может служить защитным фактором против T2DM, который теперь рассматривается один из самых сильных факторов риска AD. Более того, GIT2 ассоциирует с Metabolic Syndrome, при этом GIT2KO мыши обладают пол-специфической защитой от диеты с высоким содержание жира, вызываяющего ожирение, по сравнению с WT мышами в тех же самых условиях.
Вместе с повсеместной связью с метаболической дисфункцией развивается высоко атипичная прирожденная иммунная реакция при старении, при этом в головном мозге она преимущественно обеспечивается активированной микроглией, резидентными тканевыми макрофагами (Dheen et al., 2007). Эта врожденная иммунная реакция запускается с помощью неправильно упакованных и агрегированных белков, типичных для AD, которые соединяются с паттерн распознающими рецепторами на микроглии и астроглие (Heneka et al., 2015, Lunnon et al., 2011) , чтобы повлиять на высвобождение медиаторов воспаления, которые вносят вклад в прогрессирование и тяжесть AD (Heneka et al., 2015). Wei et al. (2014) показали, что GIT2KO мыши обнаруживают существенное увеличение способствующих воспалению цитокинов и что GIT2 является критическим терминатором передачи сигналов Toll-like рецепторов (Wei et al., 2014) (Fig. 4), указывая на критическую роль GIT2 в системе врожденного иммунитета во время старения и для возникновения нейродегенеративных нарушений.
3.2. GIT2's role in DNA damage response and obesity suggest involvement in atherosclerosis development
Атеросклероз крупных сосудов так же известен как связанная с возрастом патофизиология, при которой склеротические и стенозирующие отложения липидов формируются внутри интимного слоя сосудов в местах разветвлений и с завихрениями кровотока и в конечном счете возникновение способствующих воспалению атеросклеротических бляшек (Ross, 1999). Дисфункция эндотелия приводит к хроническому дефициту биодоступности nitric oxide, это, как полагают, первая ступень в возникновении атеросклероза (Libby, 2002, Penn et al., 1986, Ross, 1999). Хроническое воспаление, ('inflammaging'), как теперь хорошо известно способствует атеросклерозу благодаря его склонности повреждать ДНК путем образования ROS (Fig. 4) и реактивных видов азота (Libby, 2002). Атерогенные повреждения могут быть инициированы мутационными событиями как в случае доброкачественных опухолей (Penn et al., 1986, Trosko and Chang, 1980) и растут доказательства, показывающие, что происходит накопление повреждений ДНК в сосудистых гладкомышечных клетках и воспалительных клетках внутри атеросклеротических бляшек, гладкомыечных клетках и макрофагов внутри бляшек, экспрессирующих маркеры повреждений ДНК, включая фосфорилированные формы ATM и γ-H2AX, которые возрастают по мере утяжеления болезни (Gray and Bennett, 2011). Интересно, что окисленный низкой плотности липопротеин также подавляет энзимы, участвующие в эксцизионной репарации оснований (Chen et al., 2000). Прогрессирование атеросклероза также, по-видимому, испытывает сильное влияние со стороны образовавшихся кластеров несбалансированных метаболических процессов в самой сосудистой сети. Недавно, регуляция гомеостаза клеточной энергии выступила в качестве многообещающего подхода в сердечно-сосудистой фармакологии (Wang and Lopaschuk, 2007), поскольку гипергликемия была идентифицирована в качестве зачинщика атеросклероза (Aronson and Rayfield, 2002). Более того, было установлено, что воздействие Mildronate подавляет γ-butyrobetaine hydroxylase, которая катализирует формирование важного кофактора для импорта в митохондрии и окисления длинно-цепочечных жирных кислот, снижает образование атеросклеротических бляшек, поддерживая роль регуляции энергетического метаболизма при лечении атеросклероза (Vilskersts et al., 2009). Поскольку на сегодня нет сообщений о существовании недвухсмысленной связи GIT2 и атеросклероза, его роль в иммунных клетках с 'воспалительной' активностью, в оксидативных стрессах и DDR указывает всё же на роль GIT2 возникновении атеросклероза (Fig. 4) (Chadwick et al., 2010b, Lu et al., 2015). Во многих линиях клеток, в которых может действовать GIT2 как молекулярный сенсор оксидативных стрессов (Chadwick et al., 2010b) , а также как строгий фактор, способствующий выживанию, во время периодов стрессов, при которых накапливаются повреждения ДНК (Lu et al., 2015). Связь GIT2 с DDR комплексами, скорее всего, также контролируется с помощью его физических взаимодействий с ATM и γ-H2AX (Fig. 4) (Lu et al., 2015). Эти два белка, как было установлено, присутствуют в атеросклеротических бляшках и влияют на тяжесть болезни (Penn et al., 1986), тем самым выявляется возможная связь между GIT2 и возникновением атеросклеротических бляшек. Более того, как упоминалось ранее, геномная делеция GIT2 у мышей может быть защитной от ожирения (unpublished data), которое является одним из самых серьезных факторов риска возникновения сердечно-сосудистых нарушений, таких как атеросклероз (Roever et al., 2016). Поскольку GIT2 пока не был прямо ассоциирован с атеросклерозом, GIT1, как было установлено, активирует активирует в эндотелиальных клетках nitric oxide synthetase, энзим, который продуцирует NO в эндотелиальных клетках. GIT1 был идентифицирован в качестве молекулярного каркаса, облегчающего продукцию NO, благодаря ассоциации с nitric oxide synthetase эндотелиальных клеток, которая регулируется активностью Src и Akt киназ (Liu et al., 2014).
3.3. GIT2KO mice show decreased bone mineral density and bone volume
Остеопороз довольно широко распространенное метаболическое заболевание костей, характеризующееся уменьшением костной массы и минеральной плотности кости (Rachner et al., 2011) и очень часто ассоциирует со значительным возрастом (Cheung et al., 2010). В 2005, Yalin et al. выявили негативную корреляцию между superoxide dismutase (SOD) и уровнем минеральной плотностью поясничных костей у мужчин с остеопорозом (Yalin et al., 2005). Эти данные подтвердили, что оксидативные стрессы играют важную роль в патофизиологии первичного остепороза у мужчин (Yalin et al., 2005). У женщин, однако, одной из наиболее интригующих гипотез стало предположение о способности половых гормонов, т.e. эстрогена, защищать кости от оксидативных стрессов путем действия антиоксидантов (Cervellati et al., 2013, Di Gregorio et al., 2001, Lean et al., 2003), и это впоследствии было подтверждено in vitro и in vivo (Lean et al., 2003). Потеря эстрогена после менапаузы изменяет генерацию ROS и антиоксидантную защиту клеток (Fig. 4) (Lean et al., 2003). Это приводит к накоплению видов оксидантов, что, в сою очередь, позволяет стимулировать формирование и резорбцию остеокластов, в результате увеличивается тяжесть болезни (Cervellati et al., 2013, Hodge et al., 2011, Lean et al., 2004). Причиной повреждений ДНК при остеопорозе и др. дефектах скелета, как полагают, являются мутации генов, кодирующих DDR белки, которые могут приводить к нарушениям развития костей и/или дерегуляции костей (Chen et al., 2013). Chen et al. показали, что knocking out DDR белка Excision Repair Core Complementary group-1 (ERCC1) у мышей приводит к сохранению повреждений ДНК, к преждевременному клеточному старению и снижению пролиферации остеобластов. Такие мыши демонстрируют неспособность к репарации повреждений ДНК и страдают от ускоренного старения и спонтанно развивающегося остеопороза (Chen et al., 2013). Более того, ATM-дефицитные мыши (ATMKO) воспроизводят остеопороз. ATMKO мыши обладают снижением костной массы, особенно в губчатых костях и это сопровождается снижением скорости образования кости и дефектами дифференцировки остеобластов. Однако, количества предшественников костей и остеобластов остаются неизменными у ATMKO мышей. ATMKO мыши также демонстрируют заметное повышение продукции остеокластов и резорбции костей, хотя ATM , по-видимому, не оказывает клеточно-автономных эффектов на дифференцировку остеокластов и резорбцию (Rasheed et al., 2006).
Остеопороз длительное время связывали с hyperparathyroidism, при котором избыток паратироидного гормона (PTH) удалял слишком много кальция из костей, делая их тонкими и ломкими. Hyperparathyroidism нарушает также нормальный метаболизм глюкозы (Chiu et al., 2000, Procopio et al., 2002) и ассоциирует с гипергликемией и гиперлипидемией (Ring et al., 2012, Silverberg et al., 2009, Walker et al., 2012, Walker and Silverberg, 2008). Гипергликемия, которая может быть вызвана экспериментально, индукцией делеции GIT2, может индуцировать остеопороз и переломы костей за счет негативной регуляции нормального функционирования остеобластов и одновременно за счет позитивной регуляции функции остеокластов (Lampropoulos et al., 2012). Недавние доказательства, полученные на людях, страдающих от этой болезни, такие как остеопороз после менопаузы, указывают на взаимосвязь между иммунной системой и костями. Было подтверждено, что потеря кости, индуцируемая снижением эстрогена в менопаузе, является сложным эффектом множества путей и цитокинов, которые кооперируются, чтобы регулировать продукцию остеобластов и остеокластов. Среди этих цитокинов рецепторный активатор лиганда NF-κB и Tumor necrosis factor-alpha (TNFα), по-видимому, играют особенно важные роли в индукции образования и активности остеокластов. Кроме того, IL-17 может способствовать потере кости, вызывая предпочтение к образованию остеокластов и подавляя дифференцировку остеобластов (Faienza et al., 2013). Остеокласты сами по себе являются членами семейства моноцит-макрофаги и происходят из слияния происходящих из костного мозга одноядерных фагоцитов, т.e. предшественников остеокластов, которые дифференцируются под влиянием macrophage colony stimulating factor и лиганда RANK (Massey and Flanagan, 1999). RANK лиганд сам по себе продуцируется остеобластами и соединяется со своим рецептором RANK (receptor activator of nuclear factor kappa B) на остеокластах (Pacifici, 1996). Эти факторы усиливают резорбьцию кости путем увеличения количества пре-остеокластов в костном мозге, индуцируя тем самым остеопороз (Satpathy et al., 2015). Ожирение увеличивает экспрессию нескольких химических мессенджеров, которые осуществляют свои эффекты путем модуляции сигнальных путей в костях и мышцах. Эти мессенджеры (напр. TNFα, IL-6, лептины, advanced glycation end products(AGE)) модулируются в результате ожирения и, как было установлено, действуют как негативные регуляторы остеобластов и остеоцитов, в то же время действуя как позитивные регуляторы остеокластов, тем самым в конечном итоге увеличивая риск остеопороза (Roy et al., 2016).
Динамическая реорганизация цитоскелета играет важную роль в дифференцировке остеобластов и поддержании полярности остеокластов во время резорбции кости, а GIT2 , как полагают, играет роль в возникновении остеопороза посредством регуляции цитоскелета (Wang et al., 2012). Взрослые GIT2KO мыши обнаруживают снижение минеральной плотности костей и объема костей как в губчатом, так и кортикальном компартментах, это ассоциирует с дефектами созревания остеобластов. Интересно, что эти мыши обнаруживают увеличение экспрессии мРНК RANK, указывая на компенсаторную реакцию на это снижение активности остеобластов. В отсутствие GIT2, дифференцировка мезенхимных стволовых клеток способствует возникновению клонов адипоцитов в противовес клонам остеобластов, приводя к редукции количества и функции остеобластов (Fig. 4) (Wang et al., 2012). Как GIT2 участвует в развитии подобных остеопорозу симптомов, остается неясным. Однако, можно предположить, это возможно посредством ассоциации с ATM (Fig. 4) (Lu et al., 2015). ATMKO мыши были предложены в качестве модели остеопороза, обнаруживают снижение костной массы, скорости формирования кости и дефектную дифференцировку остеобластов (Rasheed et al., 2006). Взаимодействие GIT2-ATM может объяснить ассоциацию между GIT2 и возникновением остепороза, но необходимы дальнецшие исследования.
3.4. GIT2 expression increases in aged skeletal muscle reminiscent of sarcopenia
Саркопения - это потеря мышечной массы и функции, которая наиболее часто связана с возрастом. Патогенез саркопении многофакторный и зависит от стиля жизни, системных факторов (напр. хронического воспаления и гормональных отклонений), локальных пертурбаций в окружении (напр. сосудистая дисфункция), и специфичные внутримышечные процессы (Marzetti et al., 2013). В старой мышечной ткани, увеличивается присутствие оксидативных повреждающих adducts (Fulle et al., 2004, Ji, 2001, Mecocci et al., 1999). Избыточная продукция ROS вызывает оксидативные повреждения, активацию внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в саркопении (Bonetto et al., 2009) и нарушает баланс, что делает возможной постоянную деградацию и повторный синтез белков скелетных мышц (Koopman and van Loon, 2009). Исследование Super Oxide Dismutase 1 (SOD1) KO мышей выявило саркопению, подтвердив роль дисфункции митохондрий и оксидативных стрессов в возникновении и прогрессировании саркопении (Jang et al., 2010). Оксидативные стрессы, как было установлено, также индуцируют повышение уровней хронического низкой степени воспаления, которое является вредным для скелетных мышц у человека (Howard et al., 2007) и животных моделей (Siu et al., 2008). Более того, ROS, по-видимому, функционируют как вторичные мессенджеры для TNFα в скелетных мышцах, непосредственно или косвенно активируя redox-чувствительные транскрипционный фактор, Nuclear factor NF-kappa-B (Reid and Li, 2001). Этот фактор может индуцировать воспаление и вызывать связанные с возрастом активации IL-6 и TNFα (Meng and Yu, 2010) и это является критическим для гомеостаза костей и мышц (Huang et al., 2014). Комбинация увеличения оксидативных стрессов и воспаления при саркопении, по-видимому, являются причиной индукции NF-κB (Kim et al., 2007). Путь NF-κB наиболее важен для утраты скелетных мышц при нормальном и патологическом старении (Li et al., 2008). Этот путь важен для пролиферации миобластов и поддержания их в недифференцированном состоянии (Guttridge et al., 1999, Mitin et al., 2001). Активация NF-κB, p38 mitogen activated protein kinase (MAPK) и p53 путей участвуют в атрофии скелетных мышц (Guttridge, 2004).
Более того, было подтверждено, что мутации и делеции митохондриальных ДНК также могут вносить вклад в возникновение саркопении (Kujoth et al., 2005). Мутации митохондриальной ДНК, как было установлено, вызывают саркопению путем воздействия на сборку и функцию комплексов цепочек переноса электронов. Hiona et al. продемонстрировали, что отсутствие этих комплексов вызывает снижение оксидативного фосфорилирования, в отсутствие оксидативных стрессов, вызывая в конечном итоге апоптоз мышц и саркопению (Hiona et al., 2010). Наконец, саркопения и ожирение обладают общими патофизиологическими механизмами и коллективно названы саркопеническое ожирение (Choi, 2016). Сложное взаимодействие общих патофизиологических механизмов, таких как увеличение цитокинов, способствующих воспалению, оксидативные стрессы, резистентность к инсулину и понижение физической активности лежат в основе тесного взаимоотношения между саркопенией и ожирением. Это вызывает порочный круг между накоплением эктопического жира и потерей массы скелетных мышц, это реципрокное влияние др. на др. (Kim and Choi, 2015). Саркопения приводит к снижению физической активности, это же приводит увеличению риска ожирения (Zamboni et al., 2008), тогда как ожирение индуцирует воспаление, которое вносит вклад в развитие саркопении (Gregor and Hotamisligil, 2011, Lutz and Quinn, 2012). В этом контексте поэтому вполне возможно, что благодаря способности соединять чувствительность к ROS и процессы DDR (Fig. 4), GIT2, скорее всего, играет роль в связанной с возрастом дегенерацией мышц. Подтверждением этому является потенциальное компенсаторное связанное с возрастом увеличение GIT2, наблюдаемое в скелетных мышцах мышей дикого типа (Chadwick et al., 2012, Martin et al., 2015). Как упоминалось ранее, увеличение оксидативных повреждений в мышцах может наблюдаться по мере развития саркопении и с возрастом, это может быть связано с усилением экспрессии GIT2 при оксидативных стрессах и ROS (Chadwick et al., 2010b). Более того, как упоминалось выше, саркопения и воспаление ассоциированы (Lutz and Quinn, 2012), указывая тем самым на возможную связь с функцией GIT2 (Siddiqui et al., 2017). GIT2 , как было установлено, ранее был идентифицирован как негативный регулятор передачи сигналов NF-κB серез посредство контроля Toll-like receptor (TLR) (Wei et al., 2014) и посредством взаимодействия с несколькими др. белками. регулирующими NF-κB (Fig. 4) (Wang et al., 2011). Наконец, GIT2, как было установлено, участвует в возникновении центрального ожирения (unpublished data), и воспаление и ожирение, как было установлено, работают совместно, внося вклад в возникновение саркопении (Gregor and Hotamisligil, 2011, Lutz and Quinn, 2012).
3.5. GIT2KO mice show a metabolic decline reminiscent of type 2 diabetes mellitus
T2DM возникает в результате неполноценности панкреатических островковых β-клеток, неспособных секретировать инсулин в ответ на поступление глюкозы, в результате в плазме повышается уровень глюкозы, способствующий ещё большей резистентности к инсулину и ожирению (Pandey et al., 2015). Оксидативные стрессы уже давно идентифицированы как главный игрок в патогенезе и осложнениях диабета (Matough et al., 2012). В этом контексте избыточная продукция митохондриями ROS,как было установлено, является одним из наиболее важных вышестоящих событий в этом патологическом процессе (Giacco and Brownlee, 2010). T2DM пациенты обнаруживают дисбаланс между окислительной и антиоксидантной системами, усиливается приток глюкозы, увеличивает продукцию оксидантов и нарушает защиту анти-оксидантами (Jakus, 2000). Было предположено, что высокие уровни в сыворотке глюкозы широко распространены у пациентов с диабетом, они повышают внутриклеточные уровни глюкозы и тем самым индуцируют повышение скорости гликолиза. Это затем приводит к повышению доставки субстрата в митохондрии и к увеличению накопления ROS (Fig. 4) (Ola et al., 2006). Исследование Aouacheri et al. подтвердило, что гипергликемия при T2DM может приводить к подавлению анти-оксидантной активности, это может приводить к большему количеству оксидативных стрессов, снижению чувствительности инсулина и нарушению секреторной реакции, усиливающей нарушения (Aouacheri et al., 2015, Kocic et al., 2007). Оксидативные стрессы могут также в таком случае приводить к повреждениям ДНК и это является одним из механизмов, участвующего в патогенезе осложнений диабета (Pacal et al., 2011, Prasad et al., 2015, Shin et al., 2001, Slatter et al., 2000). Prasad et al. показали, что частота повреждений ДНК достоверно выше у пациентов с T2DM по сравнению с контролем (Prasad et al., 2015); механизм однако, пока неизвестен.
T2DM пациенты, кроме того, обнаруживают способствующие воспалению фенотипы, характеризующиеся присутствием цитокинов, апоптических клеток, инфильтрацией иммунных клеток, отложениями амилоида и фиброзом. Воспаление является проявлением болезни, которая может обострять T2DM за счет деструкции тканей, вызываемой медиаторами воспаления и ROS (Donath et al., 2008). Активированный врожденный иммунитет и воспаление являются важными факторами в патогенезе диабета. IL-1β, способствующий воспалению цитокин, обнаруживает повышенную экспрессию мРНК у T2DM пациентов (Donath et al., 2008, Navarro and Mora, 2006). Более того, C-реактивный белок, TNFα, и IL-6 оказываются позитивно скоррелированными со значениями резистентности к инсулину (Festa et al., 2000, Muller et al., 2002, Temelkova-Kurktschiev et al., 2002). TNFα, IL-1 и IL-6 ассоциированы с массой жирового тела и могут быть синтезированы и высвобождены жировыми клетками (Navarro and Mora, 2006). Значительная ассоциация между повышением массы телесного жира, ожирением и риском T2DM уже установлена (Abdullah et al., 2010, Carey et al., 1997, Hu et al., 2001, Wang et al., 2015). Адипоциты секретируют adipocyte гормоны и adipokines, которые могут повышать риск диабета несколькими способами, напр., за счет резистентности к инсулину (Bray, 2004).
GIT2KO мыши демонстрируют достоверное снижение RER, указывая на сдвиг прочь от утилизации глюкозы, чтобы генерировать необходимую энергию, а в направлении использования жира и потенциально белков. GIT2 экспрессируется как в панкреатических α- и β-островковых клетках (Martin et al., 2015). Геномная делеция GIT2 приводит к нарушению относительного распределения этого типа клеток внутри островков способом, сходным с таковым в др. экспериментальных моделях диабета, когда мыши обнаруживают достоверное уменьшение области островков и % β-клеток, при этом достоверно увеличивается % α-клеток. Имеются также доказательства инволюции α-клеток в массу β-клеток - грань характерная для диабетической патологии у мышей (Chen et al., 2012, Martin et al., 2015). Более того, GIT2 был обнаружен преимущественно (в смысле старения) активированным у диабетических db/db мышей по сравнению с WT контрольными мышами, как в гипоталамусе, так и в поджелудочной железе. Наконец, физическая ассоциация была обнаружена между GIT2 и множественными белками, жизненно важными для глюкозной метаболической/insulin-регуляторной системы в тканях поджелудочной железы, т.e. инсулиновых рецепторов и insulin receptor substrate 2 (Fig. 4). Взаимодействие между GIT2 и этими белками были специфически нарушены при db/db патологическом состоянии (Martin et al., 2015). Следовательно, очень вероятно, что наблюдаемое зависимое от возраста увеличение экспрессии GIT2 может представлять механизм реакции, чтобы контролировать оксидативные клеточные повреждения, репарацию ДНК и функцию β-клеток островков, а также физическую целостность рецепторов системы Ins/IGF1 (Fig. 4).
3.6. GIT2 expression is associated with a progressive increase in body weight, possibly leading to central obesity
Центральное ожирение, т.e. увеличение отложения жира вокруг главных висцеральных органов, является кардинальным и обязательным компонентом Metabolic синдрома и патологического старения (Mathieu et al., 2010). AT обладает относительно высокими уровнями ферментов антиоксидантной защиты с тем, чтобы, справляться с возникающей высокой продукцией ROS с накоплением пептидов и добавлением свободных жирных кислот (Matsuda and Shimomura, 2013). Повышенное накопление жиров в целом ассоциирует с повышенным риском возникновения метаболических нарушений. По сравнению с подкожным жиром, накоплеие висцерального жира , как известно, высвобождает множество факторов, способствующих воспалению, приводящих к резистентности к инсулину и оксидативным стрессам (Funahashi and Matsuzawa, 2007, Nikolopoulou and Kadoglou, 2012). Demirbag et al. установили, что имеется увеличение повреждений ДНК у субъектов с ожирением по сравнению с субъектами нормально веса (Demirbag et al., 2006), и связь этих изменений с метаболическими аномалиями, возникающими при ожирении (De Lorenzo et al., 2007, Demirbag et al., 2006, Di Renzo et al., 2010, Khan et al., 2006, Vassalle et al., 2009).
Matsuzawa et al. продемонстрировали, что существенная пропорция адипоцитокинов участвует в стимуляции воспаления и реакции на него, противодействуя или способствуя воспалению (Matsuzawa et al., 2004). TNFα известен как важный адипоцитокин, а уровни TNFα в плазме и жировой ткани увеличиваются у людей с ожирением (Ho et al., 2005). Кроме того, IL-1β также секретируется из AT и связан с воспалением (Ouchi et al., 2003).
Исследования показали, что GIT2 действует как keystone белок в связанны с возрастом нарушениях метаболизма, при которых наблюдается связанное с возрастом увеличение экспрессии GIT2 в органах, ассоциированных с энергетическим метаболизмом, что связано с прогрессирующим увеличением веса тела и уровней лептинов (Fig. 4), одновременно со снижением циркулирующего в крови adiponectin (Chadwick et al., 2012, Martin et al., 2015). Было также показано, что GIT2KO мыши формируют ассоциированную с полом защиту от ожирения, вызываемого диетой с высоким содержанием жира. Мыши GIT2KO обнаруживают пониженное накопление жира, повышенную скорость метаболизма, повышенный расход энергии, низкий уовень глюкозы при голодании и низкие уровни инсулина и здоровые профили липидов плазмы (unpublished data). В подтверждение роли GIT2 в контроле механизмов, связанных с ожирением, GIT2 был идентифицирован как GWAS аллель риска, выявляемый при скрининге Metabolic syndrome (Fig. 4) (Zabaneh and Balding, 2010).
3.7. GIT2 disruption is associated with premature thymic dysfunction
Старение иммунной системы и 'inflammaging' вызывают выраженную зависимую от возраста дисрегуляцию иммунной системы (Deleidi et al., 2015). Старение иммунной системы означает вызывающую вред потерю эффективности иммунных архитектуры и путей в ходе старения (Pera et al., 2015), это характеризуется различными аномалиями, таким как обратное соотношение CD4/CD8, потеря эффективности миграции B и T клеток во вторичные иммунные ткани (Montecino-Rodriguez et al., 2013) и снижение частоты хорошо функционирующих клеток натуральных киллеров (Albright and Albright, 1985). Старение иммунной системы обычно сопровождается 'inflammaging', при котором обнаруживается тяжелое накопление медиаторов воспаления в некоторых тканях (Coppe et al., 2010).
Оксидативные стрессы распознаются как главный игрок в предопределении и поддержании низкого уровня воспаления, наблюдаемого при старении и при связанных с возрастом нарушениях ('inflammaging') (De la Fuente and Miquel, 2009). Недавно установлена тесная причинно-следственная связь между оксидативным стрессом и воспалением, когда оксидативный стресс, как было установлено, влияет на врожденный и приобретенный иммунитет (Cannizzo et al., 2011). Оксидативный взрыв, ассоциированный с врожденной иммунной реакцией, активирует формирование ROS и общую оксидативную стрессовую реакцию, снижая антиоксидантную способность клеток. Свободные радикалы, которые избыточно продуцируются, будут реагировать с мембранными липидами и белками, нарушая из функцию и создавая циркулярную петлю TLRs и Nalp3 активации inflammosome (Gill et al., 2010). Повышенная воспалительная реакция обнаруживается с возрастом, сопровождается также повреждениями ДНК и DDR. DDRs, как было установлено, является важным в продукции медиаторов воспаления, сопровождаемым клеточным старением (Rodier et al., 2009).
GIT2 участвует во многих разнообразных иммунных функциях, таких как выбор позиции для тимоцитов, клеточная подвижность и избирательное восприятие нейтрофилов посредством регуляции малых GTP-связывающих белков ARF и Rac1 (Wei et al., 2014). В относительно молодом возрасте (12 мес.), GIT2KO мыши имеют преждевременно расстроенную структуру тимуса и дисфункцию T клеток (Fig. 4), по сравнению с мышами WT того же возраста (Siddiqui et al., 2017). Характерная дисфункция тимуса считается одной из наиболее консервативной у многих видов особенностью старения (Brelinska, 2003, Brelinska et al., 2008, Fabris et al., 1982). GIT2KO мыши демонстрируют временно благоприятное снижение уровней предшественников T клеток (в 3 мес. возрасте GITKO сходны с 12-мес. WT мышами), а в продвинутом возрасте снижение double positive/CD4+/CD8+ клеток (Fig. 4), и в целом дефицит в структуре тимуса и в ключевых функциональных регуляторах (Siddiqui et al., 2017). Такие мыши также более чувствительны к колитам, вызываемым dextran sodium sulfate, инфекцией Escherichia coli или endotoxin-shock challenge, и у них драматически повышаются способствующие воспалению цитокины, наблюдаемые у GIT2KO мышей, и их макрофаги. Недавно GIT2 был идентифицирован как негативный регулятор TLR-индуцированной передачи сигналов NF-κB (Fig. 4), завершающий передачу сигналов TLR-индуцированного NF-κB и MAPK путем рекрутирования фермента деубиквитилирования cylindromatosis, чтобы подавить убиквитилирование TNF receptor associated factor 6 (TRAF6) (Wei et al., 2014). Убиквитилирование TRAF6 является критическим для активации NF-κB. Чувствительность GIT2KO мышей к dextran sodium sulfate, вызывающему колит, как было установлено, зависит от передачи сигналов TLR. Т.о., GIT2 был идентифицирован как важный терминатор передачи сигналов TLR, а потеря GIT2 может приводить к неконтролируемому воспалению и тяжелым повреждениям органов (Wei et al., 2014).
3.8. GIT2 interacts with RUSC2 in lung cancer cells
Первой ступенью в канцерогенезе является характерная модификация генетического материала, вызываемая ионизирующей радиацией, мутагенными соединениями или оксидативными повреждениями. Дисбаланс redox, возникающий в различных раковых клетках, вызывается оксидативными стрессами и приводит к гипотезе, что оксидативные стрессы могут быть связаны с онкогенной стимуляцией. Повышенные уровни оксидативных повреждений ДНК были отмечены в разных опухолях. Во время канцерогенеза уровень ROS в раковых клетках увеличивается, тогда как антиоксиданты истощены (Gao et al., 2003, Hwang and Bowen, 2007). Продукция ROS может далее сопровождать прогрессирование опухоли путем стимуляции hypoxia-inducible factor-1α (HIF1-α) и сигнальных белков, таких как vascular endothelial growth factor (EGF), который поддерживает ангиогенез, делая возможным рост опухоли. ROS изменяют экспрессию p53 супрессорного гена - ключевого игрока в апоптозе (Barrera, 2012, Matsuzawa and Ichijo, 2008, Nguyen et al., 2009, Wiemer, 2011).
ДНК повреждения обусловливаются или средовыми факторами или нормальными метаболическими процессами внутри клеток, они могут нарушать способность клеток выполнять свои обычные функции (Bartkova et al., 2005, Hanahan and Weinberg, 2000, Lengauer et al., 1998). DDR, как было установлено, является критическим для защиты от рака, при этом растет количество исследований, сообщающих, что рак возникает при участии мутаций зародышевой линии в генах DDR (Hoeijmakers, 2001, Wyman and Kanaar, 2006). Относительно активации DDR белков, повышенное аутофосфорилирование ATM, как известно, обнаруживается в опухолях на ранней стадии, указывая тем самым, что DDR может выступать в качестве барьера прогрессированию опухоли (Bartkova et al., 2005, Gorgoulis et al., 2005). Более того, избыточная экспрессия белков, реагирующих на повреждения ДНК, BRCA1, PARP1, и Excision Repair Core Complementary group-1 также обнаруживаются в разных раковых опухолях (Fig. 4) (Klauke et al., 2012, Squires et al., 2013, Taron et al., 2004). BRCA1 играет важную роль в репарции DSBs, мутации в BRCA1 приводят к более высокой чувствительности к канцерогенам (Taron et al., 2004), тогда как избыточная экспрессия снижает повреждения ДНК и усиливает механизмы репарации ДНК (Feng et al., 2015). Excision Repair Core Complementary group-1 является ключевым компонентом путей эксцизионнной репарации нуклеотидов , удаления DNA adducts, которые могут препятствовать репликации клеток (Squires et al., 2013). PARP1 является ключевым сенсором для репарации разрывов одиночной нити ДНК, подавление чего приводит к накоплению разрывов одиночных нитей и к последующему возникновению DSBs после клеточного деления (Klauke et al., 2012). Один из главных посредников GIT2, p53, является наиболее часто мутируемым геном в спорадических раках у людей (Fig. 2) (Hosoya and Miyagawa, 2014, Lu et al., 2015).
Воспаление может иметь несколько лежащих в основе источников, которые, в свою очередь, могут вызывать рак; 1) инфекция, напр., Helicobacter pylori вызывает карциному желудка у людей (De Falco et al., 2015), 2) аутоиммунитет, напр., при воспалительной болезни толстого кишечника вызывает рак толстой кишки (Francescone et al., 2015) ил 3) внешняя среда, подобная задымлению (Cohen and Pope, 1995). Микроокружение при хроническом воспалительном заболевании или опухоли имеет множество сходств, подтверждающих роль воспаления в прогрессировании опухолей (Raposo et al., 2015). Как только опухоль укореняется, то хроническое воспаление усиливается микроокружением опухоли (Hanahan and Weinberg, 2011). Это также связано с оксидативными стрессами и повреждениями ДНК, первые возникают в результате воспаления клеток, усиливаемого мутациями ratein клеток и усилением геномной нестабильности, путем индукции повреждений ДНК (Waris and Ahsan, 2006).
Раковые клетки нуждаются в огромных количествах энергии для поддержания своего потенциала неограниченной репликации (Marahatta et al., 2005, Warburg et al., 1927), приводя к дисфункции энергетического метаболизма. Warburg et al. (1927) отметили. что повышенное потребление глюкозы и продукция лактата происходят даже в присутствии кислорода (аэробный гликолиз) в опухолевых клетках, теперь наз. "Warburg effect", который участвует в трансформации клеток, иммортализации и пролиферации во время туморогенеза (Oliveira et al., 2015). Эти метаболические изменения нарушают микроокружение и окружение клеток, делая более способными к пролиферации раковые клетки (Milosevic et al., 2014, Navratilova et al., 2013). Наконец, в 2002, International Agency for Research on Cancer (IARC) пришло к заключению, что рак груди, почек, толстого кишечника и эндометрия и аденокарцинома пищевода могут быть предотвращены путем избеганя избытка веса (Gonzalez Svatetz and Goday Arno, 2015). Механизмы, с помощью которых вызвается рак, могут варьировать в зависимости от типа рака, но во многих случаях они сходны с резистентностью к инсулину и возникающей в результате хронической гиперинсулинемией и хроническим воспалением, при которых ожирение играет причинную роль (Gonzalez Svatetz and Goday Arno, 2015).
GIT2 является важным в контроле поляризации клеток и зависимой от направления регуляции аппарата Гольджи посредством RUN and SH3 Domain Containing 2 (RUSC2; Fig. 4). RUSC2 является посредником GIT2 посредством фосфорилирования его сайта SHD. В разных клетках рака легких RUSC2 стабилизирует GIT2 путем подавления его деградации и увеличения его фосфорилирования (Mazaki et al., 2006, Yu et al., 2009). Нейтрофилы у GIT2KO мышей обнаруживают частичную потерю направленности перемещения и дефектный хемотаксис в направлении хемоаттрактантов (Mazaki et al., 2006). Предыдущие исследования показали, что GIT2 взаимодействует с PIX, MAP kinase/ERK kinase 1 (MEK1), phospholipase-C gamma (PLCγ) и paxillin, чтобы регулировать поляризацию клеток и повижность посредством контроля динакики цитоскелета, мемьбранного трафика и оборота фокальных адгезий (Brown et al., 2002, Hoefen and Berk, 2006). Duan et al. продемонстрировали важную роль взаимодействия между RUSC2 и GIT2 в регуляции EGF-стимулируемой RAB35-зависимой направленной миграции клеток в non-small cell раке легких (Duan et al., 2016). Нарушение регуляции EGF-receptor может приводить к повышению активности внутриклеточного пути, приводящего к прямой или косвенной клеточной пролиферации, ангиогенезу, инвазии и метастазированию (Ciardiello et al., 2004). Т.о. , Duan et al., в 2016 предоставили ряд доказательств, что RAB35/RUSC2/GIT2 путь является центральным для EGF receptor-индуцированной направленной миграции клеток рака легких (Duan et al., 2016).
4. Discussion
In this review, we have discussed the highly complex ageing process, a near-universal occurrence in biological systems, characterized by a progressive loss of physiological integrity, leading to impaired function and eventually to death (Lopez-Otin et al., 2013). We postulate that such a highly complex process could perhaps be controlled by a keystone protein, such as GIT2.
Age-related disorders are caused by a multitude of underlying processes or 'hallmarks', and GIT2 appears to be involved in each one of the previously-discussed processes. While not all links have been proven, the supporting research is encouraging. GIT2 plays an important role in stress sensitivity (Chadwick et al., 2010b, Lu et al., 2015, Schmalzigaug et al., 2009b), ageing (Chadwick et al., 2012), and somatic energy management (Martin et al., 2015), indicating that this protein might provide a novel target for therapies designed to minimize pathological ageing and age-related disease.
It thus stands to reason that GIT2-based therapies may potentially aid in alleviating some of the pathological effects caused by ageing. Considering the data obtained from GIT2KO mice, which age more rapidly than the WT age-matched controls, we hypothesize that the increase in GIT2 expression occurring with age is the body's attempt to counter the ageing process, which in the end is insufficient to overcome the damage (Lu et al., 2015, Martin et al., 2015). If we assume that the ageing process can (to a certain degree) be termed a 'GIT2-opathy', strengthening GIT2 function could potentially reinforce network resiliency, and hence allow age-related pathological processes to be reversed.
Even though a considerable body of current ageing research is being performed on the genomic level, even if target genes can be identified, we must still replace and/or alter our cells (i.e. modify the genome) to avoid pathological ageing (de Magalhaes, 2014). Employing gene therapy reveals potential for regenerative medicine, but it has been shown that other life-extending interventions, such as caloric restriction, show larger and more promising effects (Shen et al., 2011). Even if we understand the full functional ramifications of the somatic genetic code, this does not imply the possibility to therapeutically edit the humangenome. A simpler option might be to target at the protein level, using a keystone protein such as GIT2, and thus exploiting the cell's own repair mechanisms to develop ageing therapies.
While GIT2 may represent a crucial therapeutic target for ageing disorders, drug targets are preferably receptors, ion channels, kinases or phosphatases. GIT2, which acts as a scaffolding protein, does not represent an ideal drug target. To control GIT2, the identification of another protein that could control its expression would be the simplest approach. One such candidate is the PIX protein family. PIX proteins bind tightly to GIT2 (as well as GIT1), and mice lacking ?-PIX in immune cells also display a dramatic deficit in GIT2 expression (Missy et al., 2008, Pararasa et al., 2015). It thus appears that GIT2-PIX association stabilizes both proteins, so it will be important to understand whether age-related increases in GIT2 are accompanied by increases in PIX as well, and whether manipulating PIX expression can alter GIT2 levels and activity. Secondly, recent work has demonstrated that GPCRs can effectively regulate the expression of multiple signaling proteins (Gesty-Palmer et al., 2013), suggesting that GPCRs might be used to regulate the expression of specific signaling proteins of interest. To potentially control this 'ageing system', a GPCR with a strong functional link to GIT2 will have to be identified, which should show a strong co-expression relationship with GIT2 in desired tissues. This GPCR should next be targeted using a ligand that possesses a capacity to control GIT2 expression. We believe that GIT2 may represent an important target for both therapeutic development for and diagnostic research of age-related disorders, and justifies further research into means of altering keystone functions of GIT2, to reduce the burdens associated with ageing.
|